NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ SINH PHẨM CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO KHÔNG ĐIỂN HÌNH (NONTUBERCULOSIS MYCOBACTERIA NTM) TRÊN BỆNH NHÂN NGHI MẮC BỆNH LAO TẠI VIỆT NAM

SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO HÀ NỘI
TRƯỜNG THPT CHUYÊN HÀ NỘI-AMSTERDAM
QUẬN CẦU GIẤY
**************

ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT
DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP THÀNH PHỐ
LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 - 2015)
Tên đề tài: NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ SINH PHẨM
CHẨN ĐỐN VI KHUẨN LAO KHƠNG ĐIỂN HÌNH
(NONTUBERCULOSIS MYCOBACTERIA - NTM)
TRÊN BỆNH NHÂN NGHI MẮC BỆNH LAO
TẠI VIỆT NAM
Lĩnh vực: Y- Sinh
NGƯỜI HƯỚNG DẪN

TÁC GIẢ:

- Th.S Phan Minh Tuấn

1. Nguyễn Cơng Minh

- Phịng Phát triển Cơng nghệ
Y-Sinh, Trung tâm phát triển
công nghệ cao, Viện Hàn lâm
Khoa học kĩ thuật Việt Nam

2. Nguyễn Trọng Hiếu

Lớp: 12 Sinh - Trường THPT
Chuyên Hà Nội Amsterdam

Lớp: 12 Sinh - Trường THPT
Chuyên Hà Nội Amsterdam

Hà Nội, tháng 12 năm 2014

1


LỜI CẢM ƠN
Nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn công ty Intel đã tổ chức Hội thi
Khoa học trẻ Intel ISEF trên toàn thế giới, cảm ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo Việt
Nam, Sở Giáo dục và Đào tạo Hà Nội chi nhánh công ty ISEF tại Việt Nam đã
phối hợp tổ chức nên hội thi này tại Việt Nam, tạo cơ hội cho nhóm tiếp cận gần
hơn với các hoạt động khoa học trẻ trên toàn thế giới. Đây là một cơ hội tốt cho
nhóm nghiên cứu nói riêng và học sinh Hà Nội cũng như học sinh Việt Nam nói
chúng có dịp đào sâu kiến thức, đưa ra ý tưởng khoa học và hiện thực hóa, làm
quen các kỹ năng mềm khác, giao lưu và học hỏi với bạn bè trong nước và quốc tế.
Trong quá trình thực hiện đề tài, nhóm đã nhận được sự quan tâm chỉ đạo,
những góp ý chân thành của Ban Giám hiệu và Nhóm Khoa học cũng như sự tạo
điều kiện của các thầy cô giáo trường THPT Hà Nội Amsterdam. Đồng thời, sự hỗ
trợ của phịng phát triến cơng nghệ Y Sinh, Trung tâm phát triển công nghệ cao
thuộc viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam về mặt địa điểm, cơ sở vật
chất, trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm là vơ cùng q giá với nhóm nghiên cứu
trong suốt thời gian nghiên cứu.
Nhóm thực hiện đề tài đã nhận được sự hỗ trợ vô cùng nhiệt tình của các
giáo viên hướng dẫn: ThS Trần Thị Thu Hương, cô Nguyễn Thị Hưởng cùng các
chuyên gia là ThS Phan Minh Tuấn, ThS Nguyễn Chi Mai và KS Lê Thành Long
đã hỗ trợ hết lịng về mặt lí thuyết và kĩ năng, nhờ đó mà nhóm nghiên cứu có thể
hồn thành được đề tài này.
Một lần nữa, nhóm xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến các cá

nhân, tập thể và tổ chức về những đóng góp q báu và sự ủng hộ nhiệt tình trong
suốt thời gian thực hiện đề tài.

Nhóm nghiên cứu

2


Mục lục
Mục lục.................................................................................................................................................................................................. 3
Mục lục bảng...................................................................................................................................................................................... 5
Mục lục hình ảnh.............................................................................................................................................................................. 7
TÓM TẮT.............................................................................................................................................................................................. 9
I.GIỚI THIỆU.................................................................................................................................................................................... 10
1.LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI............................................................................................................................................................ 10
2.MỤC TIÊU ĐỀ TÀI................................................................................................................................................................. 11
3.TÍNH MỚI VÀ SÁNG TẠO CỦA ĐỀ TÀI......................................................................................................................... 12
II.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU........................................................................................................................................................ 12
1.KHÁI NIỆM CHUNG.............................................................................................................................................................. 12
Hình 1: MAC trên môi trường Lowenstein – Jensen sau 6 tuần ni cấy..............................................................13
2.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC............................................................................................13
Hình 2. Tỉ lệ các ca bệnh do vi khuẩn nhóm NTM gây ra tại khu vực châu Á....................................................14
3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG............................................................................15
Bảng 1. Thành phần phản ứng PCR...................................................................................................................................... 16
Bảng 2. Chu kỳ nhiệt thông thường cho phản ứng PCR............................................................................................... 16
4.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ DỰ KIẾN.................................................................................................... 17
III.QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU.............................................................................................................................................. 17
1.THU THẬP, VẬN CHUYỂN, BẢO QUẢN MẪU BỆNH PHẨM VÀ CHỦNG VI KHUẨN..................................17
Bảng 3. Danh sách các mẫu...................................................................................................................................................... 17
2.XỬ LÝ VÀ KHỬ TẠP MẪU BỆNH PHẨM..................................................................................................................... 18

3.TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MAC......................................................................................................................... 19
4.KIỂM TRA KẾT QUẢ SẢN PHẨM PCR ......................................................................................................................... 20
Hình 3: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm thơng tin qua từ khóa “mycobacterium” trên cổng thơng tin

