Nghiên cứu tính chất Phytaza tự nhiên và tái tổ hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis

Bộ giáo dục Và đào tạo


viện khoa học
và công nghệ việt nam



Viện công nghệ sinh học

Đỗ Thị Ngọc Huyền



Nghiên cứu tính chất
phytaza tự nhiên v tái tổ hợp
của vi khuẩn Bacillus subtilis




Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số : 62 42 40 01



Tóm tắt Luận án tiến sĩ sinh học

Hà nội 2007
Công trình đợc hoàn thành tại: Viện Công nghệ sinh học.

Ngời hớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thuỳ Châu
PGS.TS Trơng Nam Hải






Phản biện 1: GS.TS Phạm Văn Ty
Trờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
Phản biện 2: PGS.TS Ngô Xuân Mạnh
Trờng Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội
Phản biện 3: PGS.TS Ngô Tiến Hiển
Viện Công nghiệp thực phẩm

Luận án sẽ đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nớc họp tại
Viện Công nghệ sinh học
vào hồi 9 giờ ngày 31 tháng 8 năm 2007










Có thể tìm hiểu luận án tại th viện: Viện Công nghệ sinh học, Th viện Quốc gia
Hà Nội


1
Mở đầu

1 Tính cấp thiết của đề tài
Photpho là nguyên tố đa lợng cần thiết cho sự phát triển của ngời
và vật nuôi. Nhng đa số thức ăn cho gia súc có nguồn gốc từ các hạt thực
vật đặc biệt là ngũ cốc đều có chứa sẵn photpho. Tuy nhiên, photpho trong
các nguyên liệu này có tới 80% nằm dới dạng phân tử phytat hoặc axit
phytic (myo-inositol hexan photphat) rất khó tiêu hóa đối với các loài
động vật dạ dày đơn nh gia cầm, lợn, cáDo đó, cần phải bổ sung
những hợp chất chứa photpho vô cơ vào thức ăn để đáp ứng đủ nhu cầu

của chúng
. Lợng axit phytic và phytat không đợc tiêu hóa này theo
phân của gia cầm thải ra ngoài là nguyên nhân gây ô nhiễm môi trờng.
Chính vì vậy, việc sử dụng phytaza - một enzym có khả năng xúc tác
phản ứng thủy phân axit phytic (và các muối của axit này) giải phóng ra
một hoặc nhiều gốc photphat vô cơ tự do và myo - inositol phân tử thấp,
là các dạng chất dễ tiêu hóa hơn các hợp chất ban đầu là rất cần thiết.
Bện cạnh việc ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi, phytaza còn đợc ứng
dụng vào một số lĩnh vực khác nh thực phẩm, dợc phẩm và bảo vệ môi
trờng.
ở nớc ta, việc nghiên cứu công nghệ sản xuất phytaza mới bắt
đầu, chủ yếu đợc triển khai tại các phòng thí nghiệm của Viện Cơ điện
Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, trờng Đại học Nông Lâm
thành phố Hồ Chí Minh và trờng Đại học S phạm I. Các nghiên cứu
này mới tập trung vào tuyển chọn, xác định tính chất của phytaza tự
nhiên từ nấm mốc. Tuy nhiên cha có một công trình nào nghiên cứu về
các tính chất của phytaza từ vi khuẩn B. subtilis để có đợc những hiểu
biết sâu sắc về enzym này nhằm tiến tới sản xuất chế phẩm phục vụ chăn
nuôi.
Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi đã thực
hiện đề tài: Nghiên cứu tính chất phytaza tự nhiên và tái tổ hợp của
vi khuẩn Bacillus subtilis.


2

2 Mục tiêu của đề tài
Xác định đợc tính chất của phytaza tự nhiên từ B. subtilis và
phytaza tái tổ hợp nhằm sản xuất phytaza ứng dụng trong chăn nuôi và
một số lĩnh vực khác.

3 Nội dung nghiên cứu
9 Phân lập và tuyển chọn các chủng B. subtilis sinh phytaza cao từ một
số nguồn đất và phân động vật nhằm thu đợc phytaza có tính chịu
nhiệt.
9 Nghiên cứu thu nhận và xác định tính chất phytaza tự nhiên từ chủng
B. subtilis.
9 Phân lập gen phyC mã hóa cho phytaza từ B. subtilis làm tiền đề cho
việc biểu hiện chúng trong các hệ biểu hiện khác nhau.
9 Thiết kế và biểu hiện gen phyC trong vi khuẩn E. coli để thu nhận và
xác định tính chất của PhyC tái tổ hợp.
4 Những đóng góp mới của luận án
Bản luận án này có những đóng góp mới về khoa học và thực tiễn nh
sau:
9 Xác định đợc các đặc điểm sinh học và đã phân loại đến loài chủng
vi khuẩn phân lập từ đất và phân động vật ở Việt Nam có khả năng
sinh phytaza cao.
9 Đã tạo dòng và xác định trình tự gen phyC mã hóa phytaza của vi
khuẩn B. subtilis. Đây là gen mã hóa phytaza đầu tiên đợc phân lập
và xác định trình tự từ vi khuẩn B. subtilis đợc phân lập ở Việt Nam.
Trình tự của gen này đã đợc đăng ký trong Ngân hàng trình tự gen
Quốc tế.
9 Lần đầu tiên trong điều kiện Việt Nam đã biểu hiện thành công gen
phyC mã hóa phytaza từ B. subtilis trong vi khuẩn Escherichia coli.
9 Đã làm sáng tỏ đợc một số tính chất của phytaza tự nhiên từ chủng
B. subtilis và PhyC tái tổ hợp, từ đó giúp cho các cơ sở sản xuất ứng
dụng phytaza của B. subtilis một cách đúng đắn trong chăn nuôi.


3

5 Bố cục của luận án
Luận án gồm 137 trang, 16 bảng và 28 hình; Mở đầu (2 trang);
Chơng 1. Tổng quan tài liệu (34 trang); Chơng 2. Đối tợng và phơng
pháp nghiên cứu (16 trang); chơng 3. Kết quả và bàn luận (58 trang);
Kết luận và kiến nghị (2 trang); Tài liệu tham khảo (9 tài liệu tiếng Việt;
149 tài liệu tiếng Anh); Phụ lục (4 trang).
Chơng 1- Tổng quan ti liệu
1.1 Những nghiên cứu về axit phytic
Axit phytic là một axit hữu cơ, phân tử của nó có chứa các gốc
photphat, tồn tại chủ yếu trong các loại ngũ cốc và hạt có dầu và chúng
đợc xem nh là kho dự trữ photpho lớn trong các hạt thực vật (Lolas et
al 1997)
Một đặc tính bất lợi nhất của axit phytic đối với cơ thể động vật là
hiệu ứng kháng dinh dỡng Pallauf và Rimbach (1996). Hiệu ứng này
tạo nên do cấu trúc bất thờng của axit phytic. Khi phân tử axit phytic ở
dạng phân ly hoàn toàn, 6 nhóm photphat của chúng sẽ mang tổng điện
tích âm 12. Vì vậy, chúng có nhiều khả năng kết hợp với các ion dơng
hóa trị 1, 2, 3 hoặc hỗn hợp của các ion đó, hình thành nên các hợp chất
không hoà tan, rất khó tiêu hóa. Sự hình thành các hợp chất vô cơ không
tan trong đờng ruột đã ngăn cản sự hấp thụ các khoáng chất của cơ thể
động vật. Axit phytic khi kết hợp với các ion kim loại nh Fe
3+
, Mg
2+
,
Ca
2+
, Zn
2+
sẽ ngăn cản khả năng kết hợp của các ion kim loại này với

các axit béo không no làm giảm khả năng tiêu hóa thức ăn của động vật
và giảm giá trị dinh dỡng của nguồn thức ăn (Lei et al., 1993). Ngoài
ra, axit phytic còn tác động đến một số enzym nh tripsin, pepsin, -
amylaza, -galactosidaza và kết quả là làm giảm hoạt tính của các enzym
tiêu hóa quan trọng này (Inagawa et al., 1987).
1.2 Những nghiên cứu về phytaza
Phytaza là một enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân axit phytic
thành các myo - inositol photphat phân tử thấp và các monophotphat vô

