Nghiên cứu tạo chủng đột biến nhằm nâng cao sản lượng syringomycin e

Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

MỤC LỤC
CHỬVIÉTTÁT............................................................................................................ iii

DANH MỤC CÁC HÌNH............................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG....................................................................................................... V

MỚ ĐÀU......................................................................................................................... 1
MỤC TIÊU..................................................................................................................... 3

NỘI DUNG NGHIÊN cứu.............................................................................................3

PHẦN I. TÔNG QUAN.................................................................................................. 4
1.1.

Tong quan về syringomycin E............................................................................... 4

1.2.

Cấu trúc cùa SRE.................................................................................................. 4

1.3.

Tính chất cùa SRE................................................................................................. 5

1.4.

Cơ chế tác động của SRE tới vi sinh vật gây bệnh.................................................. 6

1.5.

Cơ chế sinh tổng hợp SRE..................................................................................... 6

1.6.

Các điều kiện nuôi cấy chúng p.syringae cho sinh tống hợp SRE........................... 7

1.7.

Một số phương pháp thu hồi SRE.......................................................................... 9

1.8.
1.9.

Nguồn thu nhận SRE............................................................................................ 10
Đặc điếm cùa chùng vi’sinh vậlsìnhsỹàộgoinycin EƯÌ..Ỉ.Lil..N.ộ.l.................... 11

1.9.1.

Đặc điềm hình thái............................................................................................ II

1.9.2.

Đặc điểm ni cấy............................................................................................. 12

1.9.3.

Đặc điềm sinh lý và sinh hóa............................................................................. 13

1.10.

ứng dụng của SRE............................................................................................. 14

II.

Đột biến sinh học................................................................................................... 15

II.

1. Khái niệm về đột biến sinh học và phân loại đột biến.......................................... 15

Hình 1.4. ADN biến đổi sau khi bị tia tử ngoại chiếu vào............................................. 16
11.2.

Các yếu tố ánh hướng đến hiệu quà gây chết và tần số phát sinh đột biến............. 17

II.3.

Cơ chế cùa đột biến bằng tia cực tím................................................................... 17

II.4.

Hệ thống sứa chữa và bào vệ ADN..................................................................... 20

II.5.

Phát hiện đột biến ờ nấm và vi khuấn..................................................................23

PHÀN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cửu.......................................... 25

2.1.

Vật liệu nghiên cứu............................................................................................. 25

2.1.1

.Đối tượng nghiên cứu........................................................................................25

2.1.2.

Hóa chất........................................................................................................... 25

ĐỖ Thị Ngọc Huyền i

Lớp: CNSH-1103


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

2.1.3.

Thiết bị và dụng cụ.......................................................................................... 25

2.1.4.

MƠÍ trường...................................................................................................... 26

2.2.

Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 26

2.2.1

.Đột biến bằng tia uv........................................................................................26

2.2.2.

Kháo sát và tuyến chọn các the đột biến có khả năng sinh SRE cao.................. 27

2.2.3.

Phương pháp cấy trực tiếp............................................................................... 27

2.2.4.

Phương pháp khuếch tán thạch.......................................................................... 27

2.2.5.

Xây dựng đường chuẩn cho xác định hoạt tính SRE.......................................... 28

2.2.6.

Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào chùng p.syringae PS 120 và thể đột

biến p.syringae PS 120-15.....................................................................................29

2.2.7.

Động thái q trình sinh tơng hợp SRE từ p.syríngae PS 120 và thê đột biến

p.syringae PS 120-15.................................................................................... 29

2.2.8.

Kiểm tra tính ổn định của thề đột biến...............................................................30

2.2.9.

XÚC định tống số vi sinh vật hiếu khí...............................................................30

PHÀN 3. KÉT QUÁ VÀ THÀO LUẬN........................................................................ 31
3.1

.Gây đột biến chúng p.syringae PS 120 bằng tia uv............................................ 31

3.2.

Sàng lọc sơ bộ các. thê đột biến\từ ựbũngíẠ.ld#/tg«eMSyi204..N.ụÌ.................... 32

3.3.

Chọn lọc các the đột biến có khà năng sinh SRE cao............................................ 33

3.4.

Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào chùng p. syringae PS 120 và thế đột

biến p. syringae PS 120-15......................................................................................... 35

3.5.

Phán tích trình tự ARN 16S cùa chúng đột biến PS 120-15.................................. 36

3.6.

Động thái cùa quá trình sinh tồng hợp SRE cùa p.syringae PS 120 và thế đột biến

p.syríngae PS 120-15.................................................................................................42
3.7.

Kiêm tra tính ơn định cùa chùng đột biến............................................................. 43

PHÀN 4. KÉT LUẬN....................................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHAO..............................................................................................45

DỖ Thị Ngọc Huyền ii

Lớp: CNSH-1103


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội
CHỦ VIÉT TẢT

g/1

: gam/lít

L/m

: litter/minute

u/ml : Unit/milliliter
Da

: Dalton

pl

: microliter

FAO : Food and Agriculture organization (Tố chức Nông lương thế giới )

kDa

: kilodalton

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Dỗ Thị Ngọc Huyền Hi

Lớp: CNSH-1103


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo cùa Syringomycin E............................................................. 5
Hình 1.2. Khuẩn lạc p.syringae trên mơi trường King B và phát quang dưới ánh sáng tia
cực tím ờ bước sóng 365 nm........................................................................................... 13
Hình 1.3. p.syringae dưới kính hiến vi điện tử.................................................................14
Hình 1.4. ADN biến đơi sau khi bị tia tử ngoại chiều vào.......................................... 1616
Hình 1.5. Thymine dimer được tạo ta bời tia uv............................................................. 19
Hình 1.6. Cơ chế đột biến bàng tia UV(Cytosine có thề hình thành 1 dimer giống nhau). 19
Hình 1.7. Cơ chế quang tái hoạt hóa sứa chữa ADN..................................................... 211
Hình 1.8. Sứa chữa sự sai khác ADN do tia uv gây ra................................................ 233
Hình 2.1. Đường chuấn biểu thị mối tương quan giữa đường kính vịng kháng nấm G.
candidum và đơn vị SRE khác nhau............................................................................... 29
Hình 3.1. Mật độ tế bào vi khuấn và tỳ lệ sống sót sau xừ lý đột biến bàng tia uv........ 322
Hình 3.2. Kicm tra hoạt tính SRE của chủng gốc p. syríngae PS 120 (hình A) và the đột
biến p. syrìngae PS 120-15 (hình B) bàng phương pháp khuyếch tán đĩa thạch........... 344
Hình 3.3: Hình ánh ADN tổng số cùa các chùng vi khuấnPS 120-15 trên gel agarose 1%
(chạy lập lại 4 lần).........................................................................................................37
Hình 3.4: Điện di đồ sán phẩm PCR khuếch đại gen 16S rARN cúa chủng vi khuấn PS
120-15.......................................................................................... ..................... 37
Hình 3.5: Sơ đồ câyl>nWsiìilWẲÀi^ukỉtìủỉi^ặíS‘ẦâíNCB1...................
?........................... 400

