NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------------------------

Nguyễn Văn Bắc

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA
THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2010


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

Nguyễn Văn Bắc

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA
THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh

Hà Nội – 2010


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Lời cảm ơn!
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh, Trưởng
phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học – người thầy đã tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập và hoàn thành
khóa luận này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn Học viện
Quân y cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ
Sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời
gian thực tập và hoàn thành khóa luận.
Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong
khoa Sinh học và các thầy cô giáo trong bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh, trường
Đại học KHTN đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập
và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin dành cho những người thân trong gia đình và bạn bè lòng
biết ơn sâu sắc, những người thân yêu đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi
trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.

Hà Nội, tháng 12 năm 2010
Học viên

Nguyễn Văn Bắc

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Bp

: Base pairs

CNSH

: Công nghệ sinh học

CTCLQG

: Chương trình chống lao quốc gia

DNA

: Acit deoxyribonucleic

dNTPs

: Deoxyribonucleotide Triphosphate

EDR

: Extensively drug resitant (Kháng thuốc mở rộng)

EMB

: Ethambutol.

HRS

: Ba loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin

HRSE

: Bốn loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin và ethambutol

INH

: Isoniazid

IPTG

: Isopropyl-thio-β-D-galactoside

Kb

: Kilo base

LB

: Luria - Bertani

MDR

: Multidrugs resistant (Kháng đa thuốc)

PAS

: Paraminosalicylic acid

PAZ

: Pyrazinamid

PCR

: Polymerase Chain Reaction

RMP

: Rifampicin

RNA

: Acid Ribonucleic

RRDR

: Rifampin resistance determining region (Vùng quyết định kháng
rifampicin)

Taq polymerase

: Thermus aquaticus DNA polymerase

TCYTTG

: Tổ chức Y tế Thế giới

V

: Volume (thể tích)

X-gal

: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

MỤC LỤC
Kết quả phát hiện đột biến.....................................................................................................57


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

MỞ ĐẦU
Bệnh lao và vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) đã được biết rõ từ một
thế kỷ nay. Hiện nay tỷ lệ nhiễm lao được ước tính là 1/3 dân số thế giới, khoảng 9
triệu người mắc lao mới và hơn 3 triệu người chết do lao mỗi năm. Bệnh lao đang trở
nên nghiêm trọng hơn với sự xuất hiện các chủng lao kháng đa thuốc (Multi-Drugs

Resistant - MDR), tức là thể lao với vi khuẩn kháng ít nhất hai loại thuốc chống lao
mạnh nhất là isoniazid (INH) và rifampicin (RMP). Theo số liệu thống kê của chương
trình chống lao Quốc gia năm 2007, thế giới có khoảng 511.000 trường hợp nhiễm lao
kháng đa thuốc, trong đó có hơn 130.000 trường hợp tử vong. Do những khó khăn
trong việc điều trị những bệnh nhân mang các chủng lao kháng thuốc phổ rộng và đa
kháng mà việc phát hiện sớm các chủng lao kháng đa thuốc sẽ trở nên rất quan trọng
trong điều trị bệnh lao.
Hiện nay nhiều nơi chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc vẫn dựa vào phương
pháp nuôi cấy vi khuẩn và làm kháng sinh đồ là chủ yếu, tuy nhiên, việc ứng dụng sinh
học phân tử cũng đang tạo ra những đột phá trong phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc.
Cơ chế kháng thuốc ở vi khuẩn lao là do trong quá trình tiến hóa, có nhiều đột biến
xuất hiện trong một số gen chức năng, trước hết là ở gen rpoB và katG. Thời gian chẩn
đoán có thể rút ngắn chỉ còn vài ngày, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện
cho kiểm soát bệnh lao dễ dàng hơn. Các nghiên cứu về sinh học phân tử trong chẩn
đoán lao kháng thuốc đã chỉ ra rằng mỗi loại kháng thuốc là do xuất hiện các đột biến
trên gen tương ứng chịu trách nhiệm. Chính vì vậy việc xác định các trường hợp nhiễm
lao kháng thuốc thường đi kèm với những chẩn đoán phát hiện đột biến gen đối với các
chủng lao phát hiện được. Các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid là do có liên quan
tới đột biến tại codon 315 trên gen katG, đối với các chủng kháng rifampicin do xuất
hiện các đột biến ở một vùng nóng gồm 27 codon nằm gần trung tâm của gen rpoB.

1


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát
hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử”

Với mục tiêu nghiên cứu: phát hiện nhanh các chủng vi khuẩn lao kháng
thuốc thông qua xác định các vị trí đột biến liên quan kháng thuốc trên gen katG và
rpoB bằng phương pháp giải trình tự và kỹ thuật multiplex real-time PCR.
Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi tiến hành một số nội dung nghiên
cứu như sau:
1.

Xác định trình tự gen rpoB và katG.

2.

Phân tích đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc phân
lập tại Việt Nam trên cơ sở trình tự nucleotide của hai gen rpoB và katG.

3.

Tối ưu hóa thành phần và chu trình bộ kit multiplex real-time PCR phát
hiện nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc.

