Nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật di truyền hiện đại trong chẩn đoán và tiên lượng một số bệnh ung thư thường gặp ở việt nam

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH







BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN
HIỆN ĐẠI TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ TIÊN LƯỢNG
MỘT SỐ BỆNH UNG THƯ THƯỜNG GẶP Ở VIỆT NAM

CNĐT : NGUYỄN SÀO TRUNG














8782

TP.HCM – 2010



1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư ảnh hưởng đến con người ở tất cả mọi lứa tuổi và nguy cơ ung
thư tăng dần theo tuổi. Ung thư là nguyên nhân gây tử vong cho 13% (7,6
triệu) người chết trong năm 2007 [239].
Ung thư là bệnh lý do tác động của môi trường với 90-95% bệnh xảy ra
do lối sống và môi trường, 5-10% do di truyền. Tất cả các yếu tố di truyền
này có thể gây rối loạn chất liệu di truyền trong tế bào.

Ung thư
đại trực tràng (ĐTT) và ung thưvúđều có thể điều trị và có tiên
lượng tươngđối tốt nếu phát hiện bệnh sớm. Tiên lượng và đáp ứng điều trị
phụ thuộc rất nhiều yếu tố nhưgiaiđoạn bệnh, loại mô học, độ mô học, các
đột biến gen (ras, p53)… [110], [178]. Mức độ tăng sinh tế bào u cũng là một
trong những yếu tố tiên lượ
ng quan trọng. Ki67 là kháng nguyên căn bản để
xác định hoạt động của tế bào u. Kháng nguyên Ki67 biểu hiện trong nhân tế
bào u ở pha G1, S, G2, và M của chu trình tế bào, trừ pha nghỉ Go.Nhiều
nghiên cứu chứng minh Ki67 là một yếu tố tiên lượng độc lập liên quan đến
sống còn của bệnh nhân ung thưĐTT cũng như trong ung thư vú [121], [231].
Bệnh bạch cầu là bệnh lý ác tính của tế bào gốc đa năng đặc trưng bởi sự

tăng sinh quá mức tế bào máu làm tích tụ tế bào non trong bạch cầu cấp, hoặc
tăng sinh quá mức nhưng có hiện tượng biệt hóa trong bạch cầu mạn, làm suy
giảm các dòng tế bào máu bình thường. Bệnh gặp ở mọi lứa tuổi và cả 2 giới,

nhưng bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) và bạch cầu mạn dòng tủy (BCMDT)
thường gặp ở người lớn, ngược lại bạch cầu cấ
p dòng lymphô (BCCDL)
thường gặp ở trẻ em, và đó là 3 thể bệnh thường gặp nhất trong nhóm bệnh lý
máu ác tính. Những bất thường nhiễm sắc thể (NST) và các bất thường về gen
2

đặc trưng cho các dạng ung thư máu, có ý nghĩa tiên lượng độc lập, giúp lựa
chọn phác đồ điều trị thích hợp và là một dấu ấn để theo dõi điều trị.

Hiện nay việc chẩn đoán thường quy các bệnh ung thư chủ yếu dựa vào
thăm khám lâm sàng, chẩn đoán hình ảnh, xét nghiệm giải phẫu bệnh. Mặc dù
các kỹ thuật này đảm bảo độ chính xác khá cao, giúp chỉ
định điều trị phù
hợp, nhưng vẫn còn một số hạn chế như sau: (1) Không thể thực hiện ở giai
đoạn sớm, khi các khối u chưa có biểu hiện lâm sàng rõ rệt. (2) Không thể
phát hiện các đột biến gen, đột biến NST, do đó không cho phép xác định bản
chất di truyền của ung thư. (3). Chính vì thế không thể theo dõi, đánh giá hiệu
quả điều trị một cách xác thực.
Ở Việ
t Nam gần đây tại một số khoa/ bệnh viện chuyên khoa ung thư đã
bắt đầu ứng dụng một số kỹ thuật chẩn đoán mới, như chẩn đoán bằng hóa mô
miễn dịch (HMMD), dấu ấn khối u, xét nghiệm NST đồ, ứng dụng kỹ thuật
lai tại chỗ gắn huỳnh quang (FISH). Tuy vậy kết quả chưa ổn định, chưa thể
thực hi
ện thường quy.
Việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền tế bào và di truyền phân tử (phân
tích DNA, phân tích biểu hiện gen p53…) giúp giải quyết các nhiệm vụ sau
đây:
- Chuẩn hóa và ứng dụng các kỹ thuật di truyền hiện đại trong chẩn đoán

và tiên lượng bệnh ung thư.
- Xem xét khả năng ứng dụng kỹ thuật tầm soát / sàng lọc các trường
hợp có nguy cơ bị ung thư.
- Xây dựng êkip các nhà di truyền học ung th
ư để phát triển nghiên cứu
và ứng dụng các kỹ thuật di truyền vào chẩn đoán, phát hiện sớm và điều trị
ung thư.
3

- Ứng dụng phương pháp gia hệ trong nghiên cứu phát hiện các trường
hợp có hội chứng tiền định ung thư di truyền, thực hiện tư vấn, theo dõi, tầm
soát phát hiện các trường hợp có nguy cơ bị ung thư.
Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật di truyền hiện đại trong
chẩn đoán và tiên lượng một số bệnh ung thư thường gặp ở Việt Nam”
thuộ
c “Chương trình Khoa học và Công nghệ trọng điểm cấp Nhà nước”
giai đoạn 2006-2010, mang mã số KC.10.18/06-10, được phê duyệt và có thời
gian thực hiện từ tháng 3 năm 2008 đến tháng 08 năm 2010.
Mục tiêu
Hai mục tiêu tổng quát của đề tài là:
(1) Xác định và chuẩn hóa được các kỹ thuật di truyền học hiện đại trong
phân tích các rối loạn vật chất di truyền trong một số bệnh ung thư.
(2) Ứng dụng các kỹ thuật trên trong chẩn đoán và tiên lượng một số
bệnh ung thư.
Trong đề tài này 3 loại ung thư được chọn lựa đưa vào nghiên cứu là:
carcinôm tuyến đại – trực tràng, carcinôm tuyến vú và bệ
nh bạch cầu với các
mục tiêu cụ thể trong từng loại bệnh như sau:
Trong ung thư ĐTT
1. Xác định tỷ lệ và các kiểu đột biến gen p53 ở carcinôm tuyến ĐTT.

