Thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen xylan beta xylanase trong e coli sử dụng vectorpET 32a(+)

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
_____ ***_____

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội

Đề tài;“ Thiết kế vecrtor biểu hiện và biểu hiện gen
xylan-beta-xylanase trong E. coli sử dụng

vectorpET 32a(+)”

Giáo viên hướng dẫn:TS. Đỗ Thị Huyền

Sinh viên thực hiện: Hồng Thị Hưig
Lóp: CNSH- 11-02

Hà Nội, 2015


Khoa Công nghệ sinh học

Viện Đại học Mỏ' Hà Nội

LỜI CẢM ON
Trước hết, tơi xin bày tó lịng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Đỗ Thị

Huyền, Phòng Kĩ Thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam, đã tận tình hướng dan, dìu dắt tơi trong suốt q trình
hồn thiện luận văn này.

Tơi xin chân thành cám ơn các tháy cô giáo Khoa Công Nghệ Sinh Học - Trường
Viện Đại học Mớ Hà Nội đã giáng dạy, giúp đỡ tơi trong suất q trình học tập và
thực hiện luận văn.

Tơi xin gừi lời cám ơn tới tồn thê các anh, các chị làm việc và học tập tại Phịng

Kỹ thuật di truyền - Viện Cơng nghệ sinh học đã giúp đỡ chi bào tơi tận tình trong
suốt thời gian thực hiện luận văn .

Cuối cùng tôi xin gửi tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp lịng biết ơn sâu sắc vì sự
quan tâm, động viên yồ SỵP\ý

troi\g suọt qứá trình học. tập và hồn thành

luận ván.
Sinh viên thực hiện

Hoàng Thị Hưong

Hoàng Thị Hương


Khoa Công nghệ sinh học

Viện Đại học Mỏ' Hà Nội

MỤC LỤC

MỤC LỤC

NHỬNG TỪ VIẾT TÁT

DANH MỤC HÌNH VÈ

MỚ ĐÀU..................................................................................................................... 1

PHÁN I. TỎNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................. 2
I. Đại cương về xylanase................................................................................ 2

I.

1.1.1.

Phân loại xy lanase.................................................................................. 3

1.1.2.

Cấu (rúc của xylanase.............................................................................. 4

, ,_

Thu yien Yien Đại học Mớ Hà Nội

1.1.3.

Cơ chê xúc tác của xylanase....... ............................................................5

1.1.4.

Đặc tính của xylanase.............................................................................. 7

1.1.5.

Nguồn xylanase........................................................................................9

1.1.6.

ứng dụng của xylanase......................................................................... 10

1.2.

Biếu hiện gen................................................................................................ 13

1.2.1.

Hệ biểu hiện E. coli............................................................................... 13

1.2.2.

Chủng biểu hiện E. coli BL21 .............................................................. 15

1.2.3.

Vector biểu hiện pET 32a(+)................................................................ 16

PHÀN II.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU................................... 18

2.1

. Vật liệu.......................................................................................................... 18

Hoàng Thị Hương


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

2.1.1

Nguồn gen, chủngvisinhvậtvà plasmid................................................... 18

2.1.2

Hóa chất và enzyme................................................................................ 18

2.1.3

. Máy móc và thiết bị............................................................................. 18

2.1.4

Các môi trường và dung dịch................................................................. 18

2.2

Phươngphápnghiêncứu.................................................................................19

2.2.1.

Khuếch đại in vitro DNA bàng phán ứng trùng hợp polymerase (PCR). 19

2.2.2.

Phàn ứng nổi gen ngoại lai vào plasmid............................................... 19

2.2.3.

Phương pháp xừ lý DNA plasmid bằng enzyme cắt hạn chế............... 19

2.2.4.

Phương pháp điện di trên gel agarose................................................... 19

2.2.5.

Tinh chế DNA bằng QIAGEN được thực hiện theo hướng dẫn của nhà

sản xuât...... TlYu"việnViện"Đạí"hực"M'ờ'Hầ"NỘỈ.................. 20
2.2.6.

Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli bắng phương pháp

sốc nhiệt................................................................................................................ 20
2.2.7.

Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli..................... 20

2.2.8.

Phương pháp điện di trên gel polyacrymide - SDS............................ 20

2.2.9.

Cảm ứng, biểu hiện protein ngoại lai.................................................... 21

PHẦN III. KÉT QUẢ NGHIÊN cửu VÀ THAO LUẬN...................................... 22

3.1.

Thiết ke vector bieu hiện pET32a(+) mang gen xbx..................................23

3.1.1

.Khuếch đại gen xbx bằng kĩ thuật PCR................................................. 23

3.1.2.

Cắt sán phẩm PCR gen xbxvằ pET32a(+)bằng Ncoỉ+Xhoỉ................. 24

3.1.3.

Nối ghép gen xbx vào vector biểu hiện pET 32a(+)............................ 25

Hoàng Thị Hương


Viện Đại học Mỏ' Hà Nội

3.1.4.

3.2.

Khoa Công nghệ sinh học

Cắt kiểm tra pET.32-.rfer bàng Xhoĩ+Xbaỉ............................................ 27

Biếu hiện gcn xbx trong E. coli BL21......................................................... 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 32

PHỤ LỤC.................................................................................................................... 37

Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội

Hoàng Thị Hưong


Khoa Công nghệ sinh học

Viện Đại học Mỏ' Hà Nội

NHỮNG từ viét tẳt
Amp

Ampicicillin

Bp

Base pair

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

E. coli

Escherichia coll

EDTA

Ethylene diamine tetra acetic acid

EtBr

Ethidium bromide

IPTG

Isopropyl P-D-1 -thiogalactopyranoside

kb

Kilo base

kDa

Thư KÌậrDlítbận Đại học Mớ Hà Nội

LB

Luria - Bertani medium

M

Mol/L

PCR

Polymerase chain reaction

RNA

Ribonucleic acid

SDS

Sodium dodecyl sulphate

TAE

Tris acetate EDTA

Tyr

Tyrosinase

XBX

Xylan-beta-xylanase

Hoàng Thị Hương


Khoa Công nghệ sinh học

Viện Đại học Mỏ' Hà Nội

DANH MỤCHÌNH VẼ

Hình 1. Cấu trúc hóa học của xylan................................................................................ 2
Hình 2. Cấu trúc bậc 3 của xylanase GH10 từ s. lividans............................................. 4
Hình 3. Cấu trúc bậc 3 của xylanase GH11 từ s. paucimobilis...................................... 5
Hình 4. Cơ chế phán ứng thủy phân của xylan bởi xylanasecủa Bacillus circulans.... 7
Hình 5. Các enzyme cần thiết phân cắt hồn tồn xylan...................................................8
Hình 6. Bân đồ vector pET32a(+)................................................................................... 17
Hình 7. Sơ đồ thí nghiệm................................................................................................. 23

Hình 8. Phân tích sàn phấm nhân gen xbx bang kĩ thuật PCR....................................... 24
Hình 9. Phân tích sàn phấm nhân gen xbx bàng kĩ thuật PCR trên gel agarose 0.8% ..25

............ ,

. Thự viên Viện Đại học Mợ Hà Noi,

Hình 11. Kêt quâ điện di tách chiêt các dòng màng vector pET32-xèx......................... 26

Hình 12. Sơ đồ vị trí cắt của 2 enzyme giới hạn Xhoỉ và Xbaỉ...................................... 27
Hình 13. Ành điện di sản phẩm cắt pET32-xbx các dòng bang enzyme giới hạn Xhoỉ

và Xbaỉ trên gel agarose 0,8%........................................................................................ 28
Hình 14. Kết quà điện di kiếm tra protein tống số được biếu hiện ở các dịng tế bào
mang pET32-xfec............................................................................................................. 29

Hình 15. Điện di dịch tế bào sau khi siêu ầm đế kiếm tra sự biểu hiện ở pha tan cùa
protein xbx trong các dịng tế bào DE3-pET32a-xftx khác nhau.................................... 30

Hồng Thị Hương


Khoa Công nghệ sinh học

Viện Đại học Mỏ' Hà Nội

MỎ DÀU

Xylanase là enzyme được nhiều nhà khoa học quan tâm. Enzyme này có khả
năng thúy phân hiệu quá các xylan - là thành phần chu yếu cùa hemicellulose trong
thành tế bào thực vật.

Trước đây, việc nghiên cứu xylanase chu yếu được tiến hành trên đối tượng

nấm sợi. Tuy nhiên, gần đây cùng với sự phát mẽ của khoa học công nghệ, ngày
càng nhiều chúng vi sinh vật có khả năng sinh xylanase được phát hiện và nghiên
cứu sâu. Đong thời, các lĩnh vực liên quan đến enzyme xylanase và ứng dụng của

loại enzyme này ờ vi khuẩn được các nhà khoa học ngày càng quan tâm hơn.

Do nhu cầu sứ dụng xylanase trong nhiều lĩnh vực ngày càng tăng, đặc biệt

nhu cầu enzyme có hoạt tính mạnh, phân cát nhanh đẻ đưa vào ứng dụng trong công
nghiệp vẫn đang thiếu. Với mục đích tìm ra những loại xylanase có đặc tính tốt hơn,
chúng tơi thực hiện đề tài “Nghiên cứu biếu hiện và biếu hiện gen xbxs mã hóa

viện?VienJpai hod.__

xylan-beta-xylanase trong E. coll su dụng vector pE r-32a(+) nhăm thu được

xylanase tái tố hợp có tính tốt đẻ có thế ứng dụng thực tiễn. Đe tài dược thực hiện
tại Phòng Kĩ thuật di truyền. Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công

nghệ Việt Nam.
MỤC TIÊU

- Thiết kế thành công vector pET 32a(+) mang gen xbxs
- Biểu hiện thành cơng xylanase trongE.co/í' BL21.

Hồng Thị Hương


Khoa Công nghệ sinh học

Viện Đại học Mở Hà Nội

PHÀN I. TỊNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đại cương về xylanase

Xylanse có tên gọi khác là:p-xylanase; endo-l,4-p-xylanase; cndo-l,4-P-D-

xylanase;P-D-xylanase;endo-p-1,4-xylan

4-xylanohydrolase;

1,4-P-xylan

xylanohydrolase; P-l,4-xylan xylannohydrolase.
Tên hệ thống: 4- p-D-xylan xylannohydrolase.

Xylanase là enzyme quan trọng nhất tham gia thũy phân xylan[8. 20].

Xylanase thúy phân xylan bằng cách cắt dứt các liên kết p-1,4-glycoside.
a-rOMoOcLA

Hình 1. Cấu trúc hóa học của xylan
Xylan là thành phan chính cấu tạo nên hemicellulose cùa thành tế bào thực

vật và là một trong số hợp chất polysaccharide quan trọng nhất trong tự nhiên [24,
31].Xylanchủ yếu tìm thấy trong cấu trúc thứ cấp của thành tế bào thực vật và tạo
thành pha giữa lignin và các hợp chat polysaccharide khác[41].Xylan cũng là một

trong những polysaccharide pho biến nhất trong các lồi thực vật thơng thường,

chiếm 30% tổng trọng lượng khô trong sinh khối thực vật nhiệt đới. Với cây gồ

mềm ở vùng ôn dới, xylan ít phổ biến hơn và chiếm khoáng 8% tống trọng lượng
khơi 14],

Hồng Thị Hương

2


Viện Đại học Mỏ' Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Sự phân hủy sinh học bộ khung cấu tạo nên xylan phụ thuộc chù yếu vào hai
lớp enzyme: endo-l,4-P-xylanase(EC .2.1.8). lớp enzyme này thủy phân liên kết
1,4-P-glucoside nối với xylose và p-xylosidase (1,4-p-D-xylan xylaohydrolase; EC