2


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Chương 1 – TỔNG QUAN
1.1. BỆNH LAO
Lao (Tuberculosis) là một bệnh truyền nhiễm mạn tính, là tình trạng nhiễm vi
khuẩn Mycobacterium tuberculosis, thường gặp nhất ở phổi nhưng cũng có thể ảnh

hưởng đến hệ thần kinh trung ương (lao màng não), hệ bạch huyết, hệ tuần hoàn (lao
kê), xương và khớp. Bệnh lao gắn liền với sự phát triển của xã hội loài người từ hàng
ngàn năm nay, trên thế giới chưa bao giờ và không một quốc gia nào, một khu vực nào,
một dân tộc nào không có người mắc và chết vì bệnh lao. Trực khuẩn lao lần đầu tiên
được bác sĩ Robert Koch đã phát hiện vào ngày 24/3/1882. Trong thời gian này ở Mỹ
và châu Âu, cứ 7 người thì có 1 người chết vì lao, do vậy, phát hiện của Robert Koch là
một bước ngoặt quan trọng trong việc khống chế và loại trừ căn bệnh này. Trước đây,
lao được xem là một trong những căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên thế giới,
lưu hành với tỷ lệ mắc bệnh khá cao, đặc biệt ở các nước thuộc châu Phi và khu vực
châu Á, trong đó có Việt Nam.
Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu.
Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và
Philippines về số bệnh nhân lao, cũng như số bệnh nhân lao xuất hiện hằng năm. Hiện
nay nguy cơ nhiễm lao ở nước ta hằng năm được ước tính là 1,5% dân số (ở các tỉnh
phía Nam là 2%, ở các tỉnh phía Bắc là 1%). Trên thực tế chỉ số nguy cơ nhiễm lao
hàng năm có thể cao hơn 1,5%, như vậy, các con số nêu trên còn có thể lớn hơn. Điều
đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với công tác phòng chống lao không những trong các
năm tới mà có thể trong thời gian khá dài, có thể đến hàng chục năm, ngay cả khi ở
thiên niên kỷ mới [3, 35].
1.2. TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THUỐC
Bệnh lao ngày càng trở nên phức tạp và có ảnh hưởng nặng nề khi xuất hiện
thêm vi khuẩn lao kháng thuốc tạo nên một dạng bệnh khó phòng chống. Các chủng

3


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

lao kháng thuốc được chia làm hai thể, đó là lao kháng đa thuốc (Multi-drugs resistant
- MDR) và lao kháng thuốc phổ rộng (Extensively drug resistant - XDR), những chủng
vi khuẩn lao kháng thuốc này là nguồn lây nhiễm và là mối đe dọa cho sức khỏe của
cộng đồng. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), trên thế giới có khoảng 42
vạn người mắc lao kháng đa thuốc, chiếm số lượng lớn nhất là ở khu vực Tây Thái
Bình Dương có 15 vạn trường hợp, kế đến là khu vực Đông Nam Á và sau đó là khu
vực Châu Phi và Đông Âu. Một số chủng lao vừa kháng đa thuốc vừa kháng thuốc phổ
rộng, có thể coi là loại siêu kháng thuốc [17]. Tình hình lao siêu kháng thuốc cũng
ngày càng trở nên trầm trọng, do vậy từ tháng 11/2004 đến 11/2005, WHO và Trung
tâm Kiểm soát Bệnh Hoa Kỳ đã phân tích 17.890 mẫu đờm gửi từ 40 quốc gia trên
toàn thế giới, và thấy rằng có 20% trường hợp là kháng đa thuốc và 2% trường hợp là
kháng thuốc phổ rộng. Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của Chương trình Chống lao
Quốc gia thì có 32,5% các trường hợp bệnh lao mới mang vi khuẩn lao kháng thuốc [1,
3].
Vi khuẩn lao kháng thuốc là một thách thức lớn, đe dọa công cuộc phòng chống
lao trên toàn cầu, vì các thuốc chống lao có hiệu quả hiện nay đang bị vi khuẩn lao
kháng lại nhất là kháng đa thuốc [10]. Thuốc chống lao có nhiều loại, tác dụng của mỗi
thuốc trên trực khuẩn lao không giống nhau. Hiện nay người ta chia thuốc chống lao
thành hai loại: (1) các thuốc chống lao chủ yếu (còn gọi là các thuốc chống lao loại
một, thuốc chống lao hàng đầu), (2) các thuốc chống lao thứ yếu (còn gọi là các thuốc
chống lao loại hai, thuốc chống lao hàng thứ hai). Trong khi các thuốc chống lao loại
một là những thuốc có hiệu quả nhất và cũng ít độc tính nhất, thì các thuốc chống lao
hàng thứ hai là những thuốc có tác dụng kém hơn lại có độc tính cao và giá thành rất
đắt. Ở New York, chi phí điều trị bệnh nhân nhạy với thuốc chỉ mất 2.000 USD trong
khi đó điều trị bệnh nhân kháng thuốc hết 250.000 USD. Hiện nay số tử vong hàng
năm do lao trên thế giới còn lớn hơn số tử vong do HIV, sốt rét và các bệnh nhiệt đới