4
cơ. Khi phản ứng thủy phân xảy ra hoàn toàn sẽ giải phóng toàn bộ các gốc
photphat trong phân tử axit phytic và tạo thành các myo - inositol tự do.
Phytaza có tên gọi đầy đủ, theo quy ớc quốc tế là: myo - inositol
hexan photphat photphohydrolaza. Mullaney và Ullah (2003) đã chia
phytaza thành 3 nhóm dựa trên cơ sở cấu trúc và các đặc tính xúc tác
khác nhau của nó, bao gồm các nhóm photphataza axit histidin (HAP),
photphataza axit tía (PAP), phytaza -propeller (BPP). Phytaza thuộc
nhóm HAP thờng có mặt ở nấm mốc, E. coli, ở một số loài thực vật và
chuột. Chúng cùng có một trình tự hoạt động bảo thủ là RHGXRXP,
đồng nhất đối với các enzym thuộc nhóm này. Phytaza thuộc nhóm PAP
đợc biết là metalophotphoesteraza, có mặt chủ yếu ở rễ thực vật để
giúp cho thực vật lấy đợc nguồn photpho trong đất, đáp ứng lại một
cách bình thờng đối với tình trạng thiếu photpho. Phytaza thuộc nhóm
BPP chỉ có ở vi khuẩn thuộc chi Bacillus. Chúng có tính đặc hiệu cơ chất
nhất, bền nhiệt và chỉ hoạt động ở pH trung tính (Kerovuo et al., 2000,
Oh et al., 2001,Tye et al., 2002).
Chơng 2 - vật liệu v phơng pháp nghiên cứu
2.1 Vật liệu nghiên cứu
226 mẫu đất và phân động vật lấy từ các cánh đồng trồng ngô, lúa
và khu chăn nuôi tại một số tỉnh miền Bắc. Chủng E. coli DH5, chủng

E. coli BL21, vectơ tách dòng pCR2.1, vectơ biểu hiện pET22b(+).
Các hóa chất sử dụng đều có độ tinh sạch (PA) và đợc mua từ các
hãng có uy tín nh: Merck, In vitrogen, Sigma
2.3 Các phơng pháp nghiên cứu:
Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh phytaza theo phơng pháp của
Shimizu (1992) có cải tiến; Định loại vi khuẩn sinh phytaza dựa vào các
đặc điểm hình thái và tính chất sinh lý, sinh hóa theo Bergey (1986).
Nhân bản và xác định trình tự gen ARN 16S của chủng vi khuẩn nghiên
cứu bằng kỹ thuật sinh học phân tử theo (Weisburg et al, 1991). Xác
định hoạt độ phytaza theo phơng pháp của Shimizu (1992). Tối
u hoá
sinh tổnghợp phytaza bằng phơng pháp quy hoạch thực nghiệm. Xác

5
định sinh khối protein theo (Vats et al., 2004). Xác định hàm lợng
protein theo phơng pháp của Bradfort (1976). Nhân bản, xác định trình
tự gen phyC và biểu hiện gen theo phơng pháp (Sambrook et al, 2001).
Xác định tính chất của phytaza theo phơng pháp của Shimizu (1992).
Chơng 3 - Kết quả v bn luận
3.1 Phân lập và định loại vi khuẩn sinh phytaza
3.1.1 Phân lập vi khuẩn sinh phytaza ngoại bào
Từ 226 mẫu đất và phân động vật lấy ở một số địa điểm khác nhau,
chúng tôi đã phân lập đợc 27 chủng vi khuẩn có khả năng sinh phytaza
và có hình thái khuẩn lạc giống chi Bacillus. Trong đó, số chủng vi
khuẩn có khả năng sinh phytaza ở các mẫu đất gần khu chăn nuôi gia
cầm là lớn nhất, tiếp theo là mẫu đất trồng lúa. Các mẫu lấy từ đất gần
chuồng trâu bò và phân của gia cầm có số lợng chủng vi khuẩn sinh
phytaza phân lập đợc là thấp nhất. Điều này có thể lý giải rằng các
động vật dạ dày đơn nh lợn, gia cầm đã không chuyển hóa hết đợc
lợng axit phytic có trong thức ăn, chính lợng axit phytic thừa này theo

phân của chúng thải ra ngoài môi trờng làm chất cảm ứng cho sinh tổng
hợp phytaza. Nhng cũng chính nồng độ axit phytic quá cao trong phân
gia cầm cùng một số chất ức chế khác có thể là nguyên nhân khiến cho
số lợng vi khuẩn sinh phytaza phân lập từ nguồn này là thấp nhất. Theo
một số tác giả đã công bố, hầu hết các chủng vi khuẩn có khả năng sinh
phytaza ngoại bào mạnh đều đợc phân lập từ các mẫu đất trồng lúa, từ
các sản phẩm đậu tơng lên men truyền thống và đất gần khu chăn nuôi
[Kim et al., 1998, Powar và Jagannathan (1982), Shimizu (1992)].
Các
kết quả nghiên cứu của chúng tôi khi phân lập đợc các chủng chủ yếu ở
đất gần khu chăn nuôi gia cầm là hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu
nêu trên.
3.1.2 Sàng lọc và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh
phytaza cao
Để có thể dễ dàng tuyển chọn đợc chủng vi khuẩn sinh phytaza
cao, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc định tính dựa vào vòng phân giải
canxi phytat trên thạch đĩa. Kết quả chúng tôi đã thu đợc 4 chủng với

6
đờng kính vòng thủy phân nhỏ hơn 0,5 cm, 7 chủng có đờng kính
vòng thủy phân lớn hơn 0,5 cm và 1 chủng có đờng kính vòng thủy
phân lớn hơn 1 cm. Hoạt độ phytaza của các chủng vi khuẩn đợc xác
định theo phơng pháp của Shimizu (1992). Kết quả 2 chủng B1 và B178
cho hoạt độ phytaza cao hơn các chủng khác. Hoạt độ phytaza do chủng
B1 sinh ra là 0,135 U/ml và chủng B178 đạt 0,115 U/ml. Trong đó chủng
B1 đợc phân lập từ đất trồng lúa và chủng B178 thu đợc từ đất gần khu
chăn nuôi gia cầm.
3.1.3 Đặc điểm sinh học và phân loại của vi khuẩn sinh phytaza
Sau khi quan sát hình thái khuẩn lạc và các phản ứng sinh lý, sinh
hóa của 7 chủng vi khuẩn phân lập dựa theo khóa phân loại của Bergey

