Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR và dòng BAC để xác định gen mùi thơn trên cây lúa (Oryza sative L.)

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM





CHÂU TẤN PHÁT






ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ PCR
VÀ DÒNG BAC ĐỂ XÁC ĐỊNH GEN
MÙI THƠM TRÊN CÂY LÚA
(Oryza sativa L.)





LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Cần Thơ - 2012
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT





VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM





CHÂU TẤN PHÁT




ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ PCR VÀ
DÒNG BAC ĐỂ XÁC ĐỊNH GEN MÙI
THƠM TRÊN CÂY LÚA
(Oryza sativa L.)

Chuyên ngành: Di Truyền và Chọn Giống
Mã số: 62.62.05.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

1. GS.TS. Nguyễn Thị Lang
2. GS.TS. Bùi Chí Bửu

Cần Thơ - 2012
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
ii

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Độc lập – Tự Do – Hạnh Phúc



LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu:”Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR
và dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây lúa (Oryza sativa L.)” này là
của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được
ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.


Tác giả luận án



Châu Tấn Phát

iii

LỜI CẢM TẠ
Xin chân thành biết ơn các Thầy, các Cô hướng dẫn khoa học:
- GS.TS. Nguyễn Thị Lang, đã hết lòng chỉ dẫn những nội dung cần thiết
thực hiện các môn học, các thí nghiệm và nội dung nghiên cứu để hoàn
thành luận án.
- GS.TS. Bùi Chí Bửu, đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn các nội dung,
phương pháp và kế hoạch triển khai thành công các môn học, thực hiện
các thí nghiệm.
- Các thầy cô tham gia giảng dạy lớp nghiên cứu sinh khóa 1 của cơ sở đào
tạo Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long.
Không thể hoàn thành luận án nếu không có sự giúp đở hướng dẫn khoa học
và động viên của Cô và Thầy.
Xin chân thành biết ơn Hội đồng đánh giá luận án cấp Cơ Sở: đã dành nhiều
thời gian để đọc và đóng góp nhiều ý kiến qúi báu cho luận án được hoàn thiện.
Xin chân thành cảm ơn:
- Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.
- Ban giám đốc Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, đã giúp đỡ tạo điều
kiện cho tôi trong học tập và thực hiện đề tài.
- Ban giám hiệu Trường Đại Học Cần Thơ.

- Ban giám hiệu và tập thể thầy cô giáo trường đại học Nộng Nghiệp I -
Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi rất nhiều
trong suốt thời gian tôi theo học chương trình cao học tại đây.
- Phòng Khoa học và Hợp tác quốc tế - Viện Lúa đồng bằng sông Cửu
Long, đã theo dõi, động viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như
thực hiện đề tài tốt nghiệp.
- Bộ môn Di Truyền và Chọn Giống – Viện Lúa đồng bằng sông Cửu
Long, đã giúp đỡ về trang thiết bị cũng như hướng dẫn chuyên môn trong
suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp.
iv

- Bộ môn Công Nghệ Hạt Giống - Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, đã
động viên và tạo điều kiện về thời gian giúp tôi có thể hoàn thành luận án
trong thời gian qui định.
- TS. Bùi Thị Thanh Tâm, TS. Phạm Trung Nghĩa đã đóng góp nhiều ý
kiến quí báu để hoàn thiện cho các môn học chuyên đề và luận án.
- Sau cùng, xin cảm thông sự hy sinh, chia sẽ và động viên của cha mẹ, em
gái, vợ và người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp góp phần
không nhỏ vào sự thành công của luận án.

Tác giả luận án



Châu Tấn Phát
v

MỤC LỤC Trang

Trang phụ bìa

i

Lời cam đoan
ii

Lời cảm tạ
iii

Mục lục
v

Danh sách bảng
viii

Danh sách hình
x

Danh mục các từ viết tắt
xiv

MỞ ĐẦU
1

1. Tính cấp thiết của đề tài 1

2. Mục tiêu nghiên cứu 2

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

3.1. Ý nghĩa khoa học 2

3.2. Ý nghĩa thực tiễn 2

4. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC
CỦA ĐỀ TÀI
4

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài 4

1.1.1 Hợp chất tạo mùi thơm, gen thơm và một số yếu tố môi
trường ảnh hưởng đến việc hình thành mùi thơm trên lúa
4

1.1.2 Nguyên lý và yêu cầu trong chọn giống bằng MAS 9

1.1.3 Nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn BAC (Bacterial
Artificial Chromosome)
9

1.2 Ứng dụng thành tựu di truyền 15

1.2.1 Nghiên cứu di truyền gen mùi thơm trên cây lúa 15

1.2.2 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước ứng dụng PCR
trong chọn lọc gen mùi thơm
19

1.2.3 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về ứng dụng BAC

DNA trong chọn giống lúa
25

vi

Chương 2: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
28

2.1 Địa điểm nghiên cứu 28

2.2 Thời gian thực hiện 28

2.3 Vật liệu nghiên cứu 28

2.4 Nội dung nghiên cứu 29

2.5 Phương pháp nghiên cứu 29

2.5.1 Phương pháp lai tạo 29

2.5.2 Phương pháp phòng thí nghiệm 33

2.6 Phân tích thống kê và xử lý số liệu 46

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

3.1 Khảo sát đặc tính thơm và không thơm trên các giống lúa mùa
và lúa cao sản
47

3.1.1 Đánh giá kiểu hình mùi thơm trên bộ lúa mùa địa phương

47

3.1.2 Đánh giá kiểu gen mang gen mùi thơm bằng chỉ thị SSR
trên các giống lúa mùa
65

