Khóa luận tốt nghiệp 2020 đỗ thị xuân phương K61CNSH

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

Đỗ Thị Xuân Phương

SỰ KHÁC NHAU TRONG QUÁ TRÌNH CHỮA LÀNH
VẾT THƯƠNG CỦA EXOSOMES ĐƯỢC PHÂN LẬP
TỪ BA NGUỒN TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỦY
XƯƠNG, MÔ MỠ VÀ DÂY RỐN

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy
Ngành Cơng nghệ sinh học
(Chương trình đào tạo: Chuẩn)

Hà Nội – 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

Đỗ Thị Xuân Phương

SỰ KHÁC NHAU TRONG QUÁ TRÌNH CHỮA LÀNH
VẾT THƯƠNG CỦA EXOSOMES ĐƯỢC PHÂN LẬP
TỪ BA NGUỒN TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỦY
XƯƠNG, MÔ MỠ VÀ DÂY RỐN

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy
Ngành Cơng nghệ sinh học

(Chương trình đào tạo: Chuẩn)

Cán bộ hướng dẫn: TS. Thân Thị Trang Uyên
PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung

Hà Nội - 2020


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn GS. TS. BS. Nguyễn Thanh Liêm, Viện
trưởng viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen Vinmec – Bệnh viện đa khoa Quốc
tế Vinmec Time City đã tạo điều kiện cho tôi được thực tập, tiếp cận những trang thiết
bị và kỹ thuật hiện đại hàng đầu, góp phần quan trọng trong sự thành cơng của khóa luận.
Tơi xin gửi lời chân thành cảm ơn tới PGS. TS. Hồng Thị Mỹ Nhung, người
đầu tiên dìu dắt tơi tới ngôi nhà thứ hai - bộ môn Sinh học Tế bào. Người đã ln nhiệt
tình giúp đỡ, đưa ra những lời khuyên chân thành và bổ ích trong suốt thời gian học tập
và nghiên cứu.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Thân Thị Trang Uyên, người đã trực
tiếp hướng dẫn tơi thực hiện và hồn thành khóa luận. Người ln tận tình giúp đỡ và
chia sẻ những kinh nghiệm, bài học quý báu trong sự nghiệp làm khoa học và trong cuộc
sống.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến ThS. Nguyễn Đắc Tú, CN. Hoàng Hương Diễm
cùng các cán bộ của Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Cơng nghệ gen Vinmec đã hỗ trợ
nhiệt tình cho tơi trong suốt q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Cùng với đó, tơi xin cảm ơn Thầy, Cô trong bộ môn Sinh học Tế bào cùng các
anh chị, các bạn và các em trong nhóm Ung thư thực nghiệm đã luôn ở bên cổ vũ, động
viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Và cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè và người thân
của tơi đã ln là chỗ dựa vững chắc, nguồn động viên to lớn giúp tiếp thêm sức mạnh
cho tơi vượt qua khó khăn để có được thành cơng như ngày hơm nay.

Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 04 tháng 05 năm 2020
Sinh viên

Đỗ Thị Xuân Phương


Khóa luận tốt nghiệp

Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................... 3
1.1. Tế bào gốc trung mô (mesenchymal stem cells – MSCs)..................................... 3
1.1.1. Giới thiệu chung về tế bào gốc trung mô ....................................................... 3
1.1.2. Nguồn phân lập và tiềm năng ứng dụng của MSCs ....................................... 4
1.2. Exosomes (EXs) tiết ra từ tế bào gốc trung mô (MSCs) ...................................... 7
1.2.1. Giới thiệu về exosomes .................................................................................. 7
1.2.2. Thành phần của exsosomes ............................................................................ 7
1.2.3. Ứng dụng của exosomes ................................................................................ 9
1.3. Quá trình lành vết thương ................................................................................... 11
1.4. Nguyên bào sợi (Fibroblast) – Vật liệu nghiên cứu ............................................ 13
1.4.1. Giới thiệu chung về nguyên bào sợi người .................................................. 13
1.4.2. Nuôi cấy nguyên bào sợi .............................................................................. 14
1.4.3. Chức năng của nguyên bào sợi .................................................................... 15
1.4.4. Vai trò trong chữa liền vết thương của nguyên bào sợi ............................... 15
1.5. Mục tiêu nghiên cứu............................................................................................ 18
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP .. 19
2.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu............................................................................ 19

2.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................. 20
2.2.1. Hóa chất ....................................................................................................... 20
2.2.2. Thiết bị ......................................................................................................... 21
2.2.3. Vật tư tiêu hao .............................................................................................. 22
2.3. Phương pháp........................................................................................................ 23
2.3.1. Phương pháp phân lập EXs .......................................................................... 23


Khóa luận tốt nghiệp

Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

2.3.2. Phương pháp đo nồng độ protein tổng số .................................................... 24
2.3.3. Phương pháp xác định chất chỉ thị ............................................................... 26
2.3.4. Phương pháp xác định hình thái, kích thước................................................ 26
2.3.5. Phương pháp đánh giá khả năng kích thích tăng sinh tế bào ....................... 27
2.3.6. Phương pháp đánh giá khả năng kích thích di cư tế bào ............................. 28
2.3.7. Phương pháp phân tích thống kê .................................................................. 29
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 30
3.1. Kết quả phân lập và protein toàn phần exosomes ............................................... 30
3.2. Chất chỉ thị của exosomes ................................................................................... 31
3.3. Hình thái, kích thước exosomes .......................................................................... 32
3.4. Khả năng kích thích tăng sinh nguyên bào sợi người ......................................... 33
3.5. Khả năng kích thích di cư nguyên bào sợi người................................................ 35
3.6. Thảo luận ............................................................................................................. 39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 43


Khóa luận tốt nghiệp

Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

DANH MỤC HÌNH MINH HỌA
Hình

Trang

Hình 1: Vai trị của MSCs ................................................................................................ 6
Hình 2: Sự hình thành và đặc điểm của exosomes .......................................................... 9
Hình 3: Các giai đoạn chữa lành vết thương cấp tính trong điều kiện sinh lý bình
thường ............................................................................................................................ 13
Hình 4: Tế bào nguyên bào sợi da người ở passage 10 ................................................. 19
Hình 5: Quy trình các bước tiến hành phân lập và đánh giá tiềm năng chữa lành vết
thương của EXs từ ba nguồn AD-MSCs, BM-MSCs và UC-MSCs ............................. 23
Hình 6: Tế bào gốc trung mơ từ mô mỡ (AD-MSC), tủy xương (BM-MSC), dây rốn
(UC-MSC) ở passage 3 .................................................................................................. 30
Hình 7: Kết quả phân tích protein đặc trưng của EXs. .................................................. 32
Hình 8: Hình thái dạng hình cốc của EXs được quan sát dưới TEM ............................ 33
Hình 9: Khả năng kích thích tăng sinh ngun bào sợi của các exosomes từ BM-MSCs,
AD-MSCs và UC-MSCs sau 48h................................................................................... 34
Hình 10: So sánh khả năng kích thích di cư nguyên bào sợi giữa các nguồn ADMSCEXs, BMMSC-EXs, UCMSC-EXs ................................................................................ 36
Hình 11: So sánh khả năng kích thích di cư nguyên bào sợi giữa các nồng độ của các
mẫu ADMSC-EXs, BMMSC-EXs, UCMSC-EXs ........................................................ 38


