XÂY DỰNG QUY TRÌNH THU NHẬN KHÁNG THỂ đơn DÒNG dựa TRÊN NUÔI cấy tế bào ĐỘNG vật

XÂY DỰNG QUY TRÌNH THU NHẬN
KHÁNG THỂ ĐƠN DỊNG DỰA TRÊN
NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Đề tài:


NỘI DUNG
01 Giới thiệu chung
Quy trình thu nhận KT
02 dựa trên NCMTBĐV
03 Thu nhận KT đơn
dòng
04 So sánh phương pháp

05 Ứng dụng


GIỚI
THIỆU


Giới thiệu
Kháng thể đơn dòng được
tổng hợp từ một dòng tế bào
lympho B sau khi được hoạt
hóa bằng một phản ứng với
kháng nguyên.
Các kháng thể đơn dòng chỉ
nhận biết một epitope trên
một kháng nguyên cho sẵn

Giới thiệu

 Tương tác KN-KT không chuyên
biệt
 Dễ sản xuất
 Giới hạn về số lượng

 Tương tác KN-KT chuyên
biệt
 Đòi hỏi kỹ thuật cao
 Không giới hạn về số lượng


Giới thiệu
Kháng thể đơn dòng (mAb) là thuốc thử quan trọng được sử dụng
trong nghiên cứu y sinh, chẩn đoán bệnh và điều trị các bệnh như
nhiễm trùng và ung thư.
Các kháng thể này được tạo ra bởi các dòng tế bào hoặc dịng vơ
tính thu được từ động vật đã được miễn dịch với chất là đối tượng
nghiên cứu.


Giới thiệu
Dòng tế bào:
Các dòng tế bào được tạo ra bằng cách kết hợp các tế bào B
miễn dịch và các tế bào u tủy (myeloma cells)
Để tạo ra mAb mong muốn, các tế bào phải được nuôi cấy
theo một trong hai cách:

 Bằng cách tiêm vào khoang phúc mạc của một con chuột đã
được chuẩn bị thích hợp (phương pháp in vivo, hoặc cổ
trướng của chuột)
 Bằng cách nuôi cấy mô trong ống nghiệm


Giới thiệu
Nguyên tắc của Chính phủ Hoa Kỳ về sử dụng và chăm sóc
Động vật có Xương sống được dùng làm thí nghiệm:
 Động vật được chọn cho quy trình phải có lồi và chất lượng thích hợp
và số lượng tối thiểu cần thiết để có được kết quả hợp lệ.
 Nên xem xét các phương pháp như mơ hình tốn học, mơ phỏng máy
tính và hệ thống sinh học trong ống nghiệm.
 Việc sử dụng động vật một cách hợp lý, bao gồm cả việc tránh hoặc
giảm thiểu sự khó chịu, đau khổ và đau đớn khi phù hợp với các thực
hành khoa học đúng đắn là điều bắt buộc.


QUY
TRÌNH


Quy trình
Sự hình thành tế bào lai Hydridoma:
 Hybrid = lai tế bào lympho B x tế bào ung thư dòng tủy myeloma ; -oma =
tumor (khối u)
 Kháng thể đơn dòng là chuỗi tế bào Hybridoma sản sinh ra kháng thể đơn
dòng là "bất tử" và có thể sản sinh ra các kháng thể giống nhau hồn tồn.
 Q trình này bắt đầu bằng cách tiêm cho chuột một kháng nguyên gây ra
phản ứng miễn dịch. Một loại tế bào bạch cầu, tế bào B, tạo ra các kháng thể

liên kết với kháng nguyên được tiêm.


Quy trình
 Hybridoma được sản xuất bằng
cách tiêm kháng nguyên đặc hiệu vào
vật chủ
1 - Tiêm kháng nguyên đặc
hiệu vào vật chủ (thường là chuột).
   2 - Tách tế bào sản sinh kháng
thể (tế bào B) từ lá lách của vật chủ.
   3 - Trộn hỗn hợp các tế bào B với
tế bào u đặc hiệu mà có thể phát triển
dễ dàng trong nuôi cấy và sản sinh
kháng thể.
   4 - Tách các tế bào dung hợp sản
sinh kháng thể đặc hiệu với các
kháng nguyên mong muốn.