Dỗ Thị Ngọc Huyền iv

Lớp: CNSH-1103

Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

DANH MỤC BẢNG
Bàng 3.1. Tý lệ sống sót cùa vi khuân sau xừ lý đột biến bàng tia uv........................... 311
Bảng 3.2. Khả nâng ức chế nấm G. candidum của các thế đột biến................................333
Bàng 3.3. Xác định hoạt tính SRE cùa các thế đột biến tuyển chọn..................................36
Bàng 3.4. Đặc điếm hình thái khuấn lạc và tế bào cùa chúng gốc.....................................35
Bàng 3.5: Định lượng ADN tống số............................................................................... 39
Bảng 3.6: Kết quá định danh sừ dụng công cụ BLAST trên NCBI.................................. 39
Bàng 3.7: Sự sai khác sau khi giãi trình tự 16S rARB cùa chúng PS 120-15kìú so sánh với
1 chùng Pseudomonas syríngae NBRC 14076 trên GenBank...................................... 41
Bàng 3.8. Khá năng sinh SRE cùa p. syringae PS 120 và the đột biến p. syringae PS 12015 ờ các khoáng thời gian khác nhau........................................................................ 422
Bảng 3.9. Khà năng sinh SRE cùa chủng gốc p. syringae PS 120 và thề đột biến p.
syringae PS 120-15 qua các thế hệ.............................................................................. 43

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Dỗ Thị Ngọc Huyền V

Lóp: CNSH-1103


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

MỎ ĐÀU

Trong những năm gần đây, van đề báo quàn sàn phàm nông sãn sau thu

hoạch đang được xã hội đặc biệt quan tâm. Trái cây đáp ứng nguồn dinh dưỡng cao

vì vậy yêu cầu trái cây phải tươi ngon, đảm bảo chất lượng và đáp ứng các nhu cầu

về vệ sinh an tồn là những tiêu chí hàng đau trong lĩnh vực bảo quân sau thu
hoạch. Trên thực tế, nông sản trong quá trình bảo quán thường bị một số sinh vật
gây hại, trong đó chủ yếu là vi sinh vật và côn trùng. Hoạt động mạnh mè của vi
sinh vật gây tốn that lớn cho nông sản ở giai đoạn sau thu hoạch, trong đó tồn thất

do nấm mốc chiếm một phần đáng kể. Theo công bố của FAO, 25% đến 50% nơng

sân trên tồn thế giới nhiễm độc tố. Qua nghiên cứu cho thầy ngô, lạc và cà phê
thường nhiễm các loại nấm mốc như Aspergillus spp. Fusarium spp, Penicillium
spp, Rhizopus spp, Aspergillus niger...Ngoài việc gây tồn thất về lượng cho nơng

sản, nấm mốc cịn sinh độc tố đặc biệt nguy hiểm với con người và động vật kinh tế.
Trong đó. Aspergillus flavusViL Aspergillus parasiticus là 2 lồi có khả năng sinh

độc tố aflatoxin mạnh nhất, độc tố này được tích tụ trong gan người, động vật và
khơng bị phân húy bới nhiệt độ cao. Aspergillus ochraceus, A. niger và Penicillium

vữidicatumcó khả nàng sinh độc to ochratoxin. Ngồi ra, một số loại nam Fusarium
có khă năng sinh độc tố trichothecen và fumonisin. Hàm lượng aflatoxin nhiễm

nhiều trên các mầu ngô, lạc và cà phê đã vượt quá ngưỡng giới hạn cho phép cúa
tiêu chuẩn Việt Nam và Quốc tế.
Ớ nước ta đã và đang sứ dụng khoảng 2(X) loại thuốc trừ sâu, 83 loại thuốc

trừ nấm, 52 loại thuốc trừ có...Những hóa chất nằm trong danh mục cho phép được

sứ dụng trong bào qn nơng sàn là nhóm pyvethroid. malathion, sumithion,

DDVP, actellic 2D, cacbon dioxit, monocrotophos. cypermethrin. Tuy nhiên, theo
kiểm tra của các cơ quan chức năng hóa chat này thường được sừ dụng vượt quá
lượng cho phép nhiều lần (http:// WWW.hoahocngaynay.com). Việc sử dụng thuốc

hóa học khơng hợp lý, sữ dụng lâu dài sẽ kéo theo các vấn đề như: ảnh hường tới

sức khóe con người và động vật, tăng khả năng hình thành tính kháng thuốc cùa sâu
DỖ Thị Ngọc Huyền 1

Lớp: CNSH-1103


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

bệnh, tiêu diệt hệ thiên địch, phá vỡ cân bằng sinh học, gây hậu quà xấu tới môi

trường. Các nhà khoa học trên thế giới đã nỗ lực nghiên cứu đế tạo ra giống cây
chuyến gen đế kháng bệnh, nhưng việc tìm kiếm công nghệ sản xuất các chất sinh

học không độc hại đế phòng trù nấm sinh độc tố trên cây trồng và hạt nơng sán vẫn
là phương pháp kiềm sốt hàng đầu.

Các syringomycin (SR) gồm A|. E và G, trong đó syringomycin E (SRE) là
nhóm chính và được nghiên cứu nhiều nhất (Segre et al„ 1989). SRE có khối lượng

phân tử là 1240 kDa. SRE có hoạt tính kháng nhiều loại nấm mốc và nấm men gây
bệnh trên thực vật như Candida, Cryptococcus, Geotrichum candidum, Rhodotorula
pilimance, Botrytis, Fusarium. Pythium ultimum, Rhizotonia, Greeneria uvicola,

Asprgillus japonicas, Mucor sp., Trichophyton sp., Curvularia brachyspora,
Nigrospora sphaerica, Penicillium thomii và Penicillium sclerotionrum, SRE có

khà năng diệt 95 - 99% nam moc Aspergillus (Aspergillus flavus, Aspergillus niger,
Aspergillus fumigatus) và Fusarium (Fusarium moniliforme và Fusarium
oxysporum) à nồng độ từ 1,9 den 7,8 pg/ml ( De Lucca et al., 1999). Khả năng
kháng nấm men cũỉrSR tốt hơn nấm ’ntdc; Tuy nhiên, chúng khơng có khà năng ức

chế vi khuấn (Sinden et al., 1971; Mekki, 2009).

Nâng cao chất lượng SRE từ chủng Pseudomonas syringae là một trong yếu
tố công nghệ quan trọng. Yukie và cộng sự (2009) gây đột biến với mục đích nâng
cao khà năng sinh SRE bang tia uv. U.S. Patent so 5, 576. 298 đã nghiên cứu đột

biến transposon từ chúng dại p. syringae MSU 174. Nhiều nghiên cứu khác cũng

thông báo sự sinh SRE thay đổi trong những chủng dột biến (Patent số wo
2012173942A2; wo 00/63240 Al). Do đó. tác nhân đột biến được xem như có
tiềm năng trong việc cái thiện sàn lượng SRE ở vi khuẩn p. syringae. Chính vì vậy,
chúng tơi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: ‘'Nghiên cứu tạo chủng đột biến nhằm

nâng cao sản lưọng syringoinycin E.”

