TIEU LUAN MON CAC HOAT CHAT SINH HOC -TACH CHIET FLAVONOID TU DIEP CA

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG
Môn: CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC
TÁCH CHIẾT FLAVONOID
TỪ DIẾP CÁ
GVHD: Lại Đình Biên
LỚP: 12CDSH2
NHÓM: FLAVONOID

 1.1 Tổng quan về thực vật:
 Cây Diếp cá còn có tên là cây Giấp cá, Lá giấp, Ngư
tinh thảo.
 Tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb
 Tên tiếng Anh của nó là heartleaf (lá hình tim) hay liza
rdtail (đuôi thằn lằn)


 - Giới Thực vật (Plantae)
 - Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
 - Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
 - Bộ Hồ tiêu (Pip rals)
 - Họ Lá giấp (Saururac a )
 - Chi Diếp cá (Houttuynia Thunb.)
 - Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.)
 - Phân lớp Ngọc lan (Magnoliida )

 Cây thuộc thảo, thân ngầm, rễ mọc ở các đốt. thân
trên mặt đất mọc đứng cao 40cm, có long. Lá hình
tim, mền nhẵn, mặt dưới tím nhạt, khi vò có mùi

tanh như cá do đó có tên là diếp cá hay ngư tinh
thảo. Cụm hoa là bông, màu vàng không có hoa,
có 4 lá bắc trắng; tất cả nhìn như một cái hoa đơn
độc. Quả nang mở ở đỉnh, hạt hình trái xoan, nhẵn.

 Phân bố từ Nhật Bản, Trung Quốc tới Nêpan, Ấn
Độ, các nước Đông Dương và Indonsia.
 Ở nước ta, cây mọc rất phổ biến. Cây mọc hoang ở
những nơi ẩm thấp. Ở miền Nam được trồng nhiều
làm rau sống.

 - Các flavonoid: quercitrin (=quercetin 3-
rhamnosid), isoquercitrin (quercetin 3-glucosid)
 - Tinh dầu: Đây là thành phần làm cho dược liệu
có mùi đặc biệt. Thành phần chủ yếu của tinh dầu
là methylnonylceton, laurylaldehyd, caprylaldehyd
và decanonyl acetaldehyd. Chất sau cùng này là
thành phần chính nhưng không bền và dễ bị phân
huỷ khi chưng cất.
 - Ngoài ra trong diếp cá còn có nhiều chất khác: N-
(4-hydroxystyryl)-benzamid, aristolactam, các
alcaloid nhân pyridin, 1,3,5 - tridecanonylbenzen.

 - Tác dụng kháng nhiều loại virus đã được nghiên cứu. Thành
phần có tác dụng là quercitrin và tinh .Tinh dầu ức chế trực
tiếp các virus sau: Virus gây bệnh herpes (mụn rộp) chủng 1
(HSV-1), virus gây bệnh cúm và HIV chủng 1 của người (HIV-
1) nhưng không thấy có tác dụng chống virus gây bệnh bại liệt.
 - Diếp cá còn có tác dụng kháng viêm, thông tiểu. Tác dụng
làm bền mao mạch của quercitric đã được chứng minh.

 - Dược điển Trung quốc chỉ định dùng lá diếp cá trong các
trường hợp apxe phổi, ho khó thở, lỵ, nhiễm trùng đường tiểu
tiện, mụn nhọt.
 - Có thể dùng diếp cá tươi để chữa đau mắt đỏ có tụ máu (giã
nhỏ lá, ép vào hai miếng giấy bản, đắp vào mắt), bệnh trĩ (hãm
lấy nước uống và rửa). Diếp cá là thứ rau ăn thông thường ở
miền Nam. Đây cũng là nguồn cung cấp vitamin P rất tốt cho
cơ thể.


 2.1. QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO DIẾP
CÁ
 Bột Diếp Cá được làm ẩm với cồn 96%
trong 2h, nạp vào bình ngấm kiệt, thêm
cồn vào bình chiết, ngâm trong 12h.
Rút dịch chiết ở tốc độ 10-12 giọt/phút
cho đến khi dịch chiết nhạt màu. Gộp
toàn bộ dịch chiết cồn, cô thu hồi dung
môi dưới áp suất giảm thu được dịch
chiết đậm đặc.

 Dịch A (mục 3.1.1.) được pha loãng với 1
lít nước, lắc phân bố với CHCl3 đến khi dịch
CHCl
3
không còn cho màu xanh nhạt với TT
FeCl
3
5%, dịch CHCl
3

được rửa nước nhiều lần,
gộp các dịch CHCl
3
, cô thu hồi dung môi được
cao A1 (12 ).

 Dịch A còn lại được lắc phân bố với ethyl acetat
đến khi dịch ethyl acetat không còn cho màu xanh rêu
đậm với TT FeCl
3
3,5%, rửa dịch ethyl acetat với 100 ml
nước cất, gộp các dịch ethylacetat, cô thu hồi dung môi
được cao lỏng A2 (54 g). A2 được dùng làm mẫu để phân
lập các flavonoid bằng sắc ký cột nhanh (VLC).

