tách dòng gen

CÁC KỸ THUẬT NGHIÊN
CÁC KỸ THUẬT NGHIÊN
CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ
CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ
I.
I.
Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái
Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái
tổ
tổ


hợp)
hợp)
II. Nghiên cứu gen tách dòng
II. Nghiên cứu gen tách dòng
III. Kỹ thuật PCR
III. Kỹ thuật PCR

I.
I.
Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái tổ
Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái tổ
hợp)
hợp)

A. Khái niệm


B. Enzym giới hạn

C. Vector tách dòng

A. Khái niệm
A. Khái niệm
-
Tách dòng gen là quá trình phân lập một gen
→ véctơ tách dòng → tế bào chủ để nhân lên
thành nhiều bản sao.
-
Để tách dòng gen cần:
-
+ ADN (gen) cần tách dòng
-
+ Enzym giới hạn
-
+ Vector tách dòng
-
+ Thể nhận (vi khuẩn)
-
+ Các enzym khác (Các E. làm đứt gãy liên
kết phosphodieste, nối ADN, E. bảo vệ, giãn
xắn, đóng xoắn ADN )


B. Enzym giới hạn:
B. Enzym giới hạn:
Phát hiện

Phát hiện
enzym giới hạn
enzym giới hạn

Hiện tượng giới hạn và sửa đổi:
-
Hiện tượng giới hạn vật chủ: Phagơ sinh
trưởng ở vật chủ này không có khả năng
sinh trưởng trên vật chủ khác dù đó đã
từng là vật chủ của nó.
-
Cơ chế: Hai loại enzym tham gia vào quá
trình này: Enzym giới hạn cắt ADN ngoại
lai ở những vị trí xác định và enzym giới
hạn sửa đổi ADN ngoại lai (methyl hóa
ADN ở những vị trí xác định) để sửa đổi
nó phù hợp vật chủ mới.

B. Enzym giới hạn
B. Enzym giới hạn

Các enzym giới hạn có hai đặc tính:

Không cắt các liên kết phophodieste ở
đầu tận cùng, thay vào đó là cắt bên
trong phân tử ADN.

Chỉ cắt khi nhận ra các trình tự đặc thù,
thường gồm 4 – 8 nucleotit, tạo ra các
đoạn ADN có đầu dính (bổ trợ) hoặc đầu

bằng.

Ví dụ: Eco RI thường
cắt ở trình tự đọc
theo chiều xuôi –
ngược như nhau.

Một số enzym giới hạn và tính chất
Một số enzym giới hạn và tính chất
Tên enzym
Tên enzym
Nguồn vi khuẩn
Nguồn vi khuẩn
Trình tự nhận biết
Trình tự nhận biết
trên ADN
trên ADN
Số
Số
nucleotit
nucleotit
của đoạn
của đoạn
trình tự
trình tự
nhận biết
nhận biết
Cắt đầu dính:
Cắt đầu dính:
Sau

Sau
3A
3A
Eco
Eco
RI
RI
Bam
Bam
HI
HI
Not
Not
I
I
Sac
Sac
I
I
Hae
Hae
III
III
Staphilococus aureus 3A
Staphilococus aureus 3A
Escherichia coli
Escherichia coli
Bacillus amiloliquefaciens
Bacillus amiloliquefaciens
Norcadio otitidis-caviarum

Norcadio otitidis-caviarum
Streptomyces
Streptomyces
achromogenes
achromogenes
Haemophilus aegyptius
Haemophilus aegyptius
5’-
5’-
↓
↓
GATC- 3’
GATC- 3’
3’- CTAG
3’- CTAG
↑
↑
-5’
-5’
5’-G
5’-G
↓
↓
AATT C-3’
AATT C-3’
3’-C TTAA
3’-C TTAA
↑
↑
G-5’

G-5’
5’-G
5’-G
↓
↓
GATC C-3’
GATC C-3’
3’-C CTAG
3’-C CTAG
↑
↑
G-5’
G-5’
5’-G
5’-G
↓
↓
CGGCCG C-3’
CGGCCG C-3’
3’-C GCCGGC
3’-C GCCGGC
↑
↑
G-5’
G-5’
5’-G AGCT
5’-G AGCT
↓
↓
C-3’

C-3’
3’-C
3’-C
↑
↑
TCGA G-5’
TCGA G-5’
5’-G CGT
5’-G CGT
↓
↓
C-3’
C-3’
3’-C
3’-C
↑
↑
GC G-5’
GC G-5’
4
4
6
6
6
6
8
8
6
6
4

4
Cắt đầu bằng
Cắt đầu bằng
Hpa
Hpa
I
I
Sca
Sca
I
I
Haemophilus
Haemophilus
paraipluenzae
paraipluenzae
Streptomyces caespitosus
Streptomyces caespitosus
5’-GTT
5’-GTT
↓
↓
AAC-3’
AAC-3’
3’-CAA
3’-CAA
↑
↑
TTG-5’
TTG-5’
5’-AGT

