PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH VẬT TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN ppt

PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA
VI SINH VẬT TRONG SẢN PHẨM
THUỶ SẢN
Chương VI
YÊU CẦU TRONG LẤY MẪU, XỬ LÝ
MẪU, TIẾP NHẬN MẪU TẠI PHÒNG
THÍ NGHIỆM
Phương pháp thu, bảo quản và vận
chuyển mẫu
• Các khái niệm
▫ Mẫu ban đầu: Mẫu ban đầu được lấy từ các bao bì chứa
đựng (hay đơn vị chứa) khác nhau, ở các vị trí khác nhau
để đảm bảo tính chất đại diện trung bình cho lô hàng. Số
lượng của mẫu ban đầu tuỳ thuộc vào số lượng đơn vị
chứa của lô hàng.
▫ Mẫu trung bình: Mẫu trung bình là lượng mẫu cần thiết
lấy ra từ mẫu ban đầu sau khi đã trộn đều mẫu ban đầu. Nó
phụ thuộc vào loại và dạng sản phẩm ban đầu.
▫ Mẫu phân tích: Mẫu phân tích là lượng mẫu cần thiết
dùng cho quá trình phân tích được lấy ra từ mẫu trung bình.
Các loại mẫu đều được dán nhãn
• Phải đảm bảo 2 điều kiện:
- Mẫu có tính đại diện cho lô hàng, lượng mẫu đủ để phân
tích.
- Thành phần & số lượng VSV ko được biến đổi kể từ khi lấy
mẫu đến khi phân tích.
Cách tiến hành lấy mẫu
• Mẫu dạng hạt: ngũ cốc, cà phê,… trong lô hàng có số
lượng bao dưới 5 thì bao nào cũng lấy một ít ở vị trí
khác nhau. Trong lô hàng từ 6 - 100 bao thì lấy ít nhất
5 bao, trong lô có số bao lớn hơn 101 trở lên thì lấy ít

nhất 5% số bao .v.v. Dụng cụ lấy mẫu là xiên lấy mẫu

• Lô hàng sắp theo hình vuông, gạch 2 đường chéo lấy
mẫu ở 2 tam giác đối diện bất kỳ

• Mẫu ban đầu phải có khối lượng 3 – 5 kg
Mẫu dạng lỏng: rượu, nước mắm
• Sản phẩm trong phy hay bồn lớn thì dùng ống xi phông,
ống hút có độ dài khác nhau để lấy mẫu ở các vị trí khác
nhau: trên, giữa và ở đáy, rồi trộn đều. Lượng mẫu tối
thiểu là 2 lít mẫu trung bình.
• Nếu sản phẩm lỏng chứa trong chai lọ, can và lô hàng
có ít hơn 1000 đơn vị chứa thì lấy 2% số đơn vị chứa, nếu
lô hàng có trên 1000 đơn vị chứa thì lấy từ 0,3 - 1% số
đơn vị chứa. Sau đó trộn đều tất cả số mẫu ban đầu đã lấy
được, để lấy ra mẫu trung bình khoảng 2 lít
• Phần còn lại của mẫu phân tích là mẫu lưu
Các sản phẩm khác dạng sánh hoặc
bán rắn
• Lấy 50 – 100 ml đối với tinh dầu, dầu ăn có thể
lấy lượng lớn hơn
• Bơ lấy 200 g trở lên cho mẫu trung bình

• Lưu ý đối với dầu thực vật, bơ phải trách sự oxy
hoá của không khí
Nhà máy CBTS: mẫu (kiểm tra vệ sinh công nghiệp)
lấy với khối lượng nhỏ, nhiều thời điểm & công đoạn
khác nhau trong qt cbiến.
Thịt, cá: nơi nhiễm chủ yếu là bề mặt, sd các dụng cụ
lấy mẫu để quét trên bề mặt sp hay cắt mẫu với độ

dày từ 2-3 mm.

Dụng cụ lấy và chứa mẫu
Từ các chất liệu khác nhau: phải thanh trùng.
Bình (có mẫu) được niêm phong, ghi số thứ tự mẫu, người
lấy mẫu
Ghi nhãn
Ghi nhãn trên mẫu: ngay trước hay sau lấy mẫu để phù hợp
hồ sơ mẫu.
Ghi nhãn trên dcụ vchuyển: tên, đchỉ , đthoại người nhận,
gửi kèm dấu hiệu dễ vỡ, tphẩm, trữ lạnh…
Yêu cầu nhãn: chịu áp suất, không thấm nước, không thể
tháo bỏ, tẩy xóa.
Hồ sơ mẫu
Mỗi mẫu có hồ sơ mẫu phù hợp vời nhãn ghi trên mẫu và
thùng chứa.
Thông tin hồ sơ mẫu
Người yêu cầu PTN phân tích mẫu: Tên, địa chỉ, điện thoại.
Nơi lấy mẫu (cửa hàng, khách hàng ), ngày, địa điểm, thời
gian lấy mẫu.
Miêu tả hoàn cảnh, môi trường nơi lấy mẫu.
Bản chất mẫu.
1 nhãn dễ đọc ghi rõ tên mẫu.
T
0
mẫu, kho chứa khi lấy mẫu.
Nguyên nhân lấy mẫu.
Thông tin thực phẩm được lấy mẫu: chế biến, thời gian sản
xuất, dạng bao bì, điều kiện bảo quản.
Tên nhà sx, nhà nhập khẩu.

