Những đột biến gen gây thiếu hụt steroid 21hydroxylase ở một bệnh nhi có hội chứng cường thượng thận bẩm sinh thể mất muối, mất nước pot

TCNCYH 23 (3) 2003
Những đột biến gen gây thiếu hụt steroid 21-
hydroxylase ở một bệnh nhi có hội chứng cờng
thợng thận bẩm sinh thể mất muối, mất nớc

Nguyễn Thị Ngọc Dao
1
, Nguyễn Thị Hoàn
2
,
Rita Bernhardt
3
, Ebert Schulze
4
.
1
Viện CNSH - TTKHTN và CNQG
2
Viện Nhi khoa Trung ơng
3
Trờng Đại học Saarland - CHLB Đức
4
Phòng xét nghiệm gen học phân tử của Prof.
F.Raue,Heidelberg - CHLB Đức

i. Đặt vấn đề
Cờng thợng thận bẩm sinh là một bệnh do
sự sai lệch di truyền trong sinh tổng hợp
cortisol gây ra. Bình thờng cortisol đợc tổng
hợp từ cholesterol trong vùng bó của vỏ thợng
thận với 5 bớc có sự xúc tác của các enzym

khác nhau. Đầu tiên chuỗi bên của cholesterol
đợc phân cắt bởi phản ứng do cholesterol
desmolase xúc tác tạo ra pregnenolone, chất
này sau đó đợc khử hydro ở vị trí 3 để tạo
thành progesterone, 2 phản ứng thủy phân ở 2
vị trí 17- và 21 của progesterone tiếp theo sẽ
tạo ra 11 deoxycortisol, chất này sau đó chuyển
thành cortisol do phản ứng xúc tác bởi 11-
hydroxylase (P450
c
11). Tất cả các enzym xúc
tác các bớc trên đều có thể có sự thiếu hụt do
đột biến gen nhng phổ biến nhất là 21-
Hydroxylase và 11 -Hydroxylase.
Sự thiếu hụt 21-hydroxylase dẫn tới giảm
lợng glucocorticoid thợng thận, trớc hết là
giảm cortisol. Sự tổng hợp mineralocorticoid
cũng giảm. Mất muối là do thiếu
mineralcorticoid ở ống lợn xa, nơi mà Na
+

đợc tái hấp thụ từ cầu thận và K
+
, H
+
đợc thải
ra. Triệu chứng lâm sàng là mất Na
+
và nớc,
toan chuyển hoá và hạ Na

+
huyết, tăng K
+
do
thiểu năng thận. Triệu chứng rối loạn đặc trng
là mất nớc trầm trọng đến mức đe doạ tính
mạng, nôn mửa và ỉa chảy trong vài tuần đầu
tiên của cuộc sống. Vào khoảng 1/3 các trờng
hợp CAH cổ điển là có khả năng sản xuất đủ
mineralcorticoid để hạn chế mất muối [2]. Biểu
hiện khác về mặt sinh hoá của CAH là sự tăng
sản phẩm androgen thợng thận, vì sự tổng hợp
hormon này không cần 21-hydroxylase xúc tác
và sự tổng hợp tăng lên khi con đờng chuyển
hoá cần 21-OHD bị chặn. Vì không có sự điều
hoà ngợc âm bởi cortisol nên tuyến yên và
vùng dới đồi tăng cờng tổng hợp ACTH, chất
này kích thích vỏ thợng thận và gây ra sự phì
đại tuyến, mặt khác do con đờng chuyển hoá
bình thờng bị khoá do thiếu men 21-
Hydroxylase nên lại càng tăng tổng hợp
androgen thợng thận. Những ảnh hởng này
xảy ra trong dạ con và kết quả là gây ra các
mức độ nam hoá khác nhau ở bộ phận sinh dục
ngoài của bào thai và trẻ sơ sinh gái. Trẻ trai bị
bệnh nói chung có thể coi là bình thờng khi
mới sinh.
Gen mã hoá cho P450
c
21 đợc ký hiệu là

CYP 21. Còn có một bản sao giống hệt với
CYP 21 đợc ký hiệu là Cyp 21P, gen này có
98% phù hợp với CYP 21 trong thứ tự nucleotid
ở các exon. Tuy nhiên CYP 21 P là gen không