3.2.1.37), lớp enzyme này thủy phân xylobise và xylooligosaccharid ngắn nhờ hoạt
động của enzyme endo-xylanasc. Các enzyme loại mạch nhánh chăng hạn như a-

glucoronidase và a-L-arabinifuranosidase và các esterase chẳng hạn như
acetylxylan esterase và ferulyl và p-coumaroyl esterase sẽ loại bó mạch nhánh
acetyl và mạch nhánh phenol [14]. Ớ cây gỗ rắn xylan có cơng thức O-acetyl-4-Omethylglucuron-oxylan. Arabino-4-O-methylglucuroxylan tìm thấy trong cây gỗ

mềm và arabinoxylan rat điển hình trong cây cỏ và thực vật bình thường khác [ 141.

1.1.1. Phân loại xylanase
Sự đa dạng cùa xylan dần đến sự đa dạng cùa enzyme xylanase[20]. Dựa vào
đặc điểm hóa lý, xylanase được phân thành 2 nhóm: một nhóm có phân tứ lượng
thấp (<30kDa) và pl acid, nhóm thứ hai .cộ phân tứ lượng cao (>30 kDa) và pl

..jnir Viện Viện Đại hỗcMợ riaTNoi

,

;

base.Mặc dù nhiêu xylanase phù hợp trong những nhóm này nhưng sơ lượng các

xylanase được mơ tá trước đây đã gia tăng rất nhiều và hiện tại nhiều xylanase có
những dặc tính trung gian được nhận biết khơng phù hựp với bất kỳ nhóm phân loại
trên nào. Từ 30 họ được xác định vào năm 1991, sự phân loại đã được cập nhật

thường xuyên với những enzyme mới phù hợp và hiện tạicó trơn 100 họ (GHI tới
GH 106)113|. Hau hết các họ bao gồm những enzyme với những đặc tính cơ chất
giống nhau.Tuy nhiên, nhiều họ lại có nhiều đặc điềm khác nhau, enzyme hoạt

động trên các carbonhydrate khác nhau. Việc tìm kiểm những cấu trúc liên quan

trong các họ khác nhau dẫn đến kết quả trong việc giới thiệu mức độ thứ bậc của sự

phân loại dược biết đến như là siêu họ hoặc quần hợp nhỏ.
Dựa trên sự tương đồng về amino acid và cấu trúc không gian các xylanase
thường được phân vào họ 10 (trước đây là F) và 11 (trước đây là G)| 12|. Hai họ này
lần lượt bao gồm các xylanase cùa các nhóm phân tứ lượng cao, pl thấp và phân tứ

lượng thấp, pl cao đã được đe cập trước đây; nhưng mồi họ bao gồm nhiều xylanase

Hoàng Thị Hương


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

khác với những đặc điếm hóa lý khác biệt rộng rãi từ hai nhóm này[6.38].Xylanase

thuộc hệ GH10 thuộc nhóm acid xylanase [42].Nhóm họ 10 bao gồm các enzyme
thủy phân cellobiose (dần xuất của cellulose) (exocellulase) và endo-p-l,3-xylanase
so với xylanase (endo-[3-l,4-xylanase) trong khi họ 11 là đơn tính chất, bao gồm các

xylanasc duy nhất.Xylanase thuộc hệ GHI 1 thuộc nhóm alkaline xylanase [42].
Một số lượng nhỏ các xylanase gần đây đã được xác định đặc diem không

xuất hiện sự tương tự phù hợp đối với họ 10 và II. Thay vào đó. những xylanase
này có những tương đồng dối với các enzyme thuộc họ cácenzyme thủy phân

glycoside, họ 5, 7. 8 và 43. Theo đó. nhóm các họ chứa các xylanase nên được mờ
rộng để bao gồm những enzyme mới này [12].

1.1.2. Cấu trúc của xylanase

Hình 2.Cấu trúc bậc 3 của xylanase GH10 từ s. Hvidans

Cấu trúc bậc 3 của endo-xylanase chú yếu được sắp xếp từ các mãnh p. Sự
khác nhau trong hoạt động xúc tác của các endo-xylanase của họ 10 và 11 được cho

là do sự khác nhau trong cấu trúc bậc ba cùa chúng, cấu trúc bậc ba của endo-

xylanase họ 10 và 11 được xác định cho hàng loạt các enzym. từ că vi khuấn và
nấm mốc.
Hoàng Thị Hương

4

Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Các thành viên họ xylanase 10 có cấu trúc a/p gấp cuộn tám lần và khối

lượng phân từ xấp xi 48 kDa.Cấu trúc toàn thế xúc tác cùa xylanase họ 10 như là

một cái thùng hình trụ được tạo thành từtám mánh p. Vị trí liên kết cơ chất của

endo-xylanase họ 10 ở khe xúc tác không sâu như với endo-xylanase họ 11. Điều

này, cùng với tính linh động hình thế lớn hơn có thẻ giãi thích ngun nhân cùa tính

đặc trưng cơ chất thấp hơn cùa endo-xylanse họ 10.

Hình 3. Cấu trúc bậc 3 của xylanase GH11 từ s, paucimobilis
Trong khi đó, họ xylanase 11 có cấu trúc mạch p gập hình bánh sandwich và

có khối lượng phân tứ nhở hơn, vào khoảng 20 kDa, pl cao và thủy phân các liên
kết glycoside với cơ chế xúc tác đổi chỗ hai lần[ 17, 19], Dựa trên cấu trúc toàn thể
xúc tác từ các manh nep gấp p tạo thành một vùng lõm với hai lớp xung quanh vị trí

xúc tác. Vũng lõm này được so sánh với lòng bàn tay và các ngón lay trong khi cái

vịng giống như ngón cái cùa tay phải. Cái vịng (loop) nhơ ra thành vùng lõm và
giới hạn trong một phân tứ isoleusin.

