Giới thiệu một số phương pháp tách ADN từ máu toàn phần - Tạp chí nghiên cứu y học pdf

TCNCYH 23 (3) 2003
Giới thiệu một số phơng pháp tách ADN
từ máu toàn phần

Lê Hoàn, Trần Khánh Chi,
Phạm Thị Nguyệt Hằng, Bạch Khánh Hòa
Đại học Y Hà Nội

Tách chiết ADN là khâu cơ bản và rất quan trọng trong kỹ thuật sinh học phân tử. Chúng tôi đã
tiến hành một số kỹ thuật tách chiết ADN từ máu ngoại vi: kỹ thuật Perchlorate sodium, kỹ thuật
Acetate amonium, kỹ thuật QIA ampkit. Đồng thời so sánh các kỹ thuật đó với nhau dựa trên một
số tiêu chuẩn. Kết quả cho thấy kỹ thuật Perchlorate sodium có nhiều u điểm nhất. Kỹ thuật này
đang đợc sử dụng thờng qui tại Labo Trung tâm Y sinh học, Đại học Y Hà Nội.

I. Đặt vấn đề
ADN (Acid Deoxyribose Nucleic) là một
đại phân tử đợc cấu thành từ các đơn phân là
nucleotid. Trong cơ thể, tất cả các tế bào có
nhân đều chứa phân tử ADN. Phân tử này mang
toàn bộ thông tin di truyền của cá thể. Nguồn
thông tin di truyền đó đợc ổn định nhờ hoạt
động tự sao chép của ADN theo nguyên tắc
bán bảo tồn". Đồng thời thông qua hoạt động
của các bộ máy tế bào, nguồn thông tin này
đợc chuyển sang các phân tử ARN thông tin
ra ngoài bào tơng tổng hợp nên phân tử
protein:
ADN sao mã mARN dịch mã Protein
Trên cơ sở đó, sinh học phân tử đã phát triển
các kỹ thuật di truyền trên ADN vào nghiên
cứu và chẩn đoán một số bệnh. Để thực hiện kỹ

thuật này đòi hỏi phải có nguồn nguyên liệu
ADN đảm bảo cả về chất và lợng. Vì vậy, tách
chiết ADN là khâu đầu tiên, cơ bản và rất quan
trọng trong các qui trình thao tác trên ADN.
Với tầm quan trọng đó, đề tài này tiến hành
ứng dụng một số kỹ thuật tách ADN khác nhau
và so sánh chúng với nhau.
Mục đích của đề tài là tìm ra một kỹ thuật
phù hợp nhất với các tiêu chuẩn về: chất lợng
ADN, hàm lợng ADN, thời gian tiến hành, chi
phí thực hiện và mức độ độc hại đối với ngời
thực hiện.
II. Đối tợng và phơng pháp
nghiên cứu
1. Đối tợng
Máu ngoại vi chống đông bằng EDTA.
2. Phơng pháp nghiên cứu
Thực hiện một số kỹ thuật tách ADN khác
nhau với nguyên lý cơn bản gồm 4 bớc:
Phá vỡ hồng cầu
Phá vỡ bạch cầu
Loại bỏ protein
Tủa ADN
2.1. Kỹ thuật tách ADN bằng Perchlorate
sodium
(Kỹ thuật của S.A. Miller, D.D. Dykes, H.F.
Polesky - 1988)
Hoá chất:
- Dung dịch I (cho 1 lít):
Sucrose 0,3M 102g

Tris HCl 1M pH7.5 10mM 10ml

2
TCNCYH 23 (3) 2003
MgCl
2
5mM 1g
Triton 100 1% 10ml
- Dung dịch II (cho 500ml):
NaCl 0,0075M 2,19g
EDTA 0,024M 4,46g
- SDS (Sodium Dodecyle Sunfate) 10%
- Perchlorate sodium 5M
- NaCl 6M
- Cồn tuyệt đối
- Cồn 70%
- T.E (cho 1lít) gồm:
Tris HCl 1M pH8 10ml
EDTA 0,5M pH8 2ml
Qui trình tách:
Phá vỡ hồng cầu:
- Lấy 10ml máu chống đông bằng EDTA.
- Thêm vào đó dung dịch I cho đủ 50ml.
- Trộn đều, ly tâm 4200 vòng/ 10 phút/ 4
0
C.
- Loại bỏ nớc nổi, thu đợc cặn trắng (nếu
còn hồng cầu thì tiếp tục loại bỏ hồng cầu bằng
dung dịch I).
Phá vỡ bạch cầu:

