LÊ ANH HUY-VIRUS HPV VÀ UNG THƯ CỔ TỬ CUNG docx

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
NGÀNH CÔNG NGHỆ HÓA HỌC
    
MÔN VI SINH ĐẠI CƯƠNG
Bài báo cáo:
HUMAN PAPILOMAVIRUS VÀ
UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

GVHD: Vương Thị Việt Hoa
SVTH: Lê Anh Huy 08139101
TP. HCM. Tháng 4 năm 2010


Mục lục:
A. Tổng quan về UTCTC.
1.tình hình UTCTC.
2.khái niệm UTCTC.
B. Các đặc điểm virus HPV.
1. Cấu tạo
2.Cấu trúc bộ gene của HPV
3.protein cua virus HPV và chức năng của nó.
C. Cac giai đoạn phát triển của UTCTC.
D. văcxin cho virus HPV.
1.vacxin Gardas.
2.vacxin cerverix.
3.Các phản ứng có thể xảy ra sau khi chủng ngừa
E.các phương pháp chuẩn đoán phân tử
1. Nghiệm pháp PAP:
2.Xét nghiệm DNA HPV
2.1Phương pháp lai bắt giữ (Hybrid Capture Technology):
2.2Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction )

2.3Phương pháp lai ngược bằng LipA (Reverse Hybridization line Probe
Assay)
2.4Phương pháp khuyếch đại tín hiệu DNA nhánh (bDNA)
2.5 Phương pháp Southern blot
2.6 Phương pháp định lượng bằng Real-time PCR:
A.TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ CỔ TỬ CUNG (UTCTC)
1.Tình hình ung thư cổ tử cung:
Ung thưổ tử cung (UTCTC) là một trong những bệnh ung thưầu và là nguyên
nhân thứ hai gây tử vong cho phụ nữ toàn thế giới .Theo Tổ chức Y Tế Thế Giới
(WHO), năm 2007, số ca mới xấp xỉ 550.000 người và gây tử vong cho khoảng
260.000 bệnh nhân, chủ yếu là các bệnh nhân ở các nước đang phát triển (chiếm 90%).
Hiện nay, theo thống kê, có khoảng 269 triệu phụ nữ trên thế giới nhiễm Human
Papillomavirus (HPV). Tình trạng viêm nhiễm này dẫn đến 440.000 người bị ung thư
ổ tử cung hàng năm. Các vùng khác nhau có có tỉ lệ mắc bệnh khác nhau. Tỉ lệ cao
nhất là vùng Trung và Nam Mỹ, miền Nam và Đông Châu Phi và vùng Caribe, với tỉ lệ
mắc phải ít nhất là 30 ca mới trên 100.000 phụ nữ mỗi năm . Đông Nam Á chiếm tỉ lệ
trung bình với gần 20 ca mới trên 100.000 phụ nữ mỗi năm.
Ở Việt Nam, UTCTC chiếm tỉ lệ 53,5% các loại ung thưở nữ giới. Theo các con số
thống kê ở Hà Nội và TP. HCM 1996 – 1999 tỉ lệ mắc chuẩn theo tuổi tính trên 100000
dân lần lượt là 5,5 và 26,0. Nhưậy tỉ lệ ung thưổ tử cung ở thành phố Hồ Chí Minh
tươối cao nếu đem so sánh với thống kê ở Mỹ (SEER) là 7.5. Theo thống kê năm
2002, hằng năm, số ca mới ung thưổ tử cung tại Việt Nam là hơố ca tử
vong gần 3000. Tỉ lệ mắc bệnh ung thưổ tử cung và nhiễm trùng HPV ở thành phố
Hồ Chí Minh cao gấp 4 lần so với Hà Nội.
2.Khái niệm về ung thư cổ tử cung
a.Ung thư
Ung thưật ngữ dùng để chỉ sự phát triển không kiểm soát và ác tính của các tế
bào. Sự phát triển này dẫn đến sự hình thành khối u. Các khối u này xâm chiếm các
phần xung quanh nó và các phần xa hơơể, phá hoại các mô bình thường và
cạnh tranh về dinh dưỡng và oxy với các mô này. Sự di căn xảy ra khi một nhóm các tế

bào tách ra từ khối u và di chuyển đến các vùng xa hơạch máu, mạch
bạch huyết và bắt đầu hình thành khối u mới tại vị trí ấy.
b.Ung thư cổ tử cung


