Phương pháp tạo golden rice

Phương pháp tạo Golden Rice

Trang 1

MỤC LỤC
I. GIỚI THIỆU CHUNG 2
1. Gạo (Rice) 2
2. Nguồn gốc 2
3. Sản xuất lúa gạo ở Việt Nam 2
4. Gạo vàng (Golden Rice) 3
5. Tình hình phát triển của gạo vàng trên thế giới. 3
6. Ý nghĩa của việc tạo ra Gạo vàng (Golden Rice) 4
II. PHƯƠNG PHÁP TẠO GOLDEN RICE 4
1. Đối tượng nghiên cứu: 4
2. Phương pháp nghiên cứu 5
3. Quy trình kỹ thuật chuyển gen Gạo vàng (Golden Rice) 5
3.1. Cơ chế tạo Gạo vàng (Golden Rice) 5
3.2. Quy trình kỹ thuật 6
3.3. Thuyết minh quy trình 7
4. Kiểm tra kết quả chuyển gen β-caroten 14
4.1. Kiểm tra bằng cảm quan 14
4.2. Kiểm tra bằng kỹ thuật phân tích phân tử 14
a. Sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện sự có mặt của các gene: psy, crt, lcy. 14
b. Hỗn hợp dùng trong phản ứng PCR và một sô dụng cụ cần thiết 14
c. Tiến hành PCR 15
d. Trích DNA và phân tích Southern 15
III. KẾT LUẬN VÀ NHỮNG VẤN ĐỀ KHÁC CỦA GOLDEN RICE: 16
IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO 17

Phương pháp tạo Golden Rice

Trang 2

I. GIỚI THIỆU CHUNG
1. Gạo (Rice)
Gạo là một sản phẩm lương thực thu từ cây lúa. Hạt gạo thường có màu trắng, nâu
hoặc đỏ thẫm, chứa nhiều dinh dưỡng. Hạt gạo chính là nhân của thóc sau khi tách bỏ vỏ
trấu và cám. Gạo là lương thực phổ biển của gần một nửa dân số thế giới.
2. Nguồn gốc
Cây lúa hiện nay được nông dân gieo trồng là kết quả xử lý trong phòng thí nghiệm và
lai tạo tự nhiên cũng như nhân tạo của nhiều thế kỷ từ cây lúa dại.


Hình 1 – Cây lúa của nông dân, kết quả của các nhà khoa học
Vì quỹ đất có giới hạn, các nhà khoa học đang nghiên cứu biến đổi gene của cây lúa để
tạo ra giống lúa mới có năng suất cao, chống được bệnh tật và thời tiết khắc nghiệt, đồng
thời rút ngắn thời gian chăm bón và sớm cho thu hoạch. Những thành công ban đầu của
lúa biến đổi gen đã được ghi nhận, song hiện các nhà khoa học vẫn chưa thống nhất được
liệu loại lúa này có tác động xấu đến sức khỏe con người hay không.
3. Sản xuất lúa gạo ở Việt Nam
Việt Nam có hai vùng trồng lúa chính là đồng bằng sông Hồng ở phía Bắc và đồng
bằng sông Cửu Long ở miền Nam. Hàng năm sản lượng của cả nước đạt 33-34 triệu
tấn thóc, trong đó chỉ sử dụng khoảng 8 triệu tấn (tương đương 4 triệu tấn gạo sau khi
xay xát) cho xuất khẩu, còn lại là tiêu thụ trong nước và bổ sung dự trữ quốc gia.
- Ở miền Bắc một năm có hai vụ lúa chính: vụ chiêm và vụ mùa.
- Ở miền Nam, nông dân trồng ba vụ một năm: vụ đông xuân (có sản lượng cao nhất
và thóc cũng đạt chất lượng tốt nhất cho xuất khẩu), vụ hè thu và vụ ba. Do lũ hàng
năm ở đồng bằng sông Cửu Long trong những năm gần đây ảnh hưởng đến sản xuất,
một phần nữa người dân có thể kiếm lời ổn định hơn từ việc nuôi thủy sản (tôm) hay
Phương pháp tạo Golden Rice

Trang 3

trồng cây ăn quả, chính quyền đã khuyến cáo nông dân giảm và chuyển đổi một phần
đất trồng lúa vụ ba. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn là bộ chủ quản, quản lý
việc sản xuất lúa gạo của Việt Nam.
4. Gạo vàng (Golden Rice)