Ngày sx, ngày đóng gói, thời hạn sử dụng, số sx.
Phương pháp lấy mẫu.
Người lấy mẫu: tên, địa chỉ, điện thoại.
PTN: tên, địa chỉ, điện thoại.
Các chỉ tiêu phân tích.
TIẾP NHẬN MẪU TẠI PHÒNG THÍ NGHIỆM
Ghi nhãn
Kiểm tra: nhãn trên mẫu có phù hợp số của hồ sơ mẫu.
T
0
mẫu, tgian mẫu đến: ghi trong hồ sơ mẫu.
T
0

mẫu khi đến
Đo T
0
= 1 phần mẫu hay 1 mẫu phụ xlý giống mẫu chính.
Đk bao gói
Mẫu giữ ở bao bì gốc (tốt nhất). Nếu chuyển bao bì, mẫu giữ ở
túi vô trùng & bằng các vật liệu không ảnh hưởng tình trạng
ban đầu của mẫu.
- Mẫu lỏng: kiểm tra bình chứa (rò rĩ, nắp đậy kín, bị nứt
/thủng) có gây nhiễm bẩn vào mẫu.
- Mẫu rắn: kiểm tra bao bì (tình trạng chân không- có khí bên
trong?, bị nứt/ lõm?), đk lý tính bên trong ( màu sắc, cơ cấu,
mất chất lỏng).
Bao bì/ lớp bọc bị hư hỏng: ghi nhận, báo cáo phân tích.

Bảo quản mẫu trước & sau khi phân tích
Với mẫu thực phẩm: sau khi lấy- bquản tách biệt nhau, giữ ở
T
0
thấp nước đá),vận chuyển ngay về PTN. Mẫu mau hư
hỏng: bảo quản đông, đặc biệt trữ dài hạn, giữ mẫu ở tủ đông
(-20
o
C). Ko thể bquản đông, phân tích mẫu trong 36h giữ
trong tủ lạnh (0-4
o
C).
Thực phẩm đồ hộp hay thực phẩm khó hư hỏng bảo quản ở
T
0
phòng đến phân tích.
Mẫu đến cuối/ hết hạn sd: Bảo quản ở T
0
ghi trên bao bì.
Từ chối nhận mẫu
Kiểm tra cảm quan: hư hỏng (mục đích thẩm định lại kết quả
kiểm tra cảm quan: nhận kiểm tra vi sinh).
Mẫu đến PTN: t
0
quá cao, hư hỏng, bị nhiễm khi vchuyển.

Xử lý mẫu
Tiền xử lý mẫu theo phương pháp chuẩn:
• Rã đông thực phẩm đông lạnh: ở T
0

tủ lạnh (4
0
C) 18h. Mẫu
thực phẩm nhỏ: đặt nơi ổn định nhiệt (không >37
0
C) 15’.
• Đồng nhất mẫu cần duy trì t
0
lạnh.
• Khối lượng mẫu phân tích 10/ 25gram.
• Mẫu thực phẩm hàm lượng muối cao, nồng độ muối dung
dịch pha loãng phù hợp nồng độ muối trong mẫu.
• Mẫu thưc phẩm hàm lượng đường cao: bổ sung đường
sucrose.



Mẫu thực phẩm mau hỏng: bảo quản lạnh ngay sau lấy mẫu
(T
0
0-4
o
C) ở thùng nước đá, mẫu tránh tx trực tiếp với nước
đá.
Mẫu dạng đông (block) không để tan đá trước khi đến PTN.
Mẫu khó hư hỏng: dùng bao, túi kín; T
0
vận chuyển, bảo
quản không vượt 45
o

C.
Mẫu kiểm nghiệm phải đạt các yêu cầu:
Dụng cụ chứa mẫu không rò rỉ, có nắp đậy kín, không bị
nứt /thủng gây nhiễm bẩn vào mẫu.
Mẫu dạng hút chân không: không có khí bên trong.
Mẫu dạng block hay mẫu nguyên con: còn nguyên vẹn
không bị biến dạng, giập nát.
Mẫu nước: phân tích ngay sau khi thu. Mẫu bảo quản lạnh
<10
o
C (>1h), vận chuyển tối đa 6h và bảo quản ở PTN tối
đa 2h.
Thời gian, T
0
bảo quản và vận chuyển ghi trong hồ sơ mẫu.