(1986), chúng tôi nhận thấy chủng vi khuẩn B1 có các đặc điểm hình
thái và sinh lý, sinh hóa giống với đặc điểm của loài B. subtilis.
Để khẳng định chắc chắn chủng B1 trên là B. subtilis, chúng tôi
cũng đã xác định một đoạn gen mã hóa ARNr 16S của chủng này. Kết
quả gen ARNr 16S của chủng B1 có độ tơng đồng về nucleotit đến
99,37% so với 4 chủng B. subtilis đã công bố, trong đó có chủng vi
khuẩn B. subtilis 168- chủng chuẩn. Từ những kết quả trên chúng tôi
khẳng định chủng B1 chính xác là loài B. subtilis.
3.2 Nghiên cứu thu nhận phytaza từ chủng B. subtilis B1
3.2.1 ảnh hởng của các yếu tố môi trờng và tỷ lệ giống
Để có thể thu nhận đợc một lợng lớn phytaza phục vụ cho xác
định tính chất và làm tiền đề cho sản xuất phytaza sau này, chúng tôi đã
nghiên cứu một số yếu tố ảnh hởng đến quá trình sinh tổng hợp phytaza
từ chủng vi khuẩn B. subtilis B1 nh nguồn cacbon, nitơ và tỷ lệ giống
đa vào lên men. Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn B. subtilis B1 có thể sử
dụng một số phế phụ phẩm nông nghiệp làm nguồn cacbon để sinh tổng
hợp phytaza. ở môi trờng có chứa cám gạo, hoạt độ phytaza đợc tạo ra
đạt 0,101 U/ml. Ngoài ra, khi khảo sát ảnh hởng của nguồn nitơ đến khả
năng sinh tổng hợp phytaza, chúng tôi nhận thấy hoạt độ phytaza thu đợc
cao nhất (1,34 U/ml) khi nuôi cấy chủng B. subtilis B1 trong môi trờng
chứa NH
4
NO
3
và cazein với nồng độ 0,4 và 10 g/l. Điều này cũng phù hợp

7
với kết quả nghiên cứu của (Kerovue et al. 1998) khi lên men sản xuất
phytaza từ chủng B. subtilis VTTE-68013, Powar và Jagannathan khi
nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp phytaza từ chủng B. subtilis 2712. Bên

cạnh các thành phần dinh dỡng ảnh hởng đến khả năng sinh tổng hợp
của phytaza thì tỷ lệ giống và chất lợng giống cũng là một yếu tố quan
trọng cho sản xuất enzym này. Lợng giống thích hợp để thu nhận
phytaza là 7,5%.
3.2.2 Tối u hóa quá trình sinh tổng hợp phytaza
Mục đích của quá trình này là tìm đợc các yếu tố ảnh hởng nhiều
nhất đến sinh tổng hợp phytaza mà tại đó quá trình sinh tổng hợp đạt cao
nhất.
Kết quả tối u hóa môi trờng sinh tổng hợp phytaza từ chủng B.
subtilis B1 cho thấy hoạt độ phytaza đạt cao nhất là 0,147 U/ml khi nuôi
cấy trên môi trờng có chứa cám gạo với lợng 90 g/l và nồng độ cazein
là 11 g/l. Nhng khi so sánh với hoạt độ phytaza tạo ra trong môi trờng
có chứa cám gạo với lợng 80 g/l, nồng độ cazein là 9 g/l (0,135 U/ml) đã
cho thấy mặc dù sử dụng nhiều cazein hơn khoảng 22% mà hoạt độ
phytaza tăng lên không đáng kể, chỉ khoảng 8,8%. Do vậy, chúng tôi chọn
môi trờng tối u cho sinh tổng hợp phytaza từ chủng B. subtilis B1 có
thành phần nh sau (g/l): Cám gạo 80; cazein 9; CaCl
2,
2; KH
2
PO
4
0,5;
K
2
HPO
4
0,4; NH
4
NO

3
0,4; MgSO
4
.7H
2
O 0,2. Lợng giống đa vào lên
men thích hợp nhất là 8,5%.
3.2.3 Động học của quá trình sinh tổng hợp phytaza từ chủng B.
subtilis B1
Chủng B. subtilis B1 đợc nuôi cấy trên môi trờng tối u và trong
quá trình lên men, mẫu đợc lấy 8 giờ một lần, bắt đầu từ giờ thứ 6 để xác
định hoạt độ phytaza.
Kết quả cho thấy ở các giờ đầu tiên sinh khối của chủng B. subtilis
B1 tăng chậm, nhng từ giờ thứ 26 trở đi sinh khối của chúng tăng mạnh
và đạt cực đại ở giờ thứ 50. Sự sinh tổng hợp phytaza cũng tăng dần từ
giờ thứ 6 và đạt cao nhất ở giờ lên men thứ 74 (0,136 U/ml). Sau đó hoạt
độ phytaza đợc sinh ra lại giảm khi thời gian lên men vợt quá 74 giờ.

8
Chúng tôi cho rằng ở giai đoạn này lợng chất cảm ứng là axit phytic
trong môi trờng đã cạn kiệt, bên cạnh đó ở thời điểm này sự sinh trởng
của tế bào đã bắt đầu chững lại cho nên đã làm giảm hoạt độ phytaza
trong dịch lên men.
3.2.4 Xác định khối lợng phân tử và hàm lợng phytaza của chủng
B. subtilis B1
Chúng tôi tiến hành điện di SDS-PAGE và thử hoạt tính phytaza
bằng phơng pháp điện di không biến tính NATIVE-PAGE. Dịch enzym
thô từ môi trờng không đợc xử lý biến tính để chạy điện di. Sau khi
điện di, phần gel dùng để thử hoạt tính đợc rửa lại bằng nớc, đệm v
đợc ép lên môi trờng thạch có chứa cơ chất của phytaza để quan sát

xem băng nào có hoạt tính. Việc xuất hiện vòng trong mờ trên nền thạch
có bổ sung cơ chất chứng tỏ rằng băng tơng ứng là phytaza.











Kết quả ở đờng chạy 3 trên hình 3.7 cho thấy xuất hiện một băng
duy nhất có hoạt tính phytaza với khối lợng khoảng 43 kDa. Khối lợng
này tơng đơng với khối lợng của phytaza đợc tách ra từ chủng B.
subtilis VTTE-68013 (Kerovuo et al., 1998). Trong khi đó phytaza ngoại
bào từ chủng B. subtilis (natto) N-77 đợc thông báo có khối lợng là 36
kDa, Shimizu (1992). Khối lợng của phytaza ngoại bào của chủng
Bacillus sp. DS11 là 45 kDa (Kim et al
., 1998).
Hình 3.7. SDS - PAGE và NATIVE - PAGE
phytaza từ chủng B. subtilis B1
SDS - PAGE Đờng chạy 1. Protein chuẩn;
2. Dịch phytaza thô;
NATIVE - PAGE 3. Băng hoạt tính của phytaza


1 2 3
kDa

116
66

45
35
25
18,4
14,4
PhyC

9
Điều đó cho thấy rằng phytaza từ B. subtilis B1 là enzym một cấu
tử. Kết luận này phù hợp với kết quả nghiên cứu về phytaza từ chi
Bacillus đã đợc một số tác giả công bố.
Lợng phytaza tự nhiên thu đợc sau khi lên men chủng B. subtilis
B1 trên môi trờng tối u có hàm lợng đạt xấp xỉ 6 mg/lít.
3.3 Nghiên cứu tách chiết phytaza từ dịch lên men
Với mục đích nghiên cứu thu nhận phytaza thô để xác định tính
chất và làm tiền đề cho sản xuất sau này chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy
chủng vi khuẩn B. subtilis B1 trên môi trờng tối u. Sau 74 giờ lên men,
ly tâm loại bỏ xác tế bào thu dịch nổi có chứa enzym thô. Dịch enzym
thô từ chủng B. subtilis B1 này đợc kết tủa bằng 3 thể tích cồn đã thu
đợc phytaza có hoạt độ riêng là 0,86 U/mg và sạch gấp 2 lần so với dịch
thô ban đầu (Bảng 3.8).
Bảng 3.8. Khảo sát độ tinh sạch của phytaza từ chủng B. subtilis B1