Hình 2 – Hạt gạo vàng giàu β-caroten
"Golden rice" là loại gạo được biến đổi gene nhằm tạo ra nhiều tiền tố vitamin A
(β- caroten ) cho người dùng. Hạt gạo vàng còn gọi là “Hạt Hy Vọng” là một khám phá
lớn của ngành nghiên cứu lúa gạo thế giới vào đầu thế kỷ 21. Trong năm 2000, công
nghệ này đã gây ra tiếng vang lớn trong nghiên cứu về dinh dưỡng thế giới - một loại
gạo biến đổi di truyền màu vàng có chứa tiền vitamin A và một số lượng lớn chất
sắt được phát minh. Từ năm 2000 và đến nay các viện nghiên cứu trên thế giới đã tạo
được hai loại là GR1 và GR2.
- GR1 được tạo ra khi chuyển gene sinh tiền tố Vitamin A từ cây hoa thủy tiên và
Erwinia uredovora vào giống lúa Indica.
- GR2 được cải tiến từ GR1 bằng cách thay gene sinh tiền tố Vitamin A từ cây hoa thủy
tiên bằng gene từ cây bắp. GR2 sản xuất ra lượng tiền tố vitamin A cao gấp 23 lần so với
GR1.
5. Tình hình phát triển của gạo vàng trên thế giới.
Gạo vàng được bắt đấu tiến hành nghiên cứu từ năm 1999. Đến năm 2000 thì GR1 ra
đời. Vào ngày 27-3-2005, một đội ngũ khoa học gia của công ty Hạt Giống Syngenta ở
Cambridge, Anh Quốc, đã tuyên bố khám phá được loại gạo vàng mới (GR 2) chứa lượng
β-caroten gấp 23 lần lớn hơn gạo vàng cũ (GR 1) được khám phá vào năm 2000.
Ngày 14-10-2008, Rockefeller Foundation tuyên bố sẽ tài trợ Viện Thí Nghiệm Lúa
Quốc Tế (IRRI) ở Philippines để hỗ trợ dự án “Hạt gạo vàng”, nhằm tăng tốc quy trình
kiểm tra chấp thuận loại lương thực GM này tại các nước đông dân: Ấn Độ, Bangladesh,
Phương pháp tạo Golden Rice

Trang 4

Indonesia và Philippines. Cơ quan Rockefeller hy vọng tài trợ nêu trên sẽ giúp Hạt gạo
vàng đến tay nông dân sớm hơn để họ có thể sản xuất đại trà.
6. Ý nghĩa của việc tạo ra Gạo vàng (Golden Rice)
- Người ta dự tính khoảng 100 đến 140
triệu trẻ em trên thế giới đang bị thiếu
vitamin A, gây ra mù mắt, bệnh sởi và tử
vong.Việc nghiên cứu tạo thành công giống lúa
cho Gạo vàng có thể cứu hàng trăm ngàn trẻ
em bị mù hàng năm vì thiếu vitamin
A.

- Gạo Vàng là sự kiện lớn nhất là khi mà
giá lương thực ngày một cao, trên thị trường
giống gạo này đã xuất hiện ở Iran 2005, đang
khảo nghiệm ở Trung Quốc, Philipin và nhiều
nước Châu Á khác. Theo dự báo Gạo vàng sẽ
được thương mại hóa vào năm 2011 là một sản
phẩm dinh dưỡng mới có tiềm năng lớn về mặt
kinh tế. Hứa hẹn mang lại một
nguồn thu nhập khổng lồ cho các
Quốc gia đang đầu tư nghiên cứu
và đang dần thành công trong đề tài
“Golden rice” này.
- Gạo chuyển gen góp phần đảm
bảo an ninh lương thực và xóa bỏ
nạn đói.
- Gạo vàng ra đời mang ý nghĩa to
lớn cho thấy sức mạnh và giá trị

ứng dụng của công nghệ sinh học
đối với đời sống con người.
II. PHƯƠNG PHÁP TẠO GOLDEN RICE
1. Đối tượng nghiên cứu:
Sử dụng Phôi non và hạt gạo các giống lúa Taipei 309, IR64 và MTL 250 (Indica) có