3


NCBI.................................................................................................................................................................................................... 21
Hình 4: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium 16S” trên
cổng thơng tin NCBI..................................................................................................................................................................... 22
Hình 5: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium rpoB” trên
cổng thơng tin NCBI..................................................................................................................................................................... 22
Hình 6: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium hsp65” trên
cổng thơng tin NCBI..................................................................................................................................................................... 23
Bảng 4. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại DNA tổng số thu từ mẫu...................................................24
5.GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GENE TRÊN PHẦN MỀM CHUYÊN DỤNG
24
Bảng 5. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự............................................................................................................ 25
Hình 7: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự.................................................................................................... 25
Hình 8: Kết quả trình tự được so sánh với các mẫu đối chứng.................................................................................27
Hình 9: Kết quả trình tự được so sánh với ngân hàng genethế giới (Genbank) để tìm sự tương đồng..28
IV.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................................................................................................... 28
1.KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ......................................................................................................................... 28
Hình 10: Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ mẫu NTM1 theo 3 quy trình tách chiết.....................28
2.KẾT QUẢ NHÂN GENE (PCR)........................................................................................................................................... 28
Hình 11: Kết quả điện của thí nghiệm tìm nhiệt độ bắt cặp và nồng độ DNA tổng số phù hợp..................29
Hình 12: Kết quả điện di sản phẩm PCR.............................................................................................................................. 30
3.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE .................................................................................................... 31
4. THỜI GIAN HOÀN THÀNH MỘT LẦN XÉT NGHIỆM............................................................................................. 31
V.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................................................................................... 32

1.KẾT LUẬN................................................................................................................................................................................ 32
PHỤ LỤC............................................................................................................................................................................................ 34

4


Mục lục bảng
Mục lục.................................................................................................................................................................................................. 3
Mục lục bảng...................................................................................................................................................................................... 5
Mục lục hình ảnh.............................................................................................................................................................................. 7
TÓM TẮT.............................................................................................................................................................................................. 9
I.GIỚI THIỆU.................................................................................................................................................................................... 10
1.LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI............................................................................................................................................................ 10
2.MỤC TIÊU ĐỀ TÀI................................................................................................................................................................. 11
3.TÍNH MỚI VÀ SÁNG TẠO CỦA ĐỀ TÀI......................................................................................................................... 12
II.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU........................................................................................................................................................ 12
1.KHÁI NIỆM CHUNG.............................................................................................................................................................. 12
Hình 1: MAC trên môi trường Lowenstein – Jensen sau 6 tuần ni cấy..............................................................13
2.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC............................................................................................13
Hình 2. Tỉ lệ các ca bệnh do vi khuẩn nhóm NTM gây ra tại khu vực châu Á....................................................14
3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG............................................................................15
Bảng 1. Thành phần phản ứng PCR...................................................................................................................................... 16
Bảng 2. Chu kỳ nhiệt thông thường cho phản ứng PCR............................................................................................... 16
4.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ DỰ KIẾN.................................................................................................... 17
III.QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU.............................................................................................................................................. 17
1.THU THẬP, VẬN CHUYỂN, BẢO QUẢN MẪU BỆNH PHẨM VÀ CHỦNG VI KHUẨN..................................17
Bảng 3. Danh sách các mẫu...................................................................................................................................................... 17
2.XỬ LÝ VÀ KHỬ TẠP MẪU BỆNH PHẨM..................................................................................................................... 18
3.TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MAC......................................................................................................................... 19
4.KIỂM TRA KẾT QUẢ SẢN PHẨM PCR ......................................................................................................................... 20

Hình 3: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm thơng tin qua từ khóa “mycobacterium” trên cổng thơng tin

5


NCBI.................................................................................................................................................................................................... 21
Hình 4: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium 16S” trên
cổng thơng tin NCBI..................................................................................................................................................................... 22
Hình 5: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium rpoB” trên
cổng thơng tin NCBI..................................................................................................................................................................... 22
Hình 6: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium hsp65” trên
cổng thơng tin NCBI..................................................................................................................................................................... 23
Bảng 4. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại DNA tổng số thu từ mẫu...................................................24
5.GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GENE TRÊN PHẦN MỀM CHUYÊN DỤNG
24
Bảng 5. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự............................................................................................................ 25
Hình 7: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự.................................................................................................... 25
Hình 8: Kết quả trình tự được so sánh với các mẫu đối chứng.................................................................................27
Hình 9: Kết quả trình tự được so sánh với ngân hàng genethế giới (Genbank) để tìm sự tương đồng..28
IV.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................................................................................................... 28
1.KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ......................................................................................................................... 28
Hình 10: Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ mẫu NTM1 theo 3 quy trình tách chiết.....................28
2.KẾT QUẢ NHÂN GENE (PCR)........................................................................................................................................... 28
Hình 11: Kết quả điện của thí nghiệm tìm nhiệt độ bắt cặp và nồng độ DNA tổng số phù hợp..................29
Hình 12: Kết quả điện di sản phẩm PCR.............................................................................................................................. 30
3.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE .................................................................................................... 31
4. THỜI GIAN HOÀN THÀNH MỘT LẦN XÉT NGHIỆM............................................................................................. 31
V.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................................................................................... 32
1.KẾT LUẬN................................................................................................................................................................................ 32
PHỤ LỤC............................................................................................................................................................................................ 34

6


Mục lục hình ảnh
Mục lục.................................................................................................................................................................................................. 3
Mục lục bảng...................................................................................................................................................................................... 5
Mục lục hình ảnh.............................................................................................................................................................................. 7
TĨM TẮT.............................................................................................................................................................................................. 9
I.GIỚI THIỆU.................................................................................................................................................................................... 10
1.LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI............................................................................................................................................................ 10
2.MỤC TIÊU ĐỀ TÀI................................................................................................................................................................. 11
3.TÍNH MỚI VÀ SÁNG TẠO CỦA ĐỀ TÀI......................................................................................................................... 12
II.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU........................................................................................................................................................ 12
1.KHÁI NIỆM CHUNG.............................................................................................................................................................. 12
Hình 1: MAC trên mơi trường Lowenstein – Jensen sau 6 tuần nuôi cấy..............................................................13