Hình:tỉ lệ gây bệnh đối với người của virus HPV
Ung thưổ tử cung được gọi tên theo bộ phận cơể mà ung thưất hiện. Ung thư
ổ tử cung còn được phân loại dựa theo loại tế bào mà nó bắt đầu phát triển. Hầu hết
ung thưổ tử cung là ung thưểu mô tế bào vảy. Chúng là những tế bào dẹt, mỏng,
lót bề mặt cổ tử cung.
Khi ung thưới một bộ phận khác của cơể, khối u mới sẽ có cùng một loại tế
bào bất thường và có cùng tên gọi với ung thưưầu). Ví dụ,
nếu ung thưổ tử cung lan đến xươế bào ung thưở xươế bào ung
thưổ tử cung. Bệnh này được gọi là ung thưổ tử cung di căn.
c.Những yếu tố nguy cơ nhiễm bệnh UTCTC:
Nguyên nhân chính gây ra bệnh ung thưổ tử cung là do nhiễm phải một hoặc nhiều
type Human papillomavirus (HPV) có nguy cơ ư!"#$%&
#"ễm thường gây ung thưổ tử cung nhất là type 16 và type 18, chiếm lần
lượt là 70% và 20% các trường hợp bệnh nhân mắc UTCTC. Theo thống kê, số phụ nữ
bị nhiễm HPV phát bệnh thành ung thưổ tử cung chỉ chiếm khoảng 5-10% người
nhiễm HPV. Nhưậy nhiễm HPV là điều kiện cần như chưủ để hình thành
bệnh. Theo các nghiên cứu, bên cạnh HPV cần có thêm sự tươủa các điều kiện
hay yếu tố khác như'hoạt động tình dục, hút thuốc lá, sinh đẻ nhiều lần, sử dụng các
thuốc tránh thai trong một thời gian dài (từ 12 năm trở lên.), hệ miễn dịch yếu hay bị
nhiễm HIV…
Theo hệ thống phân lọai Bethesda 2001, UTCTC được phân chia thành 6 cấp độ:
NILM, ASCUS, ASC-H, LSIL, HSIL, CA.
- NILM (negative for intraepithelial lesion or malignancy): được xếp vào nhóm này
gồm các trường hợp: âm tính đối với các tổn thươểu mô và không ác
tính hoặc các mẫu cho thấy không có các bất thường ở biểu mô.

- ASCUS (Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance): ở giai đoạn này
người ta bắt đầu quan sát được các bất thường của tế bào biểu mô. Đó là những
trường hợp xuất hiện các tế bào vảy không điển hình nhưhưủ cơở để kết
luận có thể dẫn đến loạn sản hay không. Đối với trường hợp này cần phải làm thêm
các chẩn đoán khác để kết luận.
- ASC-H (Atypical squamous cells, cannot exclude an HSIL): tươự ASCUS, như
ế bào vảy trong trường hợp này có khả năng phát triển thành số lượng lớn các tế
bào tổn thươặng ở giai đoạn HSIL.
- SIL mức độ thấp (LSIL): là những thay đổi còn sớm về kích thước, hình dạng, số
lượng tế bào trên bề mặt cổ tử cung. Một số tổn thươức độ thấp có thể tự biến
mất. Tuy nhiên, theo thời gian, một số tổn thường khác có thể phát triển rộng hơ
ặc trở nên bất thường hơạo nên tổn thươức độ cao. Tổn thươ(ền ung
thưức độ thấp có thể gọi là hiện tượng loạn sản nhẹ hoặc hiện tượng tân tạo trong
biểu mô cổ tử cung (CIN 1). Những thay đổi ban đầu nhưậy thường xảy ra ở phụ nữ
từ 25-35 tuổi như)ể xuất hiện ở những nhóm tuổi khác.
- SIL mức độ cao (HSIL): là có một số lượng lớn tế bào có dấu hiệu tiền ung thư%
*ống như+,-ức độ thấp, những thay đổi tiền ung thưỉ liên quan đến những
tế bào trên bề mặt cổ tử cung. Những tế bào này sẽ không trở thành ung thư"
 ấn vào những lớp tế bào sâu hơủa cổ tử cung trong nhiều tháng, có thể trong
nhiều năm. Tổn thươức độ cao còn được gọi là hiện tượng loạn sản mức độ vừa
hoặc nặng (CIN 2và CIN 3) hay ung thưểu mô nông tại chỗ. Chúng thường xuất
hiện nhiều nhất ở những phụ nữ trong độ tuổi từ 30-40 như)ể xảy ra ở
những độ tuổi khác.
- Ung thư cổ tử cung xâm lấn (CA-invasive carcinoma): Khi những tế bào bất
thường lan sâu hơổ tử cung hoặc tới các mô khác hay những cơ"
ệnh được gọi là ung thưổ tử cung hay ung thưổ tử cung thể xâm lấn.
B. CÁC ĐẶC ĐIỂM CỦA HPV:
1.Cấu tạo:
Human Papillomavirus (HPV) có vật liệu di truyền là DNA, thuộc họ Papovaviridae,
gây bệnh ở người. HPV có đường kính khoảng 55nm chứa DNA dạng vòng, mạch đôi,

