Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thu hồi, tách chiết, tinh sạch b glucan từ nấm men bia

MỞ ĐẦU
Thực tại, hàng năm trên thế giới từ các nhà máy chế biến rượu bia, thực phẩm

ủ chua... đã thải ra một lượng bã khổng lồ. Ở Việt Nam, nấm men bia thu được từ

các nhà máy bia rất lớn. Ước tính trung bình cứ 1000 lít bia thu được 1,5 kg nấm men
khô [Hồ Xưởng, 1996]. Năm 2005, sán lượng bia của cả nước đạt 1,5 tỷ lít, tương
ứng với 18 triệu tấn sinh khối nấm men thải ra. Đen năm 2010, sản lượng bia cùa cả
nước đạt 2,5 tý lít và lượng nấm men thải ra là 30 triệu tấn [Nguyễn Thị Hoàng Anh

và cs, 2008]. Hầu hết các sản phẩm lên men này chỉ được dùng đế chế biến thức ăn

cho động vật, làm phân cải tạo đất hoặc được dùng làm nguồn vật liệu rẻ tiền đế sản
xuất dịch chiết nấm men tự phân. Song vẫn cịn tồn đọng 50-60% lượng chất rắn thơ

mà chủ yếu là thành tế bào nấm men (trong đó p-glucan chiếm 50-60% trọng lượng
khô của thành tế bào nấm men) nguồn chất rắn này được bán làm thuốc bố sung cho
chăn nuôi với giá rẻ hoặc thải ra môi trường gây ô nhiễm.
Nhiều nước trên thế giới như Hàn Quốc, Mỹ, Nhật Bản... cũng đã có các sản

phẩm P-glucan sản xuất từ tế bào nấm men để sử dụng như một yếu tố kích thích

miền dịch tiềm ấn và tác động đáng kế đến việc bảo vệ vật chủ, tăng tính đề kháng
của vật chủ đối với phần lớn các loại bệnh nhiễm khuấn, nấm, virut cùng nhiều sinh
vật kí sinh khác. Không chi vậy, các nhà khoa học Nhật Bản cũng đã sản xuất chế

phẩm p-glucan như một yếu tố kích thích miễn dịch hiệu quả trong điều trị ung thư.

Bên cạnh đó, p-glucan cịn là chất chống oxi hóa có tác dụng tái tạo da, làm mờ nếp
nhăn nên được sử dụng là chất bổ sung để sản xuất mỹ phẩm.
Sản xuất chế phấm giầu p-glucan từ bã nấm men bia có ý nghĩa hết sức lớn lao

trong việc giải quyết phế thải cho nhà máy sản xuất bia, tạo ra sản phẩm có giá trị
kinh tế cao, đồng thời cịn góp phần bào vệ mơi trường. Chính vì vậy, em đã chọn
Luận văn tốt nghiệp “Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thu hồi, tách chiết, tinh sạch pglucan từ nấm men bia”.

Mục tiêu của Luận văn-. Lựa chọn được các điều kiện thích hợp thu hồi, tách chiết,
tinh sạch p-glucan từ bã nấm men bia


Các nội dung chính của Luận văn:
-

Nghiên cứu lựa chọn phương pháp thu hồi p-glucan tồng số

-

Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tinh sạch p-glucan

-

Nghiên cứu tạo dạng sàn phẩm p-glucan

2


PHẦN 1: TĨNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giói thiệu chung về 0-glucan

1.1.1. Nguồn nguyên liệu chứa 0-glucan

Nguồn nguyên liệu tự nhiên đế thu nhận p-glucan bao gồm vi khuẩn, nấm men,

tảo, nấm lớn, đại mạch và yến mạch, cấu trúc hóa học cùa P-glucan phụ thuộc vào
nguồn gốc nguyên liệu. (1,3)-p-glucan có trong vi khuấn Alcalignes faecalis, tảo

Euglena gracilis,... (1,3), (1,6) p-glucan có trong tảo Laminaria sp., tảo nâu Eisenia
bicyclis, nấm hương Lentnula ododes, nấm men Saccharomyces cerevisiae, ...và

(1,3), (1,4) p-glucan thu được nấm sò Pleurotus ostreatus, đại mạch, yến mạch và
một số loại hạt khác [Hunter và cs, 2002]. P-glucan trong yến mạch và lúa mạch có
rất ít hoặc khơng có hoạt tính. Nhưng p-glucan trong nước của yến mạch có tác dụng

làm giảm nguy cơ bệnh tim. p-glucan tim thấy trong nấm lớn có phân nhánh chỉ với
một phân tử glucoza và chí tăng cường miễn dịch đến một mức nào đó. Bên cạnh đó,

p-glucan chiết từ thành tế bào nấm men s. cerevisiae phân nhánh rất mạnh và nó có

khả năng tăng hoạt tính miễn dịch mạnh nhất trong tất cả các loại P- glucan [Chan và
cs, 2009], p-glucan là hợp chất đường liên phân tử được tạo nên từ các đơn phân tử

D-glucose gắn với nhau qua liên kết P-glycoside. Các P-glucan là nhóm các phân tử
được phân biệt dựa vào phân tử khối, độ hòa tan, độ nhớt và cấu trúc không gian 3
chiều.
Các nghiên cứu đã cho thấy dạng hợp chất khơng hịa tan (1,3/1,6) P-glucan có

hoạt tính sinh học cao hơn dạng (1,3/1,4) p-glucan. Sự khác nhau giữa liên kết pglucan và cấu tạo hóa học chủ yếu là do độ hịa tan, phản ứng và hoạt tính sinh học.