7


2.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC............................................................................................13
Hình 2. Tỉ lệ các ca bệnh do vi khuẩn nhóm NTM gây ra tại khu vực châu Á....................................................14
3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG............................................................................15
Bảng 1. Thành phần phản ứng PCR...................................................................................................................................... 16
Bảng 2. Chu kỳ nhiệt thông thường cho phản ứng PCR............................................................................................... 16
4.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ DỰ KIẾN.................................................................................................... 17
III.QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU.............................................................................................................................................. 17
1.THU THẬP, VẬN CHUYỂN, BẢO QUẢN MẪU BỆNH PHẨM VÀ CHỦNG VI KHUẨN..................................17
Bảng 3. Danh sách các mẫu...................................................................................................................................................... 17
2.XỬ LÝ VÀ KHỬ TẠP MẪU BỆNH PHẨM..................................................................................................................... 18

3.TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MAC......................................................................................................................... 19
4.KIỂM TRA KẾT QUẢ SẢN PHẨM PCR ......................................................................................................................... 20
Hình 3: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm thơng tin qua từ khóa “mycobacterium” trên cổng thơng tin
NCBI.................................................................................................................................................................................................... 21
Hình 4: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium 16S” trên
cổng thơng tin NCBI..................................................................................................................................................................... 22
Hình 5: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium rpoB” trên
cổng thơng tin NCBI..................................................................................................................................................................... 22
Hình 6: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thơng qua từ khóa “mycobacterium hsp65” trên
cổng thơng tin NCBI..................................................................................................................................................................... 23
Bảng 4. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại DNA tổng số thu từ mẫu...................................................24
5.GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GENE TRÊN PHẦN MỀM CHUN DỤNG
24
Bảng 5. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự............................................................................................................ 25
Hình 7: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự.................................................................................................... 25
Hình 8: Kết quả trình tự được so sánh với các mẫu đối chứng.................................................................................27
Hình 9: Kết quả trình tự được so sánh với ngân hàng genethế giới (Genbank) để tìm sự tương đồng..28
IV.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................................................................................................... 28

8


1.KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ......................................................................................................................... 28
Hình 10: Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ mẫu NTM1 theo 3 quy trình tách chiết.....................28
2.KẾT QUẢ NHÂN GENE (PCR)........................................................................................................................................... 28
Hình 11: Kết quả điện của thí nghiệm tìm nhiệt độ bắt cặp và nồng độ DNA tổng số phù hợp..................29
Hình 12: Kết quả điện di sản phẩm PCR.............................................................................................................................. 30
3.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE .................................................................................................... 31
4. THỜI GIAN HOÀN THÀNH MỘT LẦN XÉT NGHIỆM............................................................................................. 31
V.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................................................................................... 32

1.KẾT LUẬN................................................................................................................................................................................ 32
PHỤ LỤC............................................................................................................................................................................................ 34

TÓM TẮT
Cho đến thời điểm hiện tại, vào thế kỷ thứ 21, vi khuẩn lao vẫn luôn gây ra
các vấn đề trầm trọng cho y tế và sức khỏe cộng đồng. Mặc dù sự đầu tư cho y tế
đã tốt hơn rất nhiều với các phương tiện trang thiết bị máy móc hiện đại, các
phương pháp chẩn đoán hiệu quả đã làm giảm thiểu các ca lây truyền và nhiễm lao
mới, nhưng các hiện tượng mắc lao khơng điển hình (Nontuberculosis
mycobacteria - NTM) lại gia tăng trên đối tượng bệnh nhân có tình trạng suy giảm
miễn dịch, có tiền sử bệnh lý mãn tính tại phổi hay có những bất thường về kiểu
genecủa bệnh xơ hóa kén, α-antitrypsin, interferon-gamma (IFN-γ), interleukin-12.
9


Tại Việt Nam, việc chẩn đoán NTM tại các bệnh viện và cơ sở y tế từ trước
đến nay đều sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống cho kết quả chậm
(15 – 20 ngày) và thường xuyên bị tạp nhiễm, nên khả năng đặc hiệu trong chẩn
đoán là thấp. Ở lĩnh vực chẩn đốn phân tử thì gần như chưa có nghiên cứu nào về
vấn đề này triển khai được ghi nhận. Cũng phải nói rằng việc chẩn đoán cận lâm
sàng về NTM hiện nay tại các cơ sở y tế tại Việt Nam chưa được đầu tư nghiên cứu
một cách có bài bản, chính điều này đã góp phần đưa bệnh lao khơng điển hình do
NTM âm thầm bùng phát gây tác hại lớn đến sức khỏe và kinh tế của người bệnh.
Do vậy, Nhóm nghiên cứu đề xuất nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chẩn đoán phân tử
hiện đại trong việc chẩn đoán phát hiện sớm sự có mặt của vi khuẩn lao khơng điển
hình (NTM) trong mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nghi mắc lao nhưng không đáp
ứng với công thức điều trị lao thông thường, mục tiêu của nghiên cứu tập trungtối
ưu các khâu trong quá trình thực hiện như khâu xử lý mẫu, tách chiết DNA của vi
khuẩn từ mẫu bệnh phẩm và khâu xác định kết quả theo hướng đơn giản, dễ thao
tác, hạn chế tối đa khả năng nhiễm chéo giữa các mẫu xét nghiệm, an toàn cho

người sử dụng và thân thiện với mơi trường.

Từ khóa: Mycobacterium tuberculosis (MTB), Non Tubercolusis Mycobacterium
(NTM), Mycobacterium avium complex (MAC), PCR, lao điển hình, lao khơng
điển hình, lao mơi trường

I.