5’-AGT
↓
↓
ACT-3’
ACT-3’
3’-TCA
3’-TCA
↑
↑
TGA-5’
TGA-5’
6
6
6
6

C. Vector tách dòng: Đặc điểm
C. Vector tách dòng: Đặc điểm
1. Phải có trình tự khởi
đầu sao chép để có
khả năng tự sao chép
trong tế bào chủ.
2. Có thể nhận biết nhờ
các gen chỉ thị/hoặc
gen đánh dấu (phải
có dấu chuẩn chọn
lọc).
3. Có vị trí gắn phân tử
ADN ngoại lai (vị trí
đa tách dòng –

Multicloning site /
MCS).

Vị trí đa tách dòng
Vị trí đa tách dòng

VÉCTƠ PLASMID
- Kích thước 1 – 200
kb, sợi kép, vòng.
- pBR332 do Bolivar
và Rodiguez
(1977) thiết kế, có
21 điểm cắt cho
các enzym giới
hạn, cho phép
mang đoạn ADN
cài đến 6 kb.

VÉCTƠ PLASMID pUC
* Nhóm pUC là nhóm
véctơ plasmid
thuộc thế hệ thứ
3.
* Chứa cả điểm khởi
đầu sao chép của
phage M13.
* Thường mang dấu
chuẩn là Amp
r
và

LacZ.

Sàng lọc xanh-trắng
Sàng lọc xanh-trắng

pUC mang gen LacZ
trong vùng điều hòa
ngược dòng. Khi ADN
ngoại lai xen vào điểm
cắt gới hạn, nó phá vỡ
khung đọc của gen β-
galactosidase, làm
cho vi khuẩn không
tổng hợp được enzym
này để phân hủy cơ
chất 5-bromo-4-
chloro-3-indodyl-β-
galactosidase (gọi tắt
là X-gal) làm cho cơ
chất có mầu trắng
(khuẩn lạc trắng).

VÉCTƠ PLASMID
Ưu điểm
- Cấu trúc đơn giản, kích thước nhỏ.
- Dễ tinh sạch, dễ phân tích đoạn tái tổ hợp.
- Có thể nhân lên với số lượng lớn, tốc độ nhanh.
Nhược điểm
- Đôi khi, hiệu suất biến nạp vào tế bào chủ thấp.
- Không hiệu quả khi biến nạp ở eukaryote.

- Không tách dòng được các phân đoạn ADN kích
thước lớn (> 10 kb).

VÉCTƠ PHAGE

Phần lớn xuất phát từ
phage λ: phần trung tâm
hệ gen phage λ mang các
gen liên quan đến quá
trình gây tan vật chủ bị
thay bằng ADN ngoại lai.

Kích thước khoảng 48,5 kb.

Có thể mang các đoạn ADN
cài đến ~20 kb. (virut có
thể đóng gói ADN đến 40-
50 kb)

Khả năng xâm nhập tế bào
chủ nhanh. Có thể tách
dòng ở cả prokaryote và
eukaryote.

VÉCTƠ PHAGE
Ưu điểm:
-
Khả năng xâm nhập tế bào chủ nhanh. Có thể
tách dòng ở cả prokaryote và eukaryote.
- Có thể mang các đoạn cài đến ~ 20 kb.

- Dễ bảo quản do các hạt virut bền ở t
o
lạnh (vd.
4
o
C).
Nhược điểm:
- Kích thước lớn hơn plasmid, nên phân tích phức
tạp hơn.
- Số bản sao phage hình thành trong mỗi tế bào
thấp hơn số bản sao của plasmid.

VÉCTƠ COSMID
- Là véctơ lai của
plasmid và phage λ,
mang các ưu điểm của
hai véctơ này: (1) khả
năng tự tái bản số
lượng lớn của plasmid,
(2) có khả năng đóng
gói in-vitro như phage
- Có khả năng mang các
đoạn ADN cài có kích
thước đến 35 – 45 kb.

VÉCTƠ COSMID

VÉCTƠ CON THOI
- Các véctơ plasmid, phage
và cosmid cần các trình tự

khởi đầu sao chép khác
nhau tùy theo từng loại tế
bào chủ (trừ E. coli)
- Các véctơ con thoi có thể
sao chép trong cả E. coli
cũng như những tế bào
khác, chẳng hạn ở
eukaryote
- Các véctơ con thoi đặc biệt
có hiệu quả khi nghiên cứu
đặc tính các gen đồng thời
ở prokaryote (vd. E. coli)
và eukaryote (vd.
Saccharomyces cerevisiae)

NHIỄM SẮC THỂ NẤM MEN NHÂN TẠO (YAC)
Để có thể tách dòng các phân đoạn gen kích thước lớn
ở sinh vật nhân chuẩn có kích thước > 35-45 kb (vd.
gen dystrophin ở người có kích thước đến 2000kb), các
nhà nghiên cứu đã phát triển được véctơ nhiễm sắc thể
nấm men nhân tạo có thể mang các đoạn cài ADN dài
từ 200 đến 500 kb. Véctơ này được tạo ra từ nhiễm sắc
thể nhỏ của nấm men được cải tiến di truyền.