Phương pháp kiểm nghiệm VSV sử dụng kỹ
thuật truyền thống

• Ưu điểm: chi phí thấp (ko cần trang bị thiết bị hiện đại)
• Nhược điểm: tgian cho kquả chậm, ko đáp ứng nhu cầu
kiểm nghiệm thực tế.
Các kỹ thuật cơ bản
• Tiệt trùng
Thanh trùng khô
Dụng cụ thuỷ tinh
Các dụng cụ chịu nhiệt
Nhiệt độ thông thường 170
o

C trong 2h
Thanh trùng ướt
Môi trường nuôi cấy
Nhiệt độ 121
o
C trong 15p
Dùng đèn cồn
Tiệt trùng không gian làm việc
Khử trùng dụng cụ như dao, kéo, nhíp, que cấy, que
trải,…
Pha loãng
• Dung dịch pha loãng thường dùng
Nước muối sinh lý hoặc dung dịch peptone
• Thường pha loãng theo dãy thập phân
Tỷ lệ dung dịch:mẫu 9:1
9
ml
9
ml

9
ml
9
ml

9
ml
9
ml
9

ml
Ống
mẫu
1,0ml 1,0ml 1,0ml 1,0ml 1,0ml 1,0ml
Tách ròng

Trữ vi khuẩn
• Trên môi trường đặc
• Trên môi trường loãng (BHI, TSB… + glycerol, 1:1)
• Trữ khô ở - 80
o
CA
Loại môi trường, chỉ tiêu sinh hoá dùng trong kiểm
nghiệm vi sinh sp thuỷ sản

Phân loại môi trường
Theo trạng thái vật lý
• MT nuôi cấy VSV: mt lỏng, mt đặc và mt xốp.
• MT lỏng(ko có agar): dùng để ktra các đặc tính sinh hoá,
tăng sinh và tồn trử VSV.
• MT đặc (có chứa agar): dùng để phân lập, tách ròng VSV
với mđích thu các khuẩn lạc rời hay xđ hình thái khuẩn lạc.
• MT xốp: chỉ sd trong vi sinh công nghiệp.


Hình Các loại môi trường theo trạng
thái vật lý
Theo công dụng
• Môi trường tiền tăng sinh: giàu dinh dưỡng, ko có chất ức chế đặc
hiệu tạo đk hầu hết các loại VSV ptriển.

• Môi trường tăng sinh: có kn ức chế sự sinh trưởng 1 số nhóm VSV
nhưng tạo đk ptriển VSV khác.
• Môi trường chung: ko chứa các chất ức chế, dùng phân lập hầu hết
các loại VSV (là mt lỏng hoặc mt đặc).
• Môi trường phân biệt (mt đặc trưng) (mt đặc): chứa các thành phần
thuận lợi cho sự phát hiện các giống hay loài VSV từ một mẻ cấy
thuần chủng hoặc hổn hợp.
• Môi trường thử phản ứng sinh hoá: dùng để xđịnh 1 vài tính chất
sinh hoá các dòng VK được phân lập. Yêu cầu phải sd dòng thuần,
nếu ko kquả dễ cho hiện tượng dương tính giả (kquả sai).

Những điều cần lưu ý trong sử dụng môi trường
• Phòng kiểm nghiệm: sd mt nhập khẩu có sẵn (dạng khan).
Ưu điểm: giảm đáng kể sự sai lệch giữa các lần pha chế mt.
• Bảo quản: Mt khô bquản nơi khô thoáng,T
0
(15 – 25
o
C),
đậy kín (tránh bị hút ẩm do hơi nước trong ko khí), nếu
không mt xhiện hiện tượng: thay đổi pH, vón cục. Lưu ý:
Ko dùng mt bị vón cục, quá hạn sd.
• Pha chế: Nước pha mt khô là nước cất (các mt có hướng
dẫn lượng mt và lượng nước). Các mt nhạy cảm với T
0
(ko
đun mt quá tgian cần thiết).

• Điều chỉnh pH: MT khô khi hoà tan, đun và khử trùng
đúng cách có pH phù hợp cho ptriển VSV. 1 số trường hợp

cần điều chỉnh pH phù hợp (sd NaOH / HCl).
Lưu ý: MT đặc, điều chỉnh pH khi T
0
mt ở khoảng 45
o
C và
dụng cụ đo pH có chế độ bù nhiệt. MT lỏng đo pH ở T
0

phòng.
• Khử trùng môi trường: Thiết bị dùng khử trùng mt - nồi
hấp tiệt trùng (Autoclave), ở T
0
(121
o
C) với tgian 15’ ko kể
thời gian nâng nhiệt .

Chỉ tiêu sinh hoá trong kiểm nghiệm vi sinh
a. Nhuộm Gram
• 1884 Hans Christian Gram (nhà khoa học Đan mạch)
(1853 – 1938) phát hiện pp.
• Dựa trên đặc tính hóa lý của thành tế bào
▫ Vi khuẩn Gram dương: lớp peptidoglycan dầy 20
– 80 nm, chiếm 90% khối lượng.
▫ Vi khuẩn Gram âm: lớp peptidoglycan dầy 7 - 8
nm, chiếm 10% khối lượng và có thêm lớp màng
lipopolysaccharide bên ngoài.