1.1.2. Cấu trúc hóa học và phương pháp thu nhận p-glucan từ các nguồn

khác nhau

Tùy thuộc vào nguồn thu nhận p-glucan mà có cấu trúc khác nhau (bảng 1.1)

3


Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học của p-glucan từ các nguồn khác nhau

[Stone and Clarke, 1992]

Type of p-glucan
(structure description)

Natural source - trivial name of
p-glucan

{l,3)-P-gIucans
(linear, homogeneous)

— bacterium AicaUgenesfaecalis —
curdlan
— algae /Tụgtena gracilis — paramylon
- Poria cocos — pachyman
— Vitis vinr/era — callose
— tamarack (Larix laricina) — Lariclnan

(1.3)41,6)-p-glucans
(linear with (1,6)-linked
p-glucosy] side branches)

- algae Laminaria sp. — larmnarin

— Ciavicepspurpurea — wall glucan
— Sclerotinia sclerotiorum — wall glucan

(1,3)41.6)-P-glucans
(linear with (1,6)-Unked p-glucosyl
or p-gentobỉosyl side branches)

— brown algae Eisenia bicyciis laminarin
- mushroom Lewlinula edodes - wall
glucan

(1 »3)4 l,6)-P-glucans
(^branch on branch" structure)

— yeast Saccfia romyces cerevisiae — cell
wall glucan
- mushroom Scftizophyllum commune —
wall glucan

(1,3)4l,4)-p-glucans (linear)

— cereal Pglucans
— Iceland moss Cetraria islandica —
lichenin

(1,3)4l»4)-p-glucans (linear with
(l,4)-linked P-glucosyl side
branches)

— oyster mushroom (Pleurotus

ostreatus) — wall glucan

/3- glucan từ yến mạch

Hàm lượng p-glucan trong hạt lúa mạch (3-11%) và yến mạch (3-7%). Một

lượng nhơ p-glucans cũng được tìm thấy trong lúa (khoảng 2%), lúa mì (khoảng 1%)
và lúa miến (0,2-0,5%) [11]. Trong trường hợp yến mạch, [3-glucans có mặt chữ yếu

ờ lớp ngoài cùa hạt, trong khi trong hạt lúa mạch, các chất này được trài đều trong

tồn bộ ngũ cốc. Khơng giống như cellulose khơng hịa tan, tồn bộ phân tử glucose
được nối với nhau bới liên kết P-D-(l—> 4), p-glucans có trong nội nhũ của hạt ngũ

cốc là hỗn hợp cùa P-D-glucose chuỗi không phân nhánh liên kết với p - (1 —> 3) và

p - (1 —» 4) glycosizit [Bednarski, 2001].
P-glucan trong yến mạch và lúa mạch có rất ít hoặc khơng có hoạt tính. Nhưng
[3- glucan trong nước cùa yến mạch chịu trách nhiệm cho mối liên kết tế bào giữa các

sản phấm của yen mạch và giám nguy cơ bệnh tim.

4


Hình 1.1: cấu tạo phân tử (l-3)/(l-4)- P-glucan từ lúa mạch

Sơ đồ 1: Quy trình sản xuất p-glucan từ yến mạch trên quy mơ cơng
nghiệp [Sibakov, 2011; Heneen, 2009Ị

Ịì- glucan từ nấm

p- glucan từ nấm gồm cà 2 loại: p - (1 —> 3)/ (1 —♦ 6) glucan, dạng này khơng
hịa tan chiếm khoảng 53-58% và p - (1 —» 3)/ (1 —» 4) glucan ở dạng hòa tan chiếm
khoảng 16-46%. P- glucan có mức độ phân nhánh và trùng hợp thấp ớ dạng hịa tan,

P- glucan khơng hịa tan phân nhánh nhiều hơn và mạch dài hơn. P- glucan thu được
từ nhiều loại nấm khác nhau có kích thước phân tứ khác nhau nằm trong khoảng
0.2x10’ - 104 Kda. p- glucan có trọng lượng phân tử lớn hơn 3.1O3 Kda có độ nhớt

cao, nếu trọng lượng phân tử khoảng 9 Kda ờ dạng gel [Zekovic và cs, 2005].

5


Hình 1. 2: 0- glucan dạng hịa tan [Zckovic và cs, 2005]

Hình 1.3: 0- Glucan dạng khơng hịa tan hoặc tan nhẹ, mạch dài và chứa
nhiều nhánh IZekovic và cs, 2005]

6


Có một vài nấm dạng dược liệu, được sứ dụng như bài thuốc cổ truyền cờ châu

Á như: Chinese Reishi (Ganoderma ìucidum),

Japanese Shiitake (Lentinula

edơítes/Maitake (Grifola frondosa), nấm dạng tam gửi: Chaga (Ịnonotus obliquus),

Turkey Tail (Trametes versicolor), Split Gill (Schizophyllum commune), Mulberry

Yellow Polypore (Phellinus linteus) và dạng nuôi trồng như: Hiratake (Pleurotus

ostreatus, Oyster mushroom'). Hàm lượng [3-glucan trong Basidomycota rất thấp,

[3- glucan được biết tới trong cấu trúc và

khoảng 0.21-0.53 g/100 g khơ.

hoạt tính sinh học với các tên: lentinan từ Lentinus edodes, schizophyllan (SPG) từ

Schizophyllum commune, plcuran từ Pleurotus ữstreatus hoặc pullulans (AP-FBG) từ

Aureohasidium pulhdans, scleroglucan (SGG) từ Sclerotium rolfsii, grifolan (GRN)
từ Grifolafrondosa, krestin (PSK -polysaccharide-K and PSP - polysaccharopeptide)
từ Coríolus versicolor [Kony và cs, 2007; Standish và cs, 2008; Oba và cs, 2009;

Schmid và cs, 2010; Jong Suk Lee và cs, 2010]

Hình 1.4: [3- glucan (cịn gọi là lentinan) từ Lentinus edodes [Oba, 2009]

7


(A)

(B)

ft-1 A

Hình 1.5: cấu trúc phân tử Schizophyllan (A) từ Schizophyllum commune và
pleuran (B) từ Aureobasidium pullulans.

6ch.oh

Hình 1.6: cấu trúc phân tử scleroglucan từ Sclerotium rolfsii.

8


Sơ đồ 1.2: Quy trình sản xuất p-glucan từ nấm
/l

ft- glucan từ vi khuân
Polysaccharit từ vi khuẩn được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm

như là chất phụ gia. Chúng thường được gọi là bacterial egzopolisaccharides và là

cấu tạo của thành tế bào hoặc là sản phấm của quá trình trao đổi chất của vi khuấn:

Cellulomonas flavigena of KU strain [36], Bacillus curdlanolyticus and Bacillus
kobensis [37], Bacillus and Micromonospora [38] Agrobacterium spp. TCC31749

[39], Bradyrhizobium, Rhizobium spp. Sarcina ventriculi [40]. Các sân phẩm từ vi
khuẩn: xanthan, dextran, pullulan or gellan. cấu trúc 0-glucan cùa vi khuân tương tự

như mannans, nhưng glucose là thành phần cấu tạo cơ băn. Beta glucan là sản phẩm

của quá trình lên men được gọi là curdlan và laminarin.