GIỚI THIỆU

1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Bệnh Lao (Mycobacterium Tuberculosis - MTB) – Tác nhân gây bệnh nhiễm
trùng chiếm tỉ lệ tử vong hàng đầu tại các Quốc gia đang phát triển trong khoảng
15 năm trở lại đây. Cùng với sự bùng phát của đại dịch HIV trên tồn cầu, mơi
trường sống ngày càng suy thoái, người nhập cư từ các quốc gia kém phát triển,
bệnh nhân mắc lao bỏ điều trị … ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng miễn dịch của
con người và sức khỏe cộng đồng, và quan trọng nhất sự quay trở lại của bệnh lao
– lao kháng thuốc đã đặt nhân loại một lần nữa đối diện với đại dịch lao tưởng như
đã được thanh toán ở thế kỷ trước.
Còn tại các nước phát triển, nơi bệnh lao về cơ bản được khống chế thì bệnh

10


lao khơng điển hình (Nontubercolusis Mycobacterium – NTM) lại là tác nhân gây
nhiễm trùng âm thầm và nguy hại đối với các bệnh nhân mắc bệnh liên quan đến
tình trạng miễn dịch.
Tại Việt Nam, nếu trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) là tác nhân
gây nhiễm trùng bệnh viện hàng đầu thì NTM âm thầm đứng ở vị trí thứ 2 về độ
nguy hiểm, và tác hại to lớn của nó với bản thân bệnh nhân, liệu trình điều trị đã

gây ra tổn thất nặng nề về kinh tế, và tâm lý cho người bệnh. Thông thường một
trường hợp nuôi cấy xác định có vi khuẩn lao M.tuberculosis thì vấn đề điều trị
thường đặt ra sớm. Nhưng với một trường hợp ni cấy NTM (+) thì khơng phải
lúc nào cũng đặt vấn đề điều trị mà cần phải cần nhắc giữa nguy cơ và lợi ích cho
người bệnh. Ngồi ra cịn thấy rằng có sự khó khăn trong việc điều trị phức tạp và
kéo dài cần kết hợp nhiều loại thuốc hoặc sự nhiễm đồng thời nhiều loại bệnh cơ
hội khác cùng NTM. Vì vậy, việc xác định rõ ràng căn nguyên gây bệnh nhiễm
trùng do NTM và các vấn đề liên quan mang tính cấp thiết và thời sự đối với ngành
Y tế hiện nay.
Từ những thống kê nêu trên, nhóm nghiên cứu quyết định tiến hành đề tài
“Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm chẩn đoán vi khuẩn lao khơng điển hình
trên bệnh nhân nghi mắc bệnh lao tại Việt Nam” nhằm thiết kế một bộ sinh
phẩm đơn giản, hiệu quả, an tồn và có giá trị thực tiễn và tính linh động cao.

2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI.
Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu nghiên cứu, phát triển và bước đầu ứng
dụng bộ sinh phẩm trong việc xác định chẩn đốn sự có mặt của vi khuẩn NTM (cụ
thể là MAC-Mycobacterium avium complex) trên đối tượng nghi mắc bệnh lao
nhưng không đáp ứng với phương pháp điều trị lao truyền thống ở mức độ phịng
thí nghiệm.
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là một công cụ hữu hiệu hỗ trợ đắc lực cho
ngành chẩn đoán cận lâm sàng tại các bệnh viện, trung tâm y tế trong cuộc đấu
tranh chống lại bệnh nhiễm trùng do NTM là căn nguyên, nhằm giảm bớt thiệt hại
về tình trạng sức khỏe, thời gian, tâm lý cũng như tài chính của bệnh nhân cũng
như cộng đồng xã hội.

11


3. TÍNH MỚI VÀ SÁNG TẠO CỦA ĐỀ TÀI.

-Vi khuẩn gây bệnh NTM không phải là chủng vi khuẩn mới mà là một vi
khuẩn được ghi nhận là phân bố phổ biến và rộng rãi trong mơi trường trên tồn
cầu. Tuy nhiên, do đặc tính thích nghi của vi khuẩn tùy thuộc vào môi trường phát
triển và tồn tại mà độc lực cũng như hệ gene của chúng có thể thay đổi tùy theo
mơi trường và điều kiện sống. Vì thế, mục tiêu của đề tài là nhằm xác định chủng
vi khuẩn NTM tồn tại tại Việt Nam liệu có những thay đổi gì so với các chủng
NTM được ghi nhận ở các quốc gia khác. Nếu có, đó là những thay đổi gì? có
mang tính đặc hữu vùng miền hay khơng? có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng,
phát triển và đặc tính gây bệnh hay khơng? Nội dung này chưa được ghi nhận bởi
bất cứ nghiên cứu nào tại Việt Nam.
- Ngoài ra, bộ sinh phẩm, nếu được nghiên cứu và phát triển thành cơng, sẽ
là vũ khí hữu hiệu hỗ trợ cho ngành chẩn đoán cận lâm sàng với tiêu chí: đơn giản,
giá thành thấp, hiệu quả trong sử dụng và có tính ứng dụng cao.

II.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1. KHÁI NIỆM CHUNG
NTM là nhóm vi khuẩn cùng họ với vi khuẩn lao gây bệnh ở phổi, nhưng
điểm khác biệt là nó được phân tán rộng rãi trong mơi trường, đặc tính gây bệnh rất
linh động và khơng lây từ người này sang người khác. NTM có hơn 140 lồi khác
nhau và khơng nhất thiết liên quan đến bệnh lao nên đơi khi nó được gọi dưới
những tên khác như Vi khuẩn lao khơng điển hình (atypical tuberculosis), vi khuẩn
lao cơ hội (opportunitic tuberculosis), vi khuẩn lao môi trường (environmental
tuberculosis). Những nghiên cứu dịch tễ gần đây đã ghi nhận sự gia tăng các ca
bệnh NTM xảy ra trên toàn cầu với tỉ lệ cao hơn cả bệnh lao truyền thống.