1.1.3. Cơ chế xúc tác của xylanase

Hàng loạt các mơ hình đã được đưa ra đe giài thích cơ che hoạt động của
xylanase. Xylanase thúy phân xylan. Sự thúy phâncó thể là kết quả cùa sự duy trì

hay nghịch chuyển của trung tâm anomeric cùa các monomer đường khừ cùa

Hoàng Thị Hương

5


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

cacbonhydrat. Sự dịch chuyến glycosyl thường dẫn đến trong sự thay thế tính ái
nhân ở cacbon bão hịa cùa trung tâm anomeric và diễn ra với sự duy trì hoặc

nghịch chuyền cùa cấu hình anomeric. Hau het các enzym thúy phân polysaccharide

kiếu như cellulase và xylanase được biết đến với sự thúy phân các cơ chất cùa
chúng với sự duy trì của cấu hình anomeric của Cl. Có sự liên quan của cơ chế dịch

chuyển kép cho sự duy trì anomeric của sàn phẩm. Cơ chế dịch chuyền kép bao
gôm các đặc diêm:

- Xúc tác axit với việc thêm một proton vào cơ chất.
- Một nhóm carboxyl cùa enzym ờ trạng thái hoạt động.

- Một liên kết trung gian cộng hóa trị glycosyl xuất hiện giữa enzym với
cacbonhydrat này trong đó cấu hình anomeric cùa đường tham gia liên kết này đối

lập với đường cùa cơ chat.

Hoàng Thị Hương

6


Khoa Cơng nghệ sinh học

Viện Đại học Mỏ' Hà Nội

Hình 4. Cơ chế phản ứng thủy phân của xylan bởi xylanase của

Bacillus cữculans
(A) Cấu trúc xylan xoắn là phù hợp với dạng lõm giữa Tyr 65 và Tyr 69. Glu

172 là tác nhân xúc tác axit/bazo và Glu 78 là ái nhân. (B) Glycone liên kết với Glu
78.Chất trung gian này được giữ lại trong suốt phán ứng chuyến glycosyl. (C) Nước
chiếm chồ của nucleophile. (D) Sự tách và khuếch tán cùa glycone (xylobiose) cho
phép sự di chuyền của enzym tới một vị trí mới trên cơ chất. Xylanase cùa họ 11

biểu lộ một cơ chếendo và ngẫu nhiên hơn trong quá trình phân cắt. Điều này là bời

vì aglycone được giải phóng ớ bước (B) và glyconc ờ bước (D) [22, 23].Leggio và
các cộng sự đề xuất rang Cữ chế xúc tác cùa xylanase là:
- Xylanase nhận biết và liên kết với xylan.
- Gốc xylosyl ờ vị trí 1 bị làm biến dạng và được thả xuống hướng về phía gốc xúc

lác, liên kết glycosidic bị cong và phá vỡ để tạo thành dạng liên kết cộng hóa trị
enzym-cơ chất trung gian.

- Chất trung gian bị tấn công bời một phân tứ nước hoạt động, tiếp theo đó cơ chế
thủy phân glycosyl co dien tiếp tục diễn ra và sần phẩm được giãi phóng [26Ị.

1.1.4. Đặc tính của xylanase
Trong trung tâm hoạt động của xylanase, axit amin quyết định sự hoạt động
cúa enzyme là axit glutamic [2]. Sự thúy phân xylan dõi hõi sự hỗ trợ hoạt động của
các thành phần trong hệ thống enzyme xylanolytic.

Hoàng Thị Hương


Khoa Cơng nghệ sinh học

Viện Đại học Mở Hà Nội

Hình 5. Các enzyme cân thiết phân cắt hoàn toàn xylan

1.1.4.1. Nhiệt độ hoạt động của xylanase
Mỗi enzyme đều có một khoảng nhiệt độ hoạt động nhất định. Trong khoảng

đó sẽ có một điềm nhiệt độ mà ezyme hoạt động mạnh nhất,gọi là nhiệt độ tối ưu.

Thông thường nhiệt <ỊỘ tốỊ

(fliajenzyme này không cố định mà phụ thuộc vào

nguôn sinh tông hợp xylanase, cơ chât, thời gian phàn ứng, pH môi trường... Qua

nghiên cứu cho thấy, nhiệt độ hoạt động tối ưu cho hầu hết xylanase cứa các họ vi
khuân là 50-80°C, từ nấm là 35-50°C. Neu nhiệt độ nằm ngoài khoảng nhiệt độ

thích nghi thì xylanase có thề bị biến tính tạm thời hoặc biến tính hồn tồn, khơng
thế phục hồi lại được.Mặc dù. hoạt tính xylanase cao nhất được xác định ở 80°C tuy
nhiên nó vẫn duy trì hoạt tính xấp xi 70% ở 90°C [29].

1.1.4.2. pH hoạt động của xylanase
Cùng giống như nhiệt độ, mỗi enzyme đều có khoảng pH hoạt động thích
hợp và một diem pH hoạt động tối ưu. pH môi trường ảnh hường rất lớn đen hoạt

độ enzyme vì nó ánh hường đến độ bền và mức độ ion hóa cơ chất cúa enzyme.