Khóa luận tốt nghiệp

Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

DANH MỤC BẢNG
Bảng

Trang

Bảng 1: So sánh tế bào gốc trung mô (MSC) từ các nguồn tủy xương (BM), mô mỡ
(AD), dây rốn (UC) tổng hợp từ các tài liệu .................................................................... 4
Bảng 2: Tổng hợp các giai đoạn trong q trình lành vết thương ................................. 12
Bảng 3: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm .................................................................. 20
Bảng 4: Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm .................................................................... 21
Bảng 5: Vật tư sử dụng trong thí nghiệm ....................................................................... 22
Bảng 6: Thống kê kết quả phân lập EXs ........................................................................ 31


Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Từ đầy đủ

Từ tiếng Việt

AD

Adipose tissue

Mô mỡ

ADMSCEX

Mesenchymal stem cell-derived
exosomes originated from adipose
tissue

Exosome tiết ra bởi tế bào gốc
trung mơ có nguồn gốc từ mô
mỡ

BCA

Bicinchoninic acid

Axit bicinchoninic

BM

Bone marrow

Tủy xương

BMMSCEX

Mesenchymal stem cell-derived
exosomes originated from bone
marrow

Exosome tiết ra bởi tế bào gốc

trung mơ có nguồn gốc từ tủy
xương

BSA

Bovine serum albumin

Albumin từ huyết thanh bê

CTF

Cell traction forces

Lực kéo tế bào

DMEM

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

ECM

Extracellular matrix

Ma trận ngoại bào

EV

Extracellular vesicle

Túi ngoại bào

EX

Exosome

Exosome

FBS

Fetal bovine serum

Huyết thanh phơi thai bị

International Society for Cellular
Therapy
International Society of Extracellular
Vesicles
The International Serum Industry
Association

Hiệp hội quốc tế về liệu pháp
tế bào
Hiệp hội quốc tế và túi ngoại
bào
Hiệp hội cơng nghiệp huyết
thanh quốc tế
Enzyme thối hóa ma trận
ngoại bào

ISCT

ISEV
ISIA
MMP

Matrix metalloproteinases

MSC

Mesenchymal Stem Cells

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide

OD

Optical density

PBS

Phosphate-buffered saline

Tế bào gốc trung mô

Mật độ quang


Khóa luận tốt nghiệp

Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

Pen/Strep

Penicillin/Streptomycin

TEM

Transmission electron microscopy

TIMP

Tissue inhibitors of
metalloproteinases

Kính hiển vi điện tử truyền
qua
Ức chế mơ của enzyme thối
hóa ma trận ngoại bào

UC

Umbilical cord

Dây rốn

UCMSCEX

Mesenchymal stem cell-derived
exosomes originated from umbilical
cord

Exosome tiết ra bởi tế bào gốc
trung mơ có nguồn gốc từ dây
rốn


Khóa luận tốt nghiệp

Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết
Chấn thương mơ mềm là hiện tượng xuất hiện phổ biến có thể ở dạng cấp tính,
tuy nhiên nhiều vết thương trở nên mạn tính rất khó lành. Việc chữa lành vết thương kéo
dài và hình thành sẹo là hai thách thức lớn trong điều trị trấn thương mô mềm. Không
chỉ ảnh hưởng đến chức năng mơ mà cịn ảnh hưởng đến sức khỏe tinh thần và vấn đề
tài chính của bệnh nhân, đồng thời gây áp lực cho xã hội. Do đó rút ngắn thời gian chữa
lành trong phục hồi chấn thương mô mềm có tính cấp thiết trong lâm sàng.
Các phương pháp thơng thường hiện nay để đẩy nhanh quá trình chữa lành vết
thương bao gồm: ghép da, trị liệu bằng laser và ứng dụng cục bộ một số yếu tố tăng
trưởng hoặc liệu pháp gen. Tuy nhiên, các phương pháp này có thể dẫn đến sẹo, bất
thường sắc tố, hoại tử da và các hậu quả khơng mong muốn khác. Ngồi ra, các chất tiêm
tại chỗ có thể dễ dàng bị suy giảm bởi dịch cơ thể, liều lượng và nồng độ của chúng
thường rất khác nhau ở vị trí vết thương. Do đó, cần phải tìm một phương pháp mới ổn
định, hiệu quả và an tồn để thúc đẩy q trình lành vết thương mô mềm.
Gần đây, tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cells – MSCs) được phân lập
từ nhiều nguồn khác nhau như mô mỡ, mô dây rốn, tủy xương và tủy răng đã nổi lên như
một phương pháp điều trị đầy triển vọng trong chữa liền vết thương do khả năng biệt hóa
thành các tế bào vết thương như nguyên bào sợi, hoặc tiết ra nhiều yếu tố tăng trưởng
kích thích q trình chữa liền vết thương.

Các yếu tố được tiết ra của MSCs được bao bọc trong túi thể tiết ngoại bào
(Extracellular Vesicles – EVs). Các phân tử EVs phản ánh đặc điểm sinh lý và bệnh lý
của các tế bào tiết ra nó. Vì vậy, hiện nay, EVs và đặc biệt là exosomes đang nổi lên như
một biện pháp trị liệu thay thế vì tiềm năng tương tự như MSCs và an toàn hơn MSCs.
Tuy nhiên, EVs được phân lập từ các nguồn MSCs khác nhau có thể có chất lượng và
hiệu quả điều trị khác nhau do sự khác biệt về đặc điểm và tiềm năng của các loại tế bào
MSCs. Theo hiểu biết của chúng tôi, sự khác biệt về chất lượng và khả năng chữa liền
vết thương của EVs được phân lập từ ba nguồn MSCs ở người: mô mỡ (Adipose tissue
- AD), tủy xương (Bone marrow - BM) và cuống rốn (Umbilical cord - UC) chưa được

1


Khóa luận tốt nghiệp

Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

đánh giá. Do vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Sự khác nhau trong quá trình chữa
lành vết thương của exosomes được phân lập từ ba nguồn tế bào gốc trung mô tủy
xương, mô mỡ và dây rốn”.
Mục tiêu thí nghiệm gồm có:
- Phân lập exosomes từ ba nguồn tế bào gốc trung mô tủy xương, mô mỡ và dây rốn.
- Đánh giá khả năng kích thích của exosomes từ ba nguồn lên sự di cư của tế bào
nguyên bào sợi người.
- Đánh giá khả năng kích thích của exosomes từ ba nguồn lên sự tăng sinh của tế bào
nguyên bào sợi người.