4

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

cộng lại. Tổ chức Y tế Thế giới đã nhận định bệnh lao hiện nay đã quay trở lại và trở
nên tồi tệ hơn bởi sự kháng thuốc của vi khuẩn lao [17].
Thuốc kháng sinh đầu tiên dùng để điều trị lao là streptomycin, nhưng vài năm
sau khi kháng sinh này được sử dụng thì người ta đã nhận thấy hiện tượng đề kháng lại
streptomycin của vi khuẩn lao. Sau đó các kháng sinh chống lao khác tiếp tục ra đời:
para – aminosalysilic, isoniazid, rifampicin nhưng đều không mang lại hiệu quả sau
một thời gian điều trị nhất định [7]. Nghiên cứu tìm kiếm hoá dược mới có hiệu quả
điều trị lao, đặc biệt là lao kháng thuốc luôn luôn được thực hiện và càng ngày càng
có nhiều hợp chất chống lao mới được đưa vào sử dụng, ví dụ, gần đây là linezolid
[43]. Tuy nhiên, theo cơ chế và áp lực, vi khuẩn không ngừng biến đổi tạo nên nhiều
chủng mới hơn có khả năng kháng thuốc nhanh chóng hơn [52]. Khả năng điều trị
thành công có thể đạt 95-100% đối với những bệnh nhân mắc lao thông thường, trong
khi tỷ lệ thành công với bệnh nhân mắc lao kháng thuốc chỉ là 20 – 30%, thậm chí
còn không điều trị được khi mắc lao kháng đa thuốc và kháng thuốc phổ rộng mặc dù
đã dùng kết hợp đến năm loại kháng sinh điều trị lao. Vì vậy, việc phát hiện và ngăn
chặn sự lan truyền các chủng lao kháng đa thuốc là vấn đề quan trọng nhất trong điều
trị lao hiện nay [7, 10, 35].
1.3. VI KHUẨN LAO
1.3.1. Cấu tạo
Trực khuẩn lao có dạng hình que, thân mảnh dẻ, không có nha bào, kích thước 2
- 3 µm, dày 0,3 µm, kháng cồn, kháng acid (hình 1.1). Khi được nhuộm bằng phương
pháp Ziehl - Neelsen, trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, do không bị cồn và acid làm
mất màu carbonfuchsin. Ở môi trường nuôi cấy có độ acid đậm đặc nhất định, trực
khuẩn lao vẫn phát triển được, vì vậy, chúng được gọi là trực khuẩn kháng cồn, kháng
toan (acid fast bacilli - AFB), đây là đặc điểm nổi bật của vi khuẩn thuộc chi
mycobacteria. Đặc điểm này rất quan trọng để phát hiện trực khuẩn lao bằng phương

5


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

pháp hình thái học (nhuộm màu) trong các mẫu bệnh phẩm. Một số giả thiết cho rằng
mức kháng acid là do độ dài của các chuỗi mycolic acid. M. tuberculosis có khả năng
thể hiện tất cả các cơ chế cần thiết để tổng hợp các vitamin, amino acid và các enzyme
cofactor thiết yếu của tế bào. Mycobacteria có cấu trúc gần giống với vi khuẩn Gram
dương nhưng chúng không được xếp vào loại vi khuẩn Gram dương do các phân tử
gắn với thành tế bào là lipid chứ không phải protein hay polysaccharide. Do đó, chúng
không giữ lại tinh thể màu tím xuất hiện trong nhuộm Gram [2, 5, 37, 38].
Trực khuẩn lao rất hiếu khí, phát triển tốt nhất ở 37 oC và dưới áp suất của O 2 là
100 mmHg. Đỉnh phổi và vùng phổi dưới xương đòn thường hay mắc lao nhất vì có áp
suất O2 từ 120 – 130 mmHg (khi đứng) rồi đến thân xương và đầu xương vì áp suất O 2
ở đây là 100 mmHg. Lách, gan, dạ dày, thực quản ít mắc lao hơn vì áp suất O 2 thấp.
Trực khuẩn lao sinh sản rất chậm, cứ 20 giờ mới có một lần phân chia tế bào,
trong điều kiện phòng thí nghiệm thì cứ 12 đến 24 giờ M. tuberculosis phân chia một
lần trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng Loewenstein [46]. Tốc độ phát triển
chậm có thể là do tính thẩm thấu của thành tế bào hạn chế trong việc hấp thụ chất dinh
dưỡng và liên quan đến tốc độ tổng hợp ribosome (Hình 1.2).

Hình 1.1. Hình dạng của tế bào M.
tuberculosis
( />be_gallery/tuberculosis)

Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn lao phát

triển trong môi trường nuôi cấy.
( />ory?id=3079114&page=1)