Các
bớc
làm sạc

h
Tổng th
ể
tích (ml)
Hoạt độ
tổng (U)
Protein
tổng
số (mg)
Hoạt độ
riêng
(U.mg)
Mức độ
tinh sạc
h
(lần)
Hiệu
suất
thu hồi
(%)
Dịch thô 200 24,2 60,32 0,40 1 100
Sau tủa
bằng cồ
n
20 19,5 22,43 0,86 2,15 80

3.3 Nghiên cứu các đặc tính lý hóa của phytaza thô
Việc sử dụng phytaza trong chăn nuôi cần đòi hỏi enzym này có
một số tính chất nh: phải chịu đợc nhiệt độ cao và chịu đợc pH trong
quá trình tiêu hóa thức ăn của động vật. Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến

hành khảo sát một số yếu tố ảnh hởng đến hoạt động của enzym thô
này nh là pH, nhiệt độ và độ bền của chúng ở các dải pH, nhiệt độ khác
nhau. Bên cạnh đó cũng tiến hành kiểm tra khả năng bền của phytaza
này với một số enzym quan trọng của đờng tiêu hóa nh pepsin và
tripsin.


10
3.4.1 ảnh hởng của pH đến hoạt độ và độ bền của phyaza thô
Phytaza thô đợc sinh tổng hợp bởi chủng vi khuẩn B. subtilis B1
cho hoạt độ cao ở phổ pH từ 5,5 đến 6,5 trong điều kiện hỗn hợp phản
ứng không có CaCl
2
. Khi bổ sung CaCl
2
1 mM vào hỗn hợp phản ứng,
enzym này cho hoạt độ cao nhất ở pH = 6,5. Điều đó có thể thấy rằng
enzym này hoạt động tốt ở pH trung tính, khi ở pH quá axit hoặc quá
kiềm thì hoạt tính enzym giảm mạnh. pH này rất thích hợp với hoạt động
của phytaza trong ruột non (pH gần trung tính), nơi mà sự hấp phụ
photphat đợc tiến hành. Ngoài ra phytaza thô này tơng đối bền giữa
pH = 6 và pH = 7,5. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với công bố
của các tác giả (Kerovuo et al., 1998; Kim et al., 1998)
khi cho rằng
phytaza của chi Bacillus có pH tối u ở 6,5 và 7,5.


a)
0
20

40
60
80
100
120
3456789
pH
Ho
ạ
t đ
ộ

p
h
y
taza t ơn
g
đối
(
%
)
Không có CaCl2
CaCl2 1 mM
b)
0
20
40
60
80
100

120
0 20406080
Thời gian (phút)
Ho
ạ
t đ
ộ

p
h
y
taza cò n l
ạ
i
(
%
)
3.5
4.5
5.5
6.5
7.5
8.5

Hình 3.8. ảnh hởng của pH đến hoạt độ và độ bền của phytaza
a) ảnh hởng của pH đến hoạt độ của phytaza
b) ảnh hởng của pH đến độ bền của phytaza

3.4.2 ảnh hởng của nhiệt độ đến hoạt độ và độ bền của phytaza thô
Hoạt độ phytaza thô tăng dần ở nhiệt độ từ 30 đến 50C và đạt giá

trị cao nhất ở 50C. Hoạt độ enzym bắt đầu giảm dần trong khoảng nhiệt
độ từ 55 đến 70
o
C.

11
Nhìn chung tính bền nhiệt của phytaza thô từ chủng B. subtilis B1
phụ thuộc rất lớn vào nồng độ ion canxi có mặt trong dịch enzym. Khi
không có mặt ion Ca
2+
nhiệt độ tối u cho enzym này hoạt động là 40
o
C.
Ngợc lại, khi bổ sung CaCl
2
1 mM vào dịch đệm natri axetat nhiệt độ
tối u của phytaza này tăng lên 50
o
C. Hoạt độ của enzym vẫn còn
khoảng 83,6% sau khi ủ ở 60
o
C trong 20 phút. Điều nay cũng phù hợp
với công bố của tác giả Kim et al., 1998, ông cho rằng khi có mặt
CaCl
2
với nồng độ 5 mM thì phytaza của Bacillus sp DS11 vẫn còn
khoảng 50% sau khi ủ ở 90
o
C trong 10 phút.

0
20
40
60
80
10 0
12 0
30 40 50 60 70 80
Nhiệt độ (0C)
Hoạt độ t ơng đối (%)
Không có CaCl2
CaCL2 1mM
a)
0
20
40
60
80
100
120
0 1020 304050
Thời gian (phút)
Ho
ạ
t đ
ộ

p
h
y

taz a c ò n l
ạ
i
(
%
)
30
40
50
60
70
80
b)

Hình 3.9. ảnh hởng của nhiệt độ đến hoạt độ của phytaza
a) ảnh hởng của nhiệt độ đến hoạt độ của phytaza
b) ảnh hởng của nhiệt độ đến độ bền của phytaza
3.4.3 ảnh hởng của pepsin và tripsin đến độ bền của phytaza thô
Phytaza từ chủng B. subtilis B1 không bị tác động bởi tripsin, bởi vì
dù có mặt tripsin ở nồng độ 0,1% và cao hơn là 1% (w/w) thì hàm lợng
photpho vô cơ đợc giải phóng ra vẫn nh nhau.
Còn ngợc lại phytaza bị bất hoạt bởi pepsin có thể là do phytaza
đã bị biến tính ở pH thấp dẫn đến nhạy cảm với pepsin vì khi ở pH thấp
phytaza cũng đã bị ảnh hởng rất lớn. Kết quả này phù hợp với kết luận
Kerovuo et al ., 1998 khi cho rằng phytaza của Bacillus bền với papain,
pancreatin và tripsin, nhng lại bị bất hoạt bởi pepsin ở pH thấp .


12
3.5 Phân lập gen phyC mã hóa phytaza từ vi khuẩn B. subtilis B1

Hầu hết các vi sinh vật tự nhiên đều cho hoạt tính phytaza thấp, vì
vậy dẫn đến giá thành enzym cao. Để giảm giá thành phytaza việc tạo
các chủng tái tổ hợp cho sản lợng phytaza cao gấp nhiều lần so với các
chủng tự nhiên là việc làm hết sức cần thiết.
Với mục đích tạo chủng tái tổ hợp, trớc tiên chúng tôi nhân đoạn
gen phyC mã hóa cho phytaza từ chủng B. subtilis B1 bằng kỹ thuật PCR
với hai cặp mồi PhyCP
6
, PhyCM
17
và PhyCPT, PhyCMT và ADN hệ gen
của chủng vi khuẩn B. subtilis B1. Sau đó sản phẩm PCR (Hình 3.12)
đợc đa trực tiếp vào vectơ tách dòng pCR2.1 và biến nạp vào E. coli
chủng DH5. Phơng thức kiểm tra các dòng mang plasmit tái tổ hợp là
ngẫu nhiên và có sử dụng sản phẩm PCR ban đầu để kiểm chứng. Trên
hình 3.13 cho thấy các mẫu plasmit sau khi đợc xử lý bằng EcoR I xuất
hiện 3 băng, 1 băng tơng ứng với kích thớc của vectơ pCR2.1 (3,9 kb),
1 băng có kích thớc bằng sản phẩm PCR (1209 bp) và băng còn lại có
kích thớc khoảng 600 bp. Bên cạnh đó kết quả cắt sản phẩm PCR bằng
enzym trên cũng thu đợc hai băng có kích thớc khoảng 1200 bp và
600 bp. Vì vậy chúng tôi cho rằng ở giữa gen có thể chứa một vị trí cắt
của EcoR I.