12


Hình 1: MAC trên mơi trường Lowenstein – Jensen sau 6 tuần nuôi cấy
Triệu chứng lâm sàng bệnh biểu hiện ở cả phổi và ở ngồi phổi, trong đó biểu

hiện ở phổi thường gặp hơn. Các triệu chứng toàn thân thường không đặc hiệu như
sốt nhẹ về chiều, mệt mỏi, gầy sút ăn uống kém. Các triệu chứng tại chỗ bao gồm
ho, ho khan, hoặc ho khạc đờm kéo dài. Triệu chứng tại phổi thường là các triệu
chứng của bệnh lao. Ngoài những trường hợp nhiễm trùng biểu hiện tại một số cơ
quan như hạch, da, vết mổ… thì cịn có thể có thể gặp tình trạng bệnh tồn phát ở
đa cơ quan.
Trong tổng số các ca bênh Lao ngoài phổi trên thế giới do 140 loài thuộc loại
NTM gây ra. thì có đến hơn 50% trường hợp mắc bệnh do chủng Mycobacterium
avium complex (MAC). Ở Việt Nam nói riêng, số ca bệnh Lao ngoài phổi do chủng
MAC gây ra chiếm đến 95% tổng số. Vì vậy, có thể nói, MAC là chủng vi khuẩn
đáng lo ngại nhất trong các ác lồi gây bệnh NTM nói chung.
2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
Đối với nhiều nước trên thế giới, đặc biệt như Mỹ, Nhật… NTM đã được
nghiên cứu và đưa vào chương trình an tồn y tế Quốc gia và được đánh giá là 1
trong những tiêu chí hàng đầu trong công tác chống nhiễm khuẩn tại bệnh viện và
các cơ sở y tế. Những chương trình nghiên cứu về chẩn đoán và điều trị NTM được
tiến hành trên phổ rộng các chủng vi khuẩn NTM. Ngoài ra các kỹ thuật real-time
13


PCR, multiplex PCR, sequencing… được ứng dụng như là những phương pháp
chẩn đoán thường quy tại bệnh viện và các trung tâm nghiên cứu đã giúp các Quốc
gia này hoàn toàn chủ động trong việc khống chế và giảm thiểu các ca bệnh NTM.

Hình 2. Tỉ lệ các ca bệnh do vi khuẩn nhóm NTM gây ra tại khu vực châu Á
Ở Việt Nam, việc chẩn đoán NTM tại các bệnh viện và cơ sở y tế từ trước đến
nay đều sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống cho kết quả chậm (15
– 40 ngày) và thường xuyên bị tạp nhiễm, nên khả năng đặc hiệu trong chẩn đoán
là thấp. Ở lĩnh vực chẩn đoán phân tử thì gần như chưa có nghiên cứu nào về vấn
đề này triển khai được ghi nhận. Cũng phải nói rằng việc chẩn đoán cận lâm sàng

về NTM hiện nay tại các cơ sở ý tế tại Việt Nam chưa được đầu tư nghiên cứu một
cách có bài bản, chính điều này đã góp phần đưa bệnh lao khơng điển hình do
NTM âm thầm bùng phát gây tác hại lớn đến sức khỏe và kinh tế của người bệnh.
Ngoài phương pháp ni cấy định danh, các kĩ thuật mới chẩn đốn NTM hiện
nay bao gồm macroarray, microarray, v.v... lai với cặp mồi gắn đầu dò huỳnh
quang cũng được các bệnh viện lớn phát triển như Bệnh viện Quân y 103 hay Viện
Vệ sinh Dịch tễ Trung ương tuy nhiên chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu. Thêm
vào đó, các kĩ thuật này rất phực tạp, yêu cầu người làm có kinh nghiệm và tay
nghề cao và trang thiết bị hiện đại. Với thực trạng trên, việc đưa phương pháp này
trong khảo sát dịch tễ hay đến những nơi hẻo lánh miền núi là vơ cùng khó.

14


3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ CÁC KỸ THUẬT SỬ DỤNG
Phương pháp thu nhận, đóng gói, bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm
Nội dung của đề tài thực hiện trên đối tượng vi khuẩn có nguy cơ lây nhiễm
cấp độ 2 (Risk 2) theo quy định của WHO, vậy nên cơng việc phải được thực hiện
tại phịng xét nghiệm ATSH cấp độ II (Biosafety laboratory level 2). Các quy trình
thu nhận, đóng gói, bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm đều tuân thủ theo quy tắc
thực hành an toàn sinh học theo tiêu chuẩn của Bộ y tế và WHO (Laboratory
biosafety manual, third edition – WHO – Geneva, 2004)
Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ bệnh phẩm
DNA tổng số với chất lượng tốt là điều kiện quan trọng để thực hiện các phân
tích chẩn đốn phân tử như phân lập các đoạn gene chỉ thị từ các mẫu. Để tìm được
quy trình tách chiết DNA phù hợp và hiệu quả với các mẫu nghiên cứu, chúng tôi
đã tiến hành so sánh 3 quy trình tách chiết DNA trong đó một quy trình áp dụng
theo phương pháp kit tách chiết DNA của nhà cung cấp, các quy trình cịn lại được
thực hiện dựa vào vào các phương pháp tách chiết truyền thống và theo các tài liệu
tham khảo đồng thời có điều chỉnh cho phù hợp với mẫu.

Phương pháp thiết kế mồi
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng Ngân hàng dữ liệu NCBI
( để tìm kiếm các thơng tin và kết hợp với hai phần
mềm hiện đại, thông dụng là BioEdit và DNAstar nhằm lưu giữ thông tin và phân
tích sự đa dạng hệ genecủa chi Mycobacterium. Từ đó chọn lọc một số genetiêu
biểu có sự đa dạng di truyền cao giữ các chủng vi khuẩn gây bệnh lao truyền thống
M. tuberculosis và các chủng vi khuẩn lao không điển hình để thiết kế các cặp mồi
tương ứng tại các vùng có độ bảo thủ cao bằng cơng cụ PrimerSelect trong
DNAstar. Cặp mồi đặc hiệu cho vi khuẩn M. avium complex gây bệnh trên người
có đặc điểm: đoạn trình tự đầu 3’ (từ 1 nucleotide trở lên) của mồi xuôi và ngược
đặc hiệu đối với chủng vi khuẩn M.avium complex nhưng không đặc hiệu đối với
các chủng vi khuẩn lao M.tuberculosis.
Phương pháp PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp) cho
phép nhân một số lượng không giới hạn nguyên bản của một đoạn DNA nhất định
trong thời gian ngắn, nhờ xúc tác của DNA polymerase. Đoạn geneđược nhân lên

15


nhờ cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế. Quy trình PCR được tối ưu ở các yếu tố: nồng độ
DNA ban đầu và nhiệt độ bắt cặp mồi.
Thành phần phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt được thể hiện ở Bảng 1 và 2
Bảng 1. Thành phần phản ứng PCR
STT