2

Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

Khóa luận tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tế bào gốc trung mô (mesenchymal stem cells – MSCs)
1.1.1. Giới thiệu chung về tế bào gốc trung mô
Tế bào gốc trung mô (MSCs) là tế bào gốc trưởng thành đa năng, được phân lập
từ các mơ trưởng thành, có khả năng tự làm mới và biệt hóa thành nhiều dịng tế bào
khác nhau như tủy xương, sụn và mỡ. MSCs lần đầu được miêu tả bởi Friedenstein và
các cộng sự vào năm 1970 [16], là các tế bào tồn tại trong tủy xương, chiếm tỉ lệ nhỏ so
với quần thể tế bào gốc tạo máu. Hiệp hội quốc tế về liệu pháp tế bào (International
Society for Cellular Therapy - ISCT) đã xem xét tiêu chí tối thiểu đối với định nghĩa tế
bào gốc đa năng MSCs ở người bao gồm:
i. Các tế bào bám dính trên bề mặt ni cấy bằng nhựa
ii. Các tế bào có hình thái giống ngun bào sợi khi được duy trì trong điều kiện ni
cấy tiêu chuẩn, có thể biệt hóa dưới một kích thích nhất định thành nguyên bào
xương, mỡ, sụn hay cơ.
iii. Biểu hiện các kháng nguyên bề mặt
Positive (> 95%)

Negative (< 2%)

CD105
CD73
CD90

CD45
CD34
CD14/11b

CD79α/CD19
HLA-DR

❖ Khả năng biệt hóa
Biệt hóa là q trình chuyển dạng của tế bào, từ tế bào gốc thành dạng tế bào
chuyên hóa hơn. Những sự biến đổi này khởi nguồn từ sự thay đổi điều hịa biểu hiện
gene, bao gồm các q trình như sự methyl hóa, sự tương tác của các yếu tố điều hòa
phiên mã hay hoạt động của các miRNA. Tế bào gốc trung mô là một loại tế bào gốc đa
năng, vì vậy chúng đặc trưng bởi khả năng biệt hóa đa dịng. Ngồi tiềm năng biệt hóa
thành các dịng tế bào trung mơ thơng thường như xương, sụn, mỡ [15]…, MSCs cịn
cho thấy khả năng biệt hóa thành các dịng tế bào biểu mơ và tế bào nội mô như tế bào
thần kinh [33], tế bào tim [20]. Chính các tiềm năng biệt hóa rất lớn này đã mở ra những

3


Khóa luận tốt nghiệp

Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

hướng nghiên cứu triển vọng khi sử dụng tế bào gốc trung mô trong cấy ghép để điều trị
bệnh.
❖ Khả năng tiết các phân tử có hoạt tính sinh học
Sự tiết paracrine của MSCs được xác định đầu tiên bởi Haynesworth và cộng sự
[22]. Nhóm tác giả báo cáo rằng MSCs sản xuất và giải phóng một lượng lớn các yếu tố
tăng trưởng, chemokine và cytokine có khả năng tác động đến các tế bào lân cận. Trong
thực tế, những yếu tố tiết này có khả năng làm tăng sự hình thành mạch, giảm apoptosis
và xơ hóa, tăng cường sự sống và biệt hóa tế bào thần kinh, kích thích tái tạo ma trận
ngoại bào, hạn chế viêm cục bộ và điều chỉnh các phản ứng miễn dịch [29]. Theo cách
này, MSCs trực tiếp hoặc thông qua bài tiết paracrine kích thích sự tái tạo các tế bào bị

thương, giảm tổn thương mô và cuối cùng tăng tốc sửa chữa cơ quan. Ngoài ra, các phân
tử tiết ra bởi MSCs có vai trị như chất trung gian kích hoạt các tế bào đích hoặc kích
thích các tế bào lân cận để tiết ra các yếu tố hoạt động [6]. Gần đây, bằng chứng cho thấy
MSCs tiết ra nhiều túi ngoại bào (EVs) tham gia tái tạo mô thông qua chuyển thông tin
đến tế bào hoặc mô hư hỏng và hoạt động sinh học tương tự như MSCs [47].
1.1.2. Nguồn phân lập và tiềm năng ứng dụng của MSCs
Kể từ báo cáo đầu tiên về sự phân lập MSCs từ tủy xương chuột của Friedenstein
và cộng sự, nhiều cơ quan và mô đã được báo cáo trở thành nguồn phân lập MSCs như
máu cuống rốn, dây rốn, mô mỡ, màng ối, tủy răng [42]… Mặc dù chúng có một số điểm
tương đồng về hình thái, tiềm năng biệt hóa và mơ hình miễn dịch theo các tiêu chí tối
thiểu cho định nghĩa MSCs của ICST 2006, vẫn có sự khác biệt về số lượng tế bào, tốc
độ tăng trưởng, tần số tạo cụm, khả năng ức chế miễn dịch và biểu hiện gen.
Bảng 1: So sánh tế bào gốc trung mô (MSC) từ các nguồn tủy xương (BM), mô
mỡ (AD), dây rốn (UC) tổng hợp từ các tài liệu [28, 38]
Đặc điểm

BM- MSC
(tủy sương)

AD-MSC
(mô mỡ)

Phương pháp phân lập

Xâm lấn

Xâm lấn

*
(3-4 passage)

1: 25000 - 1:
100000

**
(7-8 passage)

Sự lão hóa của tế bào
Tần số tế bào nhân bản

/

4

UC-MSC
(dây rốn)
Không xâm
lấn
***
10 (passage)
1:3331:1609

Ghi chú


Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

Khóa luận tốt nghiệp
Khả
năng
tăng

sinh
Thành xương
(osteogenetic)
Khả
năng
biệt
hóa

Thành mỡ
(adipogenetic)