110
TCNCYH 23 (3) 2003
hoạt động, có tới 15 dạng đột biến bao gồm đột
biến mất 8 bp ở exon 3, một đột biến ở vị trí
gắn của intron 2, thêm 1 Thymidin (T) vào
exon 7, một đột biến vô nghĩa CT ở codon
318 một số đột biến điểm gây ra mất đoạn ở
exon 6 (missense mutation) Những đột biến
liên quan đến biểu hiện mất muối thờng là đột
biến làm biến đổi Arg 356 Trp. Đột biến ở
intron 2 có thể tìm thấy trong bệnh nhân mất
muối hoặc nam hoá đơn thuần. Đột biến Ile
172 Asp liên quan với nam hoá đơn thuần trong
khi Pro 30 leu và Val 281 Leu thờng đợc
thấy trong bệnh nhân dạng cổ điển
Cả 2 gen này nằm trên nhiễm sắc thể 6 P
21.3, liền kề và xen kẽ với gen C4A và C4B mã
hoá cho cấu tử thứ 4 của bổ thể huyết thanh.
Cho đến nay ngời ta đã công bố 56 đột biến
khác nhau của CYP 21.
Vì 21-hydroxylase chỉ biểu hiện ở vỏ
thợng thận nên rất khó xác định hoạt tính
enzym này trong máu hoặc tổ chức.
Progesteron và 17-OHP là những hợp chất đợc
tích lũy và tăng cao ở bệnh nhân thiếu hụt

enzym cyp 21-Hydroxylas. Việc định lợng
các nội tiết tố trên cũng là những xét nghiệm
quan trọng giúp cho chẩn đoán.
Gần đây, chẩn đoán gen học phân tử của
bệnh thiếu hụt 21-hydroxylase qua sự phân tch
trực tiếp gen CYP 21 đã đợc khảo nghiệm là
phù hợp và chính xác. Phơng pháp phân tích
gene tiến hành qua 2 bớc: Bớc thứ nhất, một
đoạn gen đặc hiệu CYP 21 đợc nhân ra, đoạn
này sẽ trở thành khuôn cho phản ứng phát hiện
đột biến ở bớc 2. Sự khuếch đại đặc hiệu CYP
21 thờng đợc tiến hành bởi những mồi đặc
hiệu allele, kết quả thu đợc 2-3 đoạn khuôn.
Sản phẩm PCR sau đó là đối tợng để tìm đột
biến bằng các phơng pháp khác nhau nh: lai
các nucleotid đặc hiệu allele, SSCP (single-
strand conformation polymorphism) hoặc đọc
trình tự trực tiếp DNA.
ii. Vật liệu và phơng pháp nghiên
cứu:
Mẫu DNA tách từ máu tĩnh mạch (chống
đông bằng EDTA) theo phơng pháp chuẩn sử
dụng phenol/chloroform/isoamylalcohol
(25:24:1). Hàm lợng và độ sạch của DNAsau
khi tách đợc kiểm tra bằng quang phổ ở 2
bớc sóng 260/280 nm và điện di gel agarose
0,8%. Sau đó 2 đoạn gen đặc hiệu 21-OH(
fragment III ở exon 6 và I ở exon 3) đợc
khuếch đại bằng phản ứng PCR.Các cặp mồi
cyp5/cyp14 và cyp 11/cyp12 đã đợc sử dụng.

Trình tự các cặp mồi:
cyp-5:5 AGC TAT AAG TGG CAC CTC
AGG 3
cyp-11: 5 CTT GGG AGA CTA CTC
CCT GCT 3
cyp-12: 5 GTT CGT ACG GGA GCA
ATA ÂAG 3
cyp -14 :5 GCA TCT CCA CGA TGT GA
3
Chơng trình chạy:
94
o
C trong 4 phút
94
o
C trong 45 giây
56
o
C trong 45 giây x 25 lần
72
o
C trong 2,5 phút
94
o
C trong 45 giây
58
o
C trong 45 giây x 10 lần
72
o

C trong 4 phút
10
o
C kết thúc
Sản phẩm PCR dài khoảng 700-850 bp
đợc đọc trình tự trực tiếp trên máy DNA
sequencer của hãng Global Edition IR
2
9(NEN)
Readir 4200 để tìm các đột biến. Mỗi bản gel
acrylamid cùng lúc phân tích trình tự đợc 15

111
TCNCYH 23 (3) 2003
mẫu DNA (60 giếng).Sử dụng chất đánh dấu
huỳnh quang đê phát hiện các base nucleotid.
iii. Kết quả
Kết quả đọc trình tự gene cho thấy: Tất cả
các thành viên trong gia đình bệnh nhân đều
có đột biến gen CYP 21 với các thể loại khác
nhau. Dới đây là kết quả cụ thể của từng
ngời:
Hình 1: Sơ đồ về sự di truyền các đột biến gen CYP 21ở gia đình bệnh nhân Ngo Đuc M.
Mẹ
Dị hợp tử
12 (nt 656) G/C