9


Hình 1.7: cấu tạo phân tử (l-3)-p-glucan (A - curdlan; B - laminarin)
1.2. p - glucan từ nấm men bia

1.2.1. Giới thiệu chung về nguồn nam men bia tại Việt Nam
Theo thống kê cùa tố chức EUWATCH cơng bố, có khoảng 3 tỷ lít bia tiêu thụ

tại Việt Nam năm 2013, tương đương với khoảng 3 tỷ USD, trung bình mỗi người
tiêu thụ khống 32 lít bia. Với mức tiêu thụ này đưa Việt Nam lên hàng tiêu thụ bia
đứng

thứ

3

Châu

Á,

đứng

số

1

tại

Đông

Nam

Á

[Châu

Long,

. Thơng thường 1 triệu lít bia có thề tạo ra 15-18 tấn bã

men cần được xử lý. Với một con số tiêu thụ bia khổng lồ như vậy, lượng bã nấm

men bia cần xứ lý lên tới khoảng 450-480 nghìn tấn. Hiện nay nấm men bia chù yếu
dùng đề làm bột chiết nam men, làm thức ăn gia súc, hoặc phân bón. Song vẫn tồn tại
khoảng 50-60% chất rắn thô chủ yếu là thành tế bào nấm men (trong đó p-glucan

chiếm 50-60% trọng lượng khơ của tế bào nấm men) chủ yếu làm thức ăn chăn nuôi,

giá trị kinh tế thấp. Do vậy rất cần thiết công nghệ thu hồi và tinh sạch p-glucan làm
thành các sản phẩm thực phẩm chức năng có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao.
1.2.2. p - glucan từ nấm men bia

Là một trong nhũng polysacharit nhiều nhất trong thành tế bào nấm men, pglucan tồn tại như một homopolymer cùa glucoza, liên kết với nhau qua cầu nối P-

(1,3) hoặc p-(l,6)-D-glycosidic, chịu trách nhiệm cho hình dạng và độ bền cơ học

của thành tế bào. Thành tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae gồm có p-(l,3)-

D-glucan, p-(l,6)-D-glucan, chitin và mannoprotein. Cả 4 thành phần cấu trúc của
thành tế bào liên kết hoá trị với nhau. Mannoprotein (khối lượng protein khoảng 100
Kda) liên kết với P-(l,6)-D -glucan qua glycosyl-phosphatidyl-inositol có chứa 5 gốc
10


mannosyl liên kết a. Đầu khứ của p-(l,6)-D-glucan liên kết với đầu glucoza không
khử của P-(l,3)-glucan. Chitin gắn thắng vào nhánh p-(l,6)-glucan. Những năm gần

đây, p-glucan phân lập từ thành tế bào nấm men ngày càng được chú ý. Các hợp chất
này có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau như tăng cường miễn dịch, kháng khối u
và là tác nhân bảo vệ phóng xạ, kích thích hệ thống miễn dịch [Bonh và cs, 1995].

Bảng 1.2. Các thành phần chính của thành tế hào
Saccharomyces cerevisiae

Thành phẩn

Trọng lượng phân tử

% Trọng lượng

Tỉ lệ Mol

(Mức độ polyme hố)

trung bình (kDa)

màng tế bào

tương đối

P-1,3 glucan (1500)

240

50

1.0

p-l, 6 glucan (150)

24

10

2

100-200

40

1.2-2.4

25

1-3

0.1-0.3

Mannoprotein

Chitin (120)

Hình 1.8: cấu trúc ngoài thành tế bào nấm men

11


0 (1 -3)-linked Branch
CH2OH

CH2OH V

Z

OH

CH2ŨH

CH2OH

HO^“í
OH

OH

CH£)H

HQ1- I

HO
ÕH

1

n

CH2

CHPH

HO^“I

ỊH

HO^“f

ỒH

OH

- í? (1-3)-linked Backbone -

Hình 1.9: cấu trúc P-glucan từ nấm men 5. cerevisiae
IWedemeyer and McLeay, 19811
1.3. Các phương pháp thu hồi, tách chiết, tinh sạch p - glucan từ nấm men

1.3.1. Các phương pháp thu hoi f3 - glucan

Thành phần chất khô của tế bào nấm men bao gồm protein và các chất có nitơ
khác chiếm 50% , chất béo 1.6%, hydrat cacbon 33.2%, mô tế bào 7.6%, tro 7.6%.

Thành phần của những chất này khơng cố định, nó có thế thay đối trong q trinh
ni cấy cũng như q trình lên men. Hydrat cacbon gồm: polysaccharic, glycogen,
trehalose (12-12.5%), mannan (18.7-24.9%), glucan (9.47-10.96%) và chitin. Những
nghiên cứu động học về sự biến đoi hydrat cacbon trong quá trình bảo quản nấm men

cho thấy là glucan, mannan và dạng glycogen tan trong kiềm và axit clohydric là yếu
tố cấu trúc của tế bào, trong khi trehalose và glycogen tan trong axit acetic, là chất
tạo năng lượng chính cho tế bào. Hàm lượng trehalose trong nấm men có liên quan

đến tính bền vững của nó, lượng trehalose càng cao nấm men càng bền. Chất mỡ của

nấm men là mỡ trung tính glycerol, photpho lipit, sterol tự do và nhiều sterol, este.

Axit amin được thủy phân từ protein tế bào nấm men có đầy đủ các loại axit amin trừ
3 loại axit amin là lyzin, methionin và triptophan.

p-glucan chiết tách từ nấm men Saccharomyces cerevisiae bao gồm từ 2 bước

như sau.

12


- Bước 1: Thủy phân tế bào nấm men thủy phân, thu phần tế bào không tan
từ cytoplasm

- Bước 2: Phần tể bào không tan đem chiết tách thu p-glucan

Thông thường thủy phân tế bào nấm men sử dụng phương pháp: hóa học, vật
lý và enzyme:

- Phương pháp hóa học: Sử dụng NaOH, HCỊ axit acetic, axit citric các hóa
chất này được sử dụng phần lớn trong các nghiên cứu cũng như các ứng dụng trong
quy mô sản xuất công nghiệp. Thơng thường sử dụng hóa chất kết hợp với nhiệt độ

cao khoảng 90-100°C [Pelizon và cs, 2005; Hunter và cs, 2004; Lee và cs, 2001].