Thành sụn
(chondrogenic)
CD73, CD90,
CD105 (marker
trung mơ)
CD44 (Matrix
marker)
CD14, CD133,
CD45, CD34
(Marker tế bào
dịng tạo máu)
CD31 (Marker
tế bào nội mơ)
HLA-DR
CD11b,
Miễn
dịch CD79α, CD19
(Marker các
dòng tế bào

máu)
CD29, CD51
(Integrin
marker)
Oct-4, Nanog,
Sox-2 (Yếu tố
phiên mã TBG
phôi (ESC))
CD106
HLA-G

*
**

**
*

***
***

*

**

**

*

**

***

*
**

***
***

**
*

**

/

*

**

/

/

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

/

+

+

+

+

+

**

+

*

*

/

**

Theo các
tài liệu
tham khảo
khác nhau

Theo các
tài liệu

tham khảo
khác nhau

Càng nhiều dấu * biểu hiện mức độ càng cao, “-” biểu diễn sự khơng biểu hiện, “+”
biểu diễn sự có biểu hiện, “/” biểu diễn chưa được báo cáo trước đó.

5


Khóa luận tốt nghiệp

Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

Nguồn phân lập MSCs có thể ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị. Ví dụ cấy ghép
AD-MSCs cải thiện sự hình thành mạch, tái tạo sợi trục và phục hồi chức năng tốt hơn
so với BM-MSCs. Bên cạnh đó, AD-MSCs gây ra các yếu tố thần kinh cao như BDNF,
VEGF và HGF [66]. Do sự khác nhau giữa các tế bào gốc trung mơ có nguồn gốc mơ
khác nhau mà thể tiết ngoại bào (exosomes) của nó cũng có những điểm khác nhau, vì
vậy có những tác động khác nhau trong điều trị và cần được đánh giá.
MSCs đóng nhiều vai trị khác nhau làm cho chúng có khả năng ứng dụng lâm
sàng. Chúng có thể biệt hóa thành nhiều dịng và có thể tham gia vào liệu pháp thay thế
tế bào. MSCs sản xuất nhiều cytokine và các yếu tố tăng trưởng ảnh hưởng đến các tế
bào khác, làm giảm viêm, tăng sinh tế bào tiền thân, cải thiện mô và cải thiện nhiễm
trùng [45]. Với tiềm năng biệt hóa và khả năng tiết các phân tử có hoạt tính sinh học,
MSCs ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong lâm sàng điều trị bệnh. Bằng chứng mới
đây đã cho thấy rằng các liệu pháp tế bào gốc là một chiến lược đầy hứa hẹn để cải thiện
sự tái tạo ở các mô bị tổn thương như tim, não, tủy sống, gan [11]. MSCs sở hữu những
lợi thế đặc biệt như biệt hóa đa dịng với các hiệu ứng miễn dịch và điều trị miễn dịch
làm cho chúng như là một liệu pháp hiệu quả an toàn trong lâm sàng. Ngồi ra, hoạt
động paracrine có thể giải thích khả năng tái tạo của MSCs và một thành phần chiếm ưu

thế là các túi ngoại bào (EVs) có vai trò quan trọng trong tiềm năng trị liệu của chúng.
Liệu pháp EVs có nguồn gốc từ MSCs cho thấy một liệu pháp đầy triển vọng khi khơng
có tế bào phù hợp trong y học tái tạo.

Hình 1: Vai trị của MSCs [45]
6


Khóa luận tốt nghiệp

Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

1.2. Exosomes (EXs) tiết ra từ tế bào gốc trung mô (MSCs)
1.2.1. Giới thiệu về exosomes
Exosome lần đầu tiên được phát hiện bởi Pan, Johnstone [43] và Harding, Stahl
[21] vào năm 1983 khi cả hai nhóm đều đang nghiên cứu về thụ thể transferrin của hồng
cầu lưới (tế bào hồng cầu chưa trưởng thành) [tương ứng ở cừu (Pan và Johnstone 1983)
và chuột (Harding và Stahl 1983)] trong quá trình trưởng thành in vitro. Thuật ngữ
“exosome” được đặt ra vào năm 1987 bởi Johnstone và cộng sự. Tuy nhiên, có nhiều
loại túi ngoại bào khác nhau có thành phần, mật độ và kích thước khác nhau. Do thiếu
các markers đặc hiệu cho các loại túi ngoại bào khác nhau, Hiệp hội túi ngoại bào quốc
tế (International Society of Extracellular Vesicles – ISEV) đã gợi ý thuật ngữ túi ngoại
bào (Extracellular Vesicles - EVs) để mô tả các túi ngoại bào từ dịch cơ thể và tế bào
nuôi cấy.
EVs là túi ngoại bào được bao bọc bởi màng lipid kép, có hình cầu hoặc hình cốc,
giải phóng bởi nhiều loại tế bào vào môi trường vi mô ngoại bào. EVs được tìm thấy
trong các chất lỏng cơ thể như nước bọt, huyết tương, sữa mẹ, nước ối, nước tiểu và
trong môi trường nuôi cấy tế bào [29]. Theo một số đặc điểm như thành phần, kích thước
EVs được phân thành các phân nhóm khác nhau, nhưng phổ biến bao gồm exosomes
(đường kính 30 - 250 nm), microvesicles (ectosome) (đường kính 100 - 1000 nm) và

apoptotic bodies (đường kính 1000 - 5000 nm). EXs bắt đầu bằng các endosome sớm,
nơi các túi nội tiết kết hợp để tái chế hoặc xuất bào. Các endosome sớm sau đó được
chuyển thành endosome muộn hay thể đa bào (multivescicular body - MVB) trong đó
các chất được sắp xếp thành các túi có đường kính 30 - 250 nm được gọi là intralumenal
vesicles (ILV). Các endosome muộn hoặc hợp nhất với lysosome để phá hủy các chất
trong nó hoặc hợp nhất với màng plasma dẫn đến sự bài tiết của các túi ILV vào mơi
trường ngoại bào khi đó các túi này được gọi là “exosomes” [1].
1.2.2. Thành phần của exsosomes
EXs là hạt nano sinh học đóng vai trị quan trọng như tín hiệu cận tiết (paracrine)
và nội tiết (endocrine) trong tương tác tế bào. Các thành phần mà EXs chứa phụ thuộc
vào nguồn tế bào. EXs có nguồn gốc từ endosome mang theo protein vận chuyển màng,
protein tham gia vào thể đa bào (multivescicular body - MVB) (Alix, TSG101), protein
dung hợp bao gồm GTPase, Annexins, flotillin và protein rab, có thể thúc đẩy sự hợp
7


