Nghiên cứu định lượng đồng thời aspirin và natri salicylat trong dung dịch A.S.A bằng phương pháp HPLC

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI ASPIRIN VÀ NATRI SALICYLAT
TRONG DUNG DỊCH A.S.A BẰng phương pháp HPLC
PHẠM THỊ HÀ, TRẦN THÚY HẠNH

Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

Từ khóa: Định lượng đồng thời, HPLC, aspirin, natri salicylat.
1. Đặt vấn đề
Dung dịch A.S.A là một trong những loại thuốc bôi
tại chỗ được dùng để chữa bệnh lang ben và một số
bệnh về da do nấm gây ra với các thành phần chính gồm
aspirin, natri salicylat. Khi điều trị tại chỗ, natri salicylat
làm dịu và giảm viêm ở vùng da kích ứng, aspirin có
tác dụng sát trùng, bong tế bào sừng và giảm ngứa nhẹ.
Để kiểm soát hàm lượng các hoạt chất trong chế
phẩm, cần đưa ra một qui trình phân tích nhằm đánh
giá chất lượng sản phẩm. Hiện tại trong các Dược điển
Việt Nam [1], Dược điển Anh [3], Dược điển Mỹ [4]
chưa có phương pháp định lượng đồng thời hai thành
phần aspirin và natri salicylat. Trước đây trong tài liệu
tiêu chuẩn ngành [2] đã đưa ra phương pháp định lượng
từng hoạt chất bằng chuẩn độ thể tích. Trong đó, định
lượng aspirin bằng phương pháp chuẩn độ thể tích trong
nền mẫu có ether, định lượng natri salicylat cũng bằng
phương pháp chuẩn độ thể tích phải qua bước bốc hơi
đến cạn trên nền mẫu có nước. Cách xử lý mẫu như vậy
phức tạp, mất thời gian.
Với mong muốn đưa ra phương pháp định lượng
đồng thời hai thành phần này trong dung dịch A.S.A tiến

hành đơn giản và nhanh chóng nhưng vẫn đảm bảo độ
chính xác, tin cậy, chúng tơi giới thiệu kết quả nghiên
cứu thẩm định quy trình định lượng đồng thời hai thành
phần aspirin và natri salicylat trong dung dịch A.S.A
bằng phương pháp HPLC.
2. Thực nghiệm
2.1. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất và chất chuẩn
2.1.1. Thiết bị, dụng cụ: Đã được hiệu chuẩn theo yêu
cầu của ISO/IEC 17025 và GLP.
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu với
detector DAD;
- Cột Apollo - C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm);
- Cân phân tích Mettler Toledo MS 105 độ chính xác
0,01 mg;

- Bộ lọc dùng cho sắc ký với màng lọc 0,45 mm;
- Các dụng cụ thuỷ tinh chính xác: bình định mức,
pipet.

2.1.2. Chất chuẩn
- Aspirin của Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố
Hồ Chí Minh; Số lơ: QT078100718; Hàm lượng: 99,5%
(nguyên trạng).
- Acid salicylic của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung
ương; Số lơ: 0118281.01; Hàm lượng: 99,93% (ngun
trạng).
2.1.3. Hóa chất thuốc thử
- Nước RO (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương);
- Acetonitril loại dùng cho HPLC (Merck - Đức);
- Acid formic loại PA (Scharlau – Tây Ban Nha);

- Natri 1-heptansulfonat loại PA (Fischer – Bỉ).
2.2. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu thử: Dung dịch A.S.A (Lô: NC001;
NSX: 26/8/2019); Nhà sản xuất: Công ty TNHH Dược
phẩm Nam Việt.
Công thức pha chế cho 18 ml thành phẩm: Aspirin
1,800 g; natri salicylat 1,584 g; ethanol 70% vừa đủ 18 ml.
2.2.2. Nội dung
- Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng aspirin
và natri salicylat bằng phương pháp HPLC.
- Ứng dụng để định lượng aspirin và natri salicylat
trong dung dịch A.S.A.
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu
- Dựa trên các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát
các điều kiện sắc ký để lựa chọn điều kiện sắc ký tối ưu.
- Xây dựng quy trình xử lý mẫu dựa trên đặc tính của
chất phân tích.
- Sử dụng phần mềm Microsoft excel để xử lý kết
quả thẩm định.

Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 2.2021; Tập 19.(72)

1


3. Kết quả và bàn luận
3.1. Xây dựng qui trình phân tích định lượng aspirin
và natri salicylat bằng phương pháp HPLC
Chúng tôi đã khảo sát về cột sắc ký, tỉ lệ pha động,

tốc độ dịng, bước sóng phát hiện, nồng độ chất phân
tích và lựa chọn được điều kiện sắc ký tối ưu như sau
3.1.1. Điều kiện HPLC
- Cột Apollo C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm).
- Detector UV: 230 nm.
- Tốc độ dịng: 1,5 ml/min.
- Thể tích tiêm: 10 µl.
- Pha động: Hòa tan 2 g natri heptansulfonat trong
hỗn hợp gồm 850 ml nước và 150 ml acetonitril, sau đó
điều chỉnh đến pH 3,4 bằng acid acetic.
- Dung mơi pha mẫu: Hỗn hợp acetonitril và acid
acetic (99 : 1).
3.1.2. Phương pháp chuẩn bị mẫu
- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 50 mg
acid salicylic chuẩn và khoảng 60 mg aspirin chuẩn vào
bình định mức 100 ml, hịa tan và thêm dung môi pha
mẫu tới vừa đủ, lắc đều. Hút chính xác 5,0 ml dung dịch
vừa thu được vào bình định mức 25 ml, pha lỗng bằng
dung mơi pha mẫu tới vừa đủ, lắc đều. Lọc qua màng lọc
0,45 µm và tiến hành tiêm vào hệ thống sắc ký.
- Dung dịch thử: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch
A.S.A vào bình định mức 50 ml, thêm dung mơi pha
mẫu đến vừa đủ, lắc đều. Hút chính xác 3,0 ml dung dịch
vừa thu được vào bình định mức 50 ml, pha lỗng bằng
dung mơi pha mẫu đến vừa đủ, lắc đều. Lọc qua màng lọc
0,45 µm và tiến hành tiêm vào hệ thống sắc ký.
3.1.3. Cách tiến hành
Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiêm 6
lần dung dịch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối của diện
tích pic acid salicylic và aspirin không được lớn hơn

2,0% và độ phân giải giữa hai pic này phải khơng được
nhỏ hơn 1,5.

Hình 1. Sắc ký đồ dung mơi pha mẫu
2

3.1.4. Tính kết quả
Tính hàm lượng natri salicylat và aspirin trong chế
phẩm dựa vào lượng cân acid salicylic và aspirin chuẩn,
hàm lượng chất chuẩn, diện tích các pic acid salicylic và
aspirin trong dung dịch chuẩn và dung dịch thử, hệ số
pha loãng của dung dịch chuẩn và dung dịch thử (Hệ số
chuyển đổi từ acid salicylic sang natri salicylat là 1,1593).
3.2. Thẩm định phương pháp
3.2.1. Tính đặc hiệu
- Dung dịch placebo của natri salicylat (tự tạo dung
dịch có các thành phần như cơng thức bào chế nhưng
khơng có natri salicylat): Pha theo qui trình phân tích
của dung dịch thử mục 3.1.2.
- Dung dịch placebo của aspirin (tự tạo dung dịch có
các thành phần như cơng thức bào chế nhưng khơng có
aspirin): Pha theo qui trình phân tích của dung dịch thử
mục 3.1.2.
- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 49,50 mg chất
chuẩn acid salicylic và 60,18 mg chất chuẩn aspirin
vào bình định mức 100 ml, hịa tan và thêm dung mơi
pha mẫu tới vừa đủ, lắc đều (dung dịch chuẩn gốc). Hút
chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc vừa thu được vào
bình định mức 25 ml, pha lỗng bằng dung mơi pha mẫu
tới vừa đủ, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm và tiến

hành tiêm vào hệ thống sắc ký.
- Dung dịch thử: Pha theo qui trình phân tích.
Tiêm dung mơi pha mẫu, các dung dịch placebo,
dung dịch chuẩn, dung dịch thử vào hệ thống sắc ký.
Kết quả cho thấy, trên sắc ký đồ của dung dịch thử cho 2
pic có thời gian lưu và phổ UV tương ứng với pic acid
salicylic và aspirin trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn
(thời gian lưu của acid salicylic khoảng 14 phút; aspirin
khoảng 17 phút). Độ tinh khiết của pic acid salicylic và
aspirin trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và thử đều
bằng 0,9999 (~ 100%). Sắc ký đồ của dung môi pha mẫu
và các dung dịch placebo không xuất hiện các chất phân
tích (Hình 1, Hình 2, Hình 3, Hình 4, Hình 5 và Hình 6).