- Sau khi thu đợc cặn trắng cho thêm vào:
4,5ml dung dịch II
125àl SDS 10%
1,1ml perchlorate sodium 5M
10àl Proteinase K 10mg/ ml
- Trộn đều, ủ 42
0
C/ 30 phút, lắc nhẹ.
- Thêm 2ml NaCl 6M.
- Trồn đều, ly tâm 3500 vòng/ 15 phút/ 4
0
C.
Tủa ADN:
- Lấy nớc nổi sang một tube khác.
- Thêm vào 2,5 thể tích cồn tuyệt đối, lắc
nhẹ, ủ ở -30
0
C qua đêm thu đợc tủa ADN
dạng hình sứa.
- Rửa tủa bằng cồn 70%, để khô, hoà tủa
bằng T.E.
2.2. Kỹ thuật tách ADN bằng acetate
d'ammonium
(Kỹ thuật của S.A.Miller, D.D.Dykes,
H.F.Polesky - 1988)
Hoá chất
T.E 20-5: TrisHCl 20mM
EDTA 5mM
- Sarkosyl 20%
- Proteinase K 10mg/ ml

- Acetate d'ammonium
- Cồn tuyệt đối
- Cồn 70%
Qui trình tách
Phá vỡ hồng cầu:
- Lấy máu chống đông bằng EDTA.
- Trộn đều, ly tâm nhẹ 2000 vòng/ 15 phút.
- Lấy phần huyết tơng giàu bạch cầu, đặt
trong đá 30 phút.
- Thêm vào 15ml dung dịch T.E 20-5, trộn
đều, ly tâm 1500 vòng/ 10 phút.
- Loại bỏ nớc nổi, thu cặn trắng.
Phá vỡ bạch cầu và loại protein:
- Sau khi thu đợc cặn trắng, thêm vào:
3,5ml T.E 20-5

3
TCNCYH 23 (3) 2003
175àl Sarkosyl 20%
75àl proteinase K
- Lắc đều, ủ 37
0
C qua đêm.
- Loại bỏ protein
- Thêm 2ml acetate d'ammonium 7,5M.
- Ly tâm 3500 vòng/ 15 phút/ 4
0
C.
Tủa ADN:
- Lấy nớc nổi sang một tube khác.

- Thêm 15ml cồn tuyệt đối.
- Trộn đều thu đợc tủa ADN hình sứa.
- Rửa tủa bằng cồn 70%, để khô, hoà tan tủa
bằng T.E.
2.2.3. Kỹ thuật tách ADN bằng QIA
ampkit (Microtechnique)
Nguyên tắc: Kỹ thuật này tách ADN từ
máu ngoại vi bằng QIAamp minikit có sẵn.
Qui trình tách:
- Cho 20àl QIAGEN protease (hoặc
proteinase K) vào eppendorf 1,5ml.
- Thêm vào đó 200àl Buffer AL, lắc bằng
máy khuấy trộn Vortex 15 giây.
- ủ 56
0
C/ 10 phút.
- Thêm 200àl cồn tuyệt đối, trộn đều bằng
máy Vortex.
- Chuyển sang cột QIAGEN, ly tâm 8000
vòng/ 10 phút, sau đó chuyển cột QIAGEN vào
tube 2ml sạch khác.
- Thêm 500àl Buffer AW1 vào cột
QIAGEN, ly tâm 8000 vòng/ 1 phút, đặt cột
QIAGEN vào tube 2ml sạch khác.
- Thêm 500àl Buffer AW2, ly tâm 14000
vòng/ 3 phút.
- Đặt cột QIAGEN vào tube ly tâm 1,5ml,
thêm 200àl Buffer AE, để ở nhiệt độ phòng 1
phút, sau đó ly tâm 8000 vòng/ 1phút.
III. Kết quả