Thành phần

Thể tích(µl)

1

DNA tổng số (100ng)

0.5-2

2

Mồi xi (10 pmol)

1.0

3

Mồi ngược (10 pmol)

1.0

4

DreamTaq™ MasterMix

12.5

5

Nước cất khử ion, khử trùng

8.5-10

Tổng thể tích

25.0

Bảng 2. Chu kỳ nhiệt thông thường cho phản ứng PCR
Bước

Phản ứng

Nhiệt độ (0C)

Thời gian

Chu kỳ

1
2
3
4
5
6

Biến tính
Biến tính
Gắn mồi
Kéo dài chuỗi
Hồn tất kéo dài
Kết thúc phản ứng

94

94
50-60
72
72
4

3 phút
30 giây
30 giây
1phút
10 phút
∞

1
30
1

Phương pháp đọc và phân tích trình tự nucleotid
Trình tự nucleotid được xác định trên máy xác định tự động ABI PRISM ®
3100 Avant Genetic Analyzer theo bộ kit BigDye ® Terminator v3.1 Cycle
Sequencing. Trình tự được xác định trên cả hai sợi khuôn và đối nghĩa với việc sử
dụng hai mồi xi và ngược. Tuy nhiên, chỉ có một mồi tham gia phản ứng, mồi
đơn này bám vào vùng bổ sung đã được thiết kế trong vector. Hiện nay, có nhiều
phần mềm chuyên dụng xử lý trình tự như PC GENE, Clustal, DNA star, BioEdit,
Chromas… Trong các phần mềm kể trên BioEdit là hệ thống phần mềm tiện dụng
nhất. Chúng tôi sẽ sử dụng BioEdit trong kỹ thuật phân tích trình tự ở đề tài này

16

4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ DỰ KIẾN
Nội dung 1: Hồn thiện quy trình phát hiện nhanh vi khuẩn lao khơng điển hình
theo ngun lý PCR đối với đoạn trình tự đặc trưng cho M.avium complex.
- Thu thập chủng vi khuẩn và mẫu bệnh phẩm MAC từ người bệnh (đã được kết
luận là mắc bệnh lao không điển hình bằng phương pháp ni cấy vi sinh truyền
thống) phục vụ nghiên cứu và thử nghiệm.
- Thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn geneđặc trưng cho chủng MAC
- Tối ưu các bước trong quy trình sử dụng kit nhằm mục tiêu sau: chất lượng ổn
định, giảm tối đa thời gian thực hiện, tiết kiệm chi phí, đảm bảo an tồn sinh học
và thân thiện với mơi trường.
Nội dung 2: Tạo bộ sản phẩm thử nghiệm
- Xây dựng quy trình chuẩn phát hiện vi khuẩn MAC của bộ sinh phẩm.
- Thử nghiệm bộ sinh phẩm ở cấp độ phịng thí nghiệm, đánh giá độ nhạy, đặc hiệu
và mức độ ổn định của bộ sinh phẩm .

III. QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU
1. THU THẬP, VẬN CHUYỂN, BẢO QUẢN MẪU BỆNH PHẨM VÀ
CHỦNG VI KHUẨN
1.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm và chủng vi khuẩn.
5 chủng vi khuẩn MAC có nguồn gốc từ Bệnh viện Phổi Trung Ương, 5 mẫu
bệnh phẩm của bệnh nhân dương tính với NTM bằng phương pháp ni cấy vi sinh
truyền thống, 1 chủng gốc Mycobacteria Avium (Avium ATCC® 25291TM*)
Bảng 3. Danh sách các mẫu
STT

Tên mẫu

Ghi chú

STT

17

Tên mẫu

Ghi chú


1
2
3
4
5
6

NTM 1
NTM 2
NTM 3
NTM 4
NTM 5
NTM 6

Bệnh nhân
Bệnh nhân
Bệnh nhân
Bệnh nhân
Bệnh nhân
Chủng MAC

7

8
9
10
11

NTM 7
NTM 8
NTM 9
NTM 10
NTM 11

Chủng MAC
Chủng MAC
Chủng MAC
Chủng MAC
Chủng chuẩn ATCC

1.2 Bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm và chủng vi khuẩn:
- Nhiệt độ bảo quản: nhiệt độ từ 4-80C có thể áp dụng nếu như khơng có
điều kiện xử lý sớm bệnh phẩm ngay sau khi thu thập,
- Đóng gói bệnh phẩm: Bệnh phẩm phải được đóng gói trước khi vận
chuyển, bảo đảm khơng dễ đổ, vỡ, phát tán tác nhân gây bệnh . . . trong q trình
vận chuyển.
+ Đóng chặt các tube chứa bệnh phẩm, bọc từng tube bệnh phẩm bằng giấy
thấm, buộc chặt.
+ Bọc ra ngoài các túi bệnh phẩm bằng giấy thấm hoặc bơng thấm nước có
chứa chất tẩy trùng (cloramine B), đặt gói bệnh phẩm vào túi nilon thứ 2, buộc chặt.
+ Các phiếu thu thập, xét nghiệm bệnh phẩm được đóng gói chung vào túi
nilon cuối cùng, buộc chặt, chuyển vào hộp bảo ôn.
- Vận chuyển bệnh phẩm: Bệnh phẩm được vận chuyển tới phịng thí

nghiệm bằng đường bộ, đường khơng. ...thời gian ngắn nhất tính từ thời điểm thu
thập bệnh phẩm.
2. XỬ LÝ VÀ KHỬ TẠP MẪU BỆNH PHẨM
Bệnh phẩm mà nhóm thu thập được là các mẫu ở dạng đờm có nhiễm vi
khuẩn gây bệnh. Liên kết giữa các phân tử đờm và các tế bào vi khuẩn nhìn chung
tương đối chắc chắn; ngồi ra, lớp đờm bao quanh tế bào vi khuẩn sẽ bảo vệ vi
khuẩn khỏi ảnh hưởng của các hóa chất gây phá hủy thành tế bào. Bệnh phẩm
khơng qua xử lí làm tan đờm sẽ cho lượng DNA tổng số vơ cùng ít, khơng đủ cho
q trình nhận biết sau này. Vì vậy, việc là sử dụng hóa chất gây tan đờm là một
phần quan trọng của q trình chẩn đốn bệnh.
2.1Dụng cụ, thiết bị và hóa chất.
- Dụng cụ: pipetter, ống tube 1,5ml, falcon 50ml, đầu type, găng tay y tế,
- Thiết bị: máy li tâm, bể ổn nhiệt ướt, tủ lạnh 4oC…
18