2. Xác định tỷ lệ biểu hiện tích tụ quá mức protein TP53, Ki67 và EGFR
trong carcinôm tuyến ĐTT bằng phương pháp HMMD và mối liên quan giữa
sự biểu hiện protein TP53, Ki67, EGFR và đột biến gen p53 với các đặc điểm
giải phẫu bệnh của carcinôm tuyến ĐTT.
4

3. Xác định giá trị của các xét nghiệm đột biến gen p53, biểu hiện tích tụ
quá mức protein TP53 và Ki67 và EGFR trong theo dõi đáp ứng điều trị và
tiên lượng carcinôm tuyến ĐTT.
4. Ứng dụng phương pháp gia hệ kết hợp với các kỹ thuật xác định đột
biến gen p53, tăng biểu hiện protein TP53 trong việc tầm soát phát hiện sớm
các trường hợp carcinôm tuyến carcinôm tuyến ĐTT.
Trong carcinôm tuyến vú
1. Xác định đặc điểm về tuổi, bệnh sử gia đình, mô bệnh học theo
WHO.
2. Khảo sát sự biểu hiện gen sinh u HER2 bằng kỹ thuật HMMD và
FISH.
3. Khảo sát sự biểu hiện protein và đột biến gen đè nén u p53 bằng kỹ
thuật HMMD và giải trình tự gen.
4. Khảo sát đột biến gen BRCA1 bằng kỹ thuật giải trình tự gen.
5. Khảo sát sự biểu hiện Ki67 bằng kỹ thuật HMMD.
6. Kh
ảo sát carcinôm tuyến vú có tính gia đình, lập cây gia hệ, tham
vấn di truyền.
Trong bệnh bạch cầu
1. Xác định đặc điểm lâm sàng, huyết học, sinh học và bất thường NST
của nhóm bệnh nhân bệnh bạch cầu để nghiên cứu bao gồm bạch cầu
mạn dòng tủy (BCMDT), bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) và bạch
cầu cấp lymphô (BCCDL) lúc chẩn đoán.
2. Hoàn chỉnh các kỹ thuật nuôi cấy - phân tích NST, kỹ thuật sinh học

phân tử bao gồm FISH và RT-PCR để chẩn đoán các bệnh lý
BCMDT, BCCDT và BCCDL.
5

3. Ứng dụng kết quả của khảo sát trên để phân nhóm nguy cơ, xác định
yếu tố tiên lượng, lựa chọn phác đồ điều trị và đánh giá hiệu quả
trong bệnh bạch cầu.
6

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1 Những khái niệm cơ bản về di truyền ung thư
- Ung thư là bệnh lý trầm trọng thường gặp nhất của y học, liên quan
chặt chẽ với các rối loạn của gen.
- Hiểu biết về đặc điểm di truyền trong ung thư giúp truy tìm và phát
hiện ung thư sớm, cải thiện đáng kể tỷ lệ tử vong do ung thư. Đột biến diễn
tiến đạt đến ung thư phụ thuộc vào các yếu tố: tốc độ đột bi
ến, số lượng cá thể
trong quần thể, tốc độ sinh sản và ưu thế chọn lọc của cá thể đột biến. Ung
thư là bệnh di truyền do đột biến tế bào sinh dưỡng.
- Sự biến đổi mối quan hệ giữa các tiền gen sinh ung, gen sinh ung và
các gen đè nén u quyết định sự ung thư hóa, sự phát triển khối u.
- Sự đột biến gen, đột biến NST (mất đoạn, chuyể
n đoạn) là đặc tính phổ
biến của tất cả các loại ung thư. Đột biến gen p53 là biến đổi di truyền thường
gặp nhất trong ung thư, có ở hơn 50% loại ung thư.
- Ở hầu hết các loại ung thư, yếu tố môi trường như virus, phóng xạ, …
tác động lên quá trình phân chia tế bào, làm thay đổi chu trình tế bào, gây đột
biến vật chất di truyền, làm rối loạn sự chết theo chương trình thúc đẩ
y quá
trình hình thành tế bào ung thư.

- Ung thư là kết quả của một loạt các đột biến tế bào sinh dưỡng, nhưng
một số ung thư khác có thể di truyền theo kiểu di truyền trội hoặc di truyền
lặn NST thường (carcinôm tuyến ĐTT, ung thư nguyên bào võng mạc…).
- Ngày nay người ta đã xác định được nhiều kiểu đột biến gen, đột biến
NST đặc hiệu hoặc không đặc hiệu cho các loại ung thư. Các tế bào ung th
ư
thường thể hiện tính đa dạng, bất thường về kích thước, hình dạng nhân, số
lượng và cấu trúc NST: các gen được nhân bản hoặc mất đi, NST bị mất, nhân
đôi, hoặc chuyển đoạn với tần xuất cao hơn nhiều so với tế bào bình thường.
7