ĐỖ Thị Ngọc Huyền 2

Lóp: CNSH-1103

Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

MỤC TIÊU
Lựa chọn được thế đột biến có khá nàng sinh tống hợp SRE với hoạt tính >

40 u/ml
NỘI DUNG NGHIÊN cút

-

Nghiên cứu gây đột biến chúng p.syringae PS 120 bằng tia uv

-

Lựa chọn thê đột biên có khả năng sinh tơng hợp SRE cao

-

Xác định hàm lượng SRE từ các thể đột biến lựa chọn

-

Quan sát đặc điếm hình thái khuấn lạc và tế bào chủng p.syringae PS 120

và thế đột biến p.syringae PS 120-15
-

Nghiên cứu động thái của quá trình sinh trưởng của chủng gốcP.syringae

PS 120 và thề đột biến p.syringae PS 120-15

-

Nghiên cứu tính ồn định cùa thế đột biến p. syringae PS 120-15

ĐỖ Thị Ngọc Huyền 3

Lớp: CNSH-1103


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội
PHÀN 1. TÓNG QUAN

1.1. Tổng quan về syringomycin E
Syringomycin E (SRE) là một trong những chất được nghiên cứu nhiều nhất

tronghọ lipodepsipeptide được sinh tong hợp bởi một số chùng vi khuấn thuộc chi
Pseudomonas đặc biệt là các chủng Pseudomonas syringaepv.syringae.

Syringomycin E đã được chứng minh đóng vai trị quan trọng trong sự tương
tác vi khuẩn- thực vật bởi khả nàng làm tăng tính độc của vi khuẩn trong thử
nghiệm in vitro (N.s. lacobellis et al„ 1992). Bên cạnh đó, SRE có đặc điếm nối bật
là khả năng diệt nấm, đặc tính này phụ thuộc vào sự có mặt cùa C1 trong đầu c cúa

cấu trúc protein cúa SRE (I. Grgurina et al„ 1994). Tính chất này được sử dụng là
một trong những phương pháp diệt nấm bằng biện pháp sinh học với các chủng nam

như Geotrichum candidum, Rhodơtorula pilimance, Botrytis cinerea, Fusarium,
Pythium ultimum, Rhizoctonia, Greeneria uvicola,Aspergillus japonicus, Mucor sp.,
Trichophyton sp., Curvularia brachyspora, Nigrospora sphaerica, Penicillium

thomii và Penicillium sclerotiorum.. .lànhững loài thường gây thối hởng quà sau thu
hoạch.
Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội
Do SRE dược sinh tông hợp bới vi khn Pseudomonas và được tiết ra trong
dịch ni. Vì vậy, đế tách chiết và thu nhận kháng sinh SRE từ dịch lên men,

nguyên tắc quan trọng đó là dựa vào các tính chất của chất kháng sinh được tạo
thành sau lên men, gồm có: i) tính chất hóa học của chất kháng sinh ờ dạng chất

bazơ yếu. axit yếu, chất trung hịa điện tích, dạng phân cực hoặc khơng phân cực; ii)
tính chất vật lý của kháng sinh gồm: tính tan của kháng sinh, dộ ben pH, dộ ben

nhiệt, độ bền trong các loại dung môi khác nhau. Từ các tính chất của kháng sinh đế
có thê kháo sát và áp dụng các phương pháp thích hợp thu nhận kháng sinh với hiệu

suất cao nhất (Richard và cộng sự 1998).

1.2. Cấu trúc của SRE
Cấu trúc phân tứ SRE là một lipodepsipeptide, được tạo thành bời 9

amino axit và hydroxy axit béo chứa 12 nguyên từ c ờ dạng amide (A. Segreer al,

1989; N. Fukuchi, 1992). Công thức phân tử cùa SRE: C53H85CIN14O17 , khối

lượng phân từ M= 1225,78 thể hiện ờ hình 1.1:

DỖ Thị Ngọc Huyền 4

Lớp: CNSH-1103


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Syringomycin E
Các syringomycin gồm A|, E và G. Trong đó, SRE được nghiên cứu nhiều

nhất. Cấu trúc SRE gồm một acid béo mạch dài. không phân nhánh và chín acid

amin khép vịng, ưa nước, tích điện dương. Trình tự acid amin cùa SRE là SerScr-Dab-Dab-Arg-Phe-Dhb-4(Cl)Thr-3(OH)Aspdược khép vịng tại nhóm 0-

cacboxyl của đầu cuối cùng c với nhóm OH cúa đầu cuối cùng N nhờ quá trình

acetyl hóa được xúc tác bời acid 3-hydroxydecanoic. Syringomycin A| và G khác
với SRE ờ acid béo trong cùng là 3-hydroxydccanoic.

Syringotoxin và syringostatin liên quan đến lipodepsinonapeptides được
sàn xuất bời các chùng phân lậpP. syringae từ cam, quýt và cây tử đinh hương.

1.3. Tính chất của SRE
SRE tan trong nước và tan trong cồn nồng độ thấp, không tan trong ether

và chloroform. Điếm đăng điện ờ pH 7. Hoạt tính kháng sinh cùa SRE không bền

trong dung dịch kiềm, đặc biệt tại pH 8 và bền trong HC1 IN, bền ở nhiệt độ cao,
không bị ánh hường bới tia cực tím. SRE có hoạt tính kháng nhiều loại nấm mốc

và nấm men. Khá năng kháng nấm men của SRE tốt hơn nấm mốc. Tuy nhiên,
chúng khơng có khá năng ức chế vi khuan (Sinden et al., 1971; Mckki.2009).

DỖ Thị Ngọc Huyền 5

Lớp: CNSH-1103


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

1.4. Co' chế tác động của SRE tói vi sinh vật gây bệnh
Các nghiên cứu gần đây tập trung nhiều vào cơ chế kháng nam cúa các
lipodepsinonapeptid mạch vòng nhò. cấu trúc lipopeptide amphipathic cùa SRE
thúc đấy sự tương tác với màng nguyên sinh chat. SRE làm tăng sự thu nhận

tetraphenylphosphonium nên dẫn đến tăng điện thế màng. Điều này gây nhiều

biến đồi như thêm H+ và mất K+ dần đến tế bào bị chết. Trong khi các nghiên cứu

khác chi ra rằng việc mất K+ và thêm H+ làm thay đối pH gradient màng nguyên
sinh chất. Cùng với sự trao đồi của K+ và H+, SRE cũng kích thích sự xâm nhập
cùa Ca2+. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu tập trung vào mơ tã tính chất

và sự hình thành kênh của SRE bằng màng lipid nhân tạo. Kết quà nghiên cứu cho
thấy SRE tạo nên kênh phụ thuộc vào điện thế trong màng hai lớp nhân tạo. SRE

tạo nên các lỗ dị (bán kính Inm) khơng đặc hiệu mà cation hóa trị 1 và 2 đều

thấm qua dược. Có ít nhất 6 phân tử SRE tham gia vào quá trình hình thành kênh
(Hutchison et «/.,1995; Feigin et al.,

1996; Hutchison và Goss, 1997).