Khóa luận tốt nghiệp

Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

nhất của MVB với màng tế bào. EXs cũng được biết là chứa tetraspannin (protein xuyên
màng) (CD9, CD63, CD81 và CD82), các phân tử bám dính (CD11b và CD54) và protein
sốc nhiệt (Hsp70 và Hsp90; chỉ định phản ứng của tế bào với các căng thẳng môi trường).
EXs cũng mang các protein liên quan đến lipid bao gồm cholesterol, sprialomyelin và
ganglioside GM3 và biểu hiện phosphatidylserine (một photpholipid là thành phần của
màng tế bào). Cả hai protein liên quan đến lipid và phospholipase đều đóng vai trị quan
trọng trong cấu trúc và chức năng của bóng bào, chuyển các protein đặc hiệu tới EXs
[10]. Việc đóng gói RNA vào EXs được chọn lọc và bao gồm các microRNA (miRNA),
RNA nhỏ khơng mã hóa (piRNA, snRNA, snoRNA, scaRNA, Y RNA), RNA antisense
tự nhiên, tRNA và các mảnh của chúng, mRNA và các mảnh của chúng, rRNA và RNA

dài không mã hóa [27]. Ngồi ra, EXs có nguồn gốc từ MSCs biểu hiện cao cytokine và
chemokine liên quan đến sự hình thành mạch và di chuyển tế bào như: IL-6, yếu tố tăng
trưởng nội mô mạch máu (VEGF), yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (bFGF) là protein
proangiogen và protein chemokine monocyte-1 (MCP-1) là chemokine thúc đẩy di
chuyển [7].
Các tác dụng điều hòa miễn dịch của MSCs như sự ức chế tăng sinh tế bào T và
B, tạo ra các tế bào tua dung nạp (DC), bài tiết cytokine chống viêm đã được chứng
minh. EXs có nguồn gốc từ MSCs ức chế các phản ứng miễn dịch thông qua việc giảm
các cytokine gây viêm và tăng phản ứng chống viêm theo cách tương tự MSCs nhưng
các cơ chế cơ bản vẫn chưa được rõ ràng [65]. Gần đây, Fattore và cộng sự, đã phát hiện
ra rằng các MSC-EXs thể hiện hoạt động ức chế miễn dịch mạnh mẽ như các MSCs bằng
phương pháp gây chết tế bào T theo chu trình, tăng số lượng tế bào T reg và giải phóng
interleukin-10 (IL- 10). Ngồi ra, các EXs có nguồn gốc từ MSCs điều chỉnh TNF-α và
IL-1β đó là các yếu tố ức chế sự trưởng thành của tế bào T [12]. Tuy nhiên, một yếu tố
hạn chế chính trong lĩnh vực phân tích thành phần EXs là việc sử dụng một loạt các
phương pháp phân lập và mô tả đặc trưng khác nhau giữa các phịng thí nghiệm khác
nhau.

8


Khóa luận tốt nghiệp

Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

Hình 2: Sự hình thành và đặc điểm của exosomes [67]
1.2.3. Ứng dụng của exosomes
1.2.3.1. So với tế bào tiết ra nó
Mặc dù sự an tồn và hiệu quả của liệu pháp MSCs đã được thể hiện nhưng vẫn
cịn nhiều khía cạnh trong cơ chế hoạt động của chúng chưa được hiểu rõ. Ban đầu các

liệu pháp dựa trên MSCs được dự đoán sẽ làm tăng cấu trúc và chức năng của các mô bị
tổn thương hoặc bị bệnh thông qua thay thế tế bào trực tiếp. Khi các MSCs được đánh
dấu và đưa vào in vivo, chúng sẽ di chuyển đến các vị trí tổn thương mơ. Tuy nhiên, có
rất ít MSCs được tạo ra tại các vị trí bị thương này và các nghiên cứu trên động vật gặm
nhấm và chó đã xác nhận rằng các MSCs được tiêm tĩnh mạch bị mắc vào mao mạch
phổi và hầu hết các MSCs đều bị loại bỏ, có một số được thơng qua và tới những mơ
đích bị thương [54]. Ngồi ra liệu pháp MSCs có một số thách thức bao gồm bị từ chối
miễn dịch, mất ổn định di truyền, giới hạn sống sót và hạn chế chức năng. Bên cạnh đó,
sự hình thành khối u là một vấn đề lớn của liệu pháp MSCs trong các ứng dụng lâm sàng.
Việc mở rộng cấp lâm sàng có thể làm tăng nguy cơ mất ổn định di truyền và sản xuất
các tế bào biến đổi. Hơn nữa, thao tác di truyền của các sản phẩm gia tăng tiềm năng gây
ung thư vì gen chuyển có thể phá vỡ sự ổn định của bộ gen đã được thể hiện ở một số
khối u như ung thư biểu mô dạ dày [35], lipoma [34] và u xương [60].

9


Khóa luận tốt nghiệp

Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

Nhiều nghiên cứu cho rằng hiệu quả điều trị của MSCs chủ yếu là hiệu ứng
paracrine của chúng, đặc biệt, thông qua việc tiết ra các túi ngoại bào (EXs) dưới dạng
sản phẩm dược phẩm. Các nghiên cứu chứng minh rằng môi trường nuôi cấy MSCs tạo
ra hiệu quả điều trị tương tự như việc cung cấp các tế bào trong các mơ hình gặm nhấm
của bệnh nhồi máu cơ tim cấp [17] và chấn thương phổi [18]. EXs được tạo ra từ các
MSCs đã được báo cáo như một cơng cụ vận chuyển nhắm đích trong liệu pháp gen và
tế bào. Gần đây, các nghiên cứu cho thấy rằng EXs được tạo ra từ MSCs có thể tóm tắt
lại các chức năng đa dạng của tế bào gốc như thúc đẩy tăng sinh tế bào [64], chống viêm
và điều hịa miễn dịch [3], chống xơ hóa [60] và chống apoptosis [5] trong các nghiên