- Các gen điều hòa bình thường có thể phân chia thành hai nhóm theo tác
dụng của sản phẩm của chúng: (1) kích thích tăng số lượng tế bào và / hoặc
(2) ức chế. Cách thứ nhất là làm cho các gen bị kích thích trở thành siêu hoạt
tính: loại đột biến này trội (chỉ cần một trong hai phiên bản gen thay đổi),
allel bị đột biến gọi là gen sinh ung, allel bình thường gọi là tiền gen sinh
ung. Cách thứ hai làm mất hoạt tính gen ức chế, đột biến lo
ại này thường lặn
(phải mất cả hai phiên bản gen mới làm tế bào thoát khỏi ức chế), gọi là gen
đè nén u.
1.2.Các loại gen liên quan ung thư
Ba loại gen chính có vai trò trong sự hình thành và phát triển của ung thư
là gen sinh ung, gen đè nén u và gen sửa lỗi bắt cặp sai [104], [110], [188].
1.2.1 Tiền gen sinh ung và gen sinh ung
Các tiền gen sinh ung có vai trò kiểm soát sự sinh sản và biệt hóa của tế
bào. Khi một tiền gen sinh ung trở nên hoạt động bất thường, khiến các tế bào
tăng trưởng quá đà thoát khỏi sự kiểm soát của cơ thể tạo ra một clôn tế bào
tăng sinh, lúc này nó được gọi là gen sinh ung. Gen sinh ung hoạt động theo
tính trội, vì vậy chỉ cần đột biến một allel cũng đủ kích hoạt gen sinh ung thư
[104]. Gen RAS trên NST số 12 là một ví dụ

điển hình. Gen này mã hóa cho
một protein gắn kết, hoạt động như “công tắc một chiều” cho sự dẫn truyền
các tín hiệu ngoại bào đến nhân và điều hòa sự dẫn truyền tín hiệu tế bào. Khi
bị đột biến, gen RAS trở thành gen sinh ung. Đột biến gen RAS được phát hiện
trong khoảng 50% trường hợp ung thư đại trực tràng thể ngẫu nhiên và trong
các polyp lớn. Sự phát hiện đột biến gen RAS
có thể giúp ích cho việc tầm
soát và chẩn đoán sớm ung thư ĐTT.
8

Có khoảng 60 tiền gen sinh ung được tìm thấy và mỗi tiền gen sinh ung
có thể biến thành gen sinh ung gây một loại ung thư. Phần lớn các gen này
được thấy dưới các dạng đột biến khác nhau trong một số loại ung thư.
Các kiểu đột biến chuyển tiền gen sinh ung thành gen sinh ung gồm: đột
biến điểm, mất đoạn, chuyển đoạn, khuếch đại, xen đoạn NST. Biến đổi xảy
ra tại vùng mã hóa protein có th
ể tạo ra sản phẩm tăng hoạt tính, còn tại các
vùng điều hòa thì có thể làm cho gen được biểu hiện quá mức. Ngoài ra gen
cũng có thể được biểu hiện quá mức do có quá nhiều phiên bản sai sót khi
nhân bản NST. Với các gen riêng biệt và đáp ứng với các chất sinh ung riêng
biệt, có thể có những kiểu bất thường đặc trưng.
Nghiên cứu trình tự chuỗi DNA cho thấy trong một số trường hợp
chuyển đoạ
n, tiền gen sinh ung biến thành gen sinh ung vì đã bị nối vào một
gen khác, do đó tạo ra sản phẩm protein bị thay đổi; trong một số trường hợp
khác tiền gen sinh ung bị đưa sang một vùng NST khác, sinh ra protein bình
thường nhưng với số lượng dư thừa.
1.2.1.1 HER1 (EGFR)
Gen EGFR nằm trên nhánh ngắn NST số 7, vị trí 12, mã hóa protein
EGFR, là protein xuyên màng có trọng lượng phân tử 170 kD. Protein EGFR

còn có tên là HER-1 hay c-ErbB-1 là thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì
nằm trên bề mặt t
ế bào, được kích hoạt khi gắn kết với các ligand đặc hiệu
như yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF) hay yếu tố chuyển dạng tăng trưởng
anpha (TGF-α) [63]. Khi gắn kết với ligand đặc hiệu, EGFR kích hoạt hàng
loạt dòng thác tín hiệu nội bào, dẫn đến hình thành ung thư do kích thích tăng
sản quá mức tế bào u, kích thích quá trình xâm nhập, quá trình sinh mạch và
di căn của tế bào u, làm tế bào không chết theo lập trình (Hình 1.1).
9


Hình 1.1: EGFR và các đường truyền tín hiệu
Các con đường hoạt hóa tín hiệu nội bào đã được biết đến như:
- MAPK - protein kinase hoạt hóa mitogen.
- PI3K/Akt.
- Con đường Phospholipase C (PLC).
- Con đường qua trung gian RAS.
Con đường qua trung gian RAS phức tạp và liên quan đến cơ chế kháng
thuốc kháng EGFR (Gefitinib hoặc Erlotinib, Cetuximab và Panitumumab)
khi có đột biến gen KRAS. Ở người có ba gen RAS mã hóa ba protein cùng tên
H-RAS, K-RAS và N-RAS. Ba gen RAS nằm trên ba NST hoàn toàn khác
nhau. Đột biến gen RAS sẽ khởi động dòng thác tín hiệu nội bào bất hoạt tác
dụng của thuố
c. Bản thân đột biến gen này cũng là một yếu tố tiên lượng độc
lập đối với bệnh nhân đang điều trị Cetuximab. Trong ung thư ĐTT, tỷ lệ gen
KRAS bị đột biến lên tới 50% và thường tại vị trí codon 12 và 13.
Tăng sinh Xâm nhập Di căn Không chết theo lập trình Sinh mạch máu
Nhân
Bào tương
Ngoài tế bào