Ostroumova cho rang các kênh SRE lớn hơn tại vị trí trans với bán kính 0,5-0,9
nm và 0,25-0,35 ntỊt^ẩ/ vì
ẻỉềtì ^ỖỂtjÀ9íaỉ^ít9ầẲỊ%ể!^PảRE là khơng đối
xứng (Ostroumova et al., 2007). SRE tạo ra hai loại kênh nhỏ và lớn khác nhau về
độ dẫn điện từ 6 đến 7 lần (Schagina et al., 1998; Kaulin et al„ 1998). Các kênh
SRE có khá năng đóng mờ đồng thời giúp tăng đáng kể độ dẫn. Tuy nhiên, các

kênh này bị bất hoạt bới nhiệt độ (Schagina et al., 1998; Malev et al., 2002).

1.5. Cơ chế sinh tổng họp SRE
Theo Mekki (2009), trong các lipodepsipeptidcs thì sinh tống hợp SRE được
nghiên cứu sâu nhất. Người ta đã tách dòng gen syringomycin (syr) từ chủng p. s.

pv. syringae B301D. Gen này có kích thước là 37kb, mã hóa cho các protein
(SyrBl, SyrB2, SyrC và SyrE) liên quan tới quá trình sinh tồng hợp SRE. Gen syrE
mã hóa cho synthetase có khối lượng 1039 kDa chứa 8 module hoạt tính axit amin.

Gen syrB chứng minh là đóng vai trị quan trọng trong sinh tơng hợp SRE. SyrBl là
protein có khối lượng 68 kDa mang vùng adenyl hóa và thio hóa. SyrB2 là protein
có khối lượng 35 kDa. Gen syrC nam giữa syrB và syrE, mã hóa cho protein có

khối lượng 48 kDa tương tự như một vài protein chứa motif enzym thioesterase.

DỖ Thị Ngọc Huyền 6

Lớp: CNSH-1103


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

Gen syrD mã hóa cho protein có khối lượng 63 kDa tham gia vào q trình tiết
SRE. Bên cạnh đó, gen syr cịn tống hợp protein SyrP có khối lượng 40kDa. SyrP

cũng được xác định có tham gia vào con đường truyền tín hiệu để dịch chuyền gốc
phospho, bời vậy người ta cho rang SyrP là một thành phần cúa kinase tham gia vào

q trình điều hịa sản xuất SRE. SyrA cũng là gen mã hóa cho một protein điều hịa
sinh tổng hợp SRE.

Cơ chế điều hòa sản xuất SRE rất phức tạp và phụ thuộc vào yếu tố dinh dưỡng

và các tín hiệu thực vật. Ví dụ, sát kích thích tạo SRE, các ion hữu cơ phosphate ức
chế sinh tông hợp SRE. Q trình điều hịa tống hợp SRE đã được nghiên cứu kỹ.

Gen lemA và gacA mã hóa cho các protein trong hệ thống truyền tín hiệu cám ứng
hai thành phần cúa Pseudomonas syringae Pv syríngae có tác dụng điều hòa khả
năng sinh SRE. LemA là một protein histidin truyền tín hiệu qua màng dược hoạt
hóa bởi tín hiệu ngoại bào phosphorylate gacA. GacA hoạt hóa q trình dịch mã.
Các chúng đột biến lemA hoặc gacA sẽ khơng có khá năng sinh SRE.

1.6. Các điều kiện nuôi cấy chung p.syringae cho sinh tống họp SRE

Mơi trườngìểìítóÀ^tịn^ VầPtii^li^ềVtíịn^PoẰl^pỉcíQAnh sản xuất SR.

Các chúng p. s. pv. syringae khác nhau thì khá năng sinh tổng hợp SR trên các
loại môi trường là không giong nhau. Trong khi đó, chúng B301D lại cho sản

lượng SR là 1024 u/ml trên cả 3 môi trường SRM (SR-minimal); SRM-M (môi

trường SRM cải tiến) và PDB (potato-dextrose broth). Chúng B3A cho sán lượng
SR là 2048 u/ml trên môi trường PDB nhưng không sinh SR trên môi trường
SRM (Gross, 1985). Tác già Gross và Devay (1977a) cho ràng lượng SR tạo ra

khi chững p. syringae được lên men tĩnh trên môi trường PDB cao hơn gấp 20 và

136 lần khi lần lượt lên men trên môi trường PDA (potato-dextrose agar) hoặc lên

men lắc trên PDB. Ảnh hưởng của môi trường lên men đến sán lượng SR lại một

lần nữa được khang định trong nghiên cứu của các tác già Neil và Dennis (1994).
Chủng p. s. pv. syringae 5D428 chi cho sàn lượng SR là 1 u/ml trên môi trường
PDB nhưng cho sản lượng SR lên tới 1280 u/ml trên môi trường SRMAp (môi

trường SRM bô sung arbutin và D-fructose). Như vậy, khã năng sàn sinh SR
không những chịu ánh hường cùa mơi trường ni cấy mà cịn phụ thuộc vào các
DỖ Thị Ngọc Huyền 7

Lớp: CNSH-1103


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

chúng nghiên cứu. Trong một nghiên cứu khác, tác giả Yukie công bố sản lượng
SRE tăng lên đen 50 mg/1 khi sử dụng môi trường lên men cái tiến (ISM) với các

thành phần sau: 1% glucose, 1% manitol, 0,4% histidine, 0,8 mM MgSOj và 0,01
mM FeClj trong 0,8 mM đệm potassium phosphate pH 7 (Yukie el al.. 2009).

Quá trình sinh tồng hợp và hoạt tính cúa SRE từ chủng p. syringae phụ
thuộc rất nhiều vào các tác nhân như sat, photpho vô cơ, nguồn nitơ, glucose.
Tương tự như các chất trao đổi chất thứ cấp từ vi khuẩn, sắt và photphat vô cơ ánh

hường tích cực tới q trình sinh tống hợp SRE bởi p. s. pv. syringae B301D.

Chúng vi khuần này chi tạo 16 đơn vị SR/ml trong môi trường PDB. Tuy nhiên,
khi bổ sung sắt với nồng độ 2 pmol/l vào mơi trường PDB thì hoạt tính SR đạt cao

nhất là 1024 u/ml sau 4 ngày lên men. Nồng độ photphat cũng ânh hường rất lớn
đến sân lượng SR. Nồng độ phosphate lớn hơn 1 mmol/1 hoặc dưới 0.4 mmol/l
đều làm giám sàn lượng SR. nồng dộ thích hợp nhất từ 0,5 đến 0,8 mmol/1. Nguồn
nitơ tốt nhất cho sinh tồng hợp SR là L-histidine với nồng độ 20 mmol/l. hoạt tính

SR đạt 2048 u/ml. Mơi trường thiếu L-histidin thì vi khuấn không phát triền. Với
nguồn nitơ là L-isofeầyinỴb^iysin và L-serin tliì Íioạttính SR chíđạt 4 đến 8 u/ml.

D - glucose và magnesium sulphat cân thiết cho sự phát triên và sàn sinh SR.
Nồng độ glucose lớn hơn 1% tạo sản lượng SR lớn nhất, từ 1024 đến 2048 u/ml.