Hình 2. Sắc ký đồ dung dịch placebo của aspirin
Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 2.2021; Tập 19.(72)


Hình 3. Sắc ký đồ dung dịch placebo của
natri salicylat

Hình 4. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn aspirin

Hình 5. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn

Hình 6. Sắc ký đồ dung dịch thử

Sắc ký đồ trên Hình 1, 2, 3, 4, 5 và 6 cho thấy phương pháp đã xây dựng có tính đặc hiệu phù hợp cho định lượng
đồng thời natri salicylat và aspirin trong dung dịch A.S.A.

3.2.2. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Tính thích hợp của hệ thống sắc ký được xác định bằng cách tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn ở mục
3.2.1. Ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết và hệ số đối xứng của pic acid salicylic và
aspirin. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký thể hiện ở Bảng 1.
Bảng 1. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
STT

Acid salicylic
Aspirin
Thời gian Diện tích pic Hệ số
Số đĩa
Thời gian Diện tích pic Hệ số
Số đĩa
lưu (phút)
(mAU.s)
đi (T) lí thuyết (N) lưu (phút)
(mAU.s)
đi (T) lí thuyết (N)

1

13,968

2054716

0,819

10379

17,275

2002923

1,034

10755

2

13,971

2054274

0,824

10406

17,278

2005609

1,043

10817

3

13,971

2053140

0,824

10443

17,277

2000887

1,048

10865

4

13,974

2053523

0,824

10476

17,281

2004285

1,052

10845

5

13,968

2050301

0,826

10538

17,272

1996919

1,051

10880

6

13,959

2042802

0,825

10595

17,254

1991480

1,052

10927

TB

13,969

2051459

17,273

2000351

RSD (%)

0,04

0,22

0,06

0,26

Độ phân giải giữa 2 pic ⁓ 5,4
Các số liệu thu được ở Bảng 1 cho thấy hệ thống sắc ký trên phù hợp cho việc phân tích định tính và định lượng
acid salicylic và aspirin.

Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 2.2021; Tập 19.(72)

3


3.2.3. Độ tuyến tính
Khảo sát trên 5 dung dịch chuẩn với 5 nồng độ tương ứng là 50%, 80%, 100%, 120%, 150% so với nồng độ định
lượng được chuẩn bị từ dung dịch chuẩn gốc ở mục 3.2.1. Kết quả thu được được trình bày trong Bảng 2, Hình 7,
Hình 8.
Bảng 2. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp
Nồng độ % so Thể tích dung dịch
STT
với định lượng
chuẩn gốc (ml)

Hệ số pha
lỗng

Acid salicylic

Aspirin

Nồng độ
(µg/ml)

Diện tích pic
(mAU.s)

Nồng độ
(µg/ml)

Diện tích pic
(mAU.s)

1

50

2

20

49,47

1022300

59,88

994768

2

80

4

25

79,14

1636083

95,81

1590928

3

100

5

25

98,93

2054716

119,76

2002923

4

120

6

25

118,72

2445978

143,71

2384331

5

150

3

10

148,40

3057381

179,64

2979265

Phương trình hồi qui:
Hệ số tương quan:
%Y:

y = 20556 x + 9653,8
r = 1,0000

0,47% (< 2%)

Hình 7. Đường hồi qui tuyến tính của acid salicylic

y =16570 x + 6059,6
r = 1,0000
0,30% (< 2%)

Hình 8. Đường hồi qui tuyến tính của aspirin

Từ kết quả ở Bảng 2 và Hình 7, 8 cho thấy với điều kiện sắc ký đã lựa chọn, trong khoảng nồng độ đã khảo sát,
có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ acid salicylic, aspirin và diện tích pic đáp ứng với hệ số tương
quan là r = 1,0000.

3.2.4. Độ đúng
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác 49,63 mg acid salicylic chuẩn và 60,48 mg aspirin chuẩn vào
bình định mức 100 ml, hịa tan và thêm dung mơi pha mẫu tới vừa đủ, lắc đều.
- Chuẩn bị dung dịch placebo gốc: Hút 1 ml ethanol 70% vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha mẫu đến
vừa đủ, lắc đều.
- Chuẩn bị các dung dịch tự tạo: Thêm chính xác 6,0 ml; 10,0 ml; 14,0 ml dung dịch chuẩn gốc vừa pha vào các
bình định mức 50 ml đã chứa sẵn 3 ml dung dịch placebo gốc, thêm dung môi pha mẫu đến vừa đủ, lắc đều thu được
các dung dịch tự tạo có nồng độ 60%, 100%, 140% so với nồng độ định lượng. Lọc qua màng lọc 0,45 µm và tiến
hành tiêm vào hệ thống sắc ký.
Tính lượng acid salicylic và aspirin tìm lại được, sử dụng dung dịch chuẩn ở mục 3.2.2. Tính thích hợp của hệ
thống sắc ký. Kết quả khảo sát độ đúng được thể hiện qua Bảng 3.
4

Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 2.2021; Tập 19.(72)

Bảng 3. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp
Acid salicylic
Lượng
Lượng
thêm vào Lượng thực
Diện tích pic
acid
% Thu
so với tế thêm vào
(mAU.s)
salicylic
hồi
(µg)
Stt nhãn
tìm lại (µg)
1
2
3

60%
60%
60%

4
5
6

100%
100%
100%

7
8
9

140%
140%
140%

2975,72
1222149
2946,88
99,03
2975,72
1233602
2974,49
99,96
2975,72
1225538
2955,05
99,31
Trung bình = 99,43%; RSD = 0,48%
4959,53
2043564
4927,50
99,35
4959,53
2026603
4886,60
98,53

4959,53
2029046
4892,49
98,65
Trung bình = 98,84%; RSD = 0,45%
6943,34
2857556
6890,22
99,23
6943,34
2857366
6889,76
99,23
6943,34
2860243
6896,70
99,33
Trung bình = 99,26%; RSD = 0,06%

Kết quả thu được ở Bảng 3 cho thấy phương pháp có
độ đúng tốt (phần trăm tìm lại từ 98,53% đến 100,43%)
và giá trị RSD đều nhỏ hơn 2,0%.

3.2.5. Khoảng xác định
Từ phần đánh giá độ tuyến tính, độ đúng suy ra
khoảng xác định của acid salicylic là 58,94 μg/ml –
137,93 μg/ml và aspirin là 71,96 μg/ml – 168,37 μg/ml

Aspirin
Lượng

Lượng
% Thu
thực tế Diện tích pic
aspirin
hồi
thêm vào
(mAU.s)
tìm lại (µg)
(µg)
3610,66
1201891
3597,78
99,64
3610,66
1211385
3626,20
100,43
3610,66
1209015
3619,10
100,23
Trung bình = 100,1%; RSD = 0,41%
6017,76
2005956
6004,69
99,78
6017,76
1990240
5957,64
99,00

6017,76
1990158
5957,40
99,00
Trung bình = 99,26%; RSD = 0,45%
8424,86
2810541
8413,16
99,86
8424,86
2806637
8401,47
99,72
8424,86
2812245
8418,26
99,92
Trung bình = 99,83%; RSD = 0,10%

(60% - 140% so với nồng độ định lượng).

3.2.6. Độ chính xác
3.2.6.1. Độ lặp lại
Khảo sát định lượng natri salicylat và aspirin trong
dung dịch A.S.A với các điều kiện sắc ký và cách chuẩn
bị mẫu như ở mục 3.1.1 và 3.1.2. Lặp lại thí nghiệm 6
lần, kết quả được trình bày trong Bảng 4.

Bảng 4. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp

Stt
1
2
3
4
5
6

Kiểm nghiệm viên 1- Kết quả phần 3.2.5.1.
Kiểm nghiệm viên 2
(Kết quả độ lặp lại)
Thiết bị: Máy HPLC Shimadzu LC-20AD XR
Thiết bị: Máy HPLC Shimadzu LC-20AD
Nồng độ dd chuẩn acid salicylic: 98,93 µg/ml
Nồng độ dd chuẩn acid salicylic: 98,13 µg/ml
Nồng độ dd chuẩn aspirin: 119,76 µg/ml
Nồng độ dd chuẩn aspirin: 121,35 µg/ml
DT pic chuẩn acid salicylic = 2051459 mAU.s
DT pic chuẩn acid salicylic = 2096231 mAU.s
DT pic chuẩn aspirin = 2000351 mAU.s
DT pic chuẩn aspirin = 2045471 mAU.s
Natri salicylat
Aspirin
Natri salicylat
Aspirin
Diện tích pic
HL (%)
Diện tích pic HL (%)
Diện tích pic
HL (%)

Diện tích pic HL (%)
(mAU.s) natri salicylat (mAU.s)
aspirin
(mAU.s)
natri salicylat
(mAU.s)
aspirin
2073935
109,80
2032689
101,41
2124421
109,18
2054931
101,59
2068324
109,50
2030791
101,32
2125110
109,21
2034384
100,58
2066516
109,41
2027385
101,15
2139395
109,95
2053747

101,53
2066216
109,39
2030504
101,30
2108826
108,38
2036030
100,66
2067915
109,48
2030403
101,30
2082124
107,01
2003772
99,06
2066858
109,42
2030541
101,30
2100599
107,96
2023122
100,02
Trung bình = 109,50%; Trung bình = 101,30%;
Trung bình = 108,62%;
Trung bình = 100,57%;
n = 6; RSD = 0,14%
n = 6; RSD = 0,08%

n = 6; RSD = 0,97%
n = 6; RSD = 0,95%
Hàm lượng natri salicylat trung bình = 109,06%; n = 12; RSD = 0,78% < 2,0%;
Hàm lượng aspirin trung bình = 100,94%; n = 12; RSD = 0,74% < 2,0%.

Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 2.2021; Tập 19.(72)

5


Kết quả ở Bảng 4 cho thấy phương pháp có độ lặp
lại tốt với RSD = 0,78% < 2,0% (natri salicylat) và
RSD = 0,74% < 2,0% (aspirin).

3.2.6.2. Độ chính xác trung gian
Độ chính xác trung gian do hai kiểm nghiệm viên
khác nhau, tiến hành khác ngày trên hai thiết bị khác
nhau. Kết quả thể hiện ở Bảng 4.
Kết quả ở Bảng 4 cho thấy phương pháp có độ chính
xác trung gian đạt yêu cầu.
4. Kết luận
Phương pháp sắc ký lỏng pha đảo đã được thiết lập
để định lượng natri salicylat và aspirin trong dung dịch

A.S.A. Phương pháp đã xây dựng sử dụng cột Apollo
- C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) trong q trình phân tích.
Pha động: Hịa tan 2 g natri heptansulfonat trong hỗn
hợp gồm 850 ml nước và 150 ml acetonitril, sau đó
điều chỉnh đến pH 3,4 bằng acid acetic, tốc độ dịng
1,5 ml/phút, thể tích tiêm 10 ml; detector DAD ở bước

sóng 230 nm; dung mơi pha mẫu: Hỗn hợp acetonitril và
acid acetic (99:1). Phương pháp được thẩm định về tính
đặc hiệu, độ thích hợp của hệ thống, độ tuyến tính, độ
đúng, khoảng xác định, độ lặp lại và độ chính xác trung
gian. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp được
xây dựng hoàn toàn phù hợp để kiểm soát hàm lượng
natri salicylat và aspirin trong dung dịch A.S.A.

Tài liệu tham khảo
1. Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam, Lần xuất bản thứ năm, NXB Y học, Hà Nội.
2. Bộ Y tế (1990), Tiêu chuẩn ngành, Nhóm R, 52TCN. 367-89.
3. The British Pharmacopoeia Commission (2019), British Pharmacopoeia.
4. The United States Pharmacopoeial Convention (2018), United States Pharmacopoeia 41.

SUMMARY

A reversed-phase liquid chromatography method was developed to assay Sodium salicylate and Aspirin in A.S.A
solution product. The method was carried by using a Apollo - C18 (250 x 4.6 mm; 5 µm) column and mobile phase is
prepared follow, dissolve 2 g of Sodium 1-heptanesulfonate in a mixture of 850 ml of Water and 150 ml of Acetonitrile, and
adjust with Glacial acetic acid to a pH of 3.4. The flow rate of mobile phase is maintained at 1.5 ml per minute, injection
volume: 10 ml, analyte was detected by a DAD detector set at 230 nm. The method was validated in specificity, linearity,
range, accuracy and precision. Validation results proved that the developed method was suitable for assay of Sodium
salicylate and Aspirin in A.S.A solution product.

(Ngày nhận bài: 26/11/2020 ; Ngày phản biện: 16/03/2021 ; Ngày duyệt đăng: 10/06/2021

THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG RABEPRAZOL
CỦA VIÊN NÉN BAO TAN TRONG RUỘT ĐÃ HÒA TAN
TRONG MÔI TRƯỜNG ACID VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỆM
LỤC THỊ VÂN, NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH,

NGUYỄN VĂN BÌNH, TRẦN THỊ HỒNG ANH

Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

Từ khóa: Rabeprazol, viên bao tan trong ruột, độ hịa tan, mơi trường acid, mơi trường đệm.
1. Đặt vấn đề
Rabeprazol là dẫn chất benzidamol, có tác dụng ức chế bơm proton, ức chế tiết dịch vị cả cơ bản và trong tình
trạng kích thích. Hoạt chất rabeprazol khơng có tính chất kháng acetylcholin hoặc đối kháng thụ thể Histamin H2
bằng cách ức chế enzym H+/K+-ATPase ở tế bào thành của niêm mạc dạ dày. Enzym này là bơm acid, hydrogen hoặc
proton trong tế bào thành niêm mạc dạ dày nên rabeprazol được coi là thuốc ức chế bơm proton. Thuốc này được chỉ
6

Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 2.2021; Tập 19.(72)