Xylanase sinh tổng hợp từ vi khuân thường hoạt động tối ưu ở pH từ 5.0 -

8,0. từ nấm men là pH 3,0 - 5,5 và bền ở dâi pH từ 4,0 - 8,0. Giá trị pH tối ưu của
xylanase vi khuân nhìn chung cao hơn so với pH toi ưu của xylanase từnấm.Trước
đó thì Ratto và các cộng sự đã cơng bố Bacillus circulans tồng hợp lên xylanase có

Hồng Thị Hương


Viện Đại học Mỏ' Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

hoạt độ 400 u/ml. Nó hoạt động tối ưu ớ pH 7 và 40% hoạt độ được duy trì ở pH

9,2[35].
1.1.5. Nguồn xylanase

1.1.5.1. Sinh tổng họp xylanase tù thực vật
Có nhiều nghiên cứu về xylanase có nguồn gốc từ thực vật, ví dụ, sự sinh

tong hợp endo-xylanase trong quá lê Nhật Ban trong suốt giai đoạn chín cùa quà

[25,40].
Một loại cndo-xylanase với khối lượng phân từ là 55 kDa từ bột mì của cây

lúa mì châu Âu cũng đã được tinh chế [11].
1.1.5.2. Sinh tổng họp xylanase tù' vi khuẩn

Vi khuẩn có khả năng sinh tồng hợp nhiều các enzym sử dụng cho các q
trình cơng nghiệp trong đó có xylanase vì đặc tính bền nhiệt của nó. Xylanase

thường được tống hợp bới một sốvi khuấn như Streptomyces, Bacillus,
Trichoderma, Thennobacillus..: [42].Trong đó chi Bacillus và ■ Streptoinycesdvtợc

quan tâm nghiên cứu nhiều đặc biệt là chi BacillusW khuấn thuộc chi Bacillus
phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đa dạng về sinh thái. Các loài thuộc chi Bacillus đã,

đang và ngày càng trở thành những vi sinh vật quan trọng hàng đau về mặt ứng
dụng. Các ứng dụng cũa chúng bao trùm hàng loạt lĩnh vực, tìr sán xuất thực phẩm

thủ cơng truyền thống đến công nghệ lên men hiện đại. đến sinh học phân tứ, ydược học chữa các bệnh hiểm nghèo, mỹ phấm, xử lý môi trường ô nhiễm, thu hồi

bạc kim loại từ các phế liệu. Chính vì lẽ đó nên đã có ngày càng nhiều các nghiên
cứu sâu về chi Bacillus này cũng như mở rộng ứng dụng của chúng đối với đời sống

con người, trong đó có rất nhiều nghiên cứu công bố liên quan đến khá năng sinh

xylanase của các chùng thuộc chi này [ 1 ].MỘt số loài sinh tổng hợp xylanase với
hoạt độ cao ở pH kiềm và nhiệt độ cao là Bacillus sp. Ratto và các cộng sự đã công

bo Bacillus cữculans tống hợp lên xylanase có hoạt độ 4(X) u/ml. Nó hoạt động tối

ưu ớ pH 7 và 40% hoạt độ được duy trì ờ pH 9,2[35].
1.1.5.3. Sinh tống họp xylanase từnấm
Hồng Thị Hương


Viện Đại học Mỏ' Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Trong số các chi nấm sợi thì chi Aspergillus và Trichoderma là hai chi sinh
enzyme xylanase được nghiên cứu nhiều nhất. Đặc biệt Aspergillus là một chi nấm

sợi có ý nghĩa cơng nghiệp cao do có khá năng sinh nhiều loại enzyme thúy phân
ngoại bào. Chính vì khả năng sinh đồng thời nhiều loại enzyme thủy phân ngoại bào

nên đa số các lồi của các chi nấm này đều có khá năng sinh ra nhiều enzyme

xylanase trên các cơ chất tự nhiên, phế phụ phẩm nông nghiệp chứa lignocellulose
như bã dầu cọ, lõi ngơ, vỏ lúa mì,...

Các enzym xylanase được sinh tống hợp từ nam thường có pH tối ưu thấp

hơn so với các xylanase có nguồn gốc từ vi khuấn. Giá trị pH tối ưu cùa xylanase từ
nam mốc thúy phân xylan thì thường dao động từ pH 3 đến 8 và ổn định ờ pH 5.

1.1.6. Úng dụng của xylanase
1.1.6.1. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi
Enzyme được nghiên cứu bồ sung vào thức ăn cho vật nuôi từ những năm

1990 và ngày càng được phố biến,rộng rãi. Hiện nay, mồi năm người ta sàn xuất
.. .
" .
yien yien Đau nọcẮMỜ Ha N01, “ ,,
°
khoảng 30 triệu tân thức ăn gia súc 'có bơ sung chê phàm enzyme, chiêm khoảng 5%

trong tống số 600 triệu tấn thức ăn gia súc được sàn xuất. Nhiều nghiên cứu đã
chứng minh rằng những hạt ngũ cốc kém chất lượng có chứa số lượng lớn các chất
kháng dinh dưỡng.Vì vậy bố sung các enzyme vào những thức ăn này cho hiệu quả
rất rõ ràng. Xylanase là một trong số các enzyme dùng cho chân nuôi thu hút dược
nhiều sự quan tâm nghiên cứu. Nhiều cơng trình đã chứng minh hiệu q dinh

dưỡng và kinh tế khi bố sung xylanase đơn hoặc kết hợp với các enzyme thúy phân

khác vào thức ăn vật nuôi. Xylanasc đã. đang và ngày càng dược bố sung nhiều hơn
vào thức ăn chăn nuôi. Việc bổ sung xylanase một cách độc lập hay kết hợp với các
enzyme khác vào thức ăn làm tăng đáng kê khôi lượng và giảm thiêu bệnh tật ở vật

ni. Xylanase có tác dụng phân giãi xylan, một thành phần quan trọng cùa
hemicellulose có nhiều trong thức ăn cùa vật ni, giái phóng dường xylose và
xylooligosaccharide dần đen làm giám độ nhớt của thức ăn. giúp cho vật ni tiêu

Hồng Thị Hương


Viện Đại học Mỏ' Hà Nội

Khoa Cơng nghệ sinh học

hóa và hấp thụ chất dinh dưỡng tốt hơn. cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột theo

hướng có lợi.

