THIẾT kế mồi PHỤC vụ TÁCH DÒNG GEN CHỊU hạn ở cây lúa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO
THIẾT KẾ MỒI PHỤC VỤ TÁCH DÒNG GEN CHỊU HẠN
(DEEPER ROOTING 1 – DR01)

1

Bộ môn:

Tin sinh học

Giảng viên hướng dẫn:

TS. Đàm Thúy Hằng

Sinh viên:

Nguyễn Thị Hoài Thương

MSSV:

20190388

Lớp:

716666


Mục lục

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN BÁO CÁO......................................................................................................3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ TIN SINH HỌC:.................................................................................................3
1.1.1. Tin sinh học là gì?........................................................................................................................3
1.1.2. Các lĩnh vực nghiên cứu chính...................................................................................................3
1.1.3. Mục đích sử dụng của tin sinh học:...........................................................................................4
1.1.4. Các công cụ phần mềm trong tin sinh học:...............................................................................4
1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY
INFORMATION:.......................................................................................................................................4
1.2.1. Lịch sử hình thành:......................................................................................................................4
1.2.2. Nội dung:.......................................................................................................................................4
1.3. ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................................................................5
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.........................................................................................5
2.1. VẬT LIỆU:...........................................................................................................................................5
2.2. PHƯƠNG PHÁP.................................................................................................................................6
2.2.1. Nhân bản, tách dịng và giải trình tự gene Deeper Rooting 1(DR01)....................................6
2.1.2. Dự đốn đặc tính sản phẩm:.....................................................................................................17
CHƯƠNG 3: TỔNG KẾT...........................................................................................................................19
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................................................20

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN BÁO CÁO
1.1. GIỚI THIỆU VỀ TIN SINH HỌC:
1.1.1. Tin sinh học là gì?
Tin sinh học (bioinformatics) là một lĩnh vực khoa học sử dụng các công nghệ của
các ngành toán học ứng dụng, tin học, thống kê, khoa học máy tính, trí tuệ nhân tạo,
hóa học và hóa sinh (biochemistry) để giải quyết các vấn đề sinh học.
Một thuật ngữ thường được dùng thay thế cho tin sinh học là sinh học tính tốn
(computational biology). Tuy nhiên, tin sinh học thiên về việc phát triển các giải thuật,

lý thuyết và các kĩ thuật thống kê và tính tốn để giải quyết các bài tốn bắt nguồn từ
nhu cầu quản lý và phân tích dữ liệu sinh học. Trong khi đó, sinh học tính tốn thiên
về kiểm định các giả thuyết (hypothesis) được đặt ra của một vấn đề trong sinh học
nhờ máy tính thực nghiệm trên dữ liệu mơ phỏng, với mục đích chính là phát hiện và
nâng cao tri thức về sinh học (ví dụ: dự đoán mối quan hệ tương tác giữa các protein,
dự đoán cấu trúc bậc 2 phân tử của protein, v.v.).
1.1.2. Các lĩnh vực nghiên cứu chính

STT

Lĩnh vực

Phân tích trình tự
Chỉ định Genone
Dị tìm đột biến và SNP

1

Genimics – Hệ gene học

Phân loại học phân tử
Bảo tồn đa dạng sinh học

2

Sinh học tiến hóa

Mức độ biểu hiện gen
Nhận diện protein
Dự đốn cấu trúc protein

3

Phân tích chức năng gene

4

Các hệ thống sinh học kiểu mẫu

5

Phân tích hình ảnh mức độ cực cao

3


1.1.3. Mục đích sử dụng của tin sinh học:
Tin sinh học khơng có tác dụng thay thế thực nghiệm do đặc thù của Sinh học
là khoa học thực nghiệm. Tin sinh học được sử dụng như một phương tiện lưu trữ
dữ liệu và dự đoán kết quả thực tiễn nhằm giảm thiểu tối đa khả năng sai lệch của
các phương pháp thực hành.
1.1.4. Các công cụ phần mềm trong tin sinh học:
Một trong các công cụ dùng trong sinh học tính tốn (computational biology)
nổi tiếng nhất là BLAST, một thuật tốn để tìm kiếm những trình tự nucleic acid
hoặc protein tương đồng lưu trữ trên các cơ sở dữ liệu.
Ba nguồn cơ sở dữ liệu công cộng lớn nhất về trình tự DNA và protein
(thường được gọi là ngân hàng gene (ngân hàng cơ sở dữ liệu gene) là NCBI,
EMBL và DDBJ.
Các ngơn ngữ lập trình của máy tính như Perl và Python thường được dùng để
giao tiếp (interface) và trích xuất (parse) dữ liệu từ các ngân hàng cơ sở dữ liệu