Bố
Dị hợp tử

P30L, 12 (nt 656) G/A,
mất đoạn 8 cặp base
(cả 3 đột biến này nằm trên một allel)








Bệnh nhân Em trai bệnh nhân: dị hợp tử


Đột biến nhận từ bố: P30L,
12 (nt 656) G
Mất đoạn 8bp (exon 3)
Đột biến nhận từ mẹ:
12(nt 656) G
Vị trí 12 (nt 656) G/G đồng hợp tử
Dẫn tới:
- 0% hoạt tính enzym 21-OH
- Mất muối
Đột biến 12 (nt 656) G/A

nhận từ mẹ nhận từ bố


Khỏe mạnh về lâm sàng

Ghi chú: 12 (nt 656) G là bệnh lý, 12 (nt
656) A hoặc C là bình thờng.
Bệnh nhân Ngô Đức M.:
Trên Allel 1: Đột biến điểm ở nucleotid 656
(A/C
G) ở intron 2 của CYP 21 (gen hoạt
động của 21-hydroxylase). A hoặc C là
polymorphismen bình thờng, G là bệnh lý.
Đột biến ở intron 2 dẫn tới sự rối loạn cơ chế

112
TCNCYH 23 (3) 2003
gắn (splicing-mechanismus) và dẫn tới sự đứt
quãng trong tổng hợp protein.
Trên Allel 2: Có 3 đột biến gồm:
- Đột biến điểm ở codon 30 (CCG
CTG)
làm thay đổi aminoacid từ Prolin thành leucin
(pro 30 leu) trong exon 1 của CYP 21.
- Đột biến điểm ở vị trí 656 (A/C
G) ở
intron 2 của CYP 21
- Mất đoạn 8 bp (GÂGACTAC) ở exon 3
3 đột biến này phù hợp với sự trao đổi ADN
đáng kể giữa CYP 21 và CYP 21P. Những đột
biến này cũng nằm trên allel của cha. Do đột
biến ở intron 2 (vị trí 656) và mất đoạn ở exon
3 nên cả 2 allele hoàn toàn bất hoạt.Từ đó có
thể khẳng định bệnh nhân Ngo Đức M. bị bệnh
CAH thể cổ điển với triệu chứng mất muối.

Bố bệnh nhân ( Ngô Văn.Th.):
Đột biến điểm dị hợp tử ở codon 30 (CCG
CTG) với sự thay đổi Pro 30 thành leu
trong exon 1 của CYP 21.
Đột biến điểm dị hợp tử ở nucleotid 656 (A
G) ở intron 2 của CYP 21 (gen hoạt động
của 21-hydroxylase), G là bệnh lý, A là bình
thờng.
Mất đoạn gen dị hợp tử của 8 bp
(GAGACTAC) ở exon 3 của CYP 21.
Tất cả 3 đột biến này nằm trên cùng một
allele và di truyền cho con là Ngô Đức. M.
Mẹ bệnh nhân, (Hoàng Thị Hiền L).:
Đột biến điểm dị hợp tử ở nucleotid 656
(G/A) ở intron 2. G là bệnh lý, A là bình
thờng.
Nh vậy là cha và mẹ bệnh nhân đã di
truyền dị hợp tử cho con và bệnh ở con họ là
thiếu hụt 21-hydroxylase thể cổ điển (classic).
Em trai bệnh nhân,( Ngô Minh Q).:
Đột biến điểm dị hợp tử ở codon 656 (G/A)
ở itron 2. Đột biến này nằm trên allele của mẹ,
không có ở allele do bố di truyền nên Ngô.
Minh Q. là ngời mang dị hợp tử của nguy cơ
bệnh thiếu hụt 21-hydroxylase thể cổ điển.
Bệnh nhi là con trai đầu, già tháng, phải mổ
đẻ. 18 ngày tuổi đã phải cấp cứu vào viện do
quấy khóc, bỏ bú. Khám tháy da khô, thóp
lõm. Trẻ tỉnh táo nhng mệt,vã mồ hôi, chân
tay lạnh. Da đen xạm nhất là vùng bộ phận sinh