Chùng này không phát triển khi môi trường thiếu glucose hay magnesium sulphat.
Công thức môi trường tối ưu cho sinh tống hợp SR được mô tả như sau: 1% D-

glucose; 0,4% L-histidine; 197,2 mg/1 MgSOj.7H2O (0,8 mmol/1); 128 mg/1

potassium phosphate (0,8 mmol/1); 2,7 mg/1 FcCl (10 mmol/1); pH 7,0 (Gross,
1985). Axit casamino kích thích sự tiết SR. Một số chủng chi sinh SR khi bồ sung

axit casamino vào môi trường PDA (Sinden et al., 1971). Môi trường PDA bổ
sung 0,4% axit casainino là môi trường tốt nhất cho sán xuất SR. Chế phẩm SR

sau tinh sạch có hoạt tính lên đen 47,9 u/pg (Gross and Devay. 1977c). Các tín
hiệu thực vật như arbutin và D - fructose cũng đóng vai trị trong quá trình sinh

tống hợp SRE. Theo tác giả Neil. 90% chùng p. s. pv. syringae tạo SRE khi môi
trường nuôi cấy được bo sung arbutin và D - fructose, trong đó có 13 chủng có

ĐỖ Thị Ngọc Huyền 8

Lóp: CNSH-1103


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

khả năng sinh SRE với hàm lượng cao hơn gấp 10 lần, một số chủng chi sinh SRE
khi môi trường bố sung chất này (Neil and Dennis, 1994).

Nhiệt độ và thời gian lên men cũng là một trong những yếu tố ânh hưởng
đen sàn xuất SR. Sinden (1971) cho ràng nhiệt độ thích hợp cho p. s. pv. syríngae
phát triển là 30°C nhưng tại nhiệt độ này thì chúng p. s. pv. syringae khơng sản

sinh SR. SR chí dược sinh tổng hợp trong khống nhiệt độ từ 15°c đến 27°c và

thích hợp nhất là ở 24°c. Cơ chế phân tử về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sản sinh
chất trao dổi thứ cấp vẫn chưa được hiểu rõ. Người ta cho răng nhiệt độ ânh

hướng trực tiếp đến sự hình thành và hoạt tính của các enzym được sinh tống hợp.
Các chùng vi sinh vật khác nhau, điều kiện lên men khác nhau (lắc hay tĩnh) dẫn

đến thời gian thích hợp cho sinh tong hợp SR cũng không giống nhau. Thời gian
tổng hợp SR thường từ 3 đến 14 ngày. Sán lượng SR cao nhất khi tế bào phát triền

cực đại. Việc sản sinh SR trong suốt q trình lên men khơng ánh hường tới sự
phát triền của p. syringae. Ngưỡng gây độc của SR đối với chúng p. syringae từ

800 đến 6400 u/ml, cao hơn gấp nhiều lần so với chúng G. candidum (100 u/ml).
pH mơi trường cũng khơnsM tójr^sfểhếu các điều kiện
lên men khác thích hợp cho sự phát triển của vi khuân (Gross and Devay, 1977c).
1.7. Một số phương pháp thu hồi SRE

Chiết xuất và thu nhận SRE đóng vai trị quan trọng trong cơng nghệ sán
xuất chất này. Dịch sau lên men được bo sung acetone với the tích tương đương

(HCI 0,46 N trong aceton). Hỗn dịch được ly tâm đế loại xác tế bào và thu dịch
nổi. Các dung môi hữu cơ thường dược sử dụng đổ chiết xuất SRE là acetone,
isopropanol, n-butanol, hỗn hợp isopropanol + 4% axit acetic, hỗn hợp
methanolmước (Gross and DeVay, 1977c; Ashok et al., 1987; Yukie et al., 2009;
Massimiliano et al„ 2011). Để tinh sạch SRE có thể được thực hiện bằng cách cho

qua sac ký cột CM cellex, sac ký trao đồi cation, cột Amberlite XAD-2, cột LC8

Brownlee Aquapore RP-300 (4,6-250 mm)...Tác già Sinden (1971) đã đánh giá
hoạt tính kháng nấm của SR sau mỗi bước cùa quy trình tách chiết chất này từ
dịch lên men chúng p. syringae. Sau khi chiết bang acetone 50% và 60% (v/v),

hoạt tính SR là 190 u/mg, hiệu suất thu hồi 91%. Tuy nhiên, hoạt tính của SR

DỖ Thị Ngọc Huyền 9

Lớp: CNSH-1103


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

tăng lên đáng kể khi chiết bàng butanol, đạt 230 đơn vị SR/mg, hiệu suất thu hồi
55%, độ tinh khiết gấp 7 lần. Neu quá trình tinh sạch SR lần lượt trái qua các bước

như 50% acetone-HCl, 60% acetone, n-butanol, cột trao đối ion CM52, sắc ký bản
mỏng và cột CM52 thì sán pham SR cuối cùng có độ tinh khiết gap 561 lần so với
chiết bằng acetone (Gross and DeVay, 1977c). Trong công bố của Michael (1995)

cho thay lượng SR tạo ra bởi chủng p. syringae B301D đạt từ 10 đen 15 mg/1 môi

trường lên men ở điều kiện invitro. Trái qua các bước tinh sạch bằng cách sử dụng
cột XAD-2,XAD-7 và cột Sephadex G-25 thì hoạt tính của SR và SRE tương ứng

là 26 và 18U/pg.

1.8. Nguồn thu nhận SRE

Lựa chọn chúng p. syringae sán sinh SRE cao là một trong các yếu tố cơng

nghệ quan trọng. Mặc dù có ý kiến cho rằng có mối quan hệ giữa khâ năng sinh

syringomycin (SR) với khả năng gây bệnh trên thực vật của p. s. pv. syringae.
Tuy nhiên một số nghiên cứu đã cho thấy không phải chủng p. s. pv. syringae gây

bệnh nào cũng sàn sinh SR. Otta và English (1971) dã phát hiện 25% trên tống số
351 chủng gây bệnh thổi tTỈục'trến^cí^ tìày'Cơn ìcííắnụ^inh SR. Trên thực tế,
những chung không gây bệnh trên cây thuốc lá là những chủng biếu sinh (sống
trên bề mặt cây nhưng không phái là vi sinh vật ký sinh) song những chủng này
vẫn sinh SR (Neil and Dennis, 1994).

Chung p. syringae được phân lập từ phần bị bệnh trên quà mận. anh đào,
đào, đậu đỗ, cù cải đường, cà chua, ớt, chanh, các loại quá hạch. Đe định loại

chùng vi khuân p. syríngae phải dựa trên hai nhóm phép thừ LOPAT và GATT,
kết hợp với quan sát hình thái và đặc diễm sinh lý, sinh hóa, tính chất huyết

thanh...(Mohammadi et al„ 2001). Theo Gross vàDevay (1976), trong số 75 chung

p. syringae phân lập thì 55/75 chúng có khá năng sinh tổng họp SR. Một số chủng
có khá năng sinh SR lên tới 3.300 u/ml. Các chùng Pseudomonas khác, bao gồm

p. pisi; p. tabaci; p. mori; p. tomator; p. coronafaciens; p. phaseolicola; p.
fluorescens; p. cepacia; p. avenae...đều khơng có khá năng sinh SR. Như vậy chi

có chúng p. syríngae mới có khả năng sinh tồng hợp SR (Gross and Devay, 1976;

Nail and Dennis, 1994).