 Dịch A còn lại tiếp tục được lắc phân bố
với nbutanol đến khi dịch nbutanol không còn cho màu
xanh đen với TT FeCl
3
3,5%. Dịch n-butanol thu được, rửa
nước nhiều lần, gộp các dịch n-butanol, cô thu hồi dung
môi được cao A3 (7 g).
 Định tính flavonoid trong các cao A1, A2,
A3 bằng phản ứng cyannidin và sắc ký lớp
mỏng.

Kết quả: phân đoạn 2 – cao A2 giàu
flavonoid so với phân đoạn 1 và phân đoạn 3,
do đó A2 được dùng để phân lập các flavonoid

bằng sắc ký cột.
Phân lập flavonoid từ cao A2 bằng SKC chân
không
Thăm dò hệ dung môi trên sắc ký lớp mỏng
 Khảo sát một số hệ dung môi, tiến
hành thăm dò trên sắc ký lớp mỏng tráng sẵn
(silica gel F254), phát hiện bằng TT FeCl
3
5%,
soi UV 254nm, UV 365nm và thu được kết quả
như sau:
STT Hệ dung môi trên sắc kí Khả năng tách
1 Butyl acetat-acid formic ++
2 Ethyl acetat +
3 Ethyl acetat- MeOH-nước
(10:0.5:1)
++
4 n-BuOH-ethyl acetat-nước

(6:2:0.5)
+
5 Ethyl acetat-aceton-nước
(8:1.8:0.2)
+++
6
Cloroform
-ethyl acetat
(2:8)
+
7 Butyl acetat-aceton (30:1) +

8 Cloroform-aceton ++
9 Butyl acetat-nước-acid
formic (15:5:5)
++++
10 Butyl acetat-nước (15:5) +++
Kết quả: Hệ Butyl acetat- nước (15:5) có khả
năng tách tốt, R1 thích hợp nên được dùng để tiến
hành triển khai trên sắc ký cột chân không. Tuy nhiên
do không có mặt của acid formic nên các vết tách kéo
đuôi, do đó silica gel sẽ được tầm 5% acid formic để
tách gọn hơn.
 Phân lập flavonoid bằng sắc ký cột chân không
Điều kiện sắc ký
- Cột thuỷ tinh xốp 5x30cm, đã xử lí bằng sulfucromic, rửa sạch, sấy
khô.
- Pha tĩnh: Silica gel 60, cỡ hạt 0,015-0,04 mm, khôi lượng 150g, được
tẩm với 7ml, acid formic, lắc đều, sấy ở 120 độ C/2 giờ trong hộp kín.
- Pha động: Butyl acetat- nước (15:5)
- Nhồi bột: Nhồi bột khô, sau đó cho 15ml pha động chảy qua cột , hút
chân không đến khi không còn dung môi.
- Khối lượng mẫu: 25g cao A2.
- Nạp mẫu dạng dung dịch. Mẫu được nạp đều lên bề mặt silica gel, hút
chân không đến khi mẫu thấm hết xuống silica gel, sau đó tiến hành
hứng phân đoạn.
- Thể tích hứng mỗi phân đoạn là 150ml.
- Kiểm tra các phân đoạn trên bảng sắc ký lớp mỏng tráng sẵn với dung
môi Butyl acetat- nước-acid formic (15:5:5), phát hiện dưới ánh sáng
thường, UV 254nm, UV 365nm, thuốc thử FeCl
3
.

Kết quả: Thu được 5 phân đoạn được ghi ở bảng sau:
Phân đoạn

V(ml) P(g)
Thành

phần
1 450 1.1 B C D
2 1200 3.7 E F H
3 3300 4.2 F H I J
4 750 2.3 G H I J
5 2400 11.6 H I J
Bảng 3.1. Kết quả phân lập flavonoid bằng dung môi butyl acetat- nước (15:5)
A

B
_____
C
_____
D
_____
E
_____
F
_____ ______
G
_____
H
_____ ______ _____ _____
I

______ _____ _____
J
______ _____ _____
TP 1 2 3 4 5
Nhận xét:
 Phân đoạn 1 (1,1g) được kết tinh trong methanol thu
được tinh thể tinh thiết màu vàng chanh , đặt tên là DC1
(34mg). Tinh thể được kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng qua 4
hệ dung môi khác nhau ethyl acetat-nước-acid formic-
acetic (100:10:5:5), Etoac-aceton-(H
2
0) (4:5,5:0,5),
CHCl
3
-HCOOH-CH
3
COOH (6:2:0,5), butyl - nước- acid
formic (15:5:5)(hình 10.11.12.13), phát hiện bằng TT.
Vanillin- asulfuric,TT.FeCl
3
, soi UV 365 nm, UV 254 nm.
 Phân đoạn 2 (3,7g) có ít nhất 3 vết phát quang màu dưới đèn UV
365 nm và cho màu xanh đen TT.FeCl
3
, trong đó có 1 vết chiếm lượng
lớn , tiến hành kết tinh phân đoạn này nhiều lần trong methanol bằng
cách hòa tan hoàn toàn phân đoạn này trong lượng vừa đủ methanol,
lọc qua phễu thủy tinh xốp. Dung dịch được để trong tủ lạnh, cho bay
hơi dung môi từ từ, lọc và rửa tinh thể methanol lạnh. Tinh thể được
kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng qua 4 hệ dung môi khác nhau ethyl