- Hóa chất: Cồn kỹ thuật, Cồn tuyệt đối, EDTA, Phenol, Chloroform, Isoamyl
alchohol, NaOH 1M, NALC, TTE, L6, L2, NaCl, RNase, PBS, Acetone, Protease
K, Sodium acetate, Ethidium bromide, Agarose, Isopropanol, nước cất....
2.2Khử tạp mẫu
- Bất hoạt ở 100OC trong 10 phút
- Dịch : Ly tâm lấy cặn trong ống tube 1,5ml, 12000 v/ phút x10 phút.
- Đờm : Khử nhiễm bằng 1 thể tích NaOH 1M (40g NaOH/lit) + 1 thể tích Natri
Citrat 0,1M (29,4gr Na-citrat.2H2O/lit) và 30mM N-acetyl-L-cystein (NALC)
(15mg/100ml), lắc cho đờm loãng đều trong 15 phút, ly tâm tách cặn như đối với
dịch.
- Mảnh sinh thiết, chủng vi khuẩn và mủ: Ly giải bằng Protease K qua đêm ở 560C
- Xử lý bệnh phẩm có máu bằng TTE (1% Triton X 100, 20mM Tris-HCl pH8.3,
1m EDTA): cho 1 ml dung dịch TTE vào mẫu đã tách cặn, lắc kỹ cho tan máu, ly
tâm loại bỏ nước nổi.

3. TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MAC
Phương pháp sử dụng đệm chiết.
+ Bổ sung 500 µl đệm chiết (100 mM Tris - HCl (pH 8), 1.5 M NaCl, 20 mM
EDTA (pH 8)), 50 µl protein K.
+ Trộn đều hỗn hợp và ủ ở 650C trong 1 giờ, 10 phút lắc đảo 1 lần.
+ Ly tâm tốc độ 12 000 rpm trong 15 phút, thu pha trên.
+ Thêm 600 µl hỗn hợp phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) và trộn hỗn
hợp bằng cách đảo đều ống trong 10 phút.
+ Ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 15 phút, chuyển pha lớp dung dịch trên sang ống
eppendorf loại 1,5 ml.
+ Thêm 600 µl hỗn hợp chloroform-isoamyl alcohol (24:1) và trộn hỗn hợp bằng
cách đảo đều ống trong 10 phút.
+ Ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 15 phút, chuyển pha lớp dung dịch trênsang ống
eppendorf loại 1,5 ml.
+ Bổ sung 1 µl RNase A 10 g/mL. Ủ hỗn hợp trong 1 giờ ở 370C.
+ Thêm 800 µl isopropanol để kết tủa DNA, trộn hỗn hợp bằng cách đảo đều ống

19


và ủ 30 phút ở -200C.
+ Ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 15 phút, thu tủa DNA, rửa DNA ba lần bằng 500
µl dung dịch ethanol 70%.
+ DNA được làm khơ, sau đó hịa tan trong nước cất khử ion khử trùng (khơng có
DNase).
4. KIỂM TRA KẾT QUẢ SẢN PHẨM PCR
4.1Thiết kế mồi đặc hiệu
Do điều kiện kĩ thuật khơng cho phép, nhóm nghiên cứu chỉ xây dựng đoạn
mồi trên phương diện lí thuyết. Cơng đoạn chế tạo mồi được thực hiên tại các cơ
sở nước ngoài, nơi có điều kiện kĩ thuật và cơ sở vật chất phù hợp. Tại cơ sở của

nhóm nghiên cứu, sau khi nhận được sản phẩm là các đoạn mồi do nhóm đặt thiết
kế, nhóm tiến hành kiểm tra đoạn mồi với DNA tổng số của chủng gốc Avium
ATCC® 25291TM sử dụng phương pháp PCR
Bằng từ khóa “mycobacterium” trên mảng dữ liệu về nucleotide của ngân hàng
dữ liệu Genbank của NCBI có 361314 kết quả hiện thị; trong đó chiếm phần lớn là
162563 trình tự của vi khuẩn lao (M. tuberculosis); 61847 trình tự của vi khuẩn lao
khơng điển hình M. avium (hình 1). Từ số liệu này cho thấy hệ genecủa vi khuẩn lao
và vi khuẩn lao khơng điển hình đã nghiên cứu khá sâu và phổ biến trên thế giới.

20


Hình 3: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm thơng tin qua từ khóa “mycobacterium”
trên cổng thơng tin NCBI
Tìm hiểu các tài liệu tham khảo của các cơng trình đã cơng bố, việc chuẩn đốn,
đánh giá đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn lao, vi khuẩn lao không điển hình,
và các chủng vi khuẩn khác trong chi mycobacterium được thực hiện phổ biến trên
các gene16S, rpoB, hsp65. trong đó gene16S được sử dụng nhiều nhất. Bằng từ khóa
“mycobacterium 16S” trên mảng dữ liệu về nucleotide Genbank của NCBI có 103283
kết quả hiện thị; trong đó nhiều nhất là 20104 trình tự gene16S của vi khuẩn lao (M.
tuberculosis); 21379 trình tự gene16S của vi khuẩn lao khơng điển hình M. avium
(hình 2). Bằng từ khóa “mycobacterium rpoB” trên mảng dữ liệu về nucleotide của
ngân hàng dữ liệu Genbank của NCBI chỉ có 53 kết quả hiện thị (hình 3);
“mycobacterium hsp65” có 2488 kết quả. Do đó chúng tơi chọn các chỉ thị 16S để
thiết kế mồi nhân gen, phục vụ nghiên cứu chuẩn đốn vi khuẩn lao khơng điển hình.