Phương pháp sử dụng hóa chất gây ô nhiễm môi trường, độ tinh sạch của sản phẩm
p-glucan không cao.

- Phương pháp vật lý: Phá vỡ thành tế bào bằng siêu âm hoặc nghiền bi, đồng
hóa ở áp suất cao [Shokri và cs, 2008; Boonraeng và cs, 2000; Wenger và cs, 2008].

Tỷ lệ thu hồi của phương pháp này thấp.

- Phương pháp sử dụng enzyme: Tự phân bằng các enzyme có sẵn trong nấm
men hoặc bố sung enzyme protease thương phẩm. Phương pháp này thân thiện với
mơi trường, an tồn, hiệu suất thu hồi cao.

1.3.2. Các phương pháp tinh sạch p - glucan từ nấm men
Tinh sạch P-glucan là một trong những khâu rất quan trọng có thể thu được
sản phẩm có độ tinh khiết cao. Các tác giã đã chứng minh được sản phấm p-glucan

có độ tinh khiết cao dề dàng hấp thụ và tiêu hóa.

Với cơng nghệ hiện nay có thế sàn xuất p-glucan có độ tinh khiết cao lên tới
98.5%, mannan <0.1%, 0.4% ct-glucan, 0.3% protein, 0.2% chitin [Kelly, 2001],

Tinh sạch p-glucan có thề sử dụng phương pháp hóa học hoặc phương pháp
enzyme:

* Phuong pháp enzy me:

- Thành tế bào thu được giữ trong môi trường kiềm pH=9-10 bố sung
enzyme protease để loại bỏ mannan [Zapatase và cs, 2008]

- Tách các pha bằng phương pháp vật lý, sử dụng ly tâm và rửa [Sedmark và
cs, 2006]

13


- Bước tiếp theo sử dụng enzyme glucoseamylase hoặc lipase đế thủy phân
lipid từ màng tế bào [Jaehrig và cs, 2008],

- Bước cuối cùng tạo dạng sản phẩm bột p-glucan thu được có mầu trắng
đến mầu nâu sẫm, khơng có hương vị
* Phương pháp hóa học [Vesna Zechner-Krpan và cs, 2010]:

- Thành tế bào thu được thúy phân bằng NaOH IM ớ nhiệt độ 90°C trong 2
giờ. Ly tâm thu cặn, rửa bàng nước cất 3 lần.

- Cặn thu được bố dung axit H3PO4, nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Ly tâm thu
cặn, rửa băng nước cất 3 lần.

- Cặn thu được xử lý loại bỏ mannaprotein bằng bồ sung dung dịch đệm citrate
pH=7, hấp 121 °C, thời gian 90 phút. Ly tâm thu cặn, rửa bằng nước cất 3 lần.
- Tạo dạng sản phẩm bằng sấy đông khô, sấy phun hoặc sấy đối lưu

1.3.3. Các phương pháp tạo dạng san pham Ị3 - glucan
Sấy là quá trình tách ẩm ra khởi vật liệu bàng phương pháp nhiệt. Nhiệt được

cung cấp cho vật liệu ấm bằng đĩa nhiệt, đối lưu, bức xạ hoặc bang năng lượng điện

trường có tần số cao. Mục đích của q trình sấy là làm giảm khối lượng vật liệu,
tăng độ bền và bảo quản sàn phẩm được lâu hơn .
Trong quá trình sấy , nước được cho bay hơi ở nhiệt độ bất kỳ do chênh lệch
độ ấm tại bề mặt và bên trong vật liệu (khếch tán ấm)hoặc sự chênh lệch áp suất hơi

riêng phần của nước tại bề mặt vật liệu và môi trường xung quanh, sấy là một q

trình khơng ổn định, độ ẩm của vạt liệu sấy thay đổi theo cả không gian và thời gian.

Trong các phương pháp làm khô cơ học, hóa lý, nhiệt.... thì q trinh sấy bằng

nhiệt thường được sử dụng nhất và là một kỹ thuật quan trọng được ứng dụng rộng
rãi trong nhiều ngành công - nơng nghiệp như hóa chất, dược phẩm, chế phẩm nông

nghiệp, chế biến nông - hải sản, vật liệu sấy dựng.... Đó khơng chỉ là một q trình
tách ấm đơn thuần mà cịn là một q trình cơng nghệ. Nó đòi hỏi vật liệu sau khi sấy

phải được đàm bào chất lượng cao, tốn ít năng lượng vì chi phí vận hành thấp. Do đó,

cần phải dựa vào tính chất vật liệu, lượng sản phẩm để chọn ra chế độ và phương
pháp sấy tối ưu cũng như tuỳ vào năng suất,hiệu quà kinh tế mà chọn hệ thống sấy

cho phù hợp.

14

* sấy chân không: Máy sấy khô chân không là việc tiến hành gia nhiệt sấy

khô các nguyên liệu cần sấy khô trong điều kiện chân không. Thiết bị sử dụng bơm

chân khơng để hút khí và hút ấm. Thiết bị sử dụng bơm chân khơng để hút khí và hút

ấm, buồng làm việc ở trạng thái chân không, tốc độ sấy khô liệu được nâng lên đáng
kể, đồng thời cịn tiết kiệm nhiệt năng.

Thiết bị sấy khơ chân khơng được chia thành hai loại: máy sấy trạng thái tĩnh
và máy sấy trạng thái động. Máy sấy chân không YZG hình ống trịn, FZG hình vng
là thiết bị sấy thuộc dòng trạng thái tĩnh, SZG là loại máy sấy chân không thuộc trạng

thái động.
Thiết bị sấy khô chân không được ứng dụng rộng rãi trong các ngành chế dược,

thực phẩm hóa chất, nhuộm... phù hợp yêu cầu GMP Dược phẩm.
*

Sấy phun:

Nguyên lý làm việc: Quá trình sấu phun là quá trình chuyến đổi dịng nhập liệu
dạng lỏng thành sản phẩm dạng bột. dòng nhập liệu được phân tán thành những hạt

nhở li ti nhờ cấu trúc phun sương. Cơ cấu phun dương thường có dạng đĩa quay hoặc
vịi áp lực. Những hạt lỏng phun ran gay lập tức tiếp xúc với dịng khí nóng, kết quả

là hơi nước được bốc đi nhanh chóng nhưng nhiệt độ của vật liệu vẫn được duy trì ờ

mức thấp. Nhờ vậy mà vật liệu được sấy mà khơng làm thay đồi đáng kế tính chất

của sản phẩm. Thời gian sấy khơ các hạt lịng dạng sương trong sấy phun nhanh hơn

nhiều so với các quá trình sấy khác.