liên kết với protein giống histone. Vỏ capsid được tạo thành từ 72 đơị capsomere,
mỗi đơị là một pentamer của protein cấu trúc L1 và L2.
Hình 1: Hình dạng Human papillomavirus
2.Cấu trúc bộ gene của HPV:
Bộ gene virus có 7200-8000 cặp base, chứa 8 khung đọc mở (Open reading frame-
ORF). Tất cả các type HPV đều có cấu trúc bộ gene tươự nhau và thường chỉ có
một mạch được dùng để phiên mã, do đó sự phiên mã xảy ra theo một chiều duy nhất.
Bộ gene papillomavirus có thể chia ra làm ba vùng:
- Vùng điều hòa dài (Long control region-LCR): chiếm khoảng 10% bộ gene, có độ dài
từ 800-1000 cặp base tùy theo từng type HPV. Sự điều hòa biểu hiện của các gene cần
cho sự tồn tại của virus nhưự phiên mã và hoạt động của chu trình tan xảy ra chủ yếu
ở vùng này. Vùng LCR có chứa vùng trình tự tín hiệu kết thúc và polyadenyl hóa của
các gene phiên mã muộn L1, L2; trình tự enhancer là vị trí gắn của nhiều nhân tố phiên
mã khác nhau như./!0120304520660##7 và promoter cần cho
sự phiên mã RNA của virus, gọi là P97 ở HPV 16 và P105 ở HPV 18.
- Vùng gene sớm (Early – E) bao gồm các khung đọc mở của các gene E1, E2, E4, E5,
E6 và E7 cần cho sự sao chép và khả năng gây bệnh của virus. Gene E6 và E7 được
xem là nguyên nhân chính dẫn đến tính bất tử và mức độ ác tính của các tế bào ung thư
ổ tử cung.
- Vùng gene muộn (Late- L) gồm hai gene L1 và L2 mã hóa cho các protein cấu trúc
tạo nên vỏ capsid của virus. Hiệu quả lâm sàng của vắc-xin có ý nghĩa gì?
Hình 2: Sơồ cấu trúc bộ gene của HPV
3.Protein của virus HPV và chức năng của nó
- Protein E1 và E2 :cần thiết cho quá trình sao chép của HPV. Chúng được bảo tồn cao
trong tất cả các type của HPV.
- Protein E4 : có thể thúc đẩy quá trình sao chép DNA của HPV và điều hòa hoạt động
của virus ở giai đoạn trễ trong chu trình xâm nhiễm của HPV.
- Protein E5 quan trọng trong giai đoạn đầu của sự xâm nhiễm, có vai trò trong việc
ngăn chặn sự chết theo chươủa các tế bào có DNA hưỏng.
- Protein E6: có khả năng gắn với protein ức chế khối u p53. p53 là một protein gắn