Quy trình
Sản xuất kháng thế đơn dịng bằng phương pháp in vitro:


Quy trình
Phương pháp ni cấy khối mơ:
Là phương pháp đơn giản
Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng phương pháp in vitro là gia tăng
nuôi cấy tế bào lai hybridoma thành những khối và làm sạch kháng thể
đơn dịng từ mơi trường ni cấy

Huyết thanh của bị cái đang mang thai chứa khoảng 50 µg/ml globulin
miễn dịch của bị đươc sử dụng trong hầu hết môi trường nuôi cấy mô.
Tế bào lai hybridoma phát triển trong 10% huyết thanh thai bê (FCS),
thích nghi trong khooảng thời gian ( 8-12 ngày) để phát triển trong ít hơn
1% FCS hoặc trong mơi trường khơng có FCS
Sự thích nghi này có thể kéo dài hơn và trong 3-5% trường hợp tế bào
lai hybrydoma sẽ khơng bao giờ thích nghi với mơi trường FCS thấp


Quy trình
Phương pháp ni cấy khối mơ:
Sau khi thích nghi, việc nuôi cấy tế bào cho phép nuôi theo thông
thường, sử dụng bình thót cổ ni cấy mơ dưới điều kiện phát triển
chuẩn khoảng 10 ngày.
Kháng thể đơn dòng sau đó sẽ được thu hoạch từ mơi trường.
Phương pháp ni cấy khối mô là một công nghệ tương đối đơn giản
để thực hiện, có giá thành đầu tư thực hiện tương đối thấp, có thời gian
từ lúc bắt đầu đến khi kết thúc khoảng 3 tuần, điều này gần giống với
phương pháp dịch tràn ổ bụng, và làm cho nó có thể sản xuất số lượng
kháng thể đơn dịng có thể so sánh được với việc sản xuất bằng
phương pháp dịch tràn ổ bụng ở chuột.


Quy trình
Phương pháp ni cấy khối mơ:
 Điều bất lợi trong những phương pháp này là một thể tích lớn môi
trường nuôi cấy mô phải xử lý, nồng độ kháng thể đơn dòng thu được sẽ
thấp ( khoảng vài microgam trong mỗi mililit) và một vài kháng thể đơn
dòng bị biến đổi trong suốt q trình cơ đặc và tinh sạch.
Trên thực tế, sự chọn lọc một kháng thể đơn dòng cho thấy độ hoạt

động bị giảm sút 42% bằng một hoặc một nồng độ chuẩn.


Quy trình
Sản xuất KT đơn dịng bằng phương pháp in vivo
(phương pháp tràn dịch ổ bụng chuột):


Quy trình
Một số hình ảnh về phương pháp chọc dị:


THU
NHẬN


Thu nhận
 Thu nhận kháng thể đơn dòng được thực hiện theo nhiều kỹ thuật khác
nhau tùy thuộc vào mục đích sử dụng và bản chất của kháng thể.
 Một số kỹ thuật cơ bản thường được sử dụng trong thu nhận kháng thể đơn
dòng:
Sắc ký lỏng cao
áp HPLC

Ngưng tụ bằng
ammonium
sulfate, nồng độ
50%

Sắc ký trao đổi

ion

Sắc ký lọc gel


Thu nhận

Sắc ký lỏng cao áp HPLC

Sắc ký lọc gel


Thu nhận
Kháng thể đơn dịng có thể được thu nhận không cần tinh
khiết bằng các phương pháp ly tâm phân đoạn. Trong trường
hợp cần kháng thể tinh khiết hơn có thể sử dụng các
phương pháp sắc ký cột ái lực với protein A, protein
G...
 Các protein có trọng lượng phân tử cao hơn sẽ kết tủa ở
nồng độ ammonium sulfate thấp hơn (50%)  không thu được
protein tinh khiết cao nhưng hỗ trợ loại bỏ một số protein không
mong muốn.


SO SÁNH


So sánh
Ưu điểm:
Phương pháp in vivo

Thường sản xuất mAb ở một nồng
độ rất cao. Nồng độ cao của mAb
trong dịch tràn ổ bụng ở chuột

Phương pháp in vitro
 Giảm việc sử dụng chuột ở
giai đoạn sản xuất kháng thể
Phương pháp được lựa chọn

có thể hạn chế việc nhiễm trong

cho cho sự sản xuất ở quy

dịch nuôi cấy in vitro khi số lượng

mô lớn

tương đương của mAb được sử
dụng

  Giảm nhân viên phịng thí
nghiệm trong việc xử lý động vật


So sánh
Ưu điểm:
Phương pháp in vivo
 Tránh phải thuần hóa kháng

Phương pháp in vitro

 Sử dụng hệ thống màng nền

thể sản xuất bởi phương

bán thấm sản xuất mAb có

pháp ni cấy mô

nồng độ thường cao như

 Đơn giản, dễ triển khai rộng
rãi

trong phương pháp dịch tràn
ổ bụng
 Tránh được sự tạp nhiễm từ
cơ thể chuột


So sánh
Nhược điểm:
Phương pháp in vivo
 Là nguyên nhân gây đau đớn
và nguy hại đến chuột
 mAb sản xuất bằng phương
pháp in vivo có thể chứa nhiều
protein chuột và những chất gây
ô nhiễm khác mà yêu cầu phải
được làm sạch

Phương pháp in vitro
 Giảm ái lực miễn dịch, thay
đổi chức năng sinh học của
kháng thể