1 2 3 4 5 6 7 1 2

kb




5,14
1,37
0,55

kb
10
6



1
0,5
0,25
1,2
Hình 3.12. Sản phẩm PCR trên gel
agaroza 0,8%
Đờng chạy 1. Chỉ thị phân tử 1 kb;
2. Sản phẩm PCR

Hình 3.13. Sản phẩm pCRphyC
Sau khi đợc xử lý bằng EcoR I
Đờng chạy 1. ADN / EcoR I + Hind III;
2. Sản phẩm PCR;
3 - 4; 6 -7. pCRphyC / EcoR I;
5. Sản
p
hẩm PCR
/

E
coR I


1,2


0,6

13

Trình tự gen phyC đợc xác định theo phơng pháp của Sanger &
đtg. Sau khi xử lý bằng chơng trình PC GENE, chúng tôi đã nhận đợc
trình tự của gen phyC hoàn chỉnh (Hình 3.14).
gaagtgcacgttcataaaaggaggatggaaa
atgaatcattcaaaaacacttttgttaaccgcggcagccggattgatgctcacatgcggt
M N H S K T L L L T A A A G L M L T C G
Peptit tín hiệu của phyC
gcggtttcttcccaggccaaacataagctgtctgatccttatcattttaccgtgaatgcg

A V S S Q A K H K L S D P Y H F T V N A
gcggcggaaacggagccggttgatacagccggtgatgcagctgatgatcctgcgatttgg
A A E T E P V D T A G D A A D D P A I W
ctggaccccaagaatcctcagaacagcaaattgatcacaaccaataaaaaatcaggctta
L D P K N P Q N S K L I T T N K K S G L
gccgtgtacagcctagagggaaagatgcttcattcctatcataccgggaagctgaacaat
A V Y S L E G K M L H S Y H T G K L N N
gttgatatccgttatgattttccgttgaacggaaaaaaagtcgatattgcggcggcatcc
V D I R Y D F P L N G K K V D I A A A S
aatcggtctgaaggaaagaataccattgagatttacgccattgacgggaaaaacggcaca
N R S E G K N T I E I Y A I D G K N G T
ttacaaagcattacggatccaaaccgcccgattgcatcagcaattgatgaagtatacggt
L Q S I T D P N R P I A S A I D E V Y G
ttcagcttgtaccgcagtcaaaaaacaggaaaatattacgcgatggtgacagggaaagaa
F S L Y R S Q K T G K Y Y A M V T G K E
ggcgaatttgaacaatacgaattaaatgcggataaaaatggatacatatccggcaaaaag
G E F E Q Y E L N A D K N G Y I S G K K
gtaagggcgtttaaaatgaattctcanacagaagggatggcagcaaacgatgaatacggc
V R A F K M N S X T E G M A A N D E Y G
agtctttttatcgcaaaagaagatgaggccatctggaagttcagcgctgagccggacggc
S L F I A K E D E A I W K F S A E P D G
ggcagtaacggaacggttatcgatcgtgccgatggcaggcatttaacccctgatattgaa
G S N G T V I D R A D G R H L T P D I E
ggactgacgatttactacgctgctgacgggaaaggttatctgcttgcctcaagccagggt
G L T I Y Y A A D G K G Y L L A S S Q G
aacagcagctacgcgatttatgaaagacagggacagaacaaatatgttgcggactttcag
N S S Y A I Y E R Q G Q N K Y V A D F Q
ataacagacgggcctgaaacagacggcacaagcgatacagacggaattgacgttctgggt
I T D G P E T D G T S D T D G I D V L G
ttcgggctggggcctgagtatccgttcggcctttttgtcgcacaggacggagagaatata

F G L G P E Y P F G L F V A Q D G E N I
gatcacggccaaaaggccaatcaaaattttaaaatggtgccatgggaaagaatcgctgat
D H G Q K A N Q N F K M V P W E R I A D
aaaatcggctttcatccgcaggtcaataaacaggttgacccgagaaaactgactgacaga
K I G F H P Q V N K Q V D P R K L T D R
agcggaaaataaacatgaaaaaagcagcttatccaagc
S G K *
Hình 3.14. Trình tự gen phyC mã hóa phytaza của chủng B. subtilis B1
Kết quả phân tích trình tự trên cho thấy đoạn gen thu đợc có kích
thớc là 1209 nucleotit với bộ ba mở đầu là ATG và bộ ba kết thúc là
TAA mã hóa cho một protein chứa 383 axit amin với khối lợng phân tử
khoảng 41,9 kDa. Trong đó 26 axit amin đầu N chịu trách nhiệm cho việc
tiết protein. Vị trí cắt của tín hiệu tiết tự nhiên này nằm ở giữa axit amin
thứ 26 và 27 (SGA-KHK). Số lợng axit amin trong trình tự tiết và vị trí
cắt này cũng giống với gen phyC của chủng B. subtilis VTTE-68013
(Kerovuo et al., 1998). Trong khi đó trình tự tín hiệu của gen phyC từ
chủng Bacillus sp. DS11 lại gồm 30 axit amin và vị trí trí cắt nằm giữa
axit amin Leu-30 và Ser-31 (Kim et al., 1998).

14
Vị trí bám của riboxom gồm trình tự SD có chứa trình tự GGAGG
nằm phía trớc mã mở đầu và đợc ngăn cách bởi 6 cặp bazơ. Ngoài ra,
cũng giống nh các PhyC từ chi Bacillus, PhyC từ chủng B. subtilis B1
khác biệt với nấm mốc về khối lợng phân tử cũng nh độ tơng đồng về
trình tự axit amin (Kerovuo et al., 1998; Kim et al., 1998).
Trình tự
bảo thủ RHGXRXP thờng đợc thấy trong hầu hết các PhyA của nấm
mốc lại không có mặt trong PhyC của chủng B1 này.
Gen phyC phân lập từ chủng B. subtilis B1 của Việt Nam và trình
tự axit amin suy diễn của gen này đợc so sánh với một số gen phyC và