DNA được biểu hiện để đáp ứng lại với sự sai hỏng của DNA. Kết quả của đáp ứng
này dẫn tới việc ngừng chu trình phân bào hoặc dẫn tới apotosis. Ngòai ra, protein E6
còn hoạt hóa telomerase – một enzyme có vai trò trong việc kéo dài telomere ở đầu mút
các nhiễm sắc thể. Protein E6 có khả năng tác động đến quá trình kiểm soát sự sao chép
của tế bào, sự phân cực của tế bào cũng như8nh bám dính của tế bào.
- Protein E7: cũng là một oncoprotein của HPV, tác động làm tăng bất thường sự sao
chép DNA của HPV. Protein E7 đóng vai trò quan trọng đối với tiến trình dẫn tới ung
thưổ tử cung và quá trình sinh bệnh của virus.
- Protein L1và L2: protein L1 có khả năng tự hình thành vỏ capsid còn protein L2 liên
quan đến sự gắn DNA và ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình đóng gói thành các
virion.
C. Các giai đoạn phát triển của ung thư cổ tử cung
Giai đoạn 1 là bị nhiễm HPV. Như nói trên phần lớn ung thư cổ tử cung là do nhiễm
HPV, nhưng không phải bất cứ ai bị nhiễm HPV đều có ung thư! Trong thực tế, ở độ tuổi
đôi mươi (hay khi mới có quan hệ tình dục), có khoảng 60% đến 80% phụ nữ bị nhiễm
HPV; nhưng sau 12 tháng, 70% trong số này không còn bị nhiễm nữa, và sau 24 tháng
chỉ còn 9% tiếp tục bị nhiễm HPV.
Sau khi bị nhiễm HPV, một trong ba tình huống lâm sàng sẽ xảy ra: hoặc là virút chỉ thụ
động (tức là chỉ có mặt trong tế bào nhưng không gây tác hại); hoặc là virút sẽ gây nên
một vài bệnh liên quan đến cổ tử cung; hoặc virút sẽ tiến triển và làm hại tế bào gây tên
tình trạng “tiền ung thư”.
Giai đoạn 2 là tiền ung thư. Phụ nữ nằm trong tình trạng này vẫn bình thường, và vẫn
chưa thể gọi là mắc bệnh “ung thư”. Đây chính là giai đoạn mà y khoa muốn nhận bệnh
và ngăn ngừa bệnh trước khi tế bào phát triển thành ung thư. Chỉ có khoảng 10% phụ nữ
bị nhiễm HPV (giai đoạn 1) trở thành tiền ung thư. Phần lớn những phụ nữ bị tiền ung
thư thường ở độ tuổi 25 đến 29. Nói cách khác, thời gian từ khi bị nhiễm HPV đến tiền
ung thư kéo dài từ 5 đến 10 năm. Khoảng 1 phần 3 trường hợp trong giai đoạn này sẽ
không phát triển thành ung thư, nhưng khoảng 12% sẽ phát triển thành ung thư chưa di
căn (giai đoạn 3)
Giai đoạn 3 là ung thư chưa/không di căn (thuật ngữ y khoa gọi là carcinoma in-situ). Ở

giai đoạn này, tế bào có dấu hiệu ung thư nhưng chỉ giới hạn trong cổ tử cung, và do đó
điều trị có thể đem lại kết quả khả quan. Một số trường hợp ung thư cổ tử cung ở giai
đoạn này cũng không phát triển thêm, và một số trường hợp thì bệnh tự nhiên biến mất!
Giai đoạn sau cùng là ung thư di căn, tức là tế bào ung thư xâm lấn sang các cơ phận
khác, và đây chính là giai đoạn nguy hiểm nhất của bệnh. Nhưng chỉ khoảng 1% trường
hợp từ giai đoạn 2 phát triển thành loại ung thư nguy hiểm ở giai đoạn cuối này. Phần
lớn phụ nữ mắc bệnh trong giai đoạn này là 50 tuổi trở lên, tức sau thời kì mãn kinh.
Không phải bệnh nhân nào cũng tiến triển từ giai đoạn 1 đến giai đoạn 4. Trong thực tế,
có nhiều trường hợp ung thư ở giai đoạn 2 và 3 tự nhiên dừng lại và không còn biểu hiện
ung thư nữa. Ngay cả quá trình hình thành và phát triển ung thư thường biến chuyển với
tốc độ khác nhau, tùy thuộc vào hệ thống miễn dịch có đủ mạnh hay không. Do đó, danh
từ “ung thư” trong thực tế bao gồm một số thực thể được “tiến hóa” bằng nhiều cách
khác nhau.
D. vacxin cho virus HPV
Hinh:vacxin HPV và tiem phòng bệnh
Hiện nay, đã có hai loại vắcxin (Gardasil và Cervarix) được phát triển và có hiệu quả
giảm nguy cơ nhiễm virút HPV týp 16, 18, 11 và 6. Kểt quả các nghiên cứu lâm sàng
cho thấy ở những phụ nữ tuổi từ 15 đến 26, cả hai vắcxin đều có hiệu quả ngăn ngừa
nhiễm HPV (hay tiền ung thư) từ 98% đến 100%.
Tuy nhiên, một điều quan trọng cần phải nhấn mạnh là hiệu quả 98-100% không có nghĩa
là vắcxin ngăn ngừa 98% đến 100% ca ung thư cổ tử cung. Để hiểu được phát biểu đó,
cần phải điểm qua 4 giai đoạn phát triển của một tế bào bình thường đến tế bào ung thư
như sau:
1.Vắc-xin Gardasil
Bệnh ung thư cổ tử cung (UTCTC) có thể chữa khỏi hoàn toàn, người bệnh vẫn có khả
năng sinh con, có chất lượng cuộc sống tốt nếu phát hiện, điều trị ở giai đoạn sớm (giai
đoạn loạn sản). Vắc xin ngừa ung thư cổ tử cung có thể sử dụng cho các bé gái từ 9 tuổi
trở lên, với ba liều vắc xin tiêm trong 6 tháng. Đây là loại vắc xin rất có hiệu quả trong
việc dự phòng ung thư cổ tử cung do vi rút Human Papiloma Vi rút (vi rút HPV) gây ra,
đặc biệt tiêm cho trẻ em gái trước tuổi có quan hệ tình dục và với 3 mũi vắc xin khả năng