ĐỖ Thị Ngọc Huyền 10

Lớp: CNSH-1103


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

1.9. Đặc điếm của chủng vi sinh vật sinh Syringomycin E
Hiện nay p.syringae là một trong những vi khuân được nghiên cứu với vai
trị là tác nhân kiềm sốt sinh học cho nhiều cây trồng trước và sau thu hoạch.
p.syringae là loại vi khuân biếu sinh phổ biến trên rau quà. có khá năng sàn sinh

một số chất kháng sinh (lacobellis et al., 1992) và các chất bề mặt sinh học có hoạt
tính kháng sinh.

Nhiều nghiên cứu cho thấy chúng p. syringae có hiệu q phịng
chốngPenicilium digitatum trên cam qt, p. expansum và B. cinerea (rên quá lê và

táo, M.Fructicola và R. stonolifer trên đào, Venturia inaequalis trên táo, E. coli

0157:H7 trên táo, ức chế Plasmopara viticola và Uncinala necator trên nho (Bull et

al., 1997).

Năm 1995, Tồ chức Bào vệ môi trường của Mỹ (EPA) đã chứng nhận và cho
phép sử dụng các sán phâm kiêm sốt sinh học phịng chơng bệnh sau thu hoạch

trên quà là BioSave 10 và BioSave 11 sàn xuất từ chúng p. syringae ESC-10 và

ESC-11 (Takemoto et al., 2010). Các che phẩm thương mại này dã dược phê duyệt
cho sử dụng phòng chổng c'acndM^DC'liM mu^odch trên IquàQẩm, quýt, táo, lê và

có khả năng ức chế các chi Botrytis, Penicilium, Mucor, và Geotrichum. Khã nãng
sinh SRE cúa chúng p. syringae ESC-10 và ESC-11 đã được nghiên cứu. Khi xứ lý
bào tư chúng Penicilium digitatum với liều 5,26 hoặc 5,45 pg/ml SRE từ chúng

ESC-10 và ESC-11 có đến 99% bào từ của chủng nam này không nảy mầm. Tuy

nhiên, khi ứng dụng để kiếm soát bệnh mốc xanh trên chanh thì lượng SRE cần sứ
dụng cao hơn lượng sử dụng để ức chế P. digitatum (Bull et al., 1998).

1.9.1. Đặc điểm hình thái

Migula (1984) định nghĩa các chi Pseudomonas gồm tất cá các vi khuân hình
que. gram âm. hiếu khí, trao đối chất hữu cơ và di động bới một hoặc nhiều tiên

mao. Ngày nay, dinh nghĩa này đã được làm rõ hơn bới phân tích các đặc diem phân
tử bang 16S rDNA. Chùng Pseudomonas âm tính poly-0-hydroxybutyrate, phát

huỳnh quang, có khả năng là các lồi điển hình p. aeruginosa và p. syringae, chúng
thuộc nhóm Ỵ- Proteobacteria. Hau hết các chủng Pseudomonas dương tính với

ĐỖ Thị Ngọc Huyền 11

Lớp: CNSH-1103


Khóa luận tốt nghiệp

poly-P-hydroxybutyrate,

Viện Dại học Mở Hà Nội

khơng

phát

huỳnh

quang

thuộc

chi

Acidovorax,Burkholderia và Ralstonia, chúng thuộc nhóm P- Proteobacteria.

p.syringae là vi khuan gram âm, hình que thuộc ngành Proteobacteria, lớp
gramma Proteobacteria, bộ Pseudomonadales, họ Pseudomonadaceae (Anzai at el.,

2000). Chúng p. syringae pv. syringae được phân lập đầu tiên từ cây từ đinh hương

năm 1899 bời M. w. Bcijcrinck và được miêu tả như Phytomonas vignae và
leguminophila Burkh (Burkholder, 1930), sau đó nó được xác định đặc điểm và đặt

tên là Pseudomonas syringaevan Hall bới tác già Van Hall (Palleroni, 1984; Young,
1991). Trong những năm 1970, khoảng 40 loại vi khuẩn thực vật với các đặc điếm

liên quan tới p. syringae pv. syringae đã được miêu tá. về sau chúng được nhóm lại

thành một loài p. syringe (Doudoroff and Palleroni. 1974) gồm một số dưới lồi

được gọi tên thành “pathovars” (pv). Tính khơng đồng nhất cao của p.syringae dẫn
đen việc chia loài thành 57 pathovars (lồi phụ) và 9 genomospccies.

1.9.2. Dặc điếm ni cấy

Khuần lạc p. syringae có đường kính 1,5-2,0 mm trên mơi trường King's B
TÚ.
V!i.. n.: 1... lí
in xự:
cải tiến sau 2 ngày nuôi cấy và 3-3,5 mm sau 3 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phịng
(Mohan and Schaad, 1987). Mơi trường King’s B cãi tiến ngăn chặn sự phát triển

cùa một số vi sinh vật hoại sinh. Ban đầu khuẩn lạc cúa các chủng phân lập có hình

dạng mờ đục, nhẵn, có mép gồ ghề, tỏa đều, khi ni cấy ớ nhiệt độ 23-25°C trong
2 tuần khuẩn lạc sẽ chuyến sang màu xanh lá cây trong suốt (Devay et al., 1968).

Sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường King’s B cải tiến, khuấn lạc tròn, mờ và màu
trang kem. Sử dụng môi trường King's B cài tiến là môi trường sàng lọc tốt với

p.syringae từ hồn tạp các chúng Pseudomonas spp.
Goszczynska và Serfonteni (1998) dã chứng minh sử dụng môi trường bán
chọn lọc, ví dự Sữa-Twen trong đó có proteose peptone số 3, sữa tách kem. Tween

80. tyrosine, CaCK, cephalexin, cyclohcximide và vancomycin, có thơ phân biệt
p.syringae pv. syringae từ p. syringae pv. phaseolicola và Xanthomonas

axonopodis pv. phaseoli.

ĐỖ Thị Ngọc Huyền 12

Lớp: CNSH-1103


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

1.9.3. Đặc điếm sinh lý và sinh hóa

p.syringae là vi khuân hiếu khí, di động, hình que cùng với một hoặc một số
tiên mao. Nó tạo sắc tố huỳnh quang trên mơi trường King’s B. Vi khuấn này âm

tính với oxidase nhưng có hoạt tính tyrosinase và hình thành levan. Hoạt tính
arginine dihydrolase âm tính. Nó thúy phân aesculin và hóa lỏng gelatin, sinh axit
từ sucrose, sử dụng axit quinic myo-inositol. D-mannitol và bctanine nhưng khơng

sử dụng homoserine hoặc L-tartaric acid. Nó có khả năng kháng huyết thanh ngưng

kết và điều này sẽ giúp phân biệt nó với các lồi Pseudomonas khác (Kaiser and
Ramos, 1980).
Vi khuân này phát triền trong dung dich mi khống với D-glucose và có

thế sử dụng amoni và amino dạng nitơ. Nó khơng có khá năng thủy' phân tinh bột,

cellulose và urea. Nó khử tetrazolium nhưng có thể hóa lơng các cơ chất
polypectane. Nó khơng hình thành bào từ và không sinh indole hoặc HịS. Nhiệt độ

tối ưu để vi khuẩn sinh trưởng là 25-30°C và pH tối ưu là 7-8 (Palleroni, 1994).