phyL mã hóa cho phytaza của vi khuẩn thuộc chi Bacillus trên ngân hàng
gen Quốc tế. Kết quả cho thấy nó có độ tơng đồng cao nhất đối với gen
phyC của chủng Bacillus sp. DS11, đạt 98% và thấp nhất so với trình tự
nucleotit của gen phyC từ chủng B. subtilis VTTE-68013, đạt 91%. Khi
đối chiếu trình tự axit amin suy diễn của gen phyC từ chủng B. subtilis
B1 với trình tự axit amin suy diễn từ gen phyC của chủng Bacillus sp
DS11 cũng cho thấy mức độ tơng đồng rất cao đạt 98%. Điều đó chứng
tỏ những đột biến trên trình tự nucleotit của gen là những đột biến vô
nghĩa, do đó không gây ra thay đổi đối với sản phẩm của gen ở mức độ
axit amin.
Kết quả phân tích về tơng quan phát sinh chủng loại cho thấy gen
phyC của chủng B. subtilis B1 thuộc nhóm gen mã hóa phytaza từ các
chủng Bacillus sp. DS11 và B. amyloliquefaciens FZB45. Mối quan hệ
giữa các trình tự axit amin của phytaza từ chủng B. subtilis B1 và một số
phytaza từ các chủng B. subtilis khác cũng cho thấy PhyC của chủng B1
có độ tơng đồng cao đạt 98% so với PhyC của chủng Bacillus sp. DS11
và khác xa so với PhyC của chủng B. subtilis VTTE-68013 độ tơng
đồng chỉ đạt 92%.
3.6 Biểu hiện gen phyC trong vi khuẩn E. coli
Với mục đích nghiên cứu tính chất và tạo ra một lợng lớn phytaza
để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, chúng tôi đã đa gen phyC phân lập từ
vi khuẩn B. subtilis B1vào biểu hiện trong E. coli bằng vectơ pET 22b
(+). Lý do chọn vectơ này vì nó có trình tự tín hiệu tiết ra ngoài khoang
chu chất và đợc thiết kế sẵn đuôi polyhistidin giúp cho quá trình tinh
sạch protein tái tổ hợp qua cột sắc ký ái lực đợc dễ dàng.

15
Chúng tôi đã gắn đoạn gen phyC vào vectơ đã mở vòng rồi chọn
vectơ tái tổ hợp. Vectơ này đợc đặt tên là pETphyC đợc biến nạp vào
tế bào E. coli chủng BL21 (DE3) và biểu hiện protein trong môi trờng

nuôi cấy có bổ sung IPTG 1 mM làm chất cảm ứng. Kết quả gen phyC
đã biểu hiện tốt dới sự điều khiển của promotơ T7 đợc cảm ứng bởi
IPTG có mặt trong môi trờng (Hình 3.19) .










3.6.1 Kiểm tra tính tan của PhyC tái tổ hợp
Hầu hết các enzym chỉ thể hiện hoạt tính của mình khi ở dạng tan.
Tuy nhiên, các enzym nói chung và phytaza nói riêng đợc tổng hợp bởi
hệ biểu hiện E. coli thờng tồn tại một số vấn đề nh không tạo cấu trúc
đúng nh trong tự nhiên và các protein đợc biểu hiện cao thờng ở dạng
không tan. Chính vì vậy việc tiến hành kiểm tra tính tan của PhyC tái tổ
hợp là cần thiết.









kDa

116
66
45
35
25

18,4

14,4


1 2 3
Hình 3.20. Kiểm tra tính tan của PhyC tái tổ
hợp trên gel polyacrylamit
Đờng chạy 1. Protein chuẩn; 2. Phytaza dạng tan;
3. Phytaza không tan
PhyC
kDa

116

66

45

35
25

Hình 3.19. Kiểm tra sự biểu hiện gen
phyC trên gel polyacrylamit 12,5%
Đờng chạy 1. Dòng tế bào mang gen
phyC nuôi cấy trong điều kiện không
cảm ứng; 2. Protein chuẩn; 3 - 9. Dòng tế
bào mang gen phyC nuôi cấy trong điều
ki
ệ
n cảm ứn
g
bằn
g
IPTG 1 mM
1 2 3 4 5 6 7 8 9
PhyC

16


Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra khả năng tan của PhyC tái tổ hợp
bằng cách so sánh giữa pha tan và pha không tan của enzym này trong
cùng một lần biểu hiện. Kết quả hình 3.20 cho thấy PhyC tái tổ hợp ở
dạng tan chiếm khoảng 40% trong tổng số phytaza thu đợc.
3.6.2 Khảo sát các điều kiện nuôi cấy nhằm nâng cao khả năng biểu
hiện gen phyC của E. coli tái tổ hợp
Nhiệt độ nuôi cấy
Kết quả thực nghiệm cho thấy nhiệt độ cũng đã ảnh hởng lớn đến
khả năng biểu hiện PhyC tái tổ hợp (Hình 3.22). ở 22
o
C, lợng phytaza

thu đợc sau 4 giờ nuôi cấy không cao, điều này có thể là do nhiệt độ
trên không thích hợp với sự sinh trởng và phát triển của E. coli cho nên
lợng protein tái tổ hợp đợc sản xuất ra thấp. Trong khi đó ở dải nhiệt
độ biểu hiện từ 28 - 37
o
C, lợng protein đợc sinh tổng hợp với hàm
lợng cao hơn hẳn so với ở 22
o
C. Nhng theo tác giả Goedel (1991)
nhiệt độ tối u cho sinh trởng của E. coli là 37
o
C lại không phải là điều
kiện tối u tạo sản phẩm. Ngoài ra, 37
o
C là nhiệt độ thích hợp đối với sự
hoạt động của rất nhiều enzym, đặc biệt là proteaza, enzym này có khả
năng phân cắt protein tái tổ hợp. Trong một số bài báo đề cập đến các
điều kiện biểu hiện phytaza thì đều công bố 30
o
C là nhiệt độ thích hợp
nhất cho E. coli biểu hiện phytaza (Kerovuo et al., 1998, Kim et al
1998). Chính vì vậy, chúng tôi cũng đã chọn 30
o
C làm nhiệt độ thích hợp
để biểu hiện PhyC tái tổ hợp.

Hình 3.22. ảnh hởng của nhiệt độ nuôi
cấy đến khả năng biểu hiện của PhyC
tái tổ hợp
Đờng chạy 1. Protein chuẩn ; 2. Phytaza
đợc tổng hợp trong môi trờng không
cảm ứng ;
3 - 6. Phytaza đợc tổng hợp ở các nhiệt độ
22, 28, 30 và 37
o
C trong môi trờng cảm
ứng
kDa
116
66
45
35
25

18,4

14,4

1 2 3 4 5 6
PhyC

17

ảnh hởng của IPTG
Bên cạnh yếu tố nhiệt độ ảnh hởng đến sự biểu hiện phytaza của
chủng tái tổ hợp, chất cảm ứng cũng tác động trực tiếp đến khả năng sinh
tổng hợp enzym này. IPTG là chất cảm ứng đối với promotơ T7 lac.
Promotơ này điều khiển trực tiếp quá trình biểu hiện gen phyC. Theo một
số tác giả, nồng độ IPTG dùng để cảm ứng biểu hiện PhyC tái tổ hợp
trong E. coli là 1 mM, 1,5 mM (Kim et al., 1998, Miksch et al., 2002)
Zinin et al., 2004). Nhng IPTG có giá thành rất cao nên việc khảo sát để
tìm ra nồng độ IPTG thích hợp nhằm giảm chi phí sản xuất là điều rất cần
thiết. Chính vì vậy, chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hởng của dải nồng độ
IPTG từ 0 - 2000 M đến lợng phytaza đợc tạo thành.