cứu tiền lâm sàng. EXs so với các liệu pháp dựa trên tế bào đảm bảo hơn cho sự an toàn
của bệnh nhân.
1.2.3.2. Vai trò trong chữa lành vết thương
Trong chữa lành vết thương, EXs có nguồn gốc từ MSCs thúc đẩy di chuyển tế
bào, tăng sinh tế bào, sản xuất collagen và thúc đẩy sự hình thành các mạch mới, tái biểu
mơ hóa và giảm độ rộng sẹo. Tác động của EXs đã được thể hiện khác nhau ở các giai
đoạn chữa lành vết thương, bao gồm điều chỉnh viêm, di cư, tăng sinh, tác dụng
proangiogenic, sản xuất collagen và tu sửa ma trận ngoại bào (ECM).
Các nghiên cứu về EXs trong điều kiện in vitro cho thấy các bóng bào có thể bị
bắt bởi các tế bào khác, do đó truyền bất kỳ thơng tin mà nó mang tới các tế bào đó [53].
EXs được tiết ra bởi các loại tế bào khác nhau và góp phần vào các tác động có lợi, bao
gồm sửa chữa mô, giao tiếp thần kinh và vận chuyển các chất. MSC-EXs đã được tìm
thấy trong kích hoạt một số con đường tín hiệu quan trọng trong việc chữa lành vết
thương (Akt, Erk và STAT3) và tạo ra biểu hiện của một số yếu tố tăng trưởng [yếu tố
tăng trưởng tế bào gan (HGF), yếu tố tăng trưởng giống insulin-1 (IGF-1), yếu tố tăng
trưởng thần kinh (NGF) và yếu tố có nguồn gốc từ stromal-1 (SDF1)], protein sốc nhiệt
(HSPs: HSP90, HSP72) và tín hiệu Wnt/β-catenin.
Một trong những phần quan trọng nhất của quy trình chữa lành vết thương là tạo
mạch để cung cấp oxy và chất dinh dưỡng từ máu cho mô bị tổn thương. Các EXs tiết ra
từ MSCs kích hoạt một số con đường truyền tín hiệu nội bào mà một trong số chúng có
thể gây ra sự biểu hiện của các yếu tố tăng trưởng tế bào hiệu quả trong sự hình thành
mạch. Ví dụ, sự kích hoạt tín hiệu STAT3 điều chỉnh biểu hiện iNOS trong tế bào

10


Khóa luận tốt nghiệp

Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

keratinocytes có thể điều chỉnh sự hình thành mạch ở vùng vết thương [8]. Bên cạnh đó,
kích hoạt Wnt4/β-catenin đã được báo cáo như là một con đường tín hiệu khác liên quan
đến proangiogen dưới tác động của EXs có nguồn gốc từ tế bào gốc trung mơ dây rốn
người [62]. Tuy nhiên, tùy thuộc vào nguồn tế bào, các điều kiện mà các EXs được tạo
ra và thành phần của chúng, những điều này có thể có tác dụng có lợi hoặc có hại cho sự
hình thành mạch và tái tạo mơ.
1.3. Q trình lành vết thương
Chữa lành vết thương là một nỗ lực phối hợp giữa các mơ và các dịng tế bào khác
nhau để thay thế sự thiếu của các cấu trúc tế bào và các lớp mơ. Q trình làm liền vết
thương được phân ra 4 giai đoạn: chảy máu, viêm, tăng sinh và tu sửa.
Chảy máu: Xảy ra ngay sau khi xuất hiện vết thương, sự co mạch và đông máu bắt đầu,
chủ yếu để ngăn sự mất máu bằng cách tập hợp tiểu cầu và hình thành cục máu đơng,
cung cấp khn cho các tế bào cần thiết khác trong chữa liền vết thương. Các cục máu
đông thu hút bắt giữ tiểu cầu, yếu tố tăng trưởng, cytokines giúp thu hút bạch cầu trung
tính, đại thực bào, tế bào nội mơ và nguyên bào sợi [41]. Các mạch máu sau đó giãn ra
cho phép dòng máu và các tế bào máu khác chảy vào nhiều hơn.
Viêm: Khi vùng da bị tổn thương làm mất hàng rào vật lý bảo vệ khỏi sự xâm nhập của
các vi sinh vật, giai đoạn viêm tạo ra một hàng rào miễn dịch bằng cách khởi động một
loạt các sự kiện phân tử. Bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân, đại thực bào được thu
hút vào vị trí vết thương trong vịng 24-72 giờ sau khi bị thương. Phagocytosis được tạo
ra bởi bạch cầu trung tính để loại bỏ vi khuẩn, các hạt lạ và mô bị hỏng. Sau khi hoàn
thành nhiệm vụ, bạch cầu trung tính trải qua q trình chết theo chu trình, sau đó đại
thực bào đến vị trí vết thương để loại bỏ các mô hoại tử và tế bào chết. Đại thực bào
cũng hoạt động như một tế bào điều tiết quan trọng trong việc kích hoạt keratinocytes,
nguyên bào sợi và các tế bào nội mô. Nếu việc tiêu diệt vi sinh vật khơng hồn thành nó
có thể kéo dài giai đoạn viêm và vết thương có thể đi vào trạng thái mạn tính khơng thể
chữa lành.
Tăng sinh: Giai đoạn này bắt đầu khi khả năng cầm máu và miễn dịch đáp ứng thành
công trong khu vực vết thương. Vào ngày thứ ba nguyên bào sợi xuất hiện và bắt đầu
tăng sinh và sản xuất protein ma trận bao gồm axit hyaluronic, fibronectin, proteoglycan,

procollagen I và III. Collagen đóng một vai trò quan trọng trong sự tăng sinh và giai
11


Khóa luận tốt nghiệp

Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

đoạn tu sửa của quá trình chữa liền vết thương, cung cấp một nền tảng cho sự hình thành
ma trận. Các tế bào biểu bì, nguyên bào sợi, đại thực bào và tế bào nội mô mạch máu
cũng bắt đầu tạo mạch máu, hình thành mạng lưới vi mạch. Các tế bào keratinocytes lân
cận cũng như các tế bào biểu mô di chuyển vào các cạnh vết thương có vai trị khơi phục
lớp biểu bì thơng qua một q trình gọi là tái biểu mơ hóa [44].
Tu sửa: Giai đoạn cuối của việc chữa lành vết thương là tu sửa. Nó bắt đầu 4 hoặc 5
ngày sau chấn thương và kéo dài hơn 2 tuần, tùy thuộc vào môi trường chữa lành vết
thương. Cùng với việc sắp xếp lại lớp hạ bì và tổng hợp ma trận ngoại bào (ECM), ma
trận nội bào trưởng thành, bó collagen tăng đường kính và axit hyaluronic và fibronectin
bị suy thối [48]. Mô liên kết cơ bản co lại và mang các cạnh vết thương lại gần nhau
hơn.
Các giai đoạn được tóm tắt trong bảng 2:
Bảng 2: Tổng hợp các giai đoạn trong q trình lành vết thương [46]
Giai
đoạn