sinh học (biological database) thông qua những chương trình tin sinh học
(bioinformatics program). Cộng đồng những lập trình viên tin sinh học đã triển
khai nhiều dự án phần mềm mã nguồn mở (free/open source) như EMBOSS,
Bioconductor, BioPerl, BioPython, BioRuby và BioJava. Điều này giúp cho việc
chia sẻ, phát triển và phổ biến các cơng cụ lập trình và tài nguyên lập trình
(programming objects) giữa các nhà tin sinh học.
1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NATIONAL CENTER FOR
BIOTECHNOLOGY INFORMATION:
1.2.1. Lịch sử hình thành:
National Center for Biotechnology Information, sau đây viết tắt là NCBI,là
một phần của United States National Library of Medicine (NLM), một chi nhánh
của National Institutes of Health (NIH). Chương trình được phê duyệt và tài trợ
bởi chính phủ Hoa Kỳ. NCBI đặt tại Bethesda, Maryland và được thành lập vào
năm 1988 thông qua luật do Thượng nghị sĩ Claude Pepper bảo trợ.
1.2.2. Nội dung:
- NCBI có đường link chính thức là: />- NCBI là một cơ sở dữ liệu liên quan đến công nghệ sinh học và y sinh học và là
một nguồn tài nguyên quan trọng cho các công cụ và dịch vụ tin sinh học. Các cơ
sở dữ liệu chính bao gồm GenBank với trình tự DNA và PubMed, một cơ sở dữ
liệu thư mục cho tài liệu y sinh. Các cơ sở dữ liệu khác bao gồm cơ sở dữ liệu
NCBI Epigenomics. Tất cả các cơ sở dữ liệu này đều có sẵn trực tuyến thơng qua
cơng cụ tìm kiếm Entrez. NCBI được chỉ đạo bởi David Lipman, cũng là một trong
những tác giả ban đầu của chương trình so sánh trình tự BLAST.
4


1.3. ĐẶT VẤN ĐỀ
Lúa là cây lương thực truyền thống và quan trọng của Việt Nam. Hiện nay,
do ảnh hưởng của sự biến đổi khí hậu, tình trạng hạn hán gia tăng ở nhiều nơi trên
thế giới trong đó có nước ta chính là nguyên nhân chính thúc đẩy các dự án, nghiên
cứu phát triển các loại cây trồng có khả năng chống chịu hạn hán tốt mà vẫn đảm

bảo được năng suất nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng gia tăng của con người.
Theo tạp chí Nature Genetics số ra ngày 4/8 ( , nhóm chuyên gia Nhật Bản đã tìm thấy một gen đặc biệt
(DEEPER ROOTING 1 – DR01) trong một giống lúa có tên Kinandang Patong
được trồng trên vùng núi cao khô ráo ở Philippines. Gen này được điều chỉnh bởi
hoocmon auxin tham gia vào quá trình kéo dài tế bào ở ngọn rẽ gây ra sự phát triển
không đối xứng của rễ, cao hơn là làm tăng góc phát triển của rễ, giúp rẽ phát triển
theo chiều hướng xuống nhiều hơn ,giúp cho cây mọc rễ dài hơn, làm năng suất
tăng gấp 3 lần trong điều kiện khô hạn.

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU:
- Giống lúa Kinandang Patong.

5


2.2. PHƯƠNG PHÁP
2.2.1. Nhân bản, tách dịng và giải trình tự gene Deeper Rooting 1(DR01)
2.2.1.1. Thiết kế đoạn mồi PCR cho việc nhân bản gene DR01
a. Nội dung: Nghiên cứu thông tin về gen Deeper Rooting 1(DR01) và
thiết kế cặp mồi để nhân gen Deeper Rooting 1(DR01) dựa trên trình tự gen
AB689741 của giống lúa Kinandang Patong trên GenBank.
b. Các bước tiến hành:
- Bước 1: Truy cập trang web NCBI theo đường
link: />- Bước 2: Trên thanh tìm kiếm, nhập từ khoá Deeper Rooting 1 hoặc
truy cập theo đường
term=Deeper+Rooting+1

link:

/>
6


- Bước 3: Khi tìm kiếm trên NCBI, hiển thị rất nhiều kết quả. Chọn lấy 5
kết quả khác nhau để lấy dữ liệu nucleotit của 5 loài khác nhau:
Bài báo 1:
 AB689741
 Version: AB689741.1
 Organism: Oryza sativa Japonica Group

Bài báo 2:
 Locus: XM_006660599
 Version: XM_006660599.3
 Organism: Oryza brachyantha