acetat-nước-acid formic-acetic, Etoac-aceton-(H
2
0) , CHCl
3
-HCOOH-
CH
3
COOH , butyl - nước- acid formic, phát hiện bằng TT. Vanillin-
asulfuric,TT.FeCl
3
, soi UV 365 nm, UV 254 nm. Tinh thể được thu màu
vàng tươi đặt tên là DC2 (450 mg).
 Phân đoạn 4 (2,3g) và phân đoạn 5 (11,6g) khá giống nhau nên
gộp chung, tiến hành kết tinh, cô thu hồi 2 phân đoạn, kiểm tra trên sắc
ký lớp mỏng nhận thấy vết G bị phân hủy thành 2 vết là G và G’ ( có
thể là sự góp mặt ủa acid formicm), Do đó để phân lập chat G thì cần
phải khảo sát lại hệ dung môi khai triển mà không có mặt của acid.
Các phân đoạn còn lại do khối lượng ít và có nhiều vết nên không tiếp
tục nghiên cứu.
Phân đoạn

Chất tinh
khiết
Đặc điểm Khối lượng

(mg)
1 DC1 Vàng chanh

34
2 DC2 Vàng tươi 450

Bảng 3.2 chất tinh chiết thu được từ các phân đoạn cột 1
 Mục đích: Để tiếp tục phân lập chất G hay các flavonoid còn lại
trong cao A2, tiens hành khảo sát lại một số hệ dung môi khai triển
vì có khả năng tách tốt nhất và Rf thích hợp.
 Điều kiện sắc ký
Cột thủy tinh xốp 5 x 30 cm, đã sử lý bằng sulfocromic, rửa
sạch, sấy khô.
 Pha tĩnh: Silica gel 60, cỡ hạt 0.015- 0.04mm, khối lượng
150g.
 Pha động: Ethyl acetat – aceton – H2O (8:1,9:0,1)
 Khối lượng mẫu: 25g cao A2.
 Nạp mẫu: nạp mẫu khô
 Thể tích hứng mỗi phân đoạn là :150 ml
 Kiểm tra các phân đoạn trên bảng sắc ký lớp mỏng tráng sẵn
với hệ dung môi butyl acetat – nước – acid formic (15:5:5), phát
hiện dưới ánh thường,UV 254 nm, UV 365nm, thuốc thử FeCl
3

5%.
 Kết quả: thu được 6 phân đoạn được ghi nhận ở bảng sau:
Phân đoạn

Dung môi

V (ml)

P(g)

Thành phần

1 (1
-5)
Ethyl acetat 100%

750

1.3

Tạp kém phân cực

2 (6
-7) Ethyl acetat- aceton- nước
(8:1,9:0,1)
300

2,2

E F

3 (8
-11)
600

4,7

E F G

4 (12
-19)
1200

5,2


G
5 (20
-43)
35000

4,3


G H
6

MeOH 100%

500

6,2

Tạp phân cực

Lực chọn pha tĩnh
Thông thường, kỹ thuật sắc ký pha đảo với cột C8
hay C18 là sự lựa chon đầu tiên cho sự phân tách các
chất có nguồn gốc tự nhiên và cũng dùng để cô đặc
hoạt chất. Việc lựa chọn loại cột phù hợp với hợp chất
hợp chất quan tâm phụ thuộc nhiều vào điều kiện thí
nghiệm. Do đó, sẽ thật khó khăn nếu thiếu sự hiểu biết

về nhóm hợp chất cần quan tâm. Tuy nhiên, việc chạy
thử với 2 hay 3 điều kiện cột pha đảo khác nhau sẽ
mang lại nhiều lợi ích, cho ta những dữ kiện cơ bản về
nhóm hợp chất quan tâm có thể thăm dò được một điều
kiện phân tách thành công.
Lượng mẫu tiêm vào cột và lượng chất tinh khiết phụ
thược nhiều vào từng yêu cầu nhất định. Khi không áp dụng
kỹ thuật cột quá tải và tiến hành thăm dò điều kiện sắc ký
cho cột điều chế bằng cột phân tích thì lượng mẫu tiêm vào
cột được giới hạn bởi độ hoà tan của mẫu trong dung môi và
khả năng chịu tải của cột.
Với yêu cầu cần một lượng khá lớn chất tinh khiết, cần
thực hiện tiêm mẫu nhiều lần với một lượng mẫu ban đầu
phù hợp để thu đủ lượng chất tinh khiết cần.
Với điều kiện lí tưởng là cột điều chế và cột phân tích
có cùng chiều dài được sản xuất với cùng một kĩ thuật nhồi
cột của cùng một hãng sản xuất,ta có thể phát triển sang
phương pháp điều chế dễ dàng hơn và có thể dự đoán trước
được.
Lựa chọn phương pháp