Bắt cặp và kết nối
với li
g
and
Các thụ thể tyrosine
kinase khác
10

Sự hoạt hóa EGFR điều hòa các cytokine tạo mạch máu (VEGF-A,
bFGF và IL8) và mạch lymphô (VEGF-C, VEGF-D), các yếu tố kích thích
quá trình sinh mạch. Những kích thích thực nghiệm trên tế bào gai ung thư
vùng đầu mặt cổ với EGF, heregulin hoặc betacellulin cho thấy ung thư này
có tăng yếu tố tạo mạch là VEGF-C và VEGF-A. Quá trình điều hòa yếu tố
VEGF-A qua trung gian EGFR thông qua con đường tín hiệu RAS-MAPK
hoặc PI3K-AKT. Ngoài ra tình trạng thiếu oxy cũng là một yếu tố điều hòa
VEGF-A. Yếu tố VEGF-C lại
được điều hòa thông qua con đường MAPK.
Quá trình hoạt hóa EGFR còn làm giảm tính kết dính giữa các tế bào ung
thư, khiến chúng di chuyển ra xa, xâm nhập các cơ quan kế cận hoặc di căn
đến các cơ quan khác. Sự kết dính giữa các tế bào với nhau và giữa tế bào với
mô đệm liên kết được điều hòa chủ yếu bởi integrin, một glycoprotein xuyên
màng, nơi sẽ truyền tải tín hiệu giữa các tế bào và môi trường xung quanh.
Integrin là một thụ thể c
ủa các protein đệm như collagen, laminin và
fibronectin, những chất cơ bản của mô liên kết. Integrin không có hoạt động
đồng hóa nội tại nhưng có thể tương tác trực tiếp với các thụ thể của tyrosine
kinase như EGFR, HER-2, và MET. Khi integrin được hoạt hóa, chất này sẽ
hoạt hóa FAK, một kinase kết dính tại chỗ, một yếu tố quan trọng cho sự gắn
kết tế bào và di chuyển tế bào. Quá trình hoạt hóa EGFR, bằng một cách nào
đó, làm FAK không còn được phosphoryl hóa và bị

bất hoạt, dẫn đến các tế
bào u mất tính liên kết với mô nền xung quanh, dễ dàng di chuyển, xâm nhập
và di căn đến cơ quan khác.
Các dòng thác tín hiệu từ sự hoạt hóa EGFR cũng làm rối loạn cơ chế
điều hòa cadherin - catenin, yếu tố quan trọng cho sự kết dính giữa các tế bào
với nhau. Một khi mối liến kết giữa các tế bào mất đi, tế bào u dễ dàng di
chuyển ra xa vị trí nguyên phát đến các cơ
quan khác. Sự kích hoạt EGFR,
cùng với các dòng thác tín hiệu nội bào đã kích thích u phát triển, sinh mạch
11

và di căn xa. Do đó, có thể thấy biểu hiện quá mức EGFR trên những ung thư
giai đoạn tiến triển và di căn xa.
* Điều trị nhắm trúng đích EGFR
EGFR biểu hiện trong ung thư ĐTT với tỷ lệ khá cao khoảng 60-80%.
Điều đó cho phép điều trị kháng EGFR cho bệnh nhân ung thư tuyến ĐTT.
Năm 2004, FDA đã chấp nhận sử dụng Cetuximab (Erbitux) như là một thuốc
nhắ
m trúng đích cho EGFR đối với điều trị ung thư ĐTT. Cetuximab là một
kháng thể kháng EGFR, có khả năng ức chế quá trình phosphoryl hóa của
EGFR, đồng thời ức chế gắn kết với các ligand tự nhiên (Hình 1.2).
Cetuximab được chỉ định đối với các trường hợp carcinôm tuyến ĐTT có biểu
hiện quá mức EGFR (phát hiện bằng phương pháp nhuộm HMMD). Các
kháng thể kháng EGFR khác cũng được sử dụng là Panitumumab và
Matuzumab.
Tuy nhiên các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ đáp ứng với Cetuximab không
tương ứng với biểu hiện quá mức EGFR trên carcinôm tuyến ĐTT. Những
trườ
ng hợp không đáp ứng có biểu hiện đột biến gen KRAS. Đột biến gen này
sẽ hoạt hóa các con đường tín hiệu nội bào khác, làm mất tác dụng của thuốc

kháng EGFR (Hình 1.2). Do đó chỉ điều trị thuốc kháng EGFR trên những
trường hợp carcinôm tuyến ĐTT không có đột biến gen KRAS.
Ngoài ra, cơ chế kháng thuốc kháng EGFR còn có sự tham gia của nhiều
yếu tố khác phức tạp hơn. Đột biến gen EGFR kháng điều trị bằng kháng thể
kháng EGFR nhưng lại nhạy với thuốc kháng tyrosine kinase.
12


Hình 1.2: Dù EGFR đã bị ức chế bởi kháng thể đơn dòng kháng EGFR,
nhưng kRAS bị đột biến sẽ kích hoạt dòng thác tín hiệu khác tác động lên
nhân gây phát triển u, tế bào bất tử, di căn và sinh mạch máu
1.2.1.2 HER 2
HER2 là tiền gen sinh ung, nằm trên nhánh dài của NST 17, tại vị trí 21,
ký hiệu 17q21. Sản phẩm của gen HER2 là thụ thể glycoprotein trên màng tế
bào, có trọng lượng phân tử là 185kd. HER2 là gen chìa khoá trong việc điều
hoà sự phát triển tế bào biểu mô. Gen HER2 khuếch đại (tăng số lượng bản
sao) làm cho bệnh tiến triển nhanh, tiên lượng xấu.
Khuếch đại gen HER2 trong nhân sẽ làm tăng sao mã mRNA, kết quả là
làm tăng sản phẩm của gen HER2 ở màng tế bào, đẩy tế bào vào dòng thác
phân bào. Tế bào tuyến vú bình thường có 2 gen HER2 trong nhân và khoảng
50.000 thụ thể nằm trên màng tế bào. Khoảng 20-30% trường hợp carcinôm
13

tuyến vú có khuếch đại gen HER2, khi đó số lượng thụ thể có thể tăng đến
hơn 1 triệu ở màng tế bào. Nhiều nghiên cứu cho thấy việc vô hiệu hóa hoạt
động của thụ thể HER2 giúp kéo dài thời gian sống của bệnh nhân.
Trastuzumab là kháng thể đơn dòng gắn kết đặc hiệu lên phần ngoại bào của
thụ thể HER2 gây bất hoạt thụ thể này và có thể dùng đơn độc hoặ
c kết hợp
với hoá trị liệu kinh điển. Cả NCCN và ASCO đều khuyến cáo phải đánh giá

tình trạng HER2 trong tất cả trường hợp carcinôm tuyến vú xâm lấn, bất kể là
bệnh mới hoặc tái phát. [217].