Ngày nay, xylanase được sử dụng thông thường trong thức ăn gia súc bao
gồm hỗn hợp các enzyme như glucanase, xylanase, proteinase và amylase. Sự bố

sung enzyme làm giám độ nhớt, gia tăng sự hấp thụ chat dinh dường, phóng thích
các chất dinh dưỡng bằng cách thúy phân chất xơ, hoặc bằng cách giãi phóng ra
khói chất xơ này và giám lượng chất thài ra.
Một nghiên cứu với sự hợp nhất của thức ăn hằng ngày, dựa trên lúa mì hoặc

lúa mạch đen, cùa những con gà giò đưa đến kết quá trong việc cải thiện lợi ích tăng
trọng cúa gà con và hiệu quà chuyển hóa thức ăn của chúng|30J. Những cãi tiến
tương tự cùng được cho những con heoăn thức ăn hàng ngày dựa trên lúa mì có bồ

sung xylanasc và phospholipase (Diebold Ct al. 2005).

1.1.6.2. Trong sản xuất ruọu vang

Trong công nghiệp sân xuât rượu vang và nước ép việc ứng dụng xylanase

cùng với pectinase.tạb thuận lợỉ.cho sự .chiết và phân loại sân.phẩm cuối cùng[16].

Những enzyme có thê tham gia tính ơn định cơm thịt trái cây và giải phóng những
tiền chất thơm. Sãn xuất rượu vang với chất thơm từ trái cây được gia tăng khi sứ

dụng xylanasc từ chung nấm men tái tố hợp[4J. Xylanase có thế được sứ dụng trong

công nghệ sán xuất bia đế giàm độ nhớt và độ đục của bia 1341.
1.1.6.3. Trong sản xuất bánh
Trong công nghiệp sàn xuất bánh, xylanase cái thiện đặc tính bột để nâng cao

tính linh hoạt cùa bột, tính năng chế biến, sự ổn định, khối lượng bánh và cấu trúc
mãnh vụn rất nhỏ [4], Nhiều enzyme như protease, xylanase và cellulase nâng cao

sức bên cúa mạng gluten và do đó nâng cao chất lượng sản phẩm bánh mì [18], Sự
thúy phân pentosans bởi hemicellulases hoặc pentosanases ờ mức tối ưu cải thiện

các đặc tính cùa bột dẫn đến tính thống nhất hơn trong đặc tính chất lượng [4].
Xylanase làm cho bột dung hịa hơn với các thơng so chat lượng bột mì khác

nhauvà biến đồi trong phương pháp chế biến: củng làm cho bột mềm, dàn thành tấm

Hoàng Thị Hương


Viện Đại học Mỏ' Hà Nội

Khoa Cơng nghệ sinh học

mịng đặc biệt tăng đáng kế khối lượng bột nở trong bánh mì [4]. Xylanase cùng với
protease, lipase và a-amylase có hiệu quá đáng kề cho việc thu được khối lượng

bánh mì nhiều hơn so với bánh mì khơng có enzyme thêm vào. Các tác động tích
cực của xylanase về khối lượng bánh mì là do tái phân phối của nước từ giai đoạn
pentosan với chat gluten. Các tác dụng cái thiện cùa pentosanases về khối lượng

bánh mì có thế được liên kết với khả năng lưu giữ khí tốt hơn trong q trình, có lẽ

do tác động của enzyme trong việc làm giám độ nhớt của gel tinh bột và cho phép

bột giãn nớ hơn nữa trong lò[281.

Xylanase được khuyến khích đế làm bánh kem xốp, cái thiện kết cấu, tính
ngon miệng và tính thống nhất cùa các bánh xốp [34].
1.1.6.4. Trong tẩy trắng giấy và bột giấy

Trong công nghiệp giấy và bột giấy xylanase tạo thuận lợi cho việc tầy trắng

hóa học bột giấy, có tác động tốt đến môi trường và kinh tế [5, 39]. Các xylanase

không dịch chuyến trực tiep thế màu dựa vào lignin nhưng thay vào đó phân rã

mạng lưới xylan vặ táp dụng lên lignin gòn lại. Sự phân rãịXỳlan-lignin hoặc tái kết
tủa trong bề mặt cùa các sợi, cho phép sự tiết lignin hiệu quá hơn bằng các chất tấy
hóa học. Việc tấy trắng được gia tăng bởi xylanase đem đến sự tăng tiết kiệm 20-

25% các chất hóa học dựa trên chlorine và giâm 15-20% trong việc sinh ra các hợp
chat chlorine hữu cơ ô nhiễm từ sự phân rã lignin [5, 39]. Việc giảm hàm lượng tác
nhân lấy trắng hóa học đòi hỏi đạt được độ trắng của giấy cần đạt tới đã đóng góp

vào việc thay the chlorine hợp thành bới chlorine dioxide ơ nhiễm ít hơn trong tay
trắng liên tục chlorine thành tố tự do, hoặc thay thế hoàn toàn các hợp chất chlorine

bằng các tác nhân thay the như hydrogen peroxide và ozone trong việc tẩy trang liên

tục chlorine tự do toàn phần.