Phương pháp tạo Golden Rice

Trang 5

đặc điểm tốt về nông học, chất lượng để thực hiện biến đổi gene.
Các Viện nghiên cứu đã sử dụng công nghệ biến đổi gen đưa một gen của cây thủy tiên
hoa vàng hoặc từ cây ngô và vi khuẩn Erwinia uredovora vào bộ gen của lúa, tạo ra
giống lúa mới có hàm lượng beta-caroten.
Sử dụng hai loại vector chuyển gen gồm hai plasmid là pCaCar và pFun3 để
chuyển gen vào vi khuẩn Agrobacterium tumefactien.
Dùng vi khuẩn A. tumefactien đã được gắn plasmid nói trên để chuyển đoạn DNA
mong muốn vào trong phôi của các giống lúa được chọn lọc.
2. Phương pháp nghiên cứu
Hạt gạo vàng là một thành quả lớn trong chương trình nghiên cứu của đội ngũ khoa học
gia Thụy Sĩ và Đức, được cơ quan Rockerfeller Foundation của Mỹ tài trợ 100 triệu
USD trong 10 năm. Đội ngũ này được hướng dẫn bởi Giáo sư Ingo Potrykus, Viện Kỹ
Thuật Liên Bang ở Thụy Sĩ, và Tiến Sĩ Peter Beyer, Đại học Freiburg ở Đức. Các
nhà khoa học đã sử dụng phôi của hạt lúa nuôi cấy mô tái sinh cây lúa phòng thí nghiệm
rồi chuyển gene bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để đưa tất cả các gene lạ vào
phôi hạt lúa sau đó. Kiểm tra biểu hiện của gene qua kiểm tra kiểu hình (hạt gạo có màu
vàng), kiểm tra theo phương pháp đánh giá cảm quan bằng mắt thường. Kiểm tra sự xuất
hiện của các gen chuyển trong cây lúa chuyển gen bằng phương pháp điện di và PCR.
3. Quy trình kỹ thuật chuyển gen Gạo vàng (Golden Rice)
3.1. Cơ chế tạo Gạo vàng (Golden Rice)

Hình 3 – cơ chế tạo gạo vàng
Phương pháp tạo Golden Rice

Trang 6

Chuyển gene vào
Plasmid pFun3
Bản thân hạt gạo có chứa Geranyl geranyl diphosphate (GGPP) một tiền chất quan
trọng trong tiến trình sinh tổng hợp β-caroten. Nhưng cây lúa thường thì lại không hề
chứa β-caroten, bằng chứng là hạt gạo thường có màu trong suốt mà không hề có màu
vàng đặc trưng của β-caroten. Để GGPP chuyển hóa thành các chất trung gian rồi
chuyển thành β-caroten thì cần có các Enzyme xúc tác tương ứng, nhưng bản thân cây lúa
lại không có chứa các gene có nhiệm vụ sinh tổng hợp ra các enzyme cần thiết để xúc tác
cho các phản ứng chuyển hóa GGPP thành β-caroten. Khi chuyển các đoạn gene psy,
crtI, lcy vào trong cây lúa thì sẽ tạo ra một sự thay đổi rất lớn. Khi đó, gen psy là gene
mã hóa để sinh tổng hợp ra enzyme phytoen synthase có nhiệm vụ xúc tác để chuyển
hóa GGPP (20C) thành phytoen (40C). Tiếp theo đoạn gen crtI mã hóa để sinh tổng hợp
enzyme phytoene desaturase có nhiệm vụ chuyển hóa phytoen thành ζ-Caroten ( zeta-
Caroten) rồi chuyển hóa tiếp thành Lycopen. Cuối cùng gen lcy mã hóa để sinh tổng hợp
enzyme Lycopen β-Cyclase có nhiệm vụ xúc tác chuyển hóa Lycopen thành β-caroten. Và
kết quả là hạt gạo chuyển gen thể hiện kiểu hình có màu vàng đặc trưng của β-caroten và
chứa một lượng tiền vitamin A rất lớn so với hạt gạo bình thường.
3.2. Quy trình kỹ thuật






Hình 4 – Sơ đồ quy trình chuyển gene gạo vàng

Chuẩn bị hạt giống Taipei
309, IR64 và MTL 250
(Indica)
Tách chiết gene ctrI từ
vi khuẩn đất Erwinia -
uredovora
Tách chiết gene psy và
gene lyc từ cây Daffodil
hoặc từ cây ngô
Chọn hạt giống có phôi tốt
Chuyển gene vào
Plasmid pCaCar
Nuôi cấy mô tái sinh từ phôi
hạt giống
Chuyển Plasmid vào
A.tumefactien và nuôi tăng
sinh vi khuẩn
Nuôi cấy
A.tumefactien trên
đĩa có chứa mầm tái
sinh từ phôi
Nuôi tăng sinh và
tái tạo cây con từ
mầm tái sinh đã
chuyển gene
Trồng lúa chuyển
gene và cho lai với
giống lúa địa
phương
Trồng đại trà