phòng ngừa ung thư cổ tử cung đạt tới 98%. Các nghiên cứu từ nước ngoài cho biết, vắc-
xin này có thể ngăn ngừa một số bệnh gây nên bởi HPV: mụn cóc sinh dục, ung thư âm
hộ, âm đạo… Vắc xin này có hiệu lực ít nhất trong năm năm và có thể kéo dài lâu hơn.
Thuốc chủng ngừa HPV Gardasil bảo vệ chống lại 2 loại Siêu Vi Khuẩn Human
Papillomaviruses gây ra phần lớn các bệnh ung thư cổ tử cung. Thuốc chủng này cũng
bảo vệ chống lại 2 loại HPV gây ra phần lớn mụn cóc ở bộ phận sinh dục. Thuốc này
được chủng thành một loạt 3 mũi trong 6 tháng.
Gardasil giúp ngừa 2 tuýp virus HPV gây ung thư là HPV16, HPV18 và 2 tuýp gây mụn
cóc.Ung thư cổ tử cung hiện đã được triển khai trên hơn 100 nước. Một số nước phát
triển như Anh, Pháp, Australia đã đưa nó vào chương trình tiêm chủng quốc gia, tiêm
miễn phí cho các em gái độ tuổi 9 den 26, tiêm văcxin ung thư cổ tử cung sẽ giúp phụ nữ
phòng ngừa được những lần nhiễm HPV sau này, bao gồm cả các type gây ung thư.
2.vacxin cervarix
Loại vắc xin Cervarix có tác dụng phòng ngừa vi rút HPV gây ung thư cổ tử cung tuýp 16
và 18. Đây là hai tuýp gây ra hơn 70% các ca ung thư cổ tử cung. Vì thế, ở lứa tuổi đã có
quan hệ tình dục, đặc biệt lứa tuổi trung niên (đối tượng có nguy cơ mắc ung thư cổ tử
cung cao nhất) cần được tiêm phòng để bảo phong benh. Việt nam đã chính thức cấp
phép lưu hành vắc xin Cervarix. Đâ là loại vắc xin có thể tiêm phòng ngừa ung thư cổ tử
cung cho phụ nữ tuổi từ 10 đến 55 tuổi.
3.Các phản ứng có thể xảy ra sau khi chủng ngừa
Các phản ứng thông thường có thể là đau, tấy đỏ và sưng ở cánh tay chỗ chích ngừa,
nhức đầu và sốt. Đối với bất cứ loại thuốc chủng nào, có thể xảy ra phản ứng vì dị ứng
tuy rất hiếm khi xảy ra. Phản ứng này có thể gồm phát ban, khó thở, hoặc sưng cổ họng,
lưỡi, môi hoặc mắt.
E. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐÓAN PHÂN TỬ:
1. Nghiệm pháp PAP:
Hay còn gọi là phết tế bào âm đạo - cổ tử cung. Đây là xét nghiệm
đơn giản, rẻ tiền, không gây tác động trên người được làm, dễ áp dụng
đại trà do đó, xét nghiệm này được dùng như công cụ trong tầm soát
bệnh. Nghiệm pháp PAP là một phương pháp tế bào học. Trong nghiệm pháp PAP, bác