NHIỄM SẮC THỂ VI KHUẨN NHÂN TẠO (BAC)
- Về cơ bản giống với nhiễm sắc
thể nấm men nhân tạo nhưng
được tạo ra từ nhân tố giới tính
F. Giống với YAC, BAC có thể
mang các đoạn cài lớn, nhưng

ngoài ra có khả năng sao chép
trong E. coli giống như các
véctơ plasmid, λ, cosmid.
- Vi khuẩn A. Tumefaciens - loại vi
khuẩn lây nhiễm chủ yếu thực vật
hai lá mầm (như cà chua, thuốc
lá, đậu ) nhưng gần đây được
biết chúng cũng lây nhiễm cả
thực vật một lá mầm, lúa – có
chứa plasmid Ti dài 200 kb
(plasmid sinh khối u). Khi lây
nhiễm, một phần của plasmid
Ti (là T-ADN) được lồng ghép
vào ADN nhiễm sắc thể của cây
làm cho các tế bào thực vật
sinh trưởng không kiểm soát
được, tạo thành khối u.

Các bước chính để tách dòng
Các bước chính để tách dòng
gen
gen

Phân lập gen: Tách ADN tổng số → cắt bằng
enzym giới hạn thích hợp ở hai đầu (thường
dùng chung với véctơ).

Chọn véctơ tách dòng: tùy kích thước đoạn
gen và tế bào chủ mà có thể chọn các véctơ
plasmid, phage, cosmid, YAC…


Tạo véctơ tái tổ hợp và nhân dòng: sử dụng
DNA/RNA ligase (vd. T4 DNA ligase) gắn véctơ
với gen phân lập. Chuyển vào tế bào chủ để
nhân lên.

Chọn lọc các dòng tế bào mang véctơ tái tổ
hợp: bằng phương pháp nuôi cấy trên môi
trường chọn lọc, hoặc sử dụng các gen chỉ
thị/gen đánh dấu.

Các bước chính để tách dòng
Các bước chính để tách dòng
gen
gen

TÁCH DÒNG GEN VÀ XÂY DỰNG NGÂN HÀNG HỆ
GEN
Có hai loại ngân hàng gen: 1) Ngân hàng hệ gen và 2) Thư viện cADN.
- Ngân hàng ADN hệ gen

Có mặt tất cả các trình tự trong hệ gen của tế bào.

Các gen có trình tự các nucleotit và cấu trúc giống như trong hệ gen
của tế bào trong tự nhiên, bao gồm cả các trình tự điều hòa, các trình
tự ADN đệm, trình tự liên gen và các trình tự không mã hóa (intron)

Ở sinh vật nhân chuẩn, phần lớn các trình tự ADN là các trình tự
không mã hóa cho protein, như các đoạn trình tự lặp lại, các trình tự
đệm, các trình tự điều khiển, bên cạnh đó là các gen cấu trúc.


ADN hệ gen là cấu trúc ADN đầy đủ và phức tạp của tế bào.
- Thư viện cADN

Chỉ là tập hợp nhỏ một phần của hệ gen, gồm các gen được biểu hiện.

Các trình tự cADN phản ánh trình tự các sản phẩm mARN được hoàn
thiện sau quá trình phiên mã, không phải là trình tự thực sự và đầy
đủ của gen tương ứng trên phân tử ADN hệ gen (không có các trình tự
điều khiển, như promoter, operator, enhancer, v.v…).

Phần lớn cADN không phải là một bản sao có chiều dài đầy đủ của
chính phân tử mARN.

Các protein được mã hóa bởi cADN có thể được tổng hợp (dịch mã)
trong một tế bào chủ mà ở đó không cần có bộ máy hoàn thiện phân
tử mARN (bao gồm quá trình cắt các intron).

cADN có trật tự và cấu trúc đơn giản hơn ADN hệ gen.


Sơ đồ tách dòng
cADN




CÁC KỸ THUẬT NGHIÊN
CÁC KỸ THUẬT NGHIÊN
CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ

CỨU DI TRUYỀN PHÂN TỬ
I.
I.
Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái
Tách dòng gen (kỹ thuật ADN tái
tổ
tổ


hợp)
hợp)
II.
II.
Nghiên cứu gen tách dòng
Nghiên cứu gen tách dòng