và cho sản
phẩm gạo
vàng
Phương pháp tạo Golden Rice

Trang 7

3.3. Thuyết minh quy trình
Trong cây lúa biến đổi gen người ta đưa vào để biểu hiện hai gene mã hóa,
phytoene synthase (psy) và lycopene cyclase (lcy) từ cây hoa thủy tiên vàng và
gen mã hóa carotoene synthetase 1 (crtI) từ vi khuẩn đất Erwinia uredovora.
Nhưng người ta thấy rằng loại lúa này không cho nhiều tiền tố vitamin A như
mong đợi vì psy làm giảm hiệu quả tích tụ β-caroten trong nội nhũ của hạt gạo.
Vì thế gen psy từ cây hoa thủy tiên vàng được thay thế bằng gen psy từ ngô.
Bước 1: Giống lúa Taipei 309, IR64 và MTL 250 (Indica) được trồng trong
nhà kính với các điều kiện môi trường tối ưu, được sinh trưởng phát triển tốt, đảm
bảo sạch bệnh. Người ta chọn những cây lúa có đặc điểm tốt, chọn hạt chắc mẩy,
bóc vỏ để chọn phôi tốt rồi tiến hành bảo quản trong môi trường vô trùng.

Hình 5 – Cây lúa được trồng trong các điều kiện nhân tạo tối ưu
để lấy nguyên liệu chuyển gene
Bước 2: Tiến hành nuôi cấy mô từ phôi đã chọn lọc ở Bước 1 để chuẩn bị nguyên
liệu cho giai đoạn chuyển gen. Quá trình nuôi cấy sử dụng môi trường MS có thành
phần như sau:
Phương pháp tạo Golden Rice

Trang 8

A.Đa lượng (g/l)
KNO

3

19.0
NH
4
NO
3

16.5


CaCl
4
.2H
2
O 4.4

MgSO
4
.7H
2
O 3.7

B.Phosphat (g/l)
KH
2
PO
4
1.7
NaH

2
PO
4

1.7


C.Vi lượng1 (g/l)
H
3
BO
3
0.62
MnSO
4
.H2O 1.69

ZnSO
4
.2H
2
O 0.86

D.Vi lượng 2 (g/l)
KI (Kali iodua) 0.83
Na
2
MoO
4
.2H O 0.25

E.Vi lượng 3 (g/l)
CuSO
4
.5H
2
O 0.25
CoCl
2
.6H
2
O 0.25


F.Sắt/EDTA (g/100ml)
Na
2
EDTA 0.372
FeSO4.7H
2
O 0.278


G.Vitamin (mg/100ml)
Glycin 200
Nicotinic acid 50

Pyridoxin-HCl 50

Thiamin-HCl 10

Myo-inositol 10.000

* Muốn có 1 lít môi trường làm việc MS:
- Chuẩn bị một bình dung tích 2 lít, chứa sẵn 400ml nước cất
-Thêm 100ml A và 100ml B
-Thêm 10ml C và 10ml F
Phương pháp tạo Golden Rice

Trang 9

-Thêm 1ml D và 1ml G
-Thêm 0,1ml E
-Thêm nước cất cho đủ 1 lít.
Bước 3: Tách chiết DNA từ vi khuẩn đất Erwinia uredovora, sau đó tiến hành cắt
bằng enzyme EcoRI và Kpnl để thu nhận đoạn gen ctrI.
Quá trình tách chiết gen ctrI được tiến hành như sau:
Lấy 1 ml nước cho và một ít giống vi sinh vật (vi khuẩn Erwinia uredovora) trên
ống thạch nghiêng cho vào ống eppendorf rồi đem cân. Lấy thêm một ống eppendorf
khác, thêm nước vào sao cho có khối lượng bằng với khối lượng của ống thí nghiệm
và đem hai ống đi ly tâm.
Đưa hai ống vào máy ly tâm, đặt sao cho 2 ống ở vị trí đối xứng tâm với nhau qua
trục quay của máy ly tâm. Đóng cửa của máy và đặt chế độ ly tâm cho máy như sau:
- Tốc độ quay: 10000 vòng/phút
- Thời gian ly tâm : 1 phút
- Nhiệt độ ly tâm: 10
0
C
Sau khi ly tâm, lấy ống thí nghiệm ra, thấy hỗn hợp phân thành 2 lớp. Ta loại bỏ
lớp nước nổi ở phía trên đi, chỉ giữ lại phần lắng (Phần sinh khối vi sinh vật). Tiếp tục