sĩ thường dùng một que quấn bông chuyên dụng phết ở cổ tử cung và các vùng quanh để
thu lấy một lớp tế bào, sau đó tế bào trên que phết sẽ được quét lên một tấm kính mỏng
và soi dưới kính hiển vi. Nghiệm pháp PAP có thể cho thấy những bất thường trong tế
bào ở cổ tử cung, các dấu hiệu tổn thương ban đầu ở mức độ thấp hoặc cao với ưu điểm
lớn là có tỉ lệ dương tính giả rất thấp.
Tuy nhiên, nghiệm pháp Pap lại có độ nhạy khá thấp, tỉ lệ âm tính giả của phương pháp
rất cao, từ 10 – 50%.
Hình:qui trình nghiệm pháp PAP
2.Xét nghiệm DNA HPV:
Nếu như nghiệm pháp PAP phát hiện một cách gián tiếp HPV thông qua những biến
đổi về mặt tế bào học mà chúng tạo ra thì xét nghiệm DNA HPV phát hiện trực tiếp DNA
của virus. Một số phương pháp phát hiện DNA HPV đã và đang được sử dụng, bao gồm :
- Phương pháp lai bắt giữ (Hybrid Capture Technology)
- Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction )
- Phương pháp lai ngược bằng LipA (Reverse Hybridization line Probe Assay)
- Phương pháp khuyếch đại tín hiệu DNA nhánh (bDNA).
- Phương pháp Southern blot.
- Phương pháp định lượng bằng Real-time PCR.
Ngòai ra, có thể sử dụng phưong pháp microarray hoặc giải trình tự gene, nhưng hai
phương pháp này rất đắt tiền nên hiếm được sử dụng.
2.1Phương pháp lai bắt giữ (Hybrid Capture Technology):
Nguyên tắc: Phương pháp xét nghiệm được thực hiện trên điã 96 giếng, gồm có
chứng dương và chứng âm. Đây là xét nhiệm lai trên pha lỏng nhằm phát hiện 13 type có
nguy cơ cao (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 và 68). Phương pháp này dựa
trên sự hình thành phân tử lai giữa mẩu dò RNA và DNA virus biến tính. Phức hợp lai
DNA-RNA được tách khỏi dung dịch bằng cách gắn với kháng thể kháng DNA-RNA cố
định trên giá thể (giếng). Sau đó, một kháng thể thứ cấp kháng kháng thể DNA-RNA có
một đầu gắn alkaline phosphatase được cho vào giếng, và phát hiện bằng cách sử dụng cơ
chất phát quang. Ánh sáng phát ra được ghi nhận thành từng đơn vị ánh sáng (RLU) bởi
một máy đo ánh sáng phát quang và tỉ lệ với lượng DNA đích. Mẫu có RLU >1 được coi

là dương tính cho các lọai HPV “nguy cơ cao”. Do đó, ngoài việc phát hiện DNA của
HPV, phương pháp này còn có thể sử dụng để định lượng một cách tương đối DNA HPV
trong mẫu bệnh phẩm.
Ưu điểm: độ nhạy cao.
Nhược điểm: tốn thời gian, không xác định chính xác type virus nguy cơ cao gây
UTCTC vì các RNA mẫu dò phát hiện chung các type nguy cơ cao nên phương pháp này
chỉ cho phép phát hiện sự hiện diện của DNA các HPV thuộc nhóm nguy cơ cao mà
không phân biệt giữa các type.
2.2Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction ):
Nguyên tắc: nhân bản trình tự đích sau đó phân tích bằng điện di, giải trình tự,
Nhiều cặp mồi đã được thiết kế và sử dụng trong chẩn đoán phân tử bằng PCR. Các
cặp mồi dùng cho mục đích định tính thường được thiết kế để nhân bản đoạn trình tự
bảo tồn cao ở vùng gene L1 như: MY09/11, PGMY09/11, GP5+/GP6+, và SPF10. Các
cặp mồi dùng cho mục đích phân type lại thường được thiết kế để nhân bản các trình
tự ở vùng gene E6/E7- vùng gene tương đối biến động giữa các type HPV.
Ưu điểm: độ nhạy rất cao.
Nhược điểm: chỉ phát hiện DNA HPV trong những mẫu có lượng DNA HPV chỉ từ
10-100 bản sao. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp không ổn định, nó phụ
thuộc nhiều vào các primer, kích thước của sản phẩm PCR, điều kiện phản ứng, khả
năng phát hiện các type khác nhau,… Vì đây là phương pháp có độ nhạy cao nên có
thể xảy ra trường hợp dương tính giả do ngoại nhiễm. Vì các nhược điểm trên nên
phương pháp này vẫn chưa được FDA cho phép sử dụng.
2.3 Phương pháp lai ngược bằng LipA (Reverse Hybridization line Probe Assay):
Nguyên tắc: Đây là phương pháp kết hợp giữa PCR và lai phân tử. Trong phương
pháp này, một đoạn gene có trình tự bảo tồn cao nằm trong vùng L1 sẽ được nhân bản.
Tiếp đó, sản phẩm PCR sẽ được biến tính và lai với các probe đặc hiệu cho từng type.
Phản ứng lai xảy ra trong các giếng có phủ streptavidin. Primer dùng cho PCR có một
đầu gắn biotin-chất liên kết bổ sung với streptavidin và do đó sản phẩm PCR thu được
sẽ có gắn biotin ở một đầu. Probe đặc hiệu cho từng type thì được đánh dấu DIG
(Digoxigenin). Quá trình rửa sẽ loại bỏ những thành phần không cần thiết. Riêng sản