1. Đo hàm lợng và đánh giá độ tinh
khiết của ADN bằng máy quang phổ kế
- Đo mật độ quang của dung dịch ADN ở
bớc sóng 260nm và ở bớc sóng 280nm.
- Hàm lợng ADN đợc xác định theo công
thức:
[ADN] àg/ml = OD
260
*Hệ số pha loãng*50.
- Đánh giá độ tinh khiết của ADN qua tỷ số
OD
260
/ OD
280
. ADN đợc coi là tinh khiết khi:
1,6<OD
260
/ OD
280
<2.

Bảng 1: Hàm lợng và độ tinh khiết của ADN tách bằng các kỹ thuật khác nhau
KT OD260 OD280 OD260/ OD280
ADN (àg/ml)
Perchlorate 0.473 0.268 1.76 9.46
Acetate amonium 0.838 0.513 1.64 16.76
QIA ampkit 0.227 0.134 1.70 11.4


4

TCNCYH 23 (3) 2003
2. Điện di kiểm tra ADN
- Bản gel điện di có 6 giếng, cho vào mỗi
giếng một thể tích ADN nh nhau.
Hình 1: Điện di kiểm tra ADN trên gel
agarose 0,8%, điện thế 100 V, thời gian 20
phút.
- Giếng số 1, 2: ADN tách từ kỹ thuật Perchlorate sodium
- Giếng số 3, 4: ADN tách từ kỹ thuật QIA ampkit
- Giếng số 5: ADN tách từ kỹ thuật Acetate Ammonium
- Giếng số 6: ADN chuẩn nông độ 12 àg/ml
- Kết quả cho thấy các băng sáng hiện rõ
nét, gọn và khá đều nhau.
IV. Bàn luận
Kỹ thuật QIA amp cho ADN chất lợng tốt
dù chỉ đi từ một lợng máu rất ít (200àl). Tuy
nhiên, chi phí cho kỹ thuật này khá cao nên
cha đợc áp dụng rộng rãi.
Hai kỹ thuật Perchlorate Sodium và Acetate
d'ammonium có u điểm là dễ tiến hành, thời
gian ngắn và chi phí vừa phải mà vẫn thu đợc
ADN đảm bảo cả về chất và lợng. Hơn nữa,
hai kỹ thuật này đi từ một lợng máu khá lớn
(10ml) nên lợng ADN thu đợc có thể sử
dụng trong những kỹ thuật đòi hỏi một lợng
ADN lớn nh định nhóm kháng nguyên bạch
cầu, định nhóm kháng nguyên tiểu cầu.
ADN tách từ kỹ thuật perchlorate sodium có
độ tinh khiết cao hơn ADN tách từ kỹ thuật
Acetate d'ammonium.

V. Kết luận
Qua quá trình tiến hành các kỹ thuật trên
cùng với kết quả thu đợc, chúng tôi nhận thấy
rằng kỹ thuật Perchlorate Sodium là phù hợp
nhất với những tiêu chuẩn đã đặt ra. Hiện nay,
kỹ thuật này đang đợc sử dụng thờng qui tại
Labo Trung tâm Y Sinh học, Đại học Y Hà Nội
để tách ADN từ máu ngoại vi.
Tài liệu tham khảo
1. Laboratoire dimmunologie plaquettaire:
Fiches Techniques. 1998, Vol.2.
2. Biologie Moleculaire: Principes et
techniques de base - Les techniques de PCR.
3. Lê Đình Lơng : Nguyên lí kỹ thuật di
truyền . 2001.
Summary
Application and comparison of some methods of
extraction DNA from peripheral blood
DNA extraction is a basic and importance step in molecular biology technical. DNA has been
extracted from peripheral blood by some techniques as: Perchlorate sodium, Acetate amonium, QIA
amp minikit. At the same time, the comparison of those techniques depend on some standard.
The result indicated: Perchlorate sodium DNA extraction is the best technique among the
techniques mentioned above.
This technique is daily used to extract DNA from peripheral blood at the Bio - Medical Centre
Laboratory, Hanoi Medical University.


5