Yếu tố tham gia

Đích tác động

Sự kiện

Chảy
máu/
đông máu

PDGF; TGF-A1 và
TGF-2; EGF; IGF

Tế bào nội mơ, tiểu cầu

Hình thành cục máu
đơng

Viêm

TGF-β; TNF-α;
heparin liên kết
EGF; FGF; IL-1

Kích hoạt keratinocytes,
tế bào nội mơ, bạch cầu,
bạch cầu trung tính, đại
thực bào

Thực bào và loại bỏ các
yếu tố xâm nhập từ bên
ngoài, vi khuẩn, tế bào
chết và ECM hư hỏng

IL; FGF; TNF-α;
Sản xuất ma trận, tổng

VEGF; bFGF;
Tăng sinh
Nguyên bào sợi
hợp collagen, hình
TGF-β; TIMP;
thành mạch máu
PDGF; angiogenin
PDGF; TGF-β; αChuyển đổi fibroblast
Myofibroblasts, nguyên
Tu sửa
SMAs; TIMPs;
thành Myofibroblasts,
bào sợi, tế bào nội mô
FGFs
vết thương co lại
PDGF (Yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu); TGF-A1 và TGF-2 (yếu tố tăng
trưởng chuyển đổi A1 và 2); EGF (yếu tố tăng trưởng biểu bì); IGF (yếu tố tăng trưởng
giống insulin); TNF-α (yếu tố hoại tử khối u-α); FGF (yếu tố tăng trưởng nguyên bào
sợi); IL (interleukin); VEGF (yếu tố tăng trưởng tế bào nội mô mạch máu); TIMP (ức
chế mô của metallicoproteinase); α-SMAs (α–actin cơ trơn).

12


Khóa luận tốt nghiệp

Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

Hình 3: Các giai đoạn chữa lành vết thương cấp tính trong điều kiện sinh lý bình
thường [46]

a) Sự đông máu, kết tập tiểu cầu và sự di chuyển của bạch cầu trung tính và đại thực
bào đến vị trí tổn thương. Trong vịng 24 giờ, một cục máu đông được bắt đầu bao gồm
fibrin và fibronectin tạo nên một kích thích di chuyển tế bào và được biết là tiết ra các
yếu tố tăng trưởng vào các mô xung quanh. b) Sau 3 ngày nhiều bạch cầu trung tính và
đại thực bào được thu hút vào vị trí vết thương, thực bào và tiêu diệt vi sinh vật cũng
như tạo ra sự tăng trưởng các yếu tố vào mơi trường vết thương. Sau 5 ngày, q trình
tạo mô hạt bao gồm fibroblasts, đại thực bào bổ sung và hệ thần kinh. Giai đoạn cuối
bao gồm di chuyển biểu bì và ăn sâu vào mơ hạt.
1.4. Ngun bào sợi (Fibroblast) – Vật liệu nghiên cứu
1.4.1. Giới thiệu chung về nguyên bào sợi người
Nguyên bào sợi là tế bào được tìm thấy trong hầu hết các mơ của cơ thể, là tế bào
hoạt động trao đổi chất đóng vai trò quan trọng trong điều chỉnh ma trận ngoại bào
(ECM), tổng hợp cấu trúc nền của da và collagen, khung cấu trúc cho các mơ và có vai
trị lớn trong chữa liền vết thương. Nguyên bào sợi có thể biến đổi kiểu hình và tổng hợp
các khối cấu trúc cần thiết thay thế mô bị thương. Nguyên bào sợi là những tế bào lớn,
dẹt, các tế bào thuôn dài (trục chính), có một tế bào chất phân nhánh bao quanh một nhân

13


Khóa luận tốt nghiệp

Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

tế bào hình elip, có hai hoặc nhiều nhân con. Một số marker đặc hiệu của nguyên bào sợi
như prolyl-4-hydroxylase, MAS516, and FSP1 [68].
Khi được kích hoạt, nguyên bào sợi biểu hiện một mạng lưới nội chất phong phú
và bộ máy Golgi nổi bật liên quan đến tổng hợp và bài tiết các phân tử ECM bao gồm
collagen, proteoglycan, fibronectin, cũng như các protease có khả năng làm suy giảm
ECM. Các protein tế bào liên kết với các integrins bề mặt tế bào và ECM tạo điều kiện

cho tế bào vận động và tạo ra lực co bóp quan trọng trong cân bằng nội mô và chữa lành
vết thương.
Ngun bào sợi có nguồn gốc từ trung mơ. Khả năng biến đổi của nguyên bào sợi
một phần là do sự đa dạng của các thụ thể bám dính bề mặt tế bào (integrins, syndecans,
cadherin) tạo điều kiện thuận lợi cho việc giao tiếp của nguyên bào sợi với môi trường
xung quanh. Một trong những biến đổi nguyên bào sợi được mô tả là sự biến đổi nguyên
bào sợi thành myofibroblast. Những tế bào này hoạt động kết hợp với các tế bào nội mơ
mạch máu để hình thành mơ hạt trong thời gian lành vết thương.
1.4.2. Nuôi cấy nguyên bào sợi
Trong điều kiện nuôi cấy thông thường, huyết thanh phơi thai bị ( Fetal bovine
serum – FBS) được bổ sung vào môi trường nuôi cấy giúp thúc đẩy tăng sinh tế bào. Đây
là một nguồn phong phú của các thành phần không xác định như các nguyên tố vi lượng,
yếu tố tăng trưởng, hormone, protein, axit amin, kháng nguyên, kháng thể, các chất có
hoạt tính sinh học (chống độc, chống oxi hóa),... Hơn nữa, hàm lượng albumin cao trong
huyết thanh đảm bảo cho các tế bào được bảo vệ khỏi các điều kiện bất lợi tiềm tàng như
thay đổi pH [32]. Các quy trình xử lý và kiểm tra của huyết thanh cần tuân theo quy định
và được chứng nhận bởi Hiệp hội Công nghiệp huyết thanh Quốc tế (The International
Serum Industry Association – ISIA). Nguyên bào sợi được nuôi cấy trong điều kiện
37oC, 5% CO2.
Huyết thanh phôi thai bị (FBS) được bổ sung vào mơi trường ni cấy bên cạnh
những ưu điểm nêu trên thì có những nhược điểm. Trong FBS chứa một lượng đáng kể
các túi ngoại bào (EV-FBS) ảnh hưởng trực tiếp đến các tế bào ni cấy trong ống
nghiệm. Ngồi ra các EVs của FBS có thể gây nhiễu cho bất kỳ đánh giá định lượng
hoặc định tính nào của EVs được phân lập từ các nguồn tế bào ni cấy khác [36]. Vì
vậy trong thí nghiệm đánh giá chất lượng và khả năng của EVs được phân lập từ các tế
14