Hình 1.3 Hoạt động của các thụ thể HER: sự bắt cặp của thụ thể HER2 và
kích hoạt tiếp theo. Sau khi ligand gắn kết, thụ thể bắt cặp đồng loại hoặc dị
loại, các tyrosine kinase nội bào của các thụ thể được phosphoryl hóa, thụ thể
được kích hoạt và bắt đầu dòng thác tín hiệu
Các thụ thể HER tồn tại ở dạng đơn phân tử trên màng tế bào. Sự hoạt
hóa các HER tùy thuộc vào sự hiện diện của các phân tử truyền tin đặc hiệu
hay còn gọi là ligand và các thụ thể khác trong họ HER. Sau khi gắn kết với
chất truyền tin, 4 thụ thể khác nhau có thể liên kết với nhau thành từng cặp
hoặc đồng loại (HER1-HER1, HER2-HER2, HER3-HER3 ) hoặc dị loại (ví
B
ắ
t c
ặ
p
d
ị
lo
ạ
i
B
ắ
t cặ
p
đ
ồ
n

g
loại
Vị trí gắn ligand
14

dụ: HER1-HER2, HER2-HER3, HER2-HER4 ). Như vậy, sự bắt cặp của 4
thụ thể khác nhau sẽ tạo ra khoảng 10 cặp thụ thể khác nhau, phức hợp tạo ra
giữa cặp thụ thể dị loại và ligand bền vững hơn phức hợp có cặp thụ thể đồng
loại (Hình 1.3).
Có hai phương pháp đánh giá HER2, Phương pháp bán định lượng:
đánh giá biểu hiện của sản phẩm gen HER2 ở màng tế bào bằng hoá mô miễn
dịch, và phương pháp định lượng: tính trung bình số lượng bản sao HER2
trong trong nhân/NST. Đánh giá sự khuếch đại gen HER2 bằng kỹ thuật lai
tại chỗ gắn huỳnh quang (FISH), được xem là tiêu chuẩn vàng để xác định
tình trạng HER2 trong carcinôm tuyến vú.
1.2.1.3 KRAS (Ki-Ras, Kirsten-Ras)
K-Ras là một thành viên của gia đình RAS gồ
m các protein GTPase
phân tử nhỏ, gắn với GTP hay GDP. Chức năng của Ras là hoạt hoá một số
con đường chuyển hoá bằng cách hoạt hoá protein kinase của ti thể hay hoạt
hoá phosphatidylinositol-3 kinase/AKT. Ras được hoạt hoá khi gắn với GTP,
và bất hoạt khi thủy phân GTP bằng cách sử dụng hoạt tính GTPase nội sinh.
Đa số các KRAS bị đột biến liên quan đến ung thư ĐTT đều xảy ra ở ba vị trí
codon đặc hiệu, đó là ở các vị trí 12, 13 và 60. Các đột bi
ến này ức chế hoạt
tính của GTPase, do đó liên tục tạo ra thể RAS hoạt động. KRAS bị đột biến
được tìm thấy đến 40-50% trong các trường hợp ung thư đại tràng rải rác và
ung thư dạng tuyến, điều đó cho thấy nghiên cứu các đột biến có thể đóng vai
trò quan trọng chẩn đoán sớm trong quá trình sinh ung.
1.2.1.4 PI3KCA

Phosphatidylinositol-3 kinase (PI3KS) thuộc gia đình kinase, gồm 3
nhóm I, II và III. Gen PI3KCA mã hoá cho tiểu đơn vị p110 alpha thuộc nhóm
I của
PI3KS. PI3KS và đặc biệt là PI3KCA có vai trò phosphoryl hoá
phosphatidylinositol 4,5-biphosphat thành phosphatidylinositol 3,4,5
15

biphosphat, có vai trò là yếu tố thông tin thứ hai giúp hoạt hoá các thành phần
khác như AKT và PDK1 kinase. Sự hoạt hoá này giúp tế bào liên tục phát
triển và ức chế sự chết tế bào theo chương trình. nhiều bằng chứng cho thấy
PI3KS và đặc biệt là PI3KCA đóng vai trò quan trọng trong carcinôm tuyến
vú, phổi, dạ dày, não và đại tràng.
1.2.2 Gen đè nén u
Bình thường gen đè nén u có thể gây dừng chu kỳ tế bào ngay cả khi gen
sinh ung thư đã được kích hoạt. Nếu tế bào không sửa chữa được DNA bị tổn
thương thì gen đè nén u sẽ khiến cho tế bào tự chết theo chương trình [59].
Gen đè nén u được mô tả đầu tiên trong nghiên cứu của Knudson về dịch tễ
của u nguyên bào võng mạc ở trẻ em. Đó là những gen hoạt động theo tính
lặn, chức năng của nó chỉ
mất đi khi cả hai allel bị bất hoạt. Khi một gen đè
nén u di truyền đột biến mầm sang cho thế hệ tiếp, thì chỉ cần thêm một đột
biến nữa trên allel còn lại sẽ gây mất chức năng của gen. Giả thuyết “hai cú
hích” của Knudson giải thích tại sao các bệnh di truyền thường thấy ở tuổi
sớm hơn các bệnh không do di truyền và giải thích khái niệm gen đè nén u
hoạt động theo kiể
u gen lặn.
1.2.2.1 Gen p53
Là gen đè nén u hay bị đột biến nhất trong ung thư ở người. Gen p53
bình thường hoạt động bằng cách làm tạm dừng chu kỳ tế bào để tiến hành
việc sửa chữa các sai lệch trong quá trình nhân đôi DNA, hoặc làm cho tế bào

tự chết theo chương trình. Vì thế gen này được xem là “người bảo vệ” của bộ
gen. Khoảng 75% carcinôm tuyến ĐTT thể ngẫu nhiên có biểu hiện bất hoạt
gen p53. Sự
xác định đột biến gen p53 trong carcinôm tuyến ĐTT có thể có ý
nghĩa tiên lượng. Bệnh nhân có biểu hiện đột biến gen p53 có tiên lượng xấu,
thời gian sống thêm ngắn hơn những bệnh nhân không có biểu hiện đột biến
gen p53 [104].
16