phẩm lai được giữ lại trong giếng và được phát hiện bằng cách lần lượt bổ sung phức
hợp anti-DIG Alkaline phosphatase và cơ chất phản ứng. Màu của phản ứng sẽ được
đo bằng OD ở bước sóng 450nm.
Ưu điểm: độ nhạy rất cao.
2.4Phương pháp khuyếch đại tín hiệu DNA nhánh (bDNA):
Nguyên tắc: Cố định tế bào lên đĩa. Cho các mẫu dò mục tiêu vào. Tiếp đến, probe
đánh dấu enzyme và cơ chất phát quang hóa học được cho vào. Việc gia tăng cường độ
tín hiệu thu được nhờ phân tử bDNA có chứa vị trí gắn alkalin phosphatase nối với
probe đánh dấu, alkaline phosphatase giúp kích họat cơ chất phát quang hóa học. Cuối
cùng lượng DNA trong mỗi mẫu được định lượng với một đường chuẩn xây dựng
bằng những lượng đã biết DNA HPV.
Ưu điểm: giúp định lượng HPV trực tiếp từ mẫu lâm sàng. Do không cần
khuyếch đại mẫu nên giảm thiểu được nguy cơ ngọai nhiễm.
Nhược điểm: độ nhạy thấp, đòi hỏi 1 lượng tế bào lớn, thời gian xử lý mẫu lâu.
2.5 Phương pháp Southern blot:
Nguyên tắc: Phương pháp này cho phép xác định được sự có mặt của các đoạn
trình tự nucleotide trên một đoạn DNA nào đó trong hỗn hợp có nhiều đoạn DNA khác
nhau. Các đọan DNA mạch đơn được đặt trên màng lai, dựa trên sự bắt cặp bổ sung
của mẫu dò (DNA probe) đã được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ ( P32) với đoạn
DNA có chứa trình tự bổ sung với mẫu dò đó hoặc dựa trên phản ứng tạo màu. Xác
định vị trí lai nhờ kĩ thuật phóng xạ tự ghi. Nơi xảy ra phản ứng lai sẽ phát quang và
chụp được nhờ phim X quang. Nơi phát quang sẽ thể hiện là vệt đen sau khi rửa phim
X quang, và đó là vị trí lai DNA.
Ưu điểm: đơn giản và hiệu quả.
2.6 Phương pháp định lượng bằng Real-time PCR:
Nguyên tắc chung: Real-Time PCR là một phản ứng động cho phép phát hiện
được lượng sản phẩm PCR tại mỗi chu kỳ của quá trình khuyếch đại, dựa trên cường
độ huỳnh quang phát ra tỷ lệ với hàm lượng sản phẩm PCR. Thông qua đó, việc đo
lượng huỳnh quang phát ra trong mỗi chu kỳ nhân bản sẽ giúp tính tóan được số lượng
bản sao trình tự mục tiêu ban đầu. Sản phẩm PCR có thể được phát hiện nhờ vào thuốc