21


Hình 4: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thơng qua từ khóa

“mycobacterium 16S” trên cổng thơng tin NCBI

Hình 5: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thơng qua từ khóa
“mycobacterium rpoB” trên cổng thơng tin NCBI

22


Hình 6: Ảnh minh họa dữ liệu tìm kiếm về nucleotide thơng qua từ khóa
“mycobacterium hsp65” trên cổng thơng tin NCBI
Cặp mồi được thiết kế có các đặc điểm sau:
-16S For: 5’-ACCTCAAGACGCATTCTTC – 3’ : Tm (50mM NaCl):
54.9ᵒC; %GC: 50%; Trọng lượng phân tử: 6,037
-16S Rev: 5’-CGACAGCTCCCTCCAAAAG-3’ : Tm (50mM NaCl):
58.1ᵒC; %GC: 60%; Trọng lượng phân tử: 6,016
Đoạn trình tự 16S được nhân lên bởi cặp mồi này có kích thước dự đoán là:
1282 bp. Cặp mồi được thiết kế đặc trưng cho chủng M.avium complex.
Để tối ưu hóa phản ứng PCR, nhóm nghiên cứu khảo sát vùng nhiệt độ bắt
cặp mồi từ 54 đến 60ᵒC và lượng DNA tổng số đưa vào từ 1-4 µl DNA tổng số có
nồng độ 100 ng/µl. DNA tổng số được sử dụng làm khuôn của phản ứng PCR là
sản phẩm được tách từ chủng M.avium chuẩn ATCC 25291
Bằng cách sử dụng kĩ thuật PCR với cặp mồi mang tính đặc hiệu với đoạn
gene16S định danh MAC, ta có thể khuếch đại số lượng bản sao của gene; sau đó,
ta kiểm tra sự có mặt của gene bằng phương pháp điện di SafeView™-Classic. Nói
chung, theo lí thuyết, khi mẫu có chứa DNA của NTM, băng DNA sẽ hiện lên và
ngược lại, nếu khơng có mặt DNA của NTM trong mẫu thì sẽ điện di sẽ khơng có
băng DNA.
4.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất:
- Dụng cụ: pipetter, ống tube 0.2ml, Parafilm, găng tay y tế
- Thiết bị: máy PCR, máy điện di, máy soi gel

- Hóa chất: PCR master mix, dung dịch agarose, dye SafeView™
4.3Kĩ thuật PCR định tính:
- Thành phần các chất cần bổ sung vào một ống eppendorf cho phản ứng PCR bao
gồm: DNA tổng số từ bệnh phẩm (100 ng); mồi xi-For (10pmol); mồi ngượcRev (10pmol); DreamTaq™ MasterMix (µl) và nước cất khử ion, khử trùng (µl)
- Tổng tỉ lệ các chất trên phải đạt 25 (µl) (bảng 2.1), tuy nhiên chúng có thể thay
đổi tuỳ theo số lượng DNA thu được từ mẫu bệnh phẩm
- Chu trình nhiệt của phản ứng PCR được đặt với thời gian quy định của mỗi giai
đoạn như sau:

23


Bước

Phản ứng

Nhiệt độ (0C) Thời gian

Chu kỳ

1

Biến tính

94

3 phút

1

2

Biến tính

94

30 giây

3 30

Gắn mồi

57

30 giây

4

Kéo dài chuỗi

72

1phút

5

Hoàn tất kéo dài

72

10 phút

6

Kết thúc phản ứng

4

∞

1

Bảng 4. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại DNA tổng số thu từ mẫu
Đoạn mồi thiết kế được lần lượt thử nghiệm với các mẫu NTM 1 đến NTM 10.
Ngồi ra, nhóm nghiên cứu cịn thử nghiệm với mẫu bênh phẩm của bệnh nhân
được xác định là mắc lao điển hình.
4.4Điện di SafeView™-Classic
* Chuẩn bị bản điện di
- Đun sôi 100ml dung dịch agarose 1%, - Nhỏ 5 µl dung dịch SafeView™-Classic
vào dung dịch agarose. Lắc đều dung dịch cho khơng cịn bọt khí và làm nguội
xuống nhiệt độ ~50oC. Đổ vào khuôn tạo các giếng để load mẫu
* Chuẩn bị mẫu:
- Mẫu được trộn với dung dịch loading dye 6x, Load các mẫu vào từng giếng của
bản điện di
* Điện di:
- Tiến hành điện di với 5 µl dung dịch SafeView™/100ml buffer
- Sau 30 phút, dừng điện di và quan sát bản điện di dưới tia cực tím.
5. GIẢI TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GENE
TRÊN PHẦN MỀM CHUN DỤNG
5.1 Kiểm nghiệm tính đúng đắn và độ tin cậy của sản phẩm

Sản phẩm PCR thu nhận ở chuyên đề 2 được đem xác định trình tự nucleotid
để kiểm chứng tính đúng đắn của quy trình.
Trình tự gene được xác định trên máy xác định tự động ABI PRISM® 3100
Avant Genetic Analyzer theo bộ kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle

24


Sequencing. Trình tự được xác định trên cả hai sợi khuôn và đối nghĩa với việc
sử dụng hai mồi xuôi và ngược. Tuy nhiên, chỉ có một mồi tham gia phản ứng,
mồi đơn này bám vào vùng bổ sung đã được thiết kế trong vector.
STT

Thành phần

Thể tích (µl)

1

Dung dịch đệm (5X)

3

2

Mồi

1,275

3

DNA mẫu (~ 200ng)

7,725

4

BigDye

3

Tổng

15

Bảng 5. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự

25 chu kỳ
96oC

96oC

1 phút

10 giây
55oC
5 giây

60oC
4 phút

72oC
8 phút

4oC
30 phút

Hình 7: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng cách bổ sung 5 µl EDTA 125mM, 60 µl
cồn 100% và ủ ở nhiệt độ phịng trong 15 phút. Tiếp đó, ly tâm 12000 v/p trong 15
phút để tủa các đoạn DNA, sau đó loại bỏ cồn. Bổ sung 60 µl cồn 70% và ly tâm

25