Kết quả khảo sát chỉ ra rằng ở mẫu không cảm ứng và cảm ứng với
nồng độ IPTG là 10 M, lợng sinh khối tế bào cao nhng phytaza đợc
tổng hợp ra lại rất thấp. Điều này đợc giải thích là do chất cảm ứng IPTG
ở nồng độ 10 M không đủ để kích hoạt promotơ T7 lac nên chủng biểu
hiện vẫn sinh trởng, phát triển bình thờng. Ngợc lại, ở các mẫu đợc
cảm ứng với nồng độ IPTG cao hơn từ 100 M đến 2000 M, thì lợng
PhyC tái tổ hợp thu đợc nhiều hơn và sinh khối tế bào ít hơn. Điều này
xảy ra có thể là do promotơ T7 lac bị cảm ứng nên từ đó tế bào tập trung
vào quá trình biểu hiện PhyC tái tổ hợp nhiều hơn là sinh trởng. Lợng

PhyC tái tổ hợp thu đ
ợc sau khi cảm ứng bằng IPTG ở nồng độ 100 M
tơng đơng lợng enzym này thu đợc khi cảm ứng ở các nồng độ cao
Hình 3.23. ảnh hởng của IPTG đến
khả năng biểu hiện PhyC tái tổ hợp
Đờng chạy 1 - 6. Phytaza đợc tổng
hợp ở các nồng độ IPTG 0; 10; 100;
500; 1000; 2000 M ; 7. Protein chuẩn
kDa
116
66
45
35
25

18,4

14,4

PhyC
1 2 3 4 5 6 7

18
hơn (Hình 3.23). Chính vì vậy, để có thể giảm giá thành phytaza chúng tôi
đã chọn nồng độ chất cảm ứng IPTG là 100 M để biểu hiện phytaza
bằng chủng E. coli BL21.
Khảo sát thời gian thu mẫu
Trong quá trình biểu hiện PhyC tái tổ hợp, thời gian lên men cũng
là yếu tố quan trọng ảnh hởng đến sản lợng của enzym này bởi vì
lợng protein đợc tổng hợp ở các thời điểm rất khác nhau. Lợng

phytaza nếu đợc thu sớm sẽ cha đạt đến mức tối đa, nhng nếu để thu
muộn lợng enzym đợc tổng hợp ra có khi lại bị giảm vì trong quá trình
lên men dài sẽ sinh ra một số chất làm ảnh hởng đến sản lợng của
chúng.
Chính vì vậy, để xác định đợc thời điểm thu mẫu thích hợp mà tại
đó lợng phytaza đợc tổng hợp cao nhất, chúng tôi đã tiến hành khảo
sát trong khoảng thời gian từ 0 đến 5 giờ sau khi cảm ứng. Kết quả khảo
sát đợc thể hiện trong hình 3.24.









Nhìn chung, lợng phytaza thu đợc tăng dần theo thời gian và ổn
định từ giờ thứ t trở đi, sau đó không tăng thêm ở giờ thứ 5 và nếu kéo
dài thời gian lên men, lợng phytaza thu đợc còn có thể bị giảm đi do
quá trình lên men đã tạo ra các chất ức chế (Hình 3.24). Chính vì những
nguyên nhân trên, để không làm ảnh hởng đến chất lợng cũng nh giá
thành sản phẩm, chúng tôi đã chọn thời điểm thu mẫu thích hợp là 4 giờ
sau khi cảm ứng.
kDa
116
66

45
35

25


Hình 3.24. Lợng phytaza đợc tổng
hợp theo thời gian
Đờng chạy 1. Protein chuẩn ; 2-7.
Phytaza ở các thời điểm 0, 1, 2, 3, 4, 5
g
i
ờ
PhyC
1 2 3 4 5 6 7

19
3.7 Biểu hiện phytaza tái tổ hợp ở điều kiện tối u trên thiết bị lên
men BIOFLO III
Chủng E. coli tái tổ hợp này đợc nuôi cấy trong bình lên men với
thể tích thực là 2,5 lít, ở các điều kiện tối u trên với pH ban đầu là 6,0
và không kiểm soát pH trong cả quá trình lên men.
Kết quả chủng E. coli BL21 mang gen phyC đã biểu hiện rất tốt ở
các điều kiện trên. PhyC tái tổ hợp thu đợc đạt mức xấp xỉ 288 mg/lít.
Lợng PhyC đợc tổng hợp trong tế bào E. coli đã tăng gấp 48 lần so với
chủng tự nhiên.
3.7.1 Tinh sạch PhyC tái tổ hợp
Sản phẩm protein tái tổ hợp sau khi tinh sạch đợc kiểm tra bằng
điện di trên gel polyacrylamit 12,5%. Kết quả PhyC tái tổ hợp đợc thể
hiện bằng một băng duy nhất có khối lợng phân tử khoảng 47 kDa
(Hình 3.26).

Hàm lợng protein tinh sạch trong các phân đoạn thu đợc nằm
trong khoảng 125-153 g/ml. Enzym đã đợc tinh sạch có hoạt độ riêng
là 52,28 U/mg. Lợng protein này đợc sử dụng để xác định các tính
chất của enzym.
3.7.2 Xác định tính chất của PhyC tái tổ hợp
ảnh hởng của pH đến hoạt độ và độ bền của PhyC tái tổ hợp
Nhìn chung, PhyC tái tổ hợp có khả năng hoạt động mạnh trong
khoảng pH từ 5,5-7 và enzym này hoạt động tối u ở pH 6,5 và khá bền
trong khoảng pH từ 5,5-6,5. Chính vì PhyC tái tổ hợp hoạt động tốt ở pH
1 2 3 4
kDa
116
66

45
35
25

18,4


14,4
Hình 3.26. PhyC tái tổ hợp sau khi tinh

sạch bằng cột sắc ký ái lực His-tag
Đờng chạy 1. Protein chuẩn; 2 - 4. Phy C
tinh sạch

PhyC

20
5,5-7 cho nên enzym này thích hợp để bổ sung vào thức ăn cho gia cầm
bởi vì diều của gia cầm có pH từ 6-7.










ảnh hởng của nhiệt độ và độ bền nhiệt đến hoạt độ của PhyC tái tổ
hợp
Bên cạnh việc xác định ảnh hởng của pH đến hoạt độ PhyC tái tổ
hợp, chúng tôi cũng đã tiến hành kiểm tra khả năng chịu nhiệt của
enzym này thông qua việc đo hoạt độ còn lại của chúng ở các nhiệt độ
khác nhau từ 30
o
C đến 80
o
C.
Nhiệt độ tối u cho PhyC tái tổ hợp hoạt động là 55

o
C, enzym này
không bị mất hoạt tính trong thời gian 20 phút từ nhiệt độ 55
o
C trở
xuống và hoạt độ enzym vẫn còn 85% sau 20 phút ủ ở 60
o
C (Hình 3.28).