1.4. ủ'ng dụng của |ỉ-glucan
1.4.1. Úng dụng trong công nghiệp thực phẩm.

p-glucan từ nấm men đã được chứng nhận an toàn GRAS năm 1997 bởi Cục

Quản lý Thực phấm và Dược phấm Mỹ (FDA), và được coi như một thành phần thực
phấm chứ không phải là chất phụ gia.
Năm 2011 ủy ban an toàn thực phẩm Châu Âu (EFSA) đã công nhận

p-glucan là thành phần thực phẩm an tồn có thể sứ dụng như thực phẩm bồ sung lên
tới 375mg/ngày và trong các sân phẩm bố sung dinh dưỡng đặc biệt lên tới

600mg/ngày.

15


P-glucan là thành phần thực phẩm trong các sản phẩm: bánh, sản phẩm lên

men có cồn, sữa chua, nước quả, sơcola, làm chất tạo đơng trong các món salad, nước
chấm, bơ.
Một vài loại beta-glucan thương mại trên thị trường sản xuất từ nấm men bia

Saccharomyces cerevisiae của công ty German company LEIBER GmbH - INTER

YEAST

- Sản phẩm của công ty p-glucan INTER YEAST: Protein - 43.5%, chất béo 4%, tổng hydratcacbon 25%, beta-glucan - 1.9%.

- Sàn phẩm P-glucan không tan: BG-HP (Beta HP( 1/3)-(l/6)-0-D-Glucane) và
p-glucan tan carboxymethylglucan BG-CMG (Beta CMG: 92% p-l,3/l,6-D-g!ucan,

1.2% protein, <0.6% of mannans and <0.5% chitin)

Tùy vào cấu trúc của P-glucan có các ứng dụng khác nhau trong quá trinh chế

biến thực phẩm.
Bảng 1.3: Khả năng ứng dụng các loại p-glucan khác nhau trong quá
trình chế biến thc phm
taioiiDood

Noncilotkfood
liitỡam

Mutaie

BslogiõlonU

yeast lua

batetiiisiiớới'ýiBfcớớs
yffittotoniWietMiJe

Rrfereices
kWBd,l9ô

ShuUaan(IHalpflii,2Ê(6i;ReedaiidN^ôfawtluu.lWl

Farepta

Mus&onittieas cereaUtWey
yea-lra
spent tar'syeast

LirKlkufVkMji'ltttiinudTito.yt
WwnsiBdiaiớtiL,206

talớta

rỏtyoớtaerỏ
atraceMar
potKunde(EPS)

Liiodk Md Muu, 2W7

yeasio

ipettbriwersyeast

Ttaiẫiietal,WI

yeast pliKới

spentbrewffsyeast

rasớlu

curdan
Mu

spent Iw'sreast
teunWfflớớWs
IBM

HuamalatietaL,ON
taiaffletOB
fc)Blđ;hl(ớa!)JltỡailèK
latodte and Midland, w

WaeiMij
OiibBlHị
Hlmpropataledible
ntarrNiKiion)

IUỂẩfete M ta«alXi Qaeenan a a, M
KidietiLl99iKfller,20l»;M«aL2()Ol

LwerinnLDLitotaterol Miku
ỉttotlMsCtlt Mu
Dietin' ta
Mu

oa
feast
tekefspast

Pỉebtóippiuáon

UodieandMidiaudTCO"
oa
oystetiMsfiMinpetiisPiesritei SyiytsyaetaLW

Muhydrta
Mu

SodieretaLI975

16


Bảng 1.4. úng dụng P-glucan trong quá trình chế biến các sản phẩm thực

phàm
Food products

References

gelling thickeners for functional

Shukla and Halpern, 2005a; Laroche and

food products

Michaud, 2007

biscuits and cookies

Seeley,1977; Shukla and Halpern, 2005b

meat products

Thammakiti et al., 2004; Shukla and

soft cheese

Shukla and Halpern, 2OO5d

bread, bread mixture, pancakes,

Shukla and Halpern, 2005e

Halpern, 2005c

toast, dough

nibbling food (salty and sweety)
ice creams, yogurts, milk drinks

Shukla and Halpern, 2005Í
Shukla and Halpern, 2005g>h; Tudorica et

al., 2004

salad dressings (creamy,

Shukla and Halpern, 20051,j

vinegar, mayonnaise) and their

Worrashinchai et al., 2006

ready mixture for use
sauces and mixture for their

Shukla and Halpern, 2005k,1

preparation
soups and mixture for soups,

Shukla and Halpern, 2005m,n,o,p

concentrates for soups

beverages, including juices and

Neumann el. al., 2006

dairy drinks

1.4.2. ủng dụng P-glucan trong y dược, mỹ phẩm

Như chúng ta đã biết, P-glucan là một polymer của glucoza và được tách chiết
từ thành tế bào nấm men, vi khuẩn, nấm và thực vật. p-glucan có vai trị như một chất

có hoạt tính sinh học có khả năng tăng cường miễn dịch. Tiến sĩ Pillcmcr Louis đã

chứng minh hiệu ứng kháng khối u của p-glucan tách từ Saccharomyces cerevisiae

và có tên thương phẩm là Zymosan [Cletus và Jack, 1998]
P-glucan có khă năng làm giảm lượng cholesterol trong máu và đã được thử

nghiệm lâm sàng trên động vật cũng như ở người. [Bohn, Bemiller, 1995]

17


p-glucan có khả năng kháng khuấn và kháng virus trong việc kiềm sốt các
lồi gây hại cho cây trồng (Kitagawa, 2007) và các cuộc tấn công của virus

(Slovakova và cs, 1997).
p-l,3-glucan có khả năng làm se lỗ chân lơng, giảm số lượng, độ sâu, độ dài
của nếp nhăn, cảm ứng tống hợp collagen varelastin, giảm màu đỏ, sự kích thích và
sự

khơ

cùa

da,

giảm

số

lượng

và

kích

cỡ

thương

tốn

trên

da.

p-l,3-glucan có thể thêm vào kem da, mỹ phẩm, thuốc mỡ, dung dịch giữ ẩm cho da,

kem cạo râu và nói chung là tất cà các sàn phẩm tiếp xúc trực tiếp với da.