6


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Trực khuẩn lao có cấu tạo rất phức tạp, hoàn hảo mà ít vi sinh vật nào có được.
Dưới kính hiển vi điện tử trực khuẩn lao có cấu tạo chính như sau (hình 1.3):
- Lớp trong cùng có cấu trúc màng, có thành phần chủ yếu là các phospholipid
gồm 2 nhóm: nhóm ưa nước hướng vào bên trong, nhóm kỵ nước quay ra ngoài. Cấu
trúc này tạo nên màng sinh học có tác dụng giúp trực khuẩn điều hòa sự thẩm thấu của
vỏ ngoài trực khuẩn, màng còn chứa các protein chức năng khác như các protein truyền
tín hiệu đến bộ máy trao đổi chất và di truyền trong nguyên sinh chất, các enzyme liên
quan đến quá trình trao đổi chất và sinh năng lượng, các chất mang làm trung gian cho
quá trình vận chuyển các chất dinh dưỡng và các ion. Các enzyme xuyên màng và tổng
hợp màng, tạo thành vách ngăn trong phân chia tế bào, tập hợp và tiết một số enzyme
ngoại bào, sao chép DNA [2, 4, 37, 38].
- Lớp tiếp theo là peptidoglucan liên kết với đường arabinose và các phân tử
mycolic acid tạo nên một bộ khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vi khuẩn có
độ cứng nhất định. Thành tế bào của mycobacteria là cấu trúc phức tạp nhất được biết
ở prokaryote, có một số thành phần hóa học và liên kết chéo bất thường, mức độ liên
kết giữa peptidoglucan ở thành tế bào M. tuberculosis là 70 - 80% trong khi ở vi khuẩn
E. coli là 20 - 30% [38]
- Lớp ngoài được tạo nên bởi sự liên kết giữa các mycolic acid và các chất
phức tạp, đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao và có cấu trúc phức tạp làm
tăng khả năng chống thấm nước của thành tế bào vi khuẩn giúp trực khuẩn tồn tại

lâu với môi trường bên ngoài, chống khả năng bị hủy diệt bởi đại thực bào và các tế
bào miễn dịch [38].
- Lớp vỏ ngoài cùng có vai trò rất quan trọng, có cấu trúc peptidoglyolipid.
Nó đảm bảo cho sự tồn tại của trực khuẩn, làm cho trực khuẩn bền vững với hiện
tượng thực bào, giúp bảo vệ khỏi áp suất thẩm thấu nên khi vào cơ thể trực khuẩn
khó bi tiêu diệt.

7


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Hình 1.3. Cấu tạo thành tế bào của M. tuberculosis
( cell.htm)

1.3.2. Cơ chế gây bệnh
Vi khuẩn lao có thể xâm nhập vào cơ thể qua nhiều con đường khác nhau:
thường là đường hô hấp, hoặc có thể qua đường tiêu hóa, da, kết mạc mắt. Sau khi gây
tổn thương tiên phát, vi khuẩn lao có thể theo đường bạch huyết hoặc đường máu để
đến gây tổn thương thứ phát ở các cơ quan khác: Phổi, thận, màng não, xương, hạch
nhưng thường bị hơn cả là đỉnh phổi, nơi có áp suất oxy là 120 mmHg vì đây là điều
kiện hoạt động tốt cho vi khuẩn lao. Độc lực của vi khuẩn lao có liên quan đến “ Cord
factor” (trehalose - 6,6’- dimycolate) là chất gây ức chế hoạt động của tế bào bạch cầu,
gây nên những u hạt mạn tính [7].
Khi vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể, trong cơ thể xuất hiện đáp ứng miễn dịch
qua trung gian tế bào. Lúc này, đại thực bào, các tế bào lympho T, lympho B và các
nguyên bào sợi kết tập lại tạo các u hạt, với các tế bào lympho vây quanh đại thực bào.
Chức năng của các u hạt không chỉ ngăn cản sự lan tỏa của tế bào M. tuberculosis mà

còn tạo môi trường tại chỗ cho các tế bào của hệ miễn dịch trao đổi thông tin [23]. Bên
trong các u hạt, tế bào lympho T tiết ra các cytokine, như γ interferon, hoạt hóa đại

8


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

thực bào khiến chúng diệt khuẩn tốt hơn. Tế bào lympho T cũng tiêu diệt trực tiếp các
tế bào bị nhiễm. Nhưng điều quan trọng là vi khuẩn không bị u hạt loại trừ hoàn toàn
mà trở nên bất hoạt tạo dạng nhiễm khuẩn “tiềm ẩn” (latent tuberculosis) [18].
1.3.3. Đặc điểm hệ gen
Toàn bộ hệ gen của vi khuẩn lao M. tuberculosis chủng H37Rv được giải trình
tự, phân tích và công bố năm 1998 gồm 4.411.529 bp, với đặc tính là chứa nhiều
guanine và cystosine (G + C khoảng 65 %). Trên 90% trình tự được dự đoán là có mã
hóa cho protein và chỉ có 6 gen giả (pseudogene - gen không mang thông tin di
truyền mã hóa cho protein) [28, 38, 44]. Dữ liệu hệ gen của một số vi khuẩn thuộc chi
Mycobacterium, trước hết là của vi khuẩn lao (M. tuberculosis) và vi khuẩn phong
(M. leprae) có tầm quan trọng đặc biệt trong nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử
hỗ trợ dịch tễ học, di truyền học và nghiên cứu kháng thuốc, số liệu đã được lưu giữ
tại một số trung tâm và có thể sử dụng một số chương trình để truy cập khám phá và
sử dụng [11, 53].
1.4. CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC Ở VI KHUẨN LAO
1.4.1. Kháng sinh trong điều trị lao
Thuốc chống lao có nhiều loại, và tác dụng của chúng lên trực khuẩn lao cũng
không giống nhau. Hiện nay người ta chia thuốc chống lao làm hai loại: (1) Các thuốc
chống lao chủ yếu: gồm năm thuốc chủ yếu đó là: isoniazid (INH), rifampicin (RMP),
ethambutol (EMB), pyrazinamid (PZA), streptomycin (SM). Đây là những thuốc kháng