* Cấu trúc gen p53
Gen p53 được tìm thấy tại nhánh ngắn đoạn 13 thuộc NST 17 (ký hiệu
17p13), quy định tổng hợp một protein thuộc nhân, trọng lượng phân tử
53kD, đảm nhận nhiều chức năng, đặc biệt là chận tiến trình phân bào lại,
thúc đẩy tế bào chết theo chương trình và biệt hóa tế bào.
Gen p53 có kích thước khoảng 20kb trên DNA, gồm 11 exon (exon đầu
tiên không mã hóa). Phiên bản RNA thông tin dài khoảng 3kb, bao gồm 1179
khung đọc mở (ORF) (Hình 1.4). Theo Bourdon, gen p53 có thêm 2 vùng
khởi động phiên mã ở intron 2 và intron 4, và 2 vùng cắt intron chọn lọc xuất
hiện ở intron 9, tạo ra các thể đồng dạng khác nhau của p53.
Hình 1.4. Gen p53, có 11 exon, mã hóa cho 2 kb mRNA
Đột biến gen p53 có thể gặp ở nhiều loại u khác nhau, có thể gây ra hội
chứng Li-Fraumeni: trong gia đình, dòng họ có nhiều người bị carcinôm
tuyến vú, sarcôm mô mềm, sarcôm xương, u não, bệnh bạch cầu.
Có khoảng 30% các trường hợp carcinôm tuyến vú có đột biến gen p53.
Loại đột biến phổ biến nhất là đột biến điểm trên những exon của gen p53,
phân tử protein được tạo ra không có chức năng nhưng ổn định và tích t
ụ lại
trong nhân tế bào. Một số trường hợp carcinôm tuyến vú liên quan đến tính
17

chất di truyền, thừa hưởng gen p53 đột biến tạo ra hội chứng carcinôm tuyến
vú gia đình.
Protein TP53 là một protein ức chế sinh ung thư, có vai trò quan trọng
trong bảo vệ tế bào, phòng ngừa biến tế bào trở nên ác tính như khi DNA hay
phần telomere của tế bào bị tổn thương hoặc tế bào thiếu oxy thì p53 sẽ được
hoạt hoá và gắn vào các đoạn DNA đặc hiệu để chuyển mã các gen liên quan
nhằm làm ngưng chu k
ỳ tế bào để sửa chữa hay chuyển tế bào vào chết theo
chương trình. Còn trong tế bào bình thường, protein TP53 giữ ở tình trạng bất
hoạt hay biểu hiện ở mức độ thấp. Các nghiên cứu cho thấy khoảng 50% các
dạng ung thư ở người có gen p53 bị đột biến, còn trong ung thư ĐTT, 30-60%
gen này có đột biến, đột biến điểm ở 6 codon 175, 245, 248, 249, 273 và 282
chiếm đến 30%, còn đa số các đột biến khác thì x
ảy ra trong khoảng từ exon 4
đến exon 8. Đã có nhiều nghiên cứu về vai trò của các đột biến trên gen p53
trong ung thư ĐTT và người ta nhận thấy, tỷ lệ đột biến trên gen p53 ở những
khối u giai đoạn sớm tương đối thấp, nên đã hạn chế việc sử dụng p53 để sàng
lọc và phát hiện ung thư dựa trên kỹ thuật phân tử.
* Các biến đổi gen p53
Các nghiên cứu trước đây [106], [166] cho r
ằng đa số đột biến p53 xuất
hiện trong vùng gen bảo tồn cao, qua quá trình tiến hóa và có chức năng quan
trọng, chủ yếu trong exon 5-8 từ acid amin thứ 126-306. Vì vậy, đa số các
nghiên cứu về đột biến p53 thường giới hạn trong phạm vi vùng exon 5-8. Điều
này làm cho tỷ lệ các đột biến xuất hiện trong vùng exon 5-8 được báo cáo lên
đến 95%. Nhóm nghiên cứu của Greenblatt [106] đã thống kê trong 50 bài báo
phân tích các đột biến bằng cách giải trình tự toàn bộ chi
ều dài của gen p53, tỷ lệ
đột biến xuất hiện ở exon 5-8 chiếm tỷ lệ 87% trong tổng số 560 đột biến được
ghi nhận, sau đó là đột biến ở exon 4 (8%) và exon 10 (4%). Như vậy, tỷ lệ đột