7


Bài báo 3:
 Locus: MT478995
 Version: Mt478995.1
 Organism: Tripidium arundinaceum

Bài báo 4:
 Locus: XM_021740453
 Version: XM_021740453.2
 Organism: Manihot esculenta

8

Bài báo 5:
 Locus: XM_006597817
 Version: XM_006597817.4
 Organism: Glycine max

- Bước 4: Tải xuống trình tự Fasta, ta được kết quả của 5 lồi như sau:
Lồi

Trình tự nucleotide

9


Oryza sativa
Japonica
Group

Oryza
brachyantha

Tripidium
arundinaceu
m

Manihot
esculenta

Glycine max

- Bước 5: Chạy chương trình so sánh trình tự Clustal Omega sử dụng đường link:
nhằm tìm ra vùng bảo thủ. Nhập 5 trình
tự nucleotit ở trên và chọn “DNA”:

10


Kết quả được như hình dưới đây:

11


12


13


Thiết kế mồi:
Giả sử AB689741 là mẫu gần với chủng cần tách dịng. Chọn AB689741 là khn
để thiết kế mồi.
-Lựa chọn vùng từ nu thứ 132 đến nu thứ 161 để thiết kế mồi xuôi
-Lựa chọn vùng từ nu 724 đến nu thứ 756 để thiết kế mồi ngược.
- Bước 5: Sử dụng phần mềm Primer3 sử dụng đường link:
thực hiện tổng hợp đoạn mồi ảo
14


15

Kết quả thu được như sau

Dựa vào một số yêu cầu đối với cặp mồi dùng trong PCR như: độ dài từ 1824 bp, tỷ lệ GC tối ưu là 50-60%, Tm nên nằm trong khoảng 50-65 độ

Nên ta chọn Primer pair 2 (thỏa mãn các yêu cầu nêu trên) và khi kiểm tra
lại mồi xuôi, mồi ngược ta thấy nó nằm trên vùng bảo thủ ở chương trình
Clustal Omega.


2.1.1.2. Tách dòng gene:
- Bước 1: Tách chiết DNA tổng số : DNA tổng số được tách từ hoa của cây lúa
Kinandang Patong.
- Bước 2: Tiến hành PCR với cặp mồi để khuếch đại gene DR01.
16


- Bước 3: Điện di sản phẩm trên gel agarose và tinh sạch.
- Bước 4: Giải trình tự gene.
- Bước 5: Phân tích BLAST kết quả gene thu được với gene trong GenBank
của NCBI.
2.1.2. Dự đốn đặc tính sản phẩm:
- Bước 1: Dự đốn đặc tính sản phẩm:Sử dụng chương trình SMS PCR để chạy
PCR ảo tạo ra sản phẩm PCR ảo.
( sử dụng đường link )

Kết quả thu được như sau:

17

- Bước 2: Sử dụng chương trình BLAST qua đường link:
nhằm dự đốn kết quả của protein thu
được.
Copy trình tự gen của sản phẩm chạy PCR ảo vừa rồi vào ơ nhập trình tự của Blast,
submit

Ta thu được kết quả

18


Đây là kết quả đã phân tích được. Chúng ta nên chọn cái có trình tự có tỉ lệ tương
đồng cao, vào đọc để nghiên cứu xem kết quả của đoạn mồi đó như thế nào.

Từ đây kết luận được mồi thiết kế chính xác với gene Deeper Rooting 1(DR01) từ
NCBI. Kết luận được rằng gene tổng hợp giúp cho cây mọc rễ dài hơn, làm năng
suất tăng gấp 3 lần trong điều kiện khô hạn.

CHƯƠNG 3: TỔNG KẾT
Cải thiện di truyền khả năng chống chịu hạn là xần thiết để sản xuất cây
trồng ổn định và đầy đủ trong điều kiện hạn hán trong khu vực. Đề tài lựa chọn
giống lúa Kinandang Patong do tính gần gũi của chúng với nền nơng nghiệp lúa
nước của Việt Nam: hồn cảnh mơi trường sống hiện nay biến đổi khí hậu và hạn
hán ở nhiều nơi và yêu cầu năng suất.
Dựa vào NCBI cùng các công cụ tin sinh, em đã xây dựng trình tự mồi,
chạy PCR ảo. Tuy nhiên, do đây là kết quả được dự đốn nên khơng đảm
bảo tính

19


chính xác hồn tồn với khn thực.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] GS.TS Nguyễn Văn Cách, Bài giảng môn Tin sinh học
[2] />[3] />[4] />[5] />[6] />[7] />[8] />[9] />
20