ta thêm vào ống thí nghiệm vừa loại bỏ phần nổi 200 microlit InstaGene (InstaGene là
hỗn hợp các chất – là bộ kid để test nhanh), rồi đem ủ ở 56
0
C trong máy ổn nhiệt
trong 30 phút để hoạt hóa enzim. Bấm đồng hồ để canh thời gian.
Sau 30 phút lấy ống thí nghiệm ra khỏi máy ổn nhiệt và đem ống đi lắc mạnh trong
10 giây bằng máy vortex. Sau đó tiếp tục đưa ống vào đặt trong bể ổn nhiệt ở 95
0
C
hoặc nước sôi trong 8 phút. Bấm đồng hồ để canh thời gian.
Sau 8 phút, lại lấy ống ra đem lắc mạnh bằng vortex trong 10 giây. Rồi đem ly tâm
với chế độ ly tâm được cài đặt là:
- Tốc độ: 11000 vòng/phút
- Thời gian ly tâm: 2-3 phút
- Nhiệt độ ly tâm: 10
0
C
Sau khi ly tâm, lấy ống nghiệm ra quan sát thấy hỗn hợp phân thành 3 lớp. Lớp trên
cùng chính là DNA có khối lượng nhỏ nhất nên nổi lên trên sau khi ly tâm.
Phương pháp tạo Golden Rice

Trang 10

Phần DNA sau khi tách ra được tiến hành cắt đoạn gen cần (đoạn gen ctrI) bằng
enzyme EcoRI. Ta thu nhận được đoạn gen ctrI để sử dụng trong chuyển gen ở các
bước sau.
Bước 4: Hoa thủy tiên (hoặc ngô) được trồng trong nhà kính với các điều kiện
môi trường tối ưu, đảm bảo sạch bệnh, được chọn lọc với điều kiện cây sinh trưởng
phát triển tốt, cho hoa có màu vàng tươi. Người ta chọn những bông hoa (quả ngô)
đang trong thời gian phát triển mạnh để chiết xuất gen. Gene psy và gene lyc của các

bông hoa (quả) này được tiến hành theo các giai đoạn như sau:
- Bỏ 10 g đá khô vào xay nhuyễn, sau đó cho 8 g hoa thủy tiên (hoặc hạt ngô), xay
cho đến khi thành bột mịn.
- Chuyển bột này vào cốc đã được làm lạnh trên nitơ lỏng trước rồi cho vào cốc 50
ml nitơ lỏng. Đặt ở -20 độ trong vòng 6 tiếng.
- Cho 20 ml dung dịch đệm đã được đun sôi vào mẫu bột đã được xử lí trên rồi tiến
hành lắc nhẹ.
- Ngâm trong bể ổn nhiệt ở 56 độ trong vòng 20 phút.
- Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt độ phòng.
Sau khi lắc chuyển dịch chiết tách trên qua ống dùng để quay li tâm và tiến hành quay
li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20 phút)
- Chuyển lớp nước ở phía trên vào ống nghiệm mới sau đó cho 2 ml dung dịch
CTAB 10 % đã được hâm nóng ở 70
0
. Sau đó trộn đều.
- Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt độ phòng.
Sau đó quay li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20 phút).
- Cho 30 ml đệm kết tủa CTAB sau đó trộn đều cho tới khi có một màng DNA
màu trắng đục nổi lên.
- Quay li tâm ở nhiệt độ phòng (3000rpm, 20 phút). Loại bỏ phần dịch lỏng thu
phần kết tủa.
- Hòa tan kết tủa bằng 5ml dung dịch muối ở nhiệt độ 56
o
C NaCl 1M và cho vào
dung dịch 5µl enzyme RNase 10mg/ml để phân hủy RNA .
- Cho 10ml cồn lạnh nguyên chất và lắc đều để kết tủa DNA.
- Quay li tâm, lấy phần tủa.
- Cho 20ml cồn 70 %, quay li tâm, lấy phần tủa.
Phương pháp tạo Golden Rice

Trang 11



- Cho 20 ml cồn nguyên chất, quay li tâm lấy phần tủa.
- Quay phần tủa với nắp ống nghiệm được mở để làm khô DNA. Lúc này DNA sẽ
chuyến sang trong suốt không màu.
- Phần DNA sau khi tách ra được tiến hành cắt đoạn gene cần (đoạn gen psy và lcy)
bằng enzim EcoRI và HindIII. Ta thu nhận được đoạn gen ctrI để sử dụng trong
chuyển gene ở các bước sau.
Bước 5: Các nhóm gene sau khi được chiết xuất, tinh sạch sẽ được cắt thành
các đoạn nhỏ được chuyển vào 2 plasmid là pCaCar và pFun3. Trong đó hai gen psy,
crt1 được chuyển vào plasmid pCaCar, gen còn lại là lcy được chuyển vào một plasmid
pFun3.