Hình 1.2. Khuấn lạc p.syringae trên mơi trường King B và phát quang dưói
ánh sáng tia cực tím ỏ’ bước sóng 365 nm

DỖ Thị Ngọc Huyền 13

Lớp: CNSH-1103


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

Hình 1.3. P.syringaeAvtờỉ kính hiền vi điện tử

1.10. ủng dụng của SRE
Nhiều nghiên cứu chứng minh SRE có hoạt tính kháng nhiều loại nấm sợi

và nấm men gây bệnh trên thực yật như Candida, Cryptococcus, Geotrichum

...

pSLIhuỵiỀn Viện DaihocMqJla .Neu ..__

candidum. Rhodotorula piltmance, Botrytis cinerea, Fusarium,Pythium ultimum,
Rhizoctonia, Greeneria uvicola, Aspergillus japonicus, Mucor sp.. Trichophyton

sp„ Curvularia brachyspora, Nigrospora sphaerica, Penicillium thomii và

Penicillium sclerotiorum. Tuy nhiên SRE không ức chế được vi khuẩn. Các

nghiên cứu cũng chi ra rằng khã năng kháng nấm men cùa SRE tốt hơn nam mốc.
SRE không gây độc đối với te bào động vật và không gây bệnh trên thực vật (De

Lucca etal., 1999; Yuki et al., 2009; Mekki, 2009; Takemoto et al„ 2010). Trong
số các chúng vi sinh vật nêu trên thì chủng G. candidum và chung R. pilimance có

độ mẫn cám cao với SR, do đó thường được dùng đế xác định khả năng sinh SR
cúa các chúng phân lập (Sinden et al„ 1971). SRE có kha năng diệt 95 - 99% nam

mốc Aspergillus (Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus) và
Fusarium ( Fusarium moniliforme và Fusarium oxysporum) ờ nồng độ từ 1,9 den

7,8 pg/ml. Độc tính cùa SRE đối với tế bào HeLa (dòng tế bào nghiên cứu ở
người) thường gấp 20 lần nồng độ SRE đề diệt 95% các nấm gây bệnh. SRE có
khà năng diệt bào từ nam đã này mầm của Aspergillus sp. và Fusarium sp., hiệu

DỖ Thị Ngọc Huyền 14

Lớp: CNSH-1103


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

quà hơn các peptide khác như cecropin A, cecropin B và dermaseptin. Kết quà thư

độc tính trên chuột và độc tính với tế bào đã chi ra rang SRE có tiềm năng phát

triển thành sản phẩm thương mại (De Lucca etal., 1999).

Chế phẩm nam đối kháng p. syringae ESC-10 với tên thương mại là
BioSave® -10LP đã được Tố chức Bào vệ mơi trường cùa Mỹ chứng nhận và cho
phép sử dụng đê kiêm sốt một sơ loại bệnh sau thu hoạch như bệnh mốc xanh,

mốc xám. bệnh bạc váy trên cam, quýt, các loại quả hạch và khoai tây (Takemoto
et al„ 2010). Khả năng sinh SRE cùa chùng p. syringae van Hall chúng ESC-10

và ESC-11 đã được nghiên cứu. Cá 2 chúng đều có khả năng sinh tống hợp SRE.
Mơi trường thích hợp cho các chúng ESC-10 và ESC-11 sinh tổng hợp SRE tương

ứng là SRMAF, PDB và hoạt tính SRE trong dịch lên men lần lượt đạt 16,8 u/ml

và 46,5 Ư/ml. Khi xứ lý bào tứ chủng Penicillium digitatuin với liều 5,26 hoặc
5,45 pg/ml SRE từ chúng ESC-10 và ESC-11 có đen 99% bào tử của chủng nấm

này không náy mầm. Tuy nhiên, khi ứng dụng để kiềm soát bệnh mốc xanh trên

chanh thì lượng SRE cần sử dụng cao hơn krựng sừ dụng đế ức chế chúng p.
digitatum (Bull eJ/h
Viện Đại học Mở Hà Nội

II. Đột biến sinh học

II. 1. Khái niệm về đột biến sinh học và phân loại đột biến

• Khái niệm
Đột biến là những biến đồi bất thường trong vật chất di truyền ở cấp độ

phân tư (ADN, gen) hoặc cấp độ tế bào (nhicm sac the), dần đen sự biến đối đột
ngột cùa một hoặc một số tính trạng, những biến đổi này có tính chất bền vững và
có thế di truyền cho các đời sau. Đột biến là quá trình xày ra đột ngột, riêng rè,
ngẫu nhiên, không định hướng ở cơ thế sống trong điều kiện tự nhiên. Đa số là đột
biến gen lặn và có hại, một số ít có lợi và có ý nghĩa rất lớn đối với q trình tiến

hóa và chọn giống. Những cá thế mang đột biến đã biếu hiện trên kiếu hình của cơ

thể gọi là thể đột biến

• Ngun nhân
Do tác nhân của mơi trường ngồi cơ thê (thường là do tác động của
con người) như:

ĐỖ Thị Ngọc Huyền 15

Lớp: CNSH-1103


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

Tác nhân vật lý: tia phóng xạ. tia cực tím, nhiệt độ...

Tác nhân hóa học: ánh hướng của nhiều chất hóa học như N-methyl-N’-nitro-N-

nitrosoguanidine (NTG), nicotine, cosinsin, dioxine (chất da cam)...
Do nguyên nhân hên trong cơ thề: Những biến đôi bất thường trong sinh lý,

sinh hóa trong tế bào (xuất hiện một cách tự nhiên).
Các tác nhân này khi sử dụng với liều lượng thích hợp sẽ giết chết hau hết

các vi sinh vật, những cá thề sống xót sẽ có sự biến đối ờ nhiễm sắc thế, gây ra đột

biến gcn liên quan tới cấu trúc của gen làm thay dối một hay nhiều nucleotit trong

trình tự mã hóa gọi là đột biến điểm. Đây là loại đột biến có ý nghĩa trong sản xuất,

làm thay đối tính trạng cũng có thế dẫn đến làm mất khà năng tạo RL (dột biến âm
tính) hay tăng cường.

Hình 1.4.ADN biến đổi sau khi bị tia tử ngoại chiếu vào

• Phân loại
Căn cứ vào tính chất xuất hiện đột biến, có thề phân chia thành các dạng

như sau:
- Đột biến gen: là những biến đối trong cấu trúc của gen xáy ra ở cấp độ
phân tứ tại một điếm nào đó trên phân tử ADN và có liên quan đến sự thay đối về
số lượng, thành phần, trật tự các cặp nucleotide trong gen. Có rất nhiều kiều biến

đổi về cấu trúc gen. Trong đó. những biến đổi liên quan đến 1 cặp nucleotide
trong gen được gọi là đột biến diêm. Trong tự nhiên, tất cá các gen đều có thế bị
DỖ Thị Ngọc Huyền 16

Lớp: CNSH-1103


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

đột biến nhưng với tần số rất thấp (1 O'6-10'4). Tuy nhiên tần số đột biến có thề
thay đơi tùy thuộc vào loại tác nhân đột biên, liêu lượng tác nhân gây đột biên và

cường độ tác động các tác nhân gây đột biến.
Các dạng đột biến gen tại một điếm thường gặp: 1/ Mất một cặp nucleotide

2/ Thêm một cặp nucleotide

3/ Thay thế một cặp nucleotide

4/ Đáo vị trí cặp

nucleotide.