nhuộm hùynh quang gắn vào DNA mạch đôi hay các probe được đánh dấu huỳnh
quang bắt cặp với những trình tự mục tiêu. Real-time PCR có thể phân tích kết quả
phản ứng PCR mà không cần bước điện di trên gel. Ngòai ra, kết quả thông qua tín
hiệu huỳnh quang phát ra theo thời gian tại mỗi chu kỳ phản ứng PCR sẽ được phân
tích bằng máy tính.
Real-time PCR có thể phân biệt những trình tự rất tương tự nhau bằng cách
khuếch đại theo nhiệt độ melting DNA nhất định. Do melting curve của DNA phụ
thuộc vào trình tự, độ dài và lượng GC nên các sản phẩm PCR có thể được phân biệt
bằng melting curves. Việc xác định melting curve được tiến hành tự động ở mỗi mẫu
sau khi khuếch đại mà không cần phải mở phản ứng ra.
Hệ thống Real-time PCR LightCycler của Roche được sử dụng nhiều hiện nay có
một số ưu điểm chính như:
- Sử dụng bộ phận gia nhiệt bằng luồng khí nóng => nhanh hơn so với gia nhiệt block
như các máy PCR thường (40 vòng trong 25’).
- Có thể áp dụng Hibridization probe assay. Đây là một ưu điểm cực lớn.
- Sử dụng ống mao quản (capilary) để chạy mẫu, có nắp đóng kín nên giảm được nguy
cơ nhiễm. Việc sử dụng ống mao dẫn tốt làm bằng thủy tinh borosilicate cũng giúp
việc truyền nhiệt hiệu quả hơn. Các ống mao dẫn hoạt động như những ống dẫn viba
giúp cho tăng hiệu quả xác định hàm lượng hùynh quang và thúc đẩy hiệu quả của quá
trình khuếch đại.
- Tự động tính toán Threshold cycle.
Hình:qui trình PCR
a) SYBGREEN I:
- SYBR Green I gắn vào tất cả phân tử DNA mạch đôi, phát ra tín hiệu huỳnh quang
tại bước sóng xác định, sự tắt huỳnh quang và phát huỳnh quang tối đa của SYBR
Green I là ở 494 nm và 521 nm. Sự phát hiện xảy ra trong bước kéo dài của real-time
PCR. Cường độ của tín hiệu gia tăng cùng với sự gia tăng số lượng DNA mạch đôi.
Trong quá trình gây biến tinh sản phẩm, SYBR Green I tách ra làm cường độ tín hiệu
huỳnh quang giảm xuống nhanh chóng.
b) Các mẫu dò đặc hiệu đánh dấu hùynh quang:

- Mẫu dò Taqman: là mẫu dò được ứng dụng rộng rãi trong sinh học phân tử. Taqman
probe là một mẫu dò oligonucleotide bắt cặp đặc hiệu với một trình tự bên trong DNA,
cDNA hay plasmid mục tiêu. Taqman probe có một nhóm phát tín hiệu hùynh quang ở
đầu 5’ và một nhóm dập tắt hùynh quang ở đầu 3’. Trong suốt pha bắt cặp/kéo dài của
phản ứng PCR, mẫu dò bị cắt bởi họat tính 5’  3’exonuclease của Taq DNA
polymerase, nhờ đó giúp tách rời reporter và quencher nên tín hiệu hùynh quang được
phát ra đồng thời với việc hình thành một sản phẩm PCR mới. Điều này cho thấy
lượng hùynh quang đo được tỷ lệ với lượng sản phẩm PCR tích lũy sau mỗi chu kỳ.
- Mẫu dò FRET: là mẫu dò truyền dẫn bước sóng hùynh quang. Hệ thống này dung hai
mẫu dò và hai mồi.
- Phân tử phát tín hiệu: là một mẫu dò kép với một đầu reporter gắn vào đầu 5’ và đầu
quencher gắn vào đầu 3’. Mẫu dò được thiết kế sao cho hai đầu bắt cặp bổ sung với
nhau.
Ưu điểm: Real-time PCR cho phép định lượng chính xác lượng DNA, cDNA, RNA
mục tiêu ban đầu, độ nhạy rất cao, tránh được hiện tượng ngọai nhiễm, thời gian nhanh
chóng, không tốn nhiều công sức.
TÀTÀI L
THAM KHẢO
1. Detection of human papillomavirus in vulval carcinoma using semi-nested
PCR and restriction enzyme typing: a rapid and sensitive technique. N H
Cartwright, L J Sant Cassia, A J Easton, A G Morris. J Clin Pathol: Mol Pathol
1996; 49:M236-M239.
2. Molecular diagnosis of human papillomavirus (HPV) infections. Anco Molijn,
Berhard Kleter, Wim Quint, Leen-Jan van Doorn. Journal of Clinical Virology 32S
(2005) S43–S51.
3. Rapid real time PCR to distinguish between high risk human papillomavirus
types 16 and 18. H A Cubie, A L Seagar, E McGoogan, J Whitehead, A Brass,M J
Arends,M W Whitley. J Clin Pathol: Mol Pathol 2001;54:24–29.
4. The use of real-time PCR and fluorogenic probes for rapid and accurate
genotyping of newborn mice. H. J. Hnatyszyn, E. R. Podack, A. K. Young, R.

Seivright, G. Spruill and G. Kraus. Molecular and Cellular Probes (2001) 15,
169–175.
5. Xây dựng quy trình định lượng cytomegalovirus bằng kỹ thuật Real-time
PCR với mẫu dò Taqman. Nguyễn Đức Huy. Khóa luận cử nhân khoa học,
nghành Sinh học, chuyên nghành Công nghệ Sinh học Y dược khóa 2003-2007.