lao hiệu quả và cũng ít độc tính nhất. (2) Các thuốc chống lao thứ yếu: là những thuốc
chống lao có tác dụng kém hơn và có độc tính cao, không được dùng trong phác đồ
điều trị lao nhưng lại được dùng trong các trường hợp điều trị thất bại do vi khuẩn lao
kháng lại các loại thuốc chống lao loại một. Các thuốc này gồm có: ethionamide,
prothionamide, paraminosalysilic acid (PAS), cycloserine, kanamycin, capreomycin,
thiacetazone, ofloxacin, các quinolone…

9


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Các thuốc isoniazid, cycloserine, kanamycin có tác dụng ức chế tổng vách tế
bào. Các thuốc streptomycin, kanamycin, capreomycin có tác dụng ức chế tổng hợp
protein. Các thuốc rifampicin và ethambutol có tác dụng ức chế sự tổng hợp nucleic
acid. Thuốc paraminosalicylic acid có tác dụng chống chuyển hóa [7, 35, 37, 38].
1.4.2. Nguyên nhân gây kháng thuốc
Vi khuẩn lao kháng thuốc là khi chúng không chịu sự tác động của các loại kháng
sinh dùng điều trị chúng. Thường nói tới vi khuẩn lao kháng thuốc là nói tới những
trường hợp vi khuẩn lao kháng với một trong những thuốc chống lao dòng thứ nhất:
isoniazid, rifampicin, pyrazinamide, ethambutol hoặc streptomycin [7, 35]
Tính kháng thuốc bao gồm chủ yếu 3 nguyên nhân chính:
-

Thuốc hoặc các gen đích bị làm biến đổi trong các chủng kháng thuốc do đó
các thuốc không còn tác dụng nữa trong việc tiêu diệt vi khuẩn.

-

Sản phẩm của gen, mà hoạt tính của nó bị ức chế bởi thuốc được vi khuẩn
sản xuất thừa ra, do đó lượng thuốc mà bệnh nhân uống vào không đủ để ức
chế hoàn toàn vi khuẩn lao.

-

Những thay đổi xảy ra ở mức độ phân tử và cơ chế xâm nhập của thuốc vào
bên trong tế bào vi khuẩn làm cho nồng độ thuốc bên trong tế bào không đạt
tới nồng độ tối thiểu có khả năng giết chết vi khuẩn gây bệnh.

Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn lao có thể xảy ra trước khi xâm nhập (tiên
phát) hoặc sau khi nhập vào cơ thể người bệnh (thứ phát). Vi khuẩn lao kháng thuốc tiên
phát là hiện tượng lây nhiễm bởi một chủng đã kháng thuốc mà vi khuẩn này đã có sự đề
kháng tự nhiên. Vì vậy, bệnh nhân mắc lao do sự lây nhiễm này, ngay từ đầu vi khuẩn
lao xâm nhập vào cơ thể đã có sự đề kháng với thuốc đang sử dụng. Còn hiện tượng
kháng thuốc thứ phát xảy ra đối với các chủng vi khuẩn lao ở bệnh nhân nào đó dùng

10


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

thuốc chống lao không đúng quy định, không đúng liều lượng, thời gian sử dụng thuốc
do đó đã chọn lọc vi khuẩn lao khang thuốc [1, 38].
Các chủng vi lao kháng thuốc được chia làm hai loại: (1) Các chủng lao kháng
đa thuốc (MDR – TB): Là trường hợp khi các chủng vi khuẩn lao kháng đồng thời hai
thuốc chống lao mạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin. (2) Các chủng lao

kháng thuốc phổ rộng (XDR – TB): Là trường hợp khi vi khuẩn lao đã ở tình trạng
kháng đa thuốc và có thêm tính kháng một trong ba loại thuốc chống lao là
capreomycin, kanamycin, amikacin [49].
Ngày nay khi nghiên cứu về sinh học phân tử, người ta đã xác định được cơ chế
kháng lại nhiều loại kháng sinh có liên quan đến các gen tương ứng. Trong hình 1.4 mô
tả các cơ chế phân tử của hiện tượng kháng đa thuốc ở vi khuẩn lao. Trong đó, kháng
isoniazid được cho là liên quan đến các gen: KatG, inhA, aphC và kasA. Kháng
streptomycin có thể là do đột biến ở gen rpsL. Kháng pyrazinamid có thể liên quan đến
gen pncA. Kháng quinolone có thể liên quan tới gen gyrA. Kháng rifampicin được xác
định là liên quan đến đột biến ở vùng gần lõi của gen rpoB, gen mã hóa tiểu phần β của
RNA polymerase [7, 25]. Trong luận văn này, chúng tôi tập trung nghiên cứu cơ chế
kháng đa thuốc, tức là trường hợp vi khuẩn lao kháng đồng thời hai thuốc chống lao
mạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin, điều đó đồng nghĩa với việc nghiên cứu
các đột biến trên gen rpoB với katG.