- Đột biến nhiễm sắc thề (đột biến về cấu trúc nhiễm sắc thề như mất đoạn,
thêm đoạn, đáo đoạn hay chuyển đoạn). Đột biến số lượng nhiễm sắc thể (thể dị
bội, đa bội).

II.2. Các yếu tố ảnh hưỏng đến hiệu quả gây chết và tần số phát sinh đột biến

-

Liều lượng chiếu: Được đặc trưng bời 3 yếu tố là thời gian chiếu, khoảng

cách chiếu, độ pha loãng bào tứ. Thực nghiệm cho thấy những đột biến dương
thường xuất hiện ở những liều lượng chiếu có độ sống sót bào từ từ 0.1 - 1%, còn
đột biến âm thường xuất hiện ờ liều lượng chiếu có nồng độ sống sót cao hơn.

- Ánh sáng thường: Sau khi đột biến bang tia tứ ngoại, nếu đem chiêu ánh
sáng thường (bước sóWg\'='3)2^
thì
khốàng 50 - 80% tế
bào được phục hồi do tác dụng của men photolyase. Hiện tượng này được gọi là

quang phục hoạt.

Ngoài ra các yếu tố nhiệt độ. pH. môi trường nuôi cấy, trạng thái sinh lí cùa

vi sinh vật cũng ảnh hướng đến hiệu quá đột biến cùa ánh sáng uv.
Có hai phương pháp chiếu tia uv đó là phương pháp chiếu trực tiếp (direct

plate irradiation - DPI) và phương pháp chiếu dịch lòng (liquid plate irradiation -

LPI). Phương pháp DPI: trái dịch nuôi cấy vi khuẩn lên đĩa petri LPI: chiếu tia
uv lên dịch nuôi cấy vi khuẩn ờ thời gian thích hợp và trãi dịch dã chiếu tia uv

lên môi trường thạch.
11.3. Co' chế của đột biến bằng tia cực tím

Đối với các vi sinh vật, các tác nhân gây đột biến chu yếu là tia cực tím và
một số hóa chất.

Tia cực tím (hay cịn gọi tia tứ ngoại, tia UV) có bước sóng dài (10‘5 - 10 6
cm) nên khó tạo ion, có lẽ chi tác động đến những chất hấp thu nói trực tiếp.

DỖ Thị Ngọc Huyền 17

Lớp: CNSH-1103

Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

Mốiliên quan chặt chẽ giữa tia tử ngoại và các cấu phần của ADN đã được chứng

minh. ADN hấp thụ tia tử ngoại mạnh nhất ờ mức sóng 254 nm, đây chính là bước
sóng

làm

tăng

tần

số

đột

biến.

Tia cực tím có năng lượng thấp được hấp thụ bới bazo purine va pyrimidin
biến nó thành dạng hoạt hóa và kích động. Vì năng lượng của tia này thấp nên khả

năng đâm xuyên và mô chậm và thường chi xuyên vào lóp bè mặt tế bào của sinh

vật đa bào, nên nó thường có tác dụng gây đột biến đối với sinh vật đơn bào. Cơ
chế hấp thụ uv và gây tạo chất dễ hoạt hóa, khi cytosine + uv + H2O sẽ tạo

thành cytosine hydrat, khi có 2 thymine nam gần cạnh nhau + uv sẽ tạo thành

thymineC5=C5 thymine (thymine dimer). Các dimer cytosine-cytosine và

cytosine- thymine cùng được tạo ra nhưng rat ít. Tất cà các dimer đều có khả năng
ngăn cân q trình sao chép ADN. Đó cũng chính là lý do tại sao tia uv có the

gict chét dược các vi sinh vật.

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Đỗ Thị Ngọc Huyền 18

Lớp: CNSH-1103


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

Hình 1.5. Thymine dimer đưọ'c tạo ta bỏi tia uv
(Cytosine có thể hình thành 1 dimer giống nhau)

Hình 1.6. Co’ chế đột biến bằng tia uv

DỖ Thị Ngọc Huyền 19

Lớp: CNSH-1103

Khóa luận tốt nghiệp

Viện Dại học Mở Hà Nội

Đầu tiên tia uv làm cho hai gốc cytosine (C) liền kề hình thành dimer.
Trong quá trình sao chép ADN, cã hai sợi đơn được sừ dụng như sợi khuôn đề

tống hợp nên các sợi mới. Cytosine dimer bắt cặp với adenine (A) thay vì guanine

(G) hình thành sợi mới. Trong quá trình sao chép ADN tiếp theo, cc bị thay thế
bằng TT. Mặc dù cytosine dimer có thế được khơi phục nhưng đột biến không
dược phát hiện bới hệ thống sừa chữa ADN.
II.4. Hệ thống sửa chữa và bảo vệ ADN

Phân tử ADN là đối tượng tác động cùa các gốc tự do trong các phản ứng ion

hóa do hóa chất hoặc các chat alkyl hóa tạo ra. Các sai hóng trong q trình sao

chép ADN có thê được sứa chữa nhờ một hệ thống gọi là hệ thống sửa sai và bão

vệ ADN. Nhờ hệ thống này mà các thông tin di truyền cúa sinh vật ốn định và
sinh vật mới có khâ năng sống sót trên trái đất.

•

Sự hồi phục sau tác hại của tia uv ỏ’ Prokaryote nhờ hiện tưọTig quang tái

hoạt hóa.
Dưới tác dụng cùa tia uv, các đột biến gen sinh ra do tạo các pyrimidine
dimer. Neu sau khi sir lý iíà^V.^a^đẫằ tnẩồQỉt ngồi ánh sáng thì phần lớn sai

hóng được phục hơi. Hiện tượng này được gọi là quang tái hoạt hóa. Năm 1949,

Albert Kelner đã phát hiện thấy hiện tượng quang tái hoạt hóa ờ E. coli vừa được

xứ lý tia uv ra ngoài ánh sáng thường, hau như các sai hòng đều được sứa chữa,

các nghiên cứu sau đó đã chứng minh được rằng năng lượng của ánh sáng thường
đã hoạt hóa một loại cnzym có tên là enzym quang phục hoi (PRE) có khá năng

cắt các vịng pyrimidine dimer (thường là các thymin dimer). Đầu tiên, enzym này
nhận biết và gan đặc hiệu vào các dimcr (ở trong bóng tối). Khi chồ sai hóng được

chiếu sáng, năng lượng được sử dụng nhờ phức hệ enzym biến thymin dimer
thành các monomer. Sau đó, enzym tách ra. Ỡ người và các sinh vật Eukaryote,

người ta chưa phát hiện thay có enzym này.

ĐỖ Thị Ngọc Huyền 20

Lớp: CNSH-1103