Hiệu suất tẩy trang cùa các xylanasc từ vi khuấn và nam khác nhau dang
được phân tích. Mặc dù nhiêu enzyme được kiêm tra có hiệu quá cao như những

phương tiện tẩy trắng nhưng những khác biệt đáng kể có thể xuất hiện phụ thuộc
vào họ và những nét đặc trưng cúa mỗi enzyme riêng biệt [15. 21 ]. Sự phản ứng lại

đối với việc tẩy trắng bằng enzyme có thể ảnh hướng bời điều kiện tẩy trẳng, những
Hoàng Thị Hương

12


Khoa Công nghệ sinh học

Viện Đại học Mỏ' Hà Nội

mẫu gỗ có liên quan và phương pháp nghiền nhão[9, 27, 32] . Hiện tại, nhiều

xylanase có nguồn gốc từ vi khuân có sẵn trên thị trường và đang được sừ dụng
thành công trong các phân xường sàn xuất bột giấy [7].
Trong mối tương quan tới quá trình tẩy trắng, việc xử lý xylanase có thể làm

giám nhẹ các đặc tính của bột giấy tinh che. Trong một số trường họp, các bột giấy
được xử lý bằng enzyme đòi hòi sự khuấy trộn lớn hơn, trong khi những tính chất

về độ mạnh của giấy không bị anh hường hoặc chi giám nhẹ một chút [36]. Sự gảm
sút về nồng độ xylan bời việc xừ lý enzyme đã được trình bày nhằm làm giám nhẹ
sự trờ lại cũa việc già hóa,tăng độ sáng cùa bột giấy và giấy[33J. Sự ứng dụng cùa
xylanase trong công nghiệp giấy và bột giấy trong các giai đoạn khác cùa việc sàn

xuất đạt kết quà tốt. ứng dụng của các xylanase trong việc nghiền nhão cơ học, sự
tháo nước bột giấy hoặc deinking của những sợi tái che, hiện nay dang được đánh
giá và có những kết quà hứa hẹn đạt được dẫn đến việc mớ rộng sứ dụng các

xylanase trong ngành công nghiệp này và vị the quan trọng càng gia tảng cho các

học Mớ Hà Nội
1.2. Biểu hiện gen
1.2.1. Hệ biểu hiện E. coli

E.coliìằvi khuẩn gram âm. Có các ưu điếm nồi bật thao tác trên vật liệu di
truyền dề, có the biếu hiện các protein ngoại lai lên đen mức 50% protein tổng của
tế bào, biếu hiện nhanh ờ một mức độ cao khi tốc độ tăng trường cua tế bào đạt cao

và mật độ tế bào đù lớn, môi trường nuôi cấy đơn gián và ré tiền và có khả năng

định vị (location) protein mục tiêu. Thêm vào đó có nhiều chủng chủ đột biến nhờ
đó có thể cải tiến việc biếu hiện protein tái tồ hợp và đươc sử dụng như một vật chủ
hữu hiệu trong cơng nghệ tách dịng.

Tuy nhiên vẫn có vài trờ ngại khi sử dụng E.coli làm hệ biếu hiện như một số
protein quan tâm được tạo ra trong E.coli không chứa methionine hoặc formyl

methionine ờ tận cùng đầu N làm mất đi các tính chất quan trọng của phân tử

Hoàng Thị Hương


Viện Đại học Mỏ' Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

protein. Mặt khác một số protein có nguồn gốc từ Eucaryote không thề biếu hiện tốt

trong E.coli.
Vector dùng đế biếu hiện gen ở E.coli được thiết ke đầy đù. bao gồm các
nhân tố di truyền được sáp xếp hợp lý nhằm điều khiến tối ưu cã quá trình phiên

mã. dịch mã và tổng hợp nên protein từ gen ngoại lai. Ngoài ra vector cịn chứa gen

mã hóa cho protein von có chức năng là dấu hiệu chọn lọc thường là gen kháng chất
kháng sinh. Thêm nữa một trình tự khơng thế thiếu đối với plasmid tự sao chép là

tâm sao chép vì nó quyết định số lượng bán coppy của plasmid trong một tế bào. Và
tạo điều kiện thuận lợi cho việc đưa các doạn vào vector biểu hiện theo đúng chiều
cúa promoter, trên vector luôn phải chứa vùng đa nối mang các trình tự của enzyme
hạn chế.

* Promter:
Vùng khới đầu phiên mã là vùng có trình tự DNA đặc biệt, nhận biết bời

RNA polymerase. Có nhiều loại promoter khác nhau được sử dụng biếu hiện gen ở
E.coli. Nhìn chung] đế biếu hiện gẹn cao, promoter phải có các đặc điềm:

- Phái là promoter mạnh, có khă năng tạo protein ngoại lai lớn hơn 10- 30% protein

tống số của te bào.
- Chi hoạt dộng ờ mức độ thấp khi khơng có cãm ứng.

- Được cám ứng theo cách đơn giản nhưng có hiệu quá cao nham tạo lượng lớn
protein mong muốn.

Hiện nay promoter được sứ dụng rộng rãi nhất là promoter bacteriophage
T7. chúng có khắ năng hoạt động rất mạnh trong tế bào E.coli khi có mặt T7 RNA

polymerase. Đây là một enzyme hoạt dộng rất mạnh, có tốc độ kéo dài chuỗi nhanh
gấp 5 lần so với các RNA polymerase khác có nguồn gốc từ E.coli.

* Vùng kẻt thúc phiên mã:

Qúa trình phiên mã được bắt đầu từ promoter, sau đó sợi mRNA kéo dài đến
khi gặp một trình tự đặc hiệu thì dừng lại. Trình tự đặc hiệu này chính là vùng kết
thúc phiên mã.

* Trình tự peptid tín hiệu:

Hoàng Thị Hương

14


Viện Đại học Mỏ' Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Các protein ngoại lai được tống hợp nhờ E.coli cằn thiết phái được tiết ra

ngồi. Đế tiết được ra khói màng tế bào, các chuỗi poly peptide cần phải có trình tự

pcptid tín hiệu nằm ở tận cùng đau N. Chuỗi này gồm 3 vùng: vùng tận cùng đầu N,
vùng tận cùng đầu c và vùng kị nước. Do vậy trên vector biểu hiện người ta thường

thiết kế sẵn chuỗi pcptid tín hiệu nằm ngay sau vùng RBS (vị trí bám của riboxom).
* Tâm sao chép (Ori)

Tâm sao chép là vị trí đặc hiệu đế khời đầu sự sao chép DNA. Nó cũng quyết

định số lượng bán sao cùa plasmid trong tế bào.
* Dấu chuấn chọn lọc:
Đe tiện cho việc nhân ra các tế bào có mang plasmid, thơng thường người ta

sừ dụng mơi trường ni cấy mà ờ đó chi có tế bào có tính trạng nhất định mới có

thể sinh trường dược. Hiện nay việc đưa các đoạn gen kháng kháng sinh vào
plasmid đang là cách phổ biến để phân biệt các tế bào đó.
* Vùng đa nối:
Vùng đa nối bao gom C^c trình t(T enzyme hạn pje thơng thường giúp cho

quá trình đưa đoạn gen ngoại lai váo vector biếu hiện trờ nên dẻ dàng. Hầu hết các
trình tự của enzyme hạn chế đều được đặt theo khung đọc và nam sau đoạn pcptid

tín hiệu.