Hình 6 – Plasmid chuyển gen (Đã được minh họa thành đường thẳng)
Bước 6: Các plasmid được chuyển vào hai đĩa petri khác nhau có nuôi vi khuẩn
Agrobacterium tumefacien dòng mannopine type Ti plasmid. Plasmid tự động chuyển
vào bên trong tế bào vi khuẩn, nhờ sự tăng sinh của vi khuẩn chúng được nhân bản với
số lượng lớn và được sử dùng trong giai đoạn tiếp theo.
Bước 7, 8: Nuôi cấy A. tumefactien trên môi trường có chứa mầm tái sinh cây lúa

đã được chuẩn bị ở bước 2. Các đoạn gen ngoại lai từ A. tumefactien sẽ được chuyển
vào mầm tái sinh từ phôi.
Môi trường để nuôi cấy được pha chế thử nghiệm như bảng dưới đây, thực nghiệm
sẽ lựa chọn ra môi trường tối ưu để sử dụng trong quá trình chuyển gene.
(Số liệu thu thập từ kết quả công bố của Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long)
Phương pháp tạo Golden Rice

Trang 12





Kết quả thực nghiệm của Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long cho biết trong số các
môi trường được nghiên cứu nói trên thì môi trường MSReg3 là môi trường tối ưu
nhất cho quá trình chuyển gene bằng A. tumefactien.
Phương pháp tạo Golden Rice

Trang 13

+ Trong giai đoạn tiếp theo vi khuẩn mang gene chuyển được đưa vào nuôi
cấy trong môi trường có chứa phôi của hạt lúa Indica đã được chuẩn bị ở trên. Vi
khuẩn chuyển đoạn gene cần chuyển vào phôi. Các phôi sau chuyển gen được đưa đi
nuôi cấy trong phòng thí nghiệm để chuẩn bị cho giai đoạn chuyển ra môi trường tự
nhiên.


Hình 7 – Quá trình chuyển gen từ A. tumefactien vào tế bào thực vật
Bước 9: Nuôi cấy mô tái sinh tạo cây con từ mầm tái sinh đã chuyển gene

Hình 8 – Tế bào callus tái sinh từ phôi chuyển gen và cây lúa đang phát triển tốt
Bước 10: Cây lúa chuyển gen sau tái sinh được nuôi tăng sinh, rồi chuyển ra môi
trường đất và được cho tập thích nghi dần với các điều kiện môi trường ngoài phòng
thí nghiệm n sau đó cho lai với giống lúa địa phương để tăng khả năng thích nghi với
Phương pháp tạo Golden Rice

Trang 14

điều kiện tự nhiên tại vùng sản xuất và được trồng với số lượng lớn ngoài tự nhiên để
thu sản phẩm.
Các hạt lúa thu được sẽ được đưa đi kiểm tra kết quả chuyển gen và kiểm tra tính
an toàn trước khi trở thành sản phẩm cho con người sử dụng.
4. Kiểm tra kết quả chuyển gen β-caroten
Để kiểm tra kết quả chuyển gen β-caroten người ta dùng hai phương pháp sau:
4.1. Kiểm tra bằng cảm quan
Quan sát và so sánh nội nhũ của hạt gạo thường và hạt gạo chuyển gen β-caroten.
Quan sát sẽ thấy hạt gạo thường có màu trắng trong, còn hạt gạo chuyển gen β-caroten
có màu vàng ngà. Hạt gạo nhận gen chuyển từ cây ngô có màu vàng sẫm hơn so với
hạt gạo nhận gen chuyển từ hoa thủy tiên, cho thấy lượng β-caroten có trong hạt gạo
nhận gen chuyển từ cây ngô cao hơn so với hạt gạo nhận gen chuyển từ hoa thủy tiên.




Hình 9 – Kiểm tra kết quả chuyển gen bằng cảm quang
4.2. Kiểm tra bằng kỹ thuật phân tích phân tử
a. Sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện sự có mặt của các gene: psy, crt, lcy.