biến xảy ra ngoài vùng exon 5-8 nói chung là khoảng 13%.
18


Hình 1.5 Gen p53 và các đột biến trong vùng mã hóa (IARC database 1999)
Theo số liệu thống kê của IARC năm 2009, đa số các đột biến gen p53
cũng xảy ra trong vùng exon 5-8 (Hình 1.5, 1.6). Tuy nhiên, tỷ lệ đột biến
xuất hiện trong và ngoài vùng exon 5-8 cũng khác nhau, tùy thuộc vào loại
ung thư. Đột biến ngoài vùng exon 5-8 xuất hiện nhiều ở ung thư bàng quang
(28%), ung thư gan (24%) và xuất hiện ít hơn ở ung thư đầu mặt (2%), ung
thư tế bào tạo máu ác tính (2%). Vì thế, tỷ lệ đột biến gen p53 có thể được
đánh giá không đúng mức với 2 lý do (1) Phạm vi nghiên cứu của gen p53
gi
ới hạn trong exon 5-8, cần thiết bổ sung các phân tích đột biến trên exon 4
và 10 nếu chưa tìm thấy đột biến ở exon 5-8; (2) Chưa đồng thời nghiên cứu
các đột biến xảy ra trong vùng intron, có thể gây ra sự cắt nối exon sai, ảnh
hưởng đến sự biểu hiện protein TP53, thường gặp khi dùng cDNA làm khuôn
mẫu phân tích các đột biến. Ngoài ra, các đột biến trong vùng intron điều hòa
cắt nối exon có thể thường gặp nhưng không được phát hiện bằng các k
ỹ thuật
PCR do các cặp mồi thường nằm trong vùng intron, và cũng không được phát
hiện bằng HMMD do protein TP53 đột biến thường là protein ngắn, mất khả
năng tích tụ trong nhân tế bào.
19


Hình 1.6. Tổng hợp dữ liệu các đột biến gen p53 theo vị trí codon (IARC
database 1999)
Trong nhiều loại ung thư, đột biến gen p53 đưa đến hình thành protein
TP53 đột biến có thời gian bán hủy kéo dài, tích tụ nhiều trong tế bào nên có

thể phát hiện được bằng kỹ thuật HMMD. Chính vì vậy p53 có thể coi như
một dấu ấn khối u, có thể có những chức năng quan trọng như:
- Dự đoán hóa ác.
- Dự đ
oán di căn.
- Đánh giá mức đáp ứng với phương pháp điều trị và tiên lượng bệnh.
Để phát hiện đột biến gen p53 có thể sử dụng các kỹ thuật:
- Phát hiện đột biến gen trực tiếp (giải trình tự)
- Phát hiện đột biến gen gián tiếp
- Tầm soát DNA
Để khảo sát protein TP53 bất thường có thể dùng các kỹ thuật phân tích
protein như Western blot, ELISA,… nhưng hiện nay thông dụng nh
ất là
phương pháp HMMD.
20

Protein p53
* Cấu trúc protein TP53
Protein p53 gồm có 393 acid amin, có khối lượng phân tử là 53kD, là
protein có hàng loạt các biến đổi sau dịch mã như phosphoryl hóa, acetyl hóa,
ubiquitin hóa, sumoyl hóa, neddyl hóa. Protein p53 có thể được chia thành 3
phần chính (1) Đầu amino có các vùng kích hoạt phiên mã TAD1, vùng
TAD2 và vùng giàu Proline [66], (2) Vùng trung tâm là vùng gắn kết DNA
đặc hiệu (DBD), (3) Đầu cacboxyl có các vùng tín hiệu định vị nhân (NLS),
vùng tetramer hóa, vùng tín hiệu rời nhân (NES), và vùng điều hòa âm tính
(REG) (Hình 1.7).

Hình 1.7. Cấu trúc protein TP53 [34]
* Protein p53 bị đột biến
Đa số đột biến gen p53 có thể làm thay đổi chức năng của protein TP53
theo hai xu hướng tăng hoặc giảm chức năng điều hòa xuôi dòng hoặc điều
hòa ngược dòng của gen p53. Khi nghiên cứu mối quan hệ nhân quả giữa sự
ổn định và chức năng của gen p53, Blagosklonny [56] cho rằng đa số đột biến
ở gen p53 làm tăng độ bền vững của protein TP53, đồng thời làm giảm chức
Đầu amino
Vùng trung tâm
Đầu cacboxyl
Vùng
kích hoạt
phiên mã
(TAD)
Vùng
giàu
Proline
Vùng kết hợp
DNA đặc hiệu
(DBD)
Vùng
tetramer
hóa
(TET)
Vùng điều

hòa âm
tính
(REG)
95 – 289 319 - 359
21

năng của nó. Theo đó, khi protein TP53 có trạng thái bền vững hay các
protein TP53 bị bất hoạt được xem là giảm chức năng [56]. Các protein TP53
bị bất hoạt trong các trường hợp sau (1) protein TP53 bị đột biến nên không
thể hiện trọn vẹn chức năng, (2) gen p53 bị đột biến nên không tạo ra protein
TP53, (3) protein TP53 bình thường được tạo ra, nhưng có 1 loại protein thứ 2
bất hoạt nó, (4) protein TP53 bình thường được tạo ra, nhưng lại không ở vị

trí thực hiện chức năng trong tế bào. Đa số đột biến ở protein TP53 gây ra
những sai hỏng trong vùng liên kết chéo giữa protein và DNA, làm cho sự
biểu hiện của p21/WAF1 không được điều hòa, dẫn đến các tế bào có sai
hỏng DNA sau stress không tự chết theo chương trình được. Vì thế, p53 đột
biến thường làm giảm chức năng của protein TP53 [227].
Ngoài ra, có một số nghiên cứu khác cho rằng protein TP53 đột biến
không chỉ theo chiều hướng giả
m chức năng như trên mà còn có thể làm tăng
chức năng điều hòa ngược của p53 lên các gen khác nhau một cách trực tiếp
hay gián tiếp, làm cho các protein đột biến có những chức năng mới, khác
protein bình thường. Khi đột biến xảy ra ở các vị trí 175His, 248Trp, 273His
và 281Gly, protein TP53 tăng thêm khả năng kích hoạt lên gen tạo kháng thể
tăng sinh tế bào trong nhân. Nếu đột biến xảy ra ở các vị trí 143Ala, 175His,
248Trp, 273His và 281Gly làm tăng khả năng gắn kết lên vùng trình tự
đặc
hiệu trên promotor của gen EGFR và kích hoạt gen này biểu hiện quá mức
[154]. Còn p53 đột biến tại 143Ala lại kích hoạt gen bFGF biểu hiện, trong

khi dạng p53 bình thường thì ức chế biểu hiện gen này. Tóm lại, tùy theo vị
trí codon và loại acid amin tạo thành sau đột biến mà protein TP53 đột biến có
thể tăng chức năng điều hòa ngược của mình lên các gen khác nhau theo
những cơ chế khác nhau. Cơ chế sự tăng chức năng của các protein TP53 đột
bi
ến này rất phức tạp.
22