Khóa luận tốt nghiệp

Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

bào MSCs trong chữa liền vết thương với vật liệu thí nghiệm là nguyên bào sợi, việc loại
bỏ EVs – FBS là cần thiết để cho kết quả đáng tin cậy.
1.4.3. Chức năng của nguyên bào sợi
Nguyên bào sợi là một nhóm các tế bào đa dạng. Trong một hệ thống cơ quan, có
thể có rất nhiều chức năng. Trong da, nguyên bào sợi ở các vị trí khác nhau có vai trị
riêng biệt. Dịng tế bào nằm ở bề ngồi liên quan đến sự hình thành nang lơng và chịu
trách nhiệm tái cấu trúc trong q trình lành vết thương, dòng tế bào sâu hơn chịu trách
nhiệm cho sự tạo thành ECM [13]. Trong cơ thể người trưởng thành, nguyên bào sợi vẫn
ở dạng không hoạt động cho đến khi kích thích tổng hợp protein và cơ chế co bóp. Người
ta ước tính rằng mỗi tế bào nguyên bào sợi có thể tổng hợp khoảng 3,5 triệu phân tử
procollagen/tế bào/ngày. Tuy nhiên số lượng chúng tiết ra được điều hòa bởi các enzym
lysosome như cathepsins B, D and L. Khoảng 10% - 90% phân tử procollagen bị thối
hóa nội bào trước khi được bài tiết tùy thuộc vào mơ và độ tuổi [39].
Ngun bào sợi cũng đóng vai trị quan trọng trong việc điều hịa thể tích và áp
lực dịch kẽ mô bằng sự tương tác của thụ thể β1 integrin (cái mà giúp chúng neo bám
vào protein ECM), đặc biệt là sự tương tác giữa collagen, laminin với α2β1 integrin
thông qua các lực nội bào được tạo ra từ các khung xương tế bào [57].
1.4.4. Vai trị trong chữa liền vết thương của ngun bào sợi
1.4.4.1.

Kích hoạt các nguyên bào sợi

Trong quá trình chữa liền vết thương, vào cuối giai đoạn viêm và bắt đầu giai
đoạn tăng sinh (24 - 48 giờ sau chấn thương), nguyên bào sợi đầu tiên xuất hiện tại vị trí
tổn thương. Nguyên bào sợi xâm nhập và làm suy giảm cục máu đông bằng cách sản
xuất nhiều loại enzyme matrix metalloproteinases (MMPs) khác nhau, thay thế bằng ma
trận ngoại bào (ECM) được tạo nên từ các thành phần như: collagen I-IV, XVIII,
glycoproteins, proteoglycans, laminin, thrombospondin, glycosaminoglycans (GAGs),

axit hyaluronic (HA) và heparan sulphate [37]. Ma trận này hỗ trợ và điều chỉnh sự di
chuyển và hoạt động của nguyên bào sợi, cũng như đóng vai trị hỗ trợ và tín hiệu cho
sự hình thành mạch, tạo mơ hạt và biểu mơ [50].
Các ngun bào sợi được tìm thấy trong các mơ khơng bị thương nơi chúng duy
trì ECM [50]. Nguyên bào sợi được tập hợp đến vị trí vết thương thơng qua các chất hóa

15


Khóa luận tốt nghiệp

Đỗ Thị Xn Phương – K61 Cơng nghệ sinh học

ứng động (chemoattractants), như: yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (PDGF),
interleukin-1 beta (IL-1β) và yếu tố hoại tử khối u-alpha (TNF-α), chúng được tạo ra từ
ma trận tạm thời (provisional matrix) và được phát tán bởi tiểu cầu và đại thực bào như
là một phần của phản ứng viêm [30]. Chất hóa ứng động rất quan trọng trong việc định
hướng các nguyên bào sợi đến vị trí vết thương bằng cách gắn với những thụ thể đặc
hiệu trên bề mặt tế bào. Liên kết này cho phép nguyên bào sợi định hướng theo nồng độ
của chất hấp dẫn và thiết lập cạnh đầu vết thương theo hướng tập trung cao nồng độ nhất.
1.4.4.2. Sự di cư của nguyên bào sợi
Guido và Tranquillo [19] quan sát thấy rằng, nguyên bào sợi di chuyển vào lòng
vết thương thông qua một cơ chế gọi là “hướng dẫn liên lạc - contact guidance”. Họ quan
sát thấy nguyên bào sợi không xâm lấn một cách tự do hay theo con đường ngắn nhất,
thay vào đó là đi theo định hướng collagen đã có sẵn ở vị trí vết thương. Có khả năng
các nguyên bào sợi tuân thủ và đi theo fibronectin ở lòng vết thương hơn là với collagen
(nguyên liệu chủ yếu của ECM). Thí nghiệm của Hsieh và Chin [25] đã chứng minh tính
đặc hiệu của fibronectin như là một yếu tố di cư. Theo Xu và Clark [58], ức chế các
integrins gắn với fibronectin (cụ thể là α3β1 và α5β1) cũng đã ức chế sự di cư. Cả hai
kết quả chứng minh vai trò cần thiết của cả hai yếu tố là chất nền và các integrins gắn

trên bề mặt tế bào để tạo điều kiện cho di cư tế bào.
Thí nghiệm nguyên bào sợi in vitro cho thấy khơng có sự di chuyển mà khơng có
fibronectin, nhưng được kích thích hơn nữa với sự có mặt của protein ECM , tenascin-C
[55]. Protein này được sản xuất nhanh chóng bởi ngun bào sợi trong vịng 24 giờ sau
khi mô bị tổn thương, nhưng được làm sạch khỏi vết thương vào thời điểm mô sửa chữa.
Hoạt động của nguyên bào sợi q ít có thể dẫn đến giảm mơ hạt và vết thương khơng
lành, trong khi đó hoạt động quá mức có thể gây bất lợi cho việc chữa liền vết thương
và dẫn đến các biến chứng như sẹo phì đại, sẹo lồi, co rút [40].
1.4.4.3. Tạo ma trận ngoại bào và sửa chữa
Nguyên bào sợi vào lòng vết thương bắt đầu tăng sinh và tạo ra enzyme thoái hóa
ma trận ngoại bào (MMPs) và các enzyme khác như seperinase để loại bỏ protein biến
tính và vật liệu ma trận tạm thời không cần thiết cho vết thương. Những proteinase này
được kiểm soát chặt chẽ bởi các chất ức chế mô của metalloproteinases (tissue inhibitors
of metalloproteinases - TIMPS) do nguyên bào sợi tiết ra. Đồng thời chúng cũng sản
16