PCR NHỮNG VẤN ĐỀ CƠ BẢN pptx

PCR
NHỮNG VẤN ĐỀ CƠ BẢN


NỘI DUNG
NỘI DUNG

Nguyên tắc PCR

Phản ứng PCR

Các loại PCR

Real-time PCR

Ứng dụng của PCR

PCR chẩn đoán tác nhân vi sinh vật



NGUYÊN TẮC CỦA PCR
NGUYÊN TẮC CỦA PCR
Thử nghiệm nhân bản
một đoạn DNA trong
ống nghiệm dựa vào
các chu kỳ nhiệt
1
2
3

4
n
2
n


NGUYÊN TẮC CỦA PCR
NGUYÊN TẮC CỦA PCR
Chu kỳ nhiệt
3 giai đoạn :

Biến tính

Bắt cặp

Kéo dài
DNA đích
1 Biến tính (94
o
C )
2 Bắt cặp (55-65
o
C)
3 Kéo dài (72
o
C)
5’
3’
3’
5’

Mồi
Taq polymerase
dNTP
PCR buffer + MgCl
2
PCR
MIX
DNA đích (Template)
PHẢN ỨNG PCR
PHẢN ỨNG PCR
PCR mix


30X-40X
94
o
C/15s-1min
55-65
o
C/15s-1min
72
o
C/30s-3min


PHẢN ỨNG PCR
PHẢN ỨNG PCR
Máy luân nhiệt


Tạo chu kỳ nhiệt

Buồng ủ nhiệt

Nhiệt độ lên xuống
chính xác, đồng nhất

Tốc độ tăng giảm nhiệt
độ cực nhanh theo
chu kỳ


PHẢN ỨNG PCR
PHẢN ỨNG PCR
Men polymerase chịu nhiệt

Tách chiết từ VK Thermus aquaticus
(Taq polymerase)

Tái tổ hợp từ VK E. coli / VK không chịu nhiệt


PHẢN ỨNG PCR
PHẢN ỨNG PCR
Kỹ thuật chống ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại
Nguyên tắc

PCR mix có thêm dUTP và men UNG (Uracil
DNA glycosidase)


Sản phẩm khuếch đại có T bị thay thế bởi U

Sản phẩn khuếch đại nếu ngoại nhiễm vào PCR
mix sẽ bị men UNG phá hủy trước khi thực hiện
PCR


CÁC LOẠI PCR
CÁC LOẠI PCR


Monoplex PCR
Monoplex PCR
PCR
94
0
C for 30”
55
0
C for 30”
72
0
C for 01’
40X


CÁC LOẠI PCR
CÁC LOẠI PCR
Multiplex PCR

PCR
94
0
C for 30”
55
0
C for 30”
72
0
C for 01’
40X


CÁC LOẠI PCR
CÁC LOẠI PCR
Touch down PCR
PCR
94
0
C for 30”
55
0
C for 30”
72
0
C for 01’
40X
94
0
C for 30”

65
0
C for 30”
05X
94
0
C for 30”
60
0
C for 30”
05X


CÁC LOẠI PCR
CÁC LOẠI PCR
PCR
94
o
C for 30”
55
o
C for 30”
72
o
C for 01’
40X
PCR
94
o
C for 30”

55
o
C for 30”
72
o
C for 01’
40X
Nested PCR


CÁC LOẠI PCR
CÁC LOẠI PCR
Nonstop nested PCR
PCR
94
o
C for 30”
65
o
C for 30”
72
o
C for 01’
10X
PCR
94
o
C for 30”
55
o

C for 30”
72
o
C for 01’
40X


CÁC LOẠI PCR
CÁC LOẠI PCR
RT- PCR (one-step)
PCR PCR
RNA
RT
(reverse
transcription)
RNA
RT
(reverse
transcription)


CÁC LOẠI PCR
CÁC LOẠI PCR


RT- PCR (two-step)
RT- PCR (two-step)
PCR PCR
RNA
RT

(reverse
transcription
)
RT with specific
primers
RNA
RT
(reverse
transcription
)
RT with random
primers


Real-time PCR
Real-time PCR
Nguyên tắc




Real-time PCR
Real-time PCR
Biểu đồ khuếch đại


Real-time PCR
Real-time PCR
Biểu đồ chuẩn

Laser
or UV
Came
ra
Real-time PCR
Real-time PCR
Máy real time PCR


Primers
Taq polymerase
dNTP
PCR buffer + MgCl
2
Real-time
PCR MIX
Target DNA (Template)
Hóa chất: Real-time PCR mix phát quang được khi có
sản phẩm PCR
Fluorescent agent
Real-time PCR
Real-time PCR
Hóa chất và thuốc thử


Real-time PCR
Real-time PCR
Ứng dụng


Định lượng tác nhân đích có trong mẫu thử

Xác định tỉ lệ biến đổi gen

Xác định kiểu di truyền

Công nghệ gen

Pháp y

Chẩn đoán và sàng lọc bệnh lý di truyền

Phát hiện tác nhân VSV gây bệnh

Giải trình tự gen


PCR CHẨN ĐOÁN TÁC NHÂN VSV
PCR CHẨN ĐOÁN TÁC NHÂN VSV
Áp dụng

Chẩn đoán
Định tính
Định lượng

Theo dõi diễn tiến bệnh và hiệu quả điều trị
Định lượng


PCR CHẨN ĐOÁN TÁC NHÂN VSV

PCR CHẨN ĐOÁN TÁC NHÂN VSV
Ưu điểm

Độ nhạy cao

Độ đặc hiệu cao

Cho kết quả nhanh hơn so với nuôi cấy

Giúp chẩn đoán tác nhân VSV không nuôi cấy
được