Ngoài ra, thể đột biến p53 có thể ức chế các dạng protein TP53 bình
thường trong quá trình tăng trưởng tế bào hoặc trong các tương tác chéo với
DNA, biểu hiện hoạt tính điều hòa trội âm tính của dạng đột biến.
1.2.2.2 Gen APC
Là một gen đè nén u gây carcinôm tuyến ĐTT, nằm trên NST số 5. Chức
năng bình thường của gen APC là kiểm soát protein -catenin để điều hòa các
tín hiệu dẫn truyền và phát triển của tế bào. Đột bi
ến gen APC quan trọng
trong sự biến đổi tế bào sớm và nó được xem là gen “gác cổng”. Nếu đột biến
gen APC là đột biến mầm thì gây ra bệnh đa polyp tuyến gia đình, nếu là đột
biến sinh dưỡng thì nó khởi đầu cho sự phát triển UTĐTT thể ngẫu nhiên, và
nếu là đột biến I1307K thì nó góp phần để hình thành UTĐTT có yếu tố gia
đình ở chủng tộc Do thái [110], [188].
1.2.2.3 Gen DCC
Năm 1989, gen DCC hay còn gọi là “gen mất đoạ
n trong ung thư ĐTT”
được phát hiện. 70% ung thư ĐTT có biểu hiện đột biến gen DCC ở nhánh
dài của NST số 18. Gen DCC mã hóa một protein có vai trò tương tác giữa tế
bào và tế bào, giữa tế bào và chất căn bản. Đột biến gen DCC cũng tìm thấy
trong 50% các trường hợp u tuyến tiến triển.
1.2.3 Gen sửa lỗi bắt cặp sai (MMR gene)
Có chức năng sửa những sai lệch trong quá trình nhân đôi DNA. Có 6

gen sửa lỗi bắt cặp sai của DNA được tìm thấy ở người là hMSH2 (ở nhánh
ngắn NST số 2 – 2p16), hMLH1 (ở nhánh ngắn NST số 3 – 3p21), hPMS1 (ở
nhánh dài NST số 2 – 2q31-33), hPMS2 (ở nhánh dài NST số 7 – 7q11),
hMSH6 (ở nhánh ngắn NST số 2 – 2p16) và hMSH3 (ở nhánh dài NST số 5 –
2q11.2-q13.2). Khi cả hai allel của gen này bị bất hoạt thì các sai lệch trong
DNA không được sửa chữa, các lỗi trong bắt cặp DNA gia tăng, từ đó tăng
23

tốc tiến trình sinh ung thư. Bốn gen đầu tiên ở trên được xem như góp phần
hình thành HNPCC với tỷ lệ tương ứng là 31%, 33%, 2% và 4% [104], [110].
1.2.4 Gen liên quan đến phát triển u - Ki67
Protein Ki67 (MKI67) là dấu ấn chỉ sự phát triển tế bào. Kháng thể Ki67
được Gerdes và cộng sự tìm ra năm 1983, giúp phát hiện kháng nguyên trong
nhân tế bào ở giai đoạn hoạt động của tế bào trừ pha nghỉ (Hình 1.8). Nhờ đặc
điểm này Ki67 đã được áp dụng trong hàng loạt các nghiên cứu về tăng sinh
tế bào trên các loại ung thư [203]. Sự phát triển khối u do mất cân bằng giữa
quá trình tăng sinh tế bào và chết tế bào. Một số nghiên cứu cho thấy sự tăng
sinh tế bào ở pha S (pha tổng hợp) có ý nghĩa trong tiên lượng sống củ
a bệnh
nhân ung thư ĐTT. Để xác định tình trạng tăng sinh tế bào u, có thể nhuộm
HMMD với các dấu ấn miễn dịch Ki67, PNCA, BrdU, cyclin B1, phospho-
histone H3, …, [159], [196]. Hiện nay việc sử dụng protein Ki67 để đánh giá
tình trạng tăng sinh tế bào u rất phổ biến. Kháng thể đơn dòng Ki67 có khả
năng phát hiện kháng nguyên Ki67 hay MKI67, một protein ở người mã hóa
bởi gen MKI67. Protein Ki67, nặng 345-395 kDa, là một dấu ấn của sự tăng
sinh tế bào. Trong pha giữa c
ủa chu kỳ tế bào, có thể phát hiện kháng nguyên
Ki67 trong nhân tế bào, trong khi pha nguyên phân, hầu hết các protein nằm
trên bề mặt của NST [159], [196]. Protein Ki67 có mặt trong các pha hoạt
động của chu kỳ tế bào như (pha G

1
, S, G
2
và pha gián phân) nhưng không
tìm thấy trong pha nghỉ G
o
. Lượng protein sẽ bắt đầu tăng từ giữa pha G
1
, tiếp
tục tăng trong các pha S, G
2
, đạt tới đỉnh ở pha gián phân, và cuối pha này,
lượng protein sẽ dị hóa. Protein Ki67 là một dấu ấn tuyệt vời để xác định khả
năng phân chia của tế bào. Tỉ lệ dương tính với Ki67 trên tế bào u thường liên
quan đến diễn tiến lâm sàng của ung thư. MIB-1 là một kháng thể đơn dòng
để phát hiện kháng nguyên Ki67 và có thể áp dụng với mẫu vùi trong nến và
bộc lộ kháng nguyên bằng nhiệt [159], [196].
24


Hình 1.8: Chu trình tế bào

Hình 1.9: Biểu hiện các tăng sinh trong chu trình tế bào
(Nguồn: BrdU & Ki67
assay [159])