11


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Hình 1.4. Cơ chế kháng đa thuốc của vi khuẩn lao
( />
1.4.3. Rifampicin và cơ chế kháng
Rifampicin tên khoa học là 3 –[[(4 – methyl – 1 – pipeainyl) imino] methyl]
(hình 1.5A). Rifampicin là dẫn xuất bán tổng hợp từ rifampicin B, một kháng sinh
được chiết xuất từ nấm Streptomyces mediterranei, là thuốc có hoạt tính diệt khuẩn
mạnh, tiệt khuẩn, thuốc diệt vi khuẩn lao trong và ngoài tế bào. Rifampicin không có
hiện tượng kháng thuốc chéo với các loại thuốc chữa lao khác. Nồng độ ức chế tối

thiểu (minimum inhibitory concentration - MIC) đối với vi khuẩn là 5 - 200 ng/ml (in
vitro). Đây là thuốc ức chế RNA polymerase mạnh nhất [29, 48].

12


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

A

B

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của rifampicin (A) và isoniazid (B) [48]

Cơ chế tác động của rifampicin liên quan đến khả năng ức chế hoạt động
của RNA polymerase. Enzyme này là một phức hợp oligomer gồm bốn tiểu đơn
vị khác nhau (α, β, β’, ω), và được mã hóa tương ứng bởi các gen rpoA, rpoB,
rpoC, rpoD [7, 20].
Khi rifampicin gắn với tiểu đơn vị β của RNA polymerase (rpoB), làm ức chế
các hoạt động sao chép tạo ra các mRNA của vi khuẩn lao và do đó làm ngưng trệ các
hoạt động sống của vi khuẩn lao. Đây là cơ chế cơ chế tác dụng của RMP đối với vi
khuẩn lao (hình 1.6).

Hình 1.6. Cấu trúc tinh thể liên kết giữa rifampicin và RNA polymerase [20]

13

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Gen rpoB có kích thước 3519 bp, mã hóa cho tiểu phần β của RNA polymerase
(Tuberculosis, 2007). Những đột biến kháng kháng sinh rifampicin thường xảy ra trên
đoạn gen rpoB, nhất là đoạn nằm gần trung tâm của gen dài 81 bp được giới hạn từ bộ
ba 507 đến 533, người ta gọi đây là vùng “nóng” – “hot-spot region” (hình 1.7). Đột
biến ở bộ ba thứ 526, 516, 531, cho kết quả đề kháng với rifampicin cao; đột biến ở bộ
ba 510, 515 và 512 thì cho khả năng kháng rifampicin ở mức độ thấp hơn [47]. Đoạn
nucleotide của vùng nóng gồm:
507-GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC
CCG CTG TCG GGC TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG CGC CTG-533
Mỗi nucleotide trên đoạn này có thể bị thay thế, hoán đổi vị trí, mất đi, thêm vào
để tạo ra các đột biến được thể hiện trên hình 1.7 như sau: [41].

Hình 1.7. Trình tự nucleotide và các vị trí có khả năng xảy ra đột biến trên đoạn “nóng”
của gen rpoB [41]

- Khi xảy ra đột biến gần vùng lõi của gen rpoB sẽ làm thay đổi cấu trúc tiểu
phần β của RNA polymerase mà nó mã hóa nên làm cho khả năng kết hợp của RMP
với tiểu phần này giảm đi. Kết quả là tác dụng của rifampicin đối với vi khuẩn lao

14


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

giảm hoặc mất đi. Như vậy đột biến trên vùng gen này của rpoB đã làm cho vi khuẩn
lao trở nên kháng thuốc với rifampicin.
- 90 - 95 % các chủng M. tuberculosis kháng rifampicin được xác định là do các
đột biến trên vùng gen nóng 81 bp này của rpoB. Như vậy còn 5 - 10 % các chủng vi
khuẩn lao không có đột biến trên vùng này của gen rpoB. Điều này cho thấy cần phải xác
định thêm những đột biến khác trên gen này hoặc những gen khác có liên quan để xác
định chính xác và toàn bộ cơ chế kháng rifampicin của vi khuẩn lao [19, 37].
1.4.4. Isoniazid và cơ chế kháng
Isoniazid có tên khoa học là isonicotinylhydrazine (INH) (hình 1.5B), là thuốc
chống lao đặc hiệu cao, có tác dụng chống lại M. tuberculosis và các loại
Mycobacterium không điển hình khác như M. bovis, M. kansasii. Isoniazid diệt khuẩn
phụ thuộc vào nồng độ thuốc ở vị trí tổn thương và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn. Cơ
chế tác dụng của isoniazid có liên quan tới sự hình thành phức hệ acyl isonicotinicNADH và như đã trình bày ở trên chúng ức chế sự tổng hợp acid mycolic cần cho
thành tế bào vi khuẩn lao.
Gen katG có kích thước 2223 bp mã hóa catalase – peroxidase. Enzyme này
hoạt hóa INH bằng cách kết hợp acyl isonicotinic với NADH để tạo thành phức hệ acyl
isonicotinic-NADH. Phức hệ này liên kết chặt chẽ với ketoenoylreductase (mã hóa bởi
gen InhA), theo đó làm ngăn cản sự hình thành cơ chất enoyl-AcpM và hoạt động tổng
hợp acid béo. Quá trình này làm ức chế sự tổng hợp acid mycolic cần cho thành tế bào
vi khuẩn lao.