Hình 10 – Kết quả chụp UV

Hỗn hợp dùng trong phản ứng PCR và một sô dụng cụ cần thiết
- Tag polymerase 0,025 U/µl (1,25U/50µl)
- Tris-HCl (pH 8.8 ) 75mM
Phương pháp tạo Golden Rice

Trang 15

- (NH4)2SO4 20mM
- Tween 20 0,01%
- dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 200µM mỗi loại
- MgCl2 1,5mM
- Các hóa chất dùng cho điện di DNA
- Máy li tâm, Eppendorf 1.5ml, 0.2ml, 0.5ml, Micropipette 20, 200, 1000µl, Máy
PCR, Máy điện di ngang80 -150V, Bộ nguồn điện di điện thế từ, Bộ chụp ảnh trên đèn
UV, Tủ ấm, Máy lắc Vortex.
Tiến hành PCR
- Dùng đầu tăm chấm và lấy coloni được nuôi cấy trong thạch nuôi rắn. Chú
ý không để thạch nuôi dính theo tăm vì trong gel có chứa các chất gây ảnh
hưởng đến phản ứng PCR.
- Cho coloni lấy được ở trên vào Eppendorf có chứa 100µl nước cất tuyệt trùng.
- Đun sôi trong vòng 5 phút
- Tiến hành quay li tâm ở tốc độ10000rpm, trong vòng 5 phút, sau đó lấy
phần nước dịch lỏng có chứa DNA đem đi nhân dòng.
Thiết lập chương trình cho máy PCR
B1. 94
0
C 1-1,5’ (Biến tính DNA )
B2. 95
0
C 20 s (Tách DNA sợi đôi thành sợi đơn)

B3. 65
0
C 20 s (Mồi bắt cặp với sợi khuôn)
B4. 72
0
C 1’ (Phản ứng kéo dài)
B5. lặp lại B2 đến B4 29 lần
B6. 72
0
C 10’ ( Tổng hợp nốt các đoạn chưa được hoàn chỉnh)
B7 4 độ

b. Trích DNA và phân tích Southern blot
DNA được trích từ lá theo phương pháp của McCouch và ctv. (1988). Mười
micrograms DNA được cắt đoạn với EcoRI (hai điểm cắt) để xác định sự hiện diện của
gen psy hoặc crtI đối với dòng lúa chuyển nạp bằng vector pCaCar và cắt đoạn với
KpnI (một điểm cắt) để xác định số bản (copy). Đối với DNA của các dòng lúa chuyển
Phương pháp tạo Golden Rice

Trang 16

nạp bằng vector pFun3 được cắt đoạn với EcoRI và HindIII (hai điểm cắt) để xác
định sự hiện diện của gen psy hoặc crtI và cắt với KpnI (một điểm cắt) để xác định số
bản.
DNA cắt đoạn được chạy điện di qua 0,8% agarose gel trước khi chuyển bằng mao
dẫn và cố định trên màng nylon (Hybond-N+, Amersham). Gen psy và crtI được
đánh dấu bằng DIG (Boeheringer, Rotkreuz, Switzerl), được dùng làm mẫu dò
(probe). Lai, rửa và phát hiện gene được thực hiện theo phương pháp của Wiinn và
ctv. (1996).
III. KẾT LUẬN VÀ NHỮNG VẤN ĐỀ KHÁC CỦA GOLDEN RICE:

Cây trồng chuyển gene đã mang lại nhiều lời ích cho con người và đặc biệt là sản
phẩm gạo vàng, một lựa chọn mới cho các quốc gia nghèo. Đây là một thành cồng lớn
của nên công nghệ sinh học của thế giới. Giá trị của các sản phẩm chuyển gen cần
nhiều thời gian để thẩm định, nhưng những gì chúng đã mang lại cho chúng ta hiện
nay đã không thể phủ nhận rằng thực vật chuyển gen có ý nghĩa tích cực và to lớn
trong đời sống con người. Gạo vàng sẽ là một niềm hy vọng rất lớn cho trẻ em phụ nữ
và nhiều thành phần khác trong xã hội. Việt Nam cũng đã thành công trong nghiên cứu
về loài GM mới này. Chúng ta hy vọng một ngày không xa gạo vàng sẽ là nguồn
lương thực cho cả thế giới và đó sẽ là một tương lai mà chúng ta không còn phải lo
lắng về khủng hoảng lương thực.
Tuy nhiên, Gạo Vàng không thể giải quyết tất cả các nguyên nhân của tình trạng
thiếu Vitamin A, những yếu tố sinh học, văn hóa, và chế độ ăn uống cơ bản.
Thiếu Vitamin A chỉ là một vấn đề trong vô số vấn đề nhức nhối của suy dinh
dưỡng. Trong hệ thống tiêu hóa, beta-carotene có thể được chuyển đổi thành retinal
hoặc bị ôxy hóa thành acid retinoic (RA). RA có thể tích tụ trong mở và huyết tương,
chúng có thể chuyển hóa thành chất độc và gây quái thai (teratogenic). Vitamin A liều
lượng thấp tốt cho sức khỏe, nhưng ở liều lượng cao, nó có thể gây ra tình trạng quá
liều Vitamin A (hypervitaminosis 2) và quái thai (teratogenicity 3). Độc tính của
Vitamin A có thể gây ra: đau bụng, buồn nôn, nôn mửa, phồng thóp ở trẻ sơ sinh. Mãn
tính có thể gây ra đau xương và khớp, gai xương (hyperotosis), rụng tóc, khô và nứt
môi, buồn nôn, tăng huyết áp, sốt nhẹ, và giảm cân (Shiva, 2001).
Phương pháp tạo Golden Rice