P-glucan có thế chống lại q trình oxy hóa, kháng khn và các hoạt động

kích thích miền dịch. Sản phẩm mỹ phấm được sử dụng trong điều trị da chứa men
p-glucans như giữ ẩm và các thành phần dưỡng ẩm [Laroche & Michaud, 2007]. Vi

vậy P-glucans được bố sung và có thể ngăn ngừa tổn thương da gây ra bởi bức xạ mặt

trời và còn được sừ dụng trong kem chống nắng, dầu gội đầu và gel (Michiko &
Yutaka, 2007), chất khử mùi, nước súc miệng và tã lót (Michiko và cs, 2005).
Việc sử dụng P-glucan cũng là rất quan trọng đối với bệnh nhân ung thư phải

điều trị bằng hóa chất hoặc chiếu xạ vì p-glucan có khả năng tăng nhanh sự phục hồi

máu khi bị chiếu xạ ờ liều gây chết và dưới mức gây chết, p-glucan cũng có thế kích

thích sự phục hồi của tủy xương sau hóa trị liệu và ngăn cản biến chứng nhiễm bệnh

trong q trình điều trị.
p-glucan kích thích sàn xuất ra các tế bào bạch cầu ở trong tủy xương. Q

trình sàn xuất tủy xương bị suy giảm, có nghĩa là giảm số lượng bạch cầu và tăng
nguy cơ nhiễm bệnh và ung thư. Khả năng tăng cường miền dịch cùa p-glucan được

đánh giá là rất tốt trên bệnh nhân ung thư được xạ trị hoặc hóa trị.
Ngồi ra, nhiều nghiên cứu khác còn cho thấy được hiệu quả tích cực của

p-glucan trong việc điều trị các khối u nhọt ác tính, bện HIV, sự biến chứng cùa các
vết thương. Đồng thời p-glucan cịn tăng cường tính đặc hiệu của các loại thuốc kháng

sinh, kháng virut.
1.4.3. Úng dụng trong nuôi trồng thủy săn

p-glucan là một chất tăng cường hệ thống miền dịch và có hiệu lực tăng cường
hệ thống miễn dịch của vật chủ [Yadomae và Ohno, 1996]. p-glucan kích thích hệ
thống miễn dịch tiềm năng trong ni trồng thuỷ sản.

18


P-glucan từ nấm men đặc biệt rất có hiệu quà như một dược phấm phòng bệnh

cho động vật dưới nước lớp Osteichthyes (các lồi cá như cá trích, cá thu, cá ngừ, cá
trống, cá chì vàng, cá tuyết, cá basa), Crustacea (các lồi giáp xác bao gồm tơm, cua)

và Penaeidae (các lồi tơm).

Khi bố sung P-glucan vào thức ăn hàng ngày của nguồn nhiễm bệnh với hàm

lượng Ig/kg thức ăn trong 12 tuần thì lượng cá, tơm sống sót tăng lên rất nhiều
[Rostad Gunnar và cs, 1995].
1.5. Tình hình nghiên cứu p-glucan trong và ngồi nước

1.5.1. Tình hình nghiên cứu p-glucan trong nước
Trong giai đoạn 2004-2005 của chương trình cơng nghệ sinh học, với sự tài trợ

của đề tài KC-04-28, lần đầu tiên ờ Việt Nam, nhóm nghiên cứu thuộc Viện Công
nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam đã bắt tay nghiên cứu quy trình

cơng nghệ tách chiết P-glucan từ thành tế bào Sacchromyces cerevisiae, bước đầu đã

thu được sản phấm có độ tinh khiết cao. Sản phẩm P-glucan từ chủng nấm men
S.cerevisiae 1 chỉ có một loại mạch 3-1,6. Sàn phẩm p-glucan từ chúng nấm men
S.cerevisiae 3 có hai loại mạch p-1,6 và P-1,3. Chế phẩm P-glucan từ chủng
S.cerevisiae 1 có trên 80% hexoza và 0.99% protein. Chế phấm p-glucan từ chủng

S.cerevisiae 2 và S.cerevisiae 3 có hàm lượng protein khoảng 1,2% và hơn 50%
hexoza.

Chế phẩm p-glucan được thử nghiệm trên chuột có tác dụng phục hồi số lượng tế
bào bạch cầu máu ngoại vi và khả năng thực bào của đại thực bào ố bụng của động

vật gây suy giám miền dịch thực nghiệm bang chiếu xạ. Chế phẩm P-glucan từ chúng
S.cercvisiae 1 có tác dụng tốt đối với hệ thống miễn dịch không đặc hiệu..
Hiện nay, Liên hiệp Khoa học sản xuất Công nghệ sinh học và Môi trường đã
sử dụng P-glucan trong chế phấm Neo-Polynut phục vụ chăn nuôi và nuôi trồng thủy

sản. Chế phẩm Neo-Polynut đã được Bộ thủy sản công nhận chất lượng và cho phép

sản xuất lưu hành.
1.5.2. Tình hình nghiên cứu p-glucan trên thế giới

Báo cáo đầu tiên vào năm 1976 về hoạt tính kháng u của polisacarit mà hồn

hợp này được tách từ vi khuẩn vào năm 1943 [Whistler và cs, 1976]. Những
polisacarit được tách từ vi khuẩn có những tác dụng phụ khơng mong muốn. Vì vậy,

19


rất nhiều polisacarit kháng khối u khơng có hiệu ứng độc được phát hiện từ những
nguồn khác nhau như nấm men, nấm ăn, tảo, địa y, và thực vật. Những nghiên cứu

tiếp theo với polisacarite không phải của vi khuẩn chỉ ra rang, glucan hoạt động bằng
cách kích thích hệ miễn dịch và không độc đối với tế bào.
Năm 1970 và 1980 những polysacarit kháng khối u (glucan) như Lentinan,