1.2.2. Chung biểu hiện E. coli BL21
Trong nghiên cứu biểu hiện dã sứ dụng chung chú là E. co/í'BL21(DE3), đây

là chủng chứa đột biến Ion protease (protease nội bào) và ompT protease (protease

màng ngoài tế bào). Vì vậy, E. cơ//BL21có ưu điềm là hạn chế sự phân cắt cùa
protease đối với protein ngoại lai, giúp cho protein ngoại lai tránh bị phân húy và ồn

định hon sau khi tống hợp. Ngoài ra, DNA hệ gen cùa E. coli BL21(DE3) có chứa
gen mã hóa cho T7 RNA polymerase, có nguồn gốc từ bacteriophage T7. Gen này

được đưa vào hệ gen của chùng E. coli BL21 (DE3) và đặt dưới sự điều khiến của

promoter lac. T7 RNA polymerase là enzyme hoạt động mạnh, có khá năng sao
chép hồn tồn bất kỳ trình tự DNA nào đặt dưới sự kiểm sốt của T7 promoter.

Hồng Thị Hưong


Viện Đại học Mỏ' Hà Nội

1.2.3.

Khoa Công nghệ sinh học

Vector biểu hiện pET 32a(+)
Để biếu hiện gene trong E. coli vector biểu hiện có thế dùng là các plasmid,

phage, cosmid. Vector biếu hiện là một plasmid được thiết ke nham mục đích săn
xuất protein với lượng lớn khi được kích thích bằng chất cảm ứng (lactose hoặc

1PTG). Cấu trúc của vector pET32a(+) được biếu hiện trên hình 6.
Vector này có khá nhiều ưu điềm vượt trội so với các hệ biếu hiện khác. Đó

là:
+ Gen ngoại lai được điều khiến bời promotor T7. là một promoter mạnh có

tính đặc hiệu cao.

+Phiên mã được điều khiến bởi lac operator, có cơ chế cám ứng IPTG.
+ Phía sau vùng đa nối có đoạn trình tự mã hóa cho 6 axit amin Histidin tích
điện âm được gọi là đi His-tag. Đi này giúp protein tái tô hợp dược giữ lại khi

chúng được đưa qua cột sắc kí ái lực do lực hút tĩnh điện giữ phần điện tích âm của

đi His-tag với điện tích dương cùa các cation có trong cột tinh sạch. Các protein
này sẽ được tách qua cột khi ch(jỊ dung dịch đệm có pH thích hợp.
+ Trên vector này có sẵn cầc điếm cắtX/íơI. Ncoỉ.Xbaỉ nên sừ dụng vector

này là một điều rất thuận lợi.
+ Thioredoximgiúp cho protein ngoại lai tránh bị phân cắt bời protease và

hình thành cấu trúc bậc 3 chính xác hơn.

Hồng Thị Hương


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Cơng nghệ sinh học

Hình 6. Bản đồ vector pET32a(+)

Hoàng Thị Hương

17


Viện Đại học Mỏ' Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

PHÀN II.VẬT LIỆU VÀ PHUONG PHÁP NGHIÊN cúu

2.1.

Vậtliệu

2.1.1

Nguồn gen, chủngvisinhvậtvà plasmid.

*

Nguồn gen: Plasmid pBlue-xửxs là nguồn mang gen do phòng Kỹ thuât di

truyền - viện Công nghệ sinh học thiết kế.

Chủngvisinhvật

*

-ChủngE. coli DH 1 Ob đượcsửdụnglàmchúngtáchdòng gen.
- ChúngE. coli BL 21 đượcsửdụng làmchúngbiêuhiện gen.

* Plasmid
- Plasmid pET-32a(+) đượcsừdụnglàm vector biếuhiện gen.
2.1.2

Hóachấtvàenzyme.

* Hóachất
SDS, Tris- HC1, EDTA. ethanol, chloroform, isoamylalcohol, EtBr,

., . in™ Thxtxtfn v.ien Dai.hoc.Ma l-La Noi'
_
glycerol.IPTG, agar. d-NTP, ampicillin, agarose. MgSOj, D-glucose, caonam men.
* Enzyme

Các enzyme cắthạnchế: Ncoỉ.XholvàHinclỉỉỉ (BioLab, Mỹ), Taq polymerase,

T4-DNA ligase.
2.1.3

. Máymócvàthiếtbị

Máy PCR (MJ Research, Mỹ), máy li tâmlạnh (Sorvall RC5B, Mỳ),
máyồnnhiệt (Mỹ), máyđiện di (Bio-Rad. Mỹ), máyxácđịnh DNA trên gel agarose
(Bio-Rad, Mỹ), máylắcổnnhiệt (New Jersey. Mỹ), máy li tâm Eppendorf.

2.1.4
-

Cácmơitrưịngvà dung dịch

Mơi trường và dung dịch sứ dụng trong biến nạp DNA plasmid vào tế bào

E.coli.(mục 1, phụ lục 1)
-

Các dung dịch được sử dụng trong tách triết DNA plasmid từ tế bào E. coli. (mục

2, phụ lục 1)
Hoàng Thị Hưong

18