15


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Hình 1.8. Cơ chế kháng INH ở vi khuẩn lao
( />

Cơ chế phân tử của tính kháng INH chủ yếu có liên quan tới đột biến thêm
đoạn/mất đoạn hoặc các đột biến nhầm nghĩa/vô nghĩa, trong đó chủ yếu diễn ra tại
codon 315 (Ser à Thr) của gen katG mã hóa catalase peroxidase [26]. Nếu có sự biến
dạng hay đột biến ở base thứ 2 tại codon 315 của gen katG (AGC biến đổi thành ACC
hay ACA) sẽ dẫn đến làm giảm hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của catalase peroxidase,
do đó M. tuberculosis sẽ trở thành kháng thuốc INH (hình 1.8) [14]. Do đó phát hiện sự
thay đổi di truyền này trong gen katG có thể cung cấp một phương pháp sàng lọc
nhanh và chính xác cho việc phát hiện các chủng M. tuberculosis kháng isoniazid.
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC
1.5.1. Đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm cận lâm sàng
*) Đặc điểm lâm sàng
Nhìn chung các dấu hiệu lâm sàng của bệnh lao có vi khuẩn kháng thuốc không
khác nhiều với bệnh lao mà vi khuẩn nhạy cảm với thuốc.

16


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

Trường hợp nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc tiên phát có thể có triệu chứng cấp
tính hơn, sốt cao hơn.
Đối với kháng thuốc mắc phải phần lớn gặp ở những bệnh nhân lao mạn tính,
được điều trị ít nhất 2 lần. Những bệnh nhân này cũng chiếm tỷ lệ chủ yếu trong số
bệnh nhân lao kháng đa thuốc. Hầu hết bệnh lao kháng đa thuốc bệnh tiến triển, hay
gặp dò phế quản – màng phổi mà điều trị gặp nhiều khó khăn [7].
*) Xét nghiệm lâm sàng
- Phản ứng Tuberculin: thường thì phản ứng da ở những bệnh nhân kháng thuốc tiên
phát có mức độ mạnh hơn so với những bệnh nhân có vi khuẩn nhạy cảm với thuốc.

Đối với kháng thuốc mắc phải, đặc biệt là kháng đa thuốc ở bệnh nhân đồng nhiễm
HIV (+) thì tỷ lệ phản ứng này âm tính khá cao.
- Hình ảnh X Quang: khi chụp phổi thẳng, kết quả cho thấy hình ảnh về bệnh lao
phổi giữa trường hợp lao kháng thuốc tiên phát với trường hợp nhạy cảm với
thuốc không có sự khác biệt. Nhưng những trường hợp kháng thuốc mắc phải thì
gặp nhiều là thể xơ hang, diện tích phổi tổn thương nhiều hơn và có nhiều hang,
kích thước của hang lớn hơn.
- Xét nghiệm vi khuẩn:
+ Về hình thể: các vi khuẩn bình thường có cấu tạo thành tế bào 3 lớp nhưng ở
vi khuẩn kháng thuốc thành tế bào có cấu tạp 4 lớp (vi khuẩn có thêm một lớp
peptidoglycolipid ở ngoài cùng). Vi khuẩn kháng với rifampicin có thành tế
bào cũng dày hơn hẳn so với vi khuẩn nhạy với thuốc. Khuẩn lạc của vi
khuẩn kháng thuốc có thể không điển hình khi nuôi cấy, mọc cằn cỗi [7]
+ Về số lượng vi khuẩn khi soi kính và nuôi cấy: những bệnh nhân kháng thuốc
thứ phát có số lượng vi khuẩn khi soi kính cao hơn nhiều so với bệnh nhân
thông thường. Không có sự khác nhau nhiều giữa bệnh nhân kháng thuốc tiên
phát và bệnh nhân thông thường. Khi nuôi cấy trên môi trường đặc số khuẩn
lạc mọc ở bệnh nhân kháng thuốc mắc phải là cao hơn và thời gian mọc

17


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

nhanh hơn so với kháng thuốc tiên phát và ở những bệnh nhân này số khuẩn
lạc lại cao hơn ở bệnh nhân thông thường [7].
+ Về đặc điểm kháng sinh đồ: kháng thuốc tiên phát thường kháng hay kháng
với nồng độ thấp, kháng thuốc mắc phải thường kháng với nồng độ cao hơn.