Schizophyllan và PSK/Krestin đã được tách từ ba nguồn nấm khác nhau, nấm ăn

Shiitake (Lentinus edodes, Schizophyllum commune và Coriolus versicolor). Tất cá

những glucan này đều được bán để sừ dụng trong y học ở Nhật. Sau đó, đã phát hiện
ra rằng hiệu lực kháng khối u cùa glucan là kết quả kích thích tế bào miễn dịch chứ

khơng phải là độc tính trực tiếp cùa glucan đối với tế bào khối u.
Việc sử dụng p-glucan in vivo làm cho vật chủ có khả ăng đáp ứng chống lại sự
phát triển của khối u và nhiễm các bệnh nấm, vi khuân, virut và protozoa [Ross và

cs, 1999; Tzannabos, 2000]. Điều đó dẫn đến một loạt các thử nghiệm lâm sàng sử
dụng P-gluacan trong chữa ung thư và như một tác nhân phòng bệnh đế phòng chống

nhiễm bệnh trong các bệnh nhân bị mổ và nhận được kết quà triển vọng. Mặc dù, hiện
nay vẫn chưa sản xuất đại trà các hợp chất này, nhưng chúng đã được sử dụng để
chữa ung thư ở Nhật Bản.
Năm 1970, một so viện nghiên cứu ờ Nhật Bản đã thử tách chiết p-glucan từ

nấm lớn và nó trở thành hướng chính ở Nhật Bản.

Sử dụng p-glucan nấm men cho cá hồi Atlantic sẽ làm tăng hoạt tính lysozym
của chúng [Paulsen và cs, 2001, 2003], Dựa trên kết quả nhận được các tác già đi đến
kết luận rằng các hợp chất vi sinh vật chứa P-glucan có khả năng kích thích sự đề

kháng khơng đặc hiệu của người và động vật, chống nhiễm độc bằng cách tăng sự

biếu hiện của lysozym. Những nghiên cứu lâm sàng cho thấy nếu bệnh nhân bị chấn

thương hoặc phẫu thuật được uống glucan sẽ giảm biến chứng nhiễm trùng và tăng
khả năng sống sót [Engstad và cs, 2002], Ngồi ra, p-glucan tan làm tăng hoạt tính
của bạch cầu và cũng làm giảm đáng kể quá trình mất bạch cầu hạt nhỏ.

Khoa Công nghệ Sinh học, trường tổng hợp Hàn Quốc đã tách chiết được P'
glucan tan trong kiềm từ thành tế bào Sacchromyces cerevisiae chủng dại và chủng

đột biến có độ tinh sạch cao [Ha và cs, 2002].

20

Ớ Thái Lan và Australia, P- glucan cũng đã được chiết từ nấm men và sử dụng

như một chất kích thích miễn dịch tiềm năng cho Penaeus monodon và Saỉmo salar
L. [Suphantharika và cs, 2003; Paulsen và cs, 2000]. Ngoài ra, ở nhiều nước khác như
Nhật Bản, Mỹ, Canada, Tiệp Khắc, Nga ... cũng tiến hành khá nhiều nghiên cứu trong

lĩnh vực này phục vụ nuôi trồng thuỷ sản.

21


2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Nguyên vật liệu

Nguyên vật liệu:

- Bã nấm men bia thu hồi tại Xưởng bia Viện Cơng nghiệp thực phẩm
Hóa chất:
-

HC1, H3PO4....

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xác định nồng độ protein hòa tan

Phương pháp Bradford, hàm lượng protein tống số được xác định theo Kelldal
2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng chất béo theo Lecoq (1965)

2 gam mầu bố sung 50 ml HC1 4N gia nhiệt hồi lưu ở 100°C trong 1 giờ. Làm

lạnh, lọc bò dịch, cặn được hòa tan bằng petrolium ether, lọc thu dung môi. Thu dầu
sau khi cho bay hơi hết dung môi, cân thu chất béo.
2.2.3. Phương pháp thu thành tế bào

* Phương pháp 1: cho dịch lên men (15% w/v) tự phân huỷ ở nhiệt độ 50°C

trong 24 giờ (Suphanthasika et all, 1997). Ly tâm 4500 vịng trong 10 phút, sau đó
thu lượng chất rắn, chất rắn này có trọng lượng khống 35% (w/w) đó là thành tế bào
nấm men bia, giữ thành tế bào ở 4°c cho đến khi sử dụng.

*Phương pháp 2: cho dịch lên men ly tâm 8000v/phút, trong 20 phút, rửa 2
lần bằng đệm citrat photphat, pH = 5,5. Hoà cặn tế bào trong 1 lít 4% NaOH, đun
nóng đến 1 oo°c, khuấy mạnh trong 1 giờ. Đế nguội ở nhiệt độ phịng, thêm 1 lít nước

lạnh để dừng phản ứng. Ly tâm 4000 v/phút trong 15 phút. Thu cặn (thành tế bào) và

bào quản ỡ 4°c cho đến khi sử dụng.
2.2.4. Phương pháp tách chiết fi-glucan tống sổ

Phương pháp 1: P-glucan được thu hồi theo phương pháp dùng kiềm cúa
Williams [Williams và cs, 1991].

Phương pháp 2'. [3-glucan được thu hồi theo phương pháp kiềm-acid cùa
Williams và Hunter [Williams và cs, 1991; Hunter và cs, 2004]

Phương pháp 3: p-glucan được thu hồi theo phương pháp enzyme của
Freimund, Porchalearn và Liu [Freimund và cs 2003, Porchalearn và cs, 2006; Liu và
cs, 2008]

22

2.2.5. Phương pháp xác định hàm lượng Ịì-glucan (theo phương pháp

McCleary và Glennie-Holmes (1985)

Sử dụng kit phân tích p-glucan bang enzyme cùa cơng ty Megazyme
International Ireland Ltd, Wicklow, Ireland.
Bộ Kít phân tích bao gồm 5 loại dung dịch, phân tích được khoảng 100 mẫu.

-

Chai dung dịch 1: Lichenase [specific, e»í/«-(l-3)(l-4)-p-D-glucan 4-

glucanohydrolase], dung tích 1 mL. Pha lỗng V=20 ml trong buffer

sodium phosphat 20mM, pH=6.5, giữ ở -20°C.