dục.Chẩn đoán ban đầu là viêm phế quản va
theo dõi hội chứng sinh dục thợng thận. Xét
nghiệm máu cho thấy Na+ giảm (112mmol/l),
K+ tăng (>7 mmol/l), testosteron cao
(14,6nmol/l), progesteron 17,4nmol/l. Điều trị
bàng DCA tiêm và Prednisolon. Dựa vào các
dấu hiệu lâm sàng, các bác sĩ đã chẩn đoán
bệnh nhi bị hội chứng sinh dục thợng thận thể
mất muối, nớc. Bố mẹ và em của bệnh nhi đều
không có biểu hiện bệnh lý. Qua phân tích gen
mới biết đợc cả bố mẹ và em bệnh nhân đều
là ngời mang gen bệnh dị hợp tử.
Chẩn đoán phân tích gen là phơng pháp
hiện đại giúp phát hiện và phân loại bệnh một
cách chính xác để có hớng điều trị đúng.Từ
bệnh nhân có thể phát hiện các thành viên có
liên quan di truyền trong gia đình là những
ngời dị hợp tử có mang gen bệnh.Trên cơ sở
đó có thể quản lý,theo dõi đợc bệnh nhân
cũng nh ngời lành mang bệnh. Góp phần t
vấn phòng tránh nguy cơ di truyền các đột biến
tạo thành bệnh và có thể chủ động diều trị bầng
Dexametason cho ngời mẹ có nguy cơ ngay từ
khi mang thai.Hiện nay,các nhà khoa học đang
nghiên cứu liệu pháp điều trị gene cho một số
bệnh di truyền,trong đó có bệnh thiếu hụt 21-
Hydroxylase. ở nhiều nớc trên thế giới, thiếu
hụt 21-hydroxylase đã đợc đa vào chơng
trình sàng lọc sơ sinh để phát hiện sớm và điều
trị kịp thơi giúp trẻ có thể có cuooc sống tốt

hơn.Những chẩn đoán trớc sinh có giá trị quan
trong trong điều trị các thai nhi gái trong việc
hạn chế biểu hiện bệnh.

113
TCNCYH 23 (3) 2003
Những nghiên cứu phân tích gene trên số
lơng lớn bệnh nhân để tìm dạng đột biến đặc
trng cho cộng đông hoặc tìm ra các dạng mới
ở ngời Việt nam cũng là việc làm cần thiết để
góp phần tìm hiểu đặc điểm di truyền,cơ sở
phân tử của bệnh đồng thời góp phần vào chẩn
đoán nhanh,chính xác và điều trị có hiệu quả
căn bệnh này.
Tài liệu tham khảo
1. Maria I, New at al. Prenatal Diagnosis
for congenital adrenal hyperplasia in 532
Pregnancies: Journal of Clinical
Endocrinology and Metabolism. 2001, 86 (12):
5651-5657.
2. Lee HH: CYP 21 mutations and
congenital adrenal hyperplasia. Clinical
Genetics. 2001, 59: 293-301.
3. Paulo Ferrez Collett Solberg. CAH:
From genetics and Biochemistry to clinical
practice Part I and II. Clin.Pediatrics. 2001,
40: 1-16 and 125-132
4. Perin C.White and Phyllis W.Speiser:
CAH due to 21-hydrroxylase deficiency.
Endocrine Reviews. 2000, 21: 245-291.

5. Weisenpecharova R. Abtracts of 2
nd

international FEBS advanced course: Cyt-P450
systems: from Structur to application.
Distribution of CYP 21 gene mutatión in
Slovak Patients with Congenital adrenal
hyperplasia (enzym P450
C21
deficiency). 2002.
6. Catherine E. Keegan and Anthony
A.Killeen.An Overrview of molecular
diagnosis of steroid 21-Hydroxxylase
deficiency. Journal of molecular diagnostics.
2001, Vol.3 N 2; May 2001: 49-54.

Summary
The mutations caused steroid 21-hydroxylase
deficiency on a patient with symptom of congenital
adreanal hyperplasia-SW
Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is a common inherited disorders of adrenal
steroidogenesis caused maindly by defecfs in the steroid 21- hydroxylase (CYP21) gene. More than
90% of CAH cases are caused by mutations of the CYP 21 gene on chromosome 6 p 21.3. The wide
range of CAH phenotype is associated with multiple mutaion known to affect 21- Hydroxylase
enzyme activity. To date, 56 different CYP-21 mutations have been reported, mostly point
mutations, but small deletation or insertions have been described too, as well as complete gene
deletions. A reliable and accutate detection of CYP 21 mutation is not only important for clinical
diagnosis, but also for carrier detection as there is a high variability in the basal level of 17-
hydroxy progesterone between normal and heterorygous individuals. Several strategies based on
polymerase chain reaction (PCR)- driven amplification with allele- specific oligonucleotides to the

CYP 21 gene have been developed.There is a direct relation between the severity of the disease and
the reduction in enzym activity caused by mutations.
In this article, the DNA sequence results of a patient with CAH ( salt wasting variation) and his
family members have been described. This patient have been in herited all mutations from his
parents. This results are agreed with clinical diagnosis and experimental estimation of blood and
urine hormon levels.
Keyword: 21-Hydroxylase,CAH,CYP 21 mutations

114