Trang 17

Một lập luận chống lại Gạo Vàng là một người cần phải tiêu thụ nhiều hất là 9 kg
Gạo Vàng mỗi ngày thì mới đáp ứng đủ liều lượng Vitamin A cần thiết (tổ chức Hòa
bình Xanh, 2001). IRRI đã cố gắng để giải quyết vấn đề này bằng cách tăng mức độ
carotenoid trong Gạo Vàng 2, tuy nhiên, vẫn còn câu hỏi về tỷ lệ chuyển đổi, liệu
chúng có thể được chuyển hóa thành cùng một lượng Vitamin A đã xác định trước.

Liệu Gạo Vàng an toàn với bất kỳ đặc điểm kiểu gen mới dị thường có rủi ro gì đến sức
khỏe con người không? Trong biến đổi gen, những biến dị (không định hướng và
không mong muốn) thì rất phổ biến bởi vì quá trình biến nạp gen là ngẫu nhiên có thể
có nhiều hơn một vị trí gen ngoài được chèn vào. Các gen ngoại cũng có khả năng tự
sắp xếp lại hoặc chúng có thể bị xóa bỏ hay lặp đi lặp lại. Tất cả quá trình đó sẽ sản
xuất ra một loại protein mới không có trong lịch sử tiến hóa của con người, từ đó có thể
tăng nguy cơ của việc giảm mức độ dinh dưỡng, hoặc xuất hiện các loại chất độc, chất
gây dị ứng chống lại quá trình hấp thu chất dinh dưỡng (Ho, 2001; NRC and NAS,
2004). Ví dụ, Zolla et al.(2008), đã báo cáo về 43 protein được theo dõi, 14 đã giảm
mức độ, 13 có mức tăng, 9 đã bị tắt, và 7 được tạo mới, trong quá trình biến đổi gen
ngô. Không phải tìm kiếm đâu xa cho những ví dụ về biến dị di truyền của các cây
trồng GMO (genetically modified organisms) mà là màu vàng của hạt Gạo Vàng đã
gây nhiều bất ngờ. Gạo Vàng sẽ có màu đỏ bởi vì lycopene(chất có màu đỏ) là sản
phẩm của hai carotenoid chuyển gen sinh tổng hợp bao gồm phytoene synthase (Psy)
và bacterial carotene desaturase (CRTI)] được sử dụng trong biến nạp gen Gạo Vàng
(Schaub et al. 2005). Tuy nhiên, lycopene chưa bao giờ được nghiên cứu trong bất kỳ
cây lúa biến đổi gen nào. Thay vào đó, các chất beta carotene, lutein và zeaxanthin
được tạo ra thì được nghiên cứu (Schaub et al. 2005).

IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, Chọn giống cây trồng – phương pháp truyền thống
và phân tử, NXB Nông nghiệp.
[2] Nguyễn Hoàng Lộc, Lê viết Dũng, Trần Quốc Dung, Công nghệ AND tái tổ hợp, NXB
Đại học Quốc gia TPHCM.
[3] Beyer. 2005. Why is
Golden
Rice
Golden
(Yellow) Instead of Red? Plant Physiol.
138(1):441-450.

Phương pháp tạo Golden Rice

Trang 18

Tài liệu từ internet:
1. Teratology. 45(1): 65-74. Ho, M.W.
2001.
An
exercise
in how not to do science. In The
Golden Rice
Report:
All that Glitters is not Gold :
eports/goldenrice.htm
2.
3.
4.
5.
6.