-

Chai dung dịch 2: P-Glucosidase dung tích 1 tnL. Pha lỗng V=20 ml trong

-

Chai dung dịch 3: GOPOD Buffer cho phàn ứng. Buffer (48 mL, pH=7.4),

buffer sodium acetate 50mM, pH= 4.0, giữ ở -20°C

p-hydroxybenzoic acid and sodium azide (0.4 % w/v). Pha loãng bằng

nước cất thành I lít dung địch, dung dịch sứ dụng ngay

-

Chai

4:

GOPOD

Enzymes.

Glucose

oxidase

plus

peroxidase,

4-aminoantipyrine. Dạng bột
-

Chai dung dich 5: Dung dịch D-Glucose chuẩn (5 mL, 1.0 mg/mL) trong 0.2

% benzoic acid (w/v)
Mầu chứa p-glucan hịa tan trong HCL đậm đặc, sau đó thủy phân có gia nhiệt

hồi lưu mẫu trong dung dịch HC1 1.3 N ở 100(,C trong 1 giờ. Sau đó bồ sung 10ml
KOH 2N, chuyển tồn bộ mầu vào bình định mức 100 ml, bô sung buffer sodium

acetate pH=5 chỉnh đến vạch định mức. Dịch đem lọc qua màng lọc Whaterman GF/A
trước khi dịch bị chuyển mầu. Thủy phân D-glucose bang endo-l,3-p-glucanase (20

u/ml) và p-glucosidase (4 u/ml) ở 40°C trong 60 phút. Kết thúc, bổ sung 3ml gluco
oxidase/peoxidase vào dịch huyền phù phía trên, giữ 40°C trong 20 phút. Dịch đo tại

bước sóng 510 nm, trên máy UV-vis. Dung dịch blank 0.2ml buffer sodium acetate
pH=5 có bố sung 3ml gluco oxidase/peoxidase. P-glucan tổng được xác định ở cả

phẩn cặn và phần dịch thủy phân tế bào.

2.2.6. Phuong pháp xác dính hàm lượng chất béo
Phân tích theo TCVN4331:2009

Lipid là este phức tạp của rượu bậc 3 glyerin và axit béo caocaps (axit
panmitic, stearic, oleic, linoleic...)

23


Xác định lipid dựa vào tính chất đa số chất lipid đều hồ tan trong các dung

mơi hũu cơ như ete etylic, cacbon disunfua, ete petrol...Dung mơi nào có nhiệt độ

sơi thấp và tỷ trọng càng nhỏ thì hồ tan và chiết lipid ra khỏi thực phẩm càng nhanh
và càng dễ làm bốc hơi đi. Trong phịng thí nghiệm hay dùng ete petrol. Các ete này
hoà tan nhanh các lipid như axit béo, phosphtit, sáp, các rượu béo, andehyt, xeton,

các chất màu...

Hồn họp các chất béo được chiết bằng ete etylic gọi là béo thô, thành phần béo

thô chiết được phụ thuộc vào dung mơi dùng vì độ tan cùa các chất béo khác nhau
trong mồi loại dung môi là không giống nhau.
Chất béo thô được xác định theo phương pháp trực tiếp là chiết bởi dung môi.

Một trong những ohương pháp trực tiếp xác định chất béo chính xác nhất là chiết
bằng máy Soxhlet.

Nguyên tắc: Dựa vào tính chất các dung mơi hữu cơ có khá năng hồ tan và
rút được chất béo ra khỏi mẫu phân tích. Sau khi tách được chất béo, đun đuổi dung
môi ra khỏi chất béo và sấy khô chất béo đen trọng lượng không đối.

Tiến hành: Cân 5 g mẫu cho vào bầu chiết của máy chiết Soxhlet chiết ở 70°C,
trong 6-8giờ. Chuyến dung mơi đã chiết béo sang bình cầu sau đó cất đuối dung mơi,

cân cốc, tìm ra lượng chất béo.
* Cách tính

Chất béo %

= G1-G2 X 100

G
G1: Trọng lượng cốc chứa mẫu, g
G2: Trọng lượng cốc chứa chất béo, g

G: Trọng lượng mẫu, g

24

3. KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1.

Nghiên cứu lựa chọn phương pháp thu hồi [3-glucan tổng số

p-glucan thô từ bã nấm men bia được thu hồi theo 3 phương pháp khác nhau
đã ghi chi tiết ở phần phương pháp. Thí nghiệm tiến hành trên quy mô 500 kg nấm

men bia sau khi xử lý thu hồi axit amin, còn lại phần bã tiếp tục đi xử lý để thu

hồi P-glucan. 500kg nấm men bia (w=85%), thu hồi được 32kg thành tế bào nấm
men (w=65%). Bảng 3.1 phân tích các thành phần trong thành tể bào nấm men

thu được như sau:

Bảng 3.1. Thành phần thành tế bào nấm men khô
Protein (%)
10

p-glucan (%)

Chất héo (%)

49,5

9

Thành tế bào nấm men được bổ sung nước theo tỉ lệ 1:1 (w/v), tiến hành thu

hồi (3-glucan. Hiệu suất thu hồi p-glucan theo từng phương pháp được thể hiện
trong băng 3.2.

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của các phưong pháp tói hiệu suất thu hồi
p-glucan tống số từ bã nấm men bia

Phương pháp thu hồi

Ịì-glucan tong số (kg)

1

1.6

Hiệu suất thu hồi
P-glucan (%)

17.5

2

2.0

22.6

3

4.01

44.5

Từ kết quả bàng 3.2 cho thấy thu hồi p-glucan theo phương pháp sử dụng kiềm

hiệu suất thu hồi thấp nhất, chỉ đạt 17.5%. Phương pháp sử dụng kiềm kết hợp với
acid hiệu suất thu hồi cao hơn đạt 22.6%, tuy nhiên tỷ lệ thu hồi vẫn còn rất thấp.
Phương pháp sừ dụng enzyme proteasse cho hiệu suất thu hồi cao nhất, đạt 44.5%.

Đây là phương pháp thu hồi tối ưu và có ý nghĩa trên quy mơ sàn xuất cơng nghiệp,
do khơng sử dụng hóa chất, phương pháp này rất thân thiện với môi trường. Mặt khác

phương pháp này cũng loại bỏ được các tạp chất như manoprotein, các peptid. Ket

quà này cũng phù hợp với một số công bố mới nhất cúa tác giả Chema Borchani

25