0
20
40
60
80
100
120
33.544.555.566.577.588.59
pH
Hoạt độ tơng đối (%)
0

20
40
60
80
100
120
Hoạt độ còn lại (%)
Hoạt độ phytaza
Độ bền phytaza

Hình 3.28. ảnh hởng của nhiệt độ đến hoạt độ và độ
bền của PhyC tái tổ hợp
Hình 3.27. ảnh hởng của pH đến hoạt độ và độ bền
của PhyC tái tổ hợp
0
20
40
60
80
100
120
30 40 45 50 55 60 65 70 75 80
Hoạt độ tơng đối (%)
0
20
40
60
80
100
120

Hoạt độ còn lại (%)
Hoạt độ phytaza
Độ bền phytaza

21

ảnh hởng của các ion kim loại và chất khử đến PhyC tái tổ hợp
ảnh hởng của ion kim loại và chất khử đến hoạt độ PhyC tái tổ
hợp đợc kiểm tra bằng cách sử dụng natri phytat làm cơ chất.
Bảng 3.12. ảnh hởng của ion kim loại và chất khử đến hoạt độ
PhyC
Ion kim loại Hoạt độ PhyC tơng đối (%)
Đối chứng 100
MgCl
2
86
MnCl
2
55
CaCl
2
100
CuCl
2
9
NiCl
2
16
EDTA 4
Hoạt độ của PhyC tái tổ hợp bị giảm mạnh mẽ khi có mặt EDTA và

Cu
2+
. Nhìn chung, một số ion kim loại nh Mg
2+
, Mn
2+
, Ni
2+
đợc thử với
nồng độ 1 mM đã ức chế phytaza ngoại trừ Ca
2+
. Điều này cũng đã đợc
Ha và Oh (2000) khẳng định trong nghiên cứu cấu trúc của phytaza từ
chủng B. amyloliquefaciens. Tác giả này đã cho rằng ion canxi có vai trò
quan trọng trong cấu trúc và hoạt tính của phytaza.
Tác động của PhyC tái tổ hợp lên các cơ chất thức ăn chăn nuôi
PhyC tái tổ hợp có tác động đến tất cả các cơ chất thức ăn đợc thử,
trong đó lợng photpho vô cơ đợc giải phóng ra nhiều nhất là cám gạo,
đạt 3,6 mol/g. Kết quả trên có thể là do trong số các cơ chất trên cám
gạo có chứa nhiều axit phytic nhất cho nên khi PhyC tái tổ hợp tác động
vào lợng photpho vô cơ đợc giải phóng ra là lớn nhất. Theo số liệu của
tác giả Tyagi và Verma (1998) cám gạo là cơ chất có chứa nhiều axit
phytic nhất, chiếm 80% tổng số photpho của bản thân chúng, trong khi
đó đậu tơng và bột ngô chỉ chiếm 60% và 72% theo thứ tự. Điều này
cũng phù hợp với kết quả đã đợc Kerovuo et al., 1998; Ngô Thanh
Xuân và Mai Thị Hằng (2006) đa ra khi thử nghiệm phytaza tự nhiên từ
chi Bacillus và phytaza của chủng nấm mốc Aspergillus niger XP.

22

ảnh hởng của tripsin và pepsin đến PhyC tái tổ hợp
PhyC tái tổ hợp không bị tác động bởi tripsin bởi vì khi ủ enzym
này với tripsin trong 1 giờ, hoạt độ PhyC tái tổ hợp vẫn còn lại là 100%.
Trong khi đó, PhyC tái tổ hợp lại mẫn cảm với pepsin vì hoạt độ PhyC
còn lại sau khi xử lý với pepsin chỉ còn 23%. Trong khi đó, Papp -
phytaza tái tổ hợp đợc sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Pseudomonas putida
thì lại bị bất hoạt bởi enzym này (Dharmsthiti et al., 2005).

Ngoài ra, PhyC tái tổ hợp cũng mẫn cảm với pepsin vì hoạt độ
PhyC còn lại sau khi xử lý với pepsin trong 1 giờ chỉ còn 23%. Kết quả
nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp kết quả nghiên cứu của Kerovuo
et al., 1998 khi cho rằng phytaza của B. subtilis VTT E-68013 bị bất hoạt
bởi pepsin.
Mặc dù PhyC bị bất hoạt bởi pepsin nhng xu hớng chung hiện
nay là sản xuất những chế phẩm đa enzym cho nên việc kết hợp giữa
phytaza của nấm mốc với phytaza của vi khuẩn sẽ giải quyết đợc vấn đề
trên.
Động học enzym
Giống nh hầu hết các phytaza của Bacillus, PhyC tái tổ hợp trong
luận án này cũng tuân theo phơng trình của Michaelis-Menten. Giá trị
K
m
, V
max
của PhyC tái tổ hợp đợc xác định là 0,48 mM và 180
mol/phút. Trong khi đó giá trị K
m
của phytaza đối với natri phytat của
Bacillus sp. DS11 là 0,55 mM và B. subtilis natto đợc báo cáo là 0,5

mM (Kim et al., 1998; Shimizu (1992).
Nhìn chung, các tính chất của PhyC tái tổ hợp rất thích hợp dùng
trong việc sản xuất chế phẩm đa enzym để bổ sung vào thức ăn cho động
vật dạ dày đơn nhằm làm tăng khả năng hấp thụ photpho và muối
khoáng sẵn có trong thức ăn của chúng. Việc sử dụng kết hợp giữa
phytaza của nấm mốc với phytaza của vi khuẩn đã giải quyết đợc vấn
đề phytaza bị bất hoạt bởi enzym đờng tiêu hóa và chúng có thể hoạt
động tốt cả pH ở dạ dày (nơi phytaza của vi khuẩn không hoạt động
đợc) cũng nh pH ở ruột non (nơi phytaza của nấm mốc bị mất hoạt
tính).

23
Kết luận

1. Đã phân lập đợc 27 chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp
phytaza cao từ đất và phân động vật lấy tại một số tỉnh miền Bắc Việt
Nam. Dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lý hóa học và phơng pháp xác
định trình tự ARNr 16S đã khẳng định chủng vi khuẩn B1 có khả năng
sinh tổng hợp phytaza cao nhất là vi khuẩn B. subtilis.
2. Đã khảo sát và tối u hóa đợc điều kiện nuôi cấy cho sinh tổng hợp
phytaza của chủng B. subtilis B1, hàm lợng phytaza đạt 6 mg/l.
Phytaza thô từ chủng B. subtilis B1 có nhiệt độ tối u là 50
o
C, pH tối
u là 6,5, bền với tripsin và bị bất hoạt bởi pepsin.
3. Đã phân lập, tạo dòng và xác định trình tự nucleotit gen phyC mã hóa
cho phytaza từ chủng vi khuẩn B. subtilis B1 ở Việt Nam. Gen này có
kích thớc là 1209 bp đã đợc đăng ký trong ngân hàng gen Quốc tế
với số đăng ký là AJ584664.
4. Đã thành công trong việc thiết kế và biểu hiện gen phyC từ B. subtilis

B1 trong vi khuẩn E. coli. ở các điều kiện nhiệt độ 30
o
C, nồng độ chất
cảm ứng IPTG 100 M, thời gian thu mẫu là 4 giờ sau cảm ứng đã
cho thu đợc lợng PhyC tái tổ hợp là 288 mg/l, lớn hơn 48 lần so với
phytaza từ chủng tự nhiên.
5. PhyC tái tổ hợp có nhiệt độ tối u là 55
o
C, pH tối u là 6,5. Giá trị K
m

= 0,48 mM, V
max
= 180 mol/phút, hoạt độ riêng là 52,28 U/mg.
Enzym này bị ức chế mạnh bởi EDTA, ion Cu
2+

và bền với tripsin.

Kiến nghị

1. Tiếp tục nghiên cứu một số điều kiện ảnh hởng đến quá trình sinh
tổng hợp phytaza từ chủng E. coli tái tổ hợp nh là sử dụng lactoza để
thay thế cho chất cảm ứng IPTG đắt tiền, lên men bán liên tục để thu
nhận đợc lợng lớn phytaza.
2. Nghiên cứu đa gen phyC mã hóa cho phytaza từ B. subtilis B1 trên
vào hệ biểu hiện nấm men nhằm dễ dàng thu nhận PhyC tái tổ hợp.