Kháng thuốc tiên phát hay gặp với một thuốc, kháng thuốc thứ phát thường tỷ
lệ kháng cùng lúc với nhiều thuốc cao hơn [7].
Như vậy không thể dựa vào lâm sàng hay thời gian điều trị hiệu quả để chẩn
đoán bệnh nhân lao kháng thuốc được. Các xét nghiệm cận lâm sàng khác chỉ có giá trị
gợi ý. Chẩn đoán bệnh lao kháng thuốc hiện nay vẫn phải lấy kết quả kháng sinh đồ
làm tiêu chuẩn.
1.5.2. Xác định kiểu hình
Gồm các phương pháp sau: Phương pháp xác định tương quan, phương pháp
xác định tỷ lệ kháng, phương pháp đo màu, phương pháp khử nitrate và nhiều phương
pháp khác [13]. Các phương pháp này đều xác định khả năng phát triển của vi khuẩn
lao trong môi trường nuôi cấy có kháng sinh, từ đó đưa ra kết luận về khả năng kháng
thuốc của chủng vi khuẩn lao đang nghiên cứu [12]. Nhược điểm của các phương pháp
này là vi khuẩn lao mọc chậm, trên môi trường Lowenstein-Jensen thường mất 4-6
tuần. Sử dụng hệ thống môi trường lỏng được cải tiến như MGIT, BATEC cũng mất 2
tuần. Điều này làm cho công tác điều trị và kiểm soát tình hình bệnh lao cũng như bệnh
lao kháng thuốc còn khó khăn.
1.5.3. Xác định kiểu gen
Hiện nay có nhiều phương pháp xác định kiểu gen được ứng dụng để chẩn đoán
vi khuẩn lao kháng thuốc [1, 4], giải trình tự gen [6] , lai trên pha rắn [36], Real – time
PCR [14]
Các phương pháp chẩn đoán xác định kiểu gen dựa trên cơ sở phát hiện đột biến
ở các gen có liên quan tới tính kháng thuốc tương ứng [51], sử dụng các kỹ thuật cao,

18


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

đòi hỏi thiết bị hiện đại, tốn kém và cần nhân lực có trình độ chuyên sâu nhưng thời
gian chẩn đoán bằng phương pháp này nhanh hơn, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
Để xác định đột biến trên gen có liên quan tới kháng thuốc (gen rpoB và katG)
hiện nay giải trình tự gen vẫn là phương pháp xác định cơ bản, chính xác nhất và thời
gian cho kết quả từ 3 - 5 ngày. Sau khi giải trình tự đoạn gen vừa được tách dòng từ
chủng lao nghiên cứu ta sẽ so sánh trật tự sắp xếp các nucleotide ở mẫu thí nghiệm với
trật tự nucleotide chuẩn để biết được các vị trí sai lệch [22, 16].
Việc xác định các đột biến có liên quan kháng thuốc rifampicin và isoniazid
bằng kỹ thuật giải trình tự cho biết chính xác vị trí đột biến cũ và mới trên gen cần
nghiên cứu, mang lại hiểu biết sâu sắc về sự đa dạng của cấu trúc quần thể vi khuẩn lao
ở bệnh nhân lao kháng thuốc, đánh giá được tỷ lệ đột biến liên quan kháng thuốc trên
các chủng lao phân lập từ các vùng địa lý khác nhau. Qua đó làm tiền đề xây dựng một
số bộ kit real-time PCR, nhằm phát hiện nhanh vi khuẩn lao kháng rifampicin và
isoniazid tại Việt Nam.
1.5.4. Kỹ thuật real-time PCR và multiplex real-time PCR
Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được
ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, do đặc điểm này nên với real-time PCR
người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các bước thí nghiệm để đọc và
phân tích kết quả để xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không vì kết quả cuối
cùng của phản ứng khuếch đại cũng được hiển thị ngay sau khi hoàn tất phản ứng
khuếch đại. Như vậy, nên có thể nói real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích
trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch
đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để
người làm thí nghiệm có thể thấy được.
Chìa khóa của kỹ thuật real-time PCR chính là hóa chất và thuốc thử có trong
phản ứng, trong đó chất huỳnh quang được thêm vào hỗn hợp phản ứng là yếu tố đầu

19

Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Văn Bắc

tiên mà người làm real-time PCR cần quan tâm. Chất huỳnh quang này phải làm thế
nào để ống phản ứng có thể phát được huỳnh quang khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích
thích một khi trong ống phản ứng này có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại từ
DNA đích, và sẽ không thể phát được huỳnh quang nếu không có sản phẩm khuếch đại
trong ống. Cho đến nay, nhiều chất huỳnh quang như vậy đã được tìm ra và sử dụng
rộng rãi. Trong phạm vi khóa luận này, chúng tôi chỉ xin trình bày chất huỳnh quang
thường được sử dụng nhất đó là Taqman probe [8].
Probe hay còn gọi là “đoạn dò” là những đoạn oligonucletides sợi đơn có trình
tự có thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích (trong PCR, đó là
sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích). Đoạn dò này với đầu 5’ có gắn chất phát
huỳnh quang (gọi là reporter) còn đầu 3’ có gắn chất dập tắt huỳnh quang tương ứng
(gọi là quencher) để dập tắt được ánh sáng huỳnh quang được phát ra từ reporter. Cơ
chế của sự phát tín hiệu huỳnh quang khi có sản phẩm khuếch đại là nhờ hoạt tính 5’-3’
exonuclease của enzyme Taq polymerase có khả năng cắt bỏ các probe khi các probe
bắt cặp lên sợi khuôn và cản đầu 3’ của mồi khi enzyme kéo dài mồi để tổng hợp sợi
bổ sung (hình 1.9)

20