3.1.3 Đánh giá kiểu hình mùi thơm trên bộ lúa cao sản 68

3.1.4 Đánh giá kiểu gen mang gen mùi thơm trên các giống lúa
cao sản thử nghiệm
72

3.2 Đánh giá kiểu hình và kiểu gen mùi thơm trên các giống sử dụng
làm vật liệu lai và quần thể con lai sau khi được lai tạo
76

3.2.1 Đánh giá mùi thơm trên các giống lúa bố mẹ 76

3.2.2 Phát triển quần thể của 20 tổ hợp lai 78

3.2.3 Phân tích đa dạng di truyền dựa vào kiểu hình của các
giống lúa bố mẹ và các tổ hợp lai thế hệ F1
79

3.2.4 Phân tích sự biểu hiện di truyền mùi thơm ở quần thể cây
lai F1
82

3.2.5 Phân tích sự biểu hiện di truyền mùi thơm ở quần thể F3
từ cặp lai OM2517/OM3536
83

vii

3.2.6 Đánh giá kiểu gen mùi thơm của một số giống bố mẹ và tổ
hợp lai bằng chỉ thị phân tử
84

3.2.7 Đánh giá kiểu hình và kiểu gen mùi thơm trên quần thể
BC2F2 từ tổ hợp lai OM2517/OM3536
86

3.3 Khai thác thư viện BAC nhằm dòng hóa vùng chứa gen qui định
mùi thơm
92

3.3.1 Sàng lọc gen thơm của cây lúa thông qua BAC DNA 92

3.3.2 Xây dựng BAC contig (các chuỗi DNA nhân bản nằm liền
kề) trên vùng gen mùi thơm
104

3.3.3 Xác định BAC DNA chứa alen mùi thơm 105

3.3.4 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn lọc dòng mang gen
mùi thơm
106

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
112

4.1 Kết luận 112

4.2 Đề nghị 113

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC


viii


DANH SÁCH BẢNG


Số thứ tự Nội dung Trang

Bảng 2.1 Các chỉ thị phân tử đã sử dụng để nghiên cứu trong đề tài
luận án và trình tự mồi tương ứng
28

Bảng 2.2 Nguồn gốc và một số đặc điểm của các giống lúa được sử
dụng làm bố
29

Bảng 2.3 Nguồn gốc và một số đặc điểm của các giống lúa được sử
dụng làm mẹ
30

Bảng 2.4 Trọng lượng agarose theo nồng độ và đối tượng thí
nghiệm
36

Bảng 2.5 Chương trình chạy PCR với chỉ thị SSR 37

Bảng 2.6 Chương trình chạy PCR với chỉ thị STS 38

Bảng 3.1 Cấp độ mùi thơm trên lá của một số giống lúa mùa địa
phương
50

Bảng 3.2 Cấp độ mùi thơm trên thân của một số giống lúa mùa địa
phương
51

Bảng 3.3 Cấp độ mùi thơm trên hạt của một số giống lúa mùa địa
phương
52

Bảng 3.4 Một số giống lúa mùa chỉ thể hiện mùi thơm trên lá và hạt 53

Bảng 3.5 Một số giống lúa mùa chỉ thể hiện mùi thơm trên thân và
lá
54

Bảng 3.6 Một số giống lúa mùa chỉ thể hiện mùi thơm trên hạt và
thân
54

Bảng 3.7 Các giống lúa mùa thể hiện mùi thơm toàn diện trên cả
thân, lá và hạt
55

Bảng 3.8 Đánh giá kiểu hình mùi thơm trên lá, thân và hạt của 30
giống lúa cao sản thuộc bộ cao sản
69

Bảng 3.9 So sánh kiểu hình và kiểu gen trên 30 giống thuộc bộ lúa
cao sản
75

ix

Bảng 3.10 Cấp độ mùi thơm trên lá, thân và hạt của các giống lúa bố
mẹ
77

Bảng 3.11 Cấp độ mùi thơm trên lá và thân của các tổ hợp lai thế hệ
F1
78

Bảng 3.12 Mùi thơm trên thân, lá và hạt của quần thể F3 từ cặp lai
OM2517/OM3536
83

Bảng 3.13 So sánh kiểu gen và kiểu hình trên quần thể BC2F2 của tổ
hợp lai OM2517/OM3536
91

Bảng 3.14 Những dòng BAC dự tuyển phủ trên locus mùi thơm
được sàng lọc bằng chỉ thị RM223
96

Bảng 3.15 Những dòng BAC dự tuyển phủ trên locus mùi thơm
được sàng lọc bằng chỉ thị RG28FL-RB
97

Bảng 3.16 Những dòng BAC dự tuyển phủ trên locus mùi thơm
được sàng lọc bằng chỉ thị SP6
99

Bảng 3.17 Ba mươi sáu (36) dòng BAC đã được phát hiện sau khi
chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR với 3 chỉ thị phân tử
RM223, RG28FL-RB và SP6
100

Bảng 3.18 Vị trí trên điện di đồ của 36 dòng BAC được xác định
thông qua 3 chỉ thị phân tử RM223, RG28FL-RB và SP6
102

Bảng 3.19 Các cá thể BC2F2 từ tổ hợp lai OM2517/OM3536 được
chọn sau khi sàng lọc PCR với 2 chỉ thị 25D10 và 31F5
109

Bảng 3.20 So sánh kiểu gen và kiểu hình trên quần thể BC2F2 của tổ
hợp lai OM2517/OM3536 sau khi đánh giá bằng 2 chỉ thị
phân tử 25D10 và 31F5
111


x

DANH SÁCH HÌNH

Số thứ tự Nội dung Trang

Hình 1.1
Bản đồ vật lý của Xa4 locus.
12

Hình 2.1 Thao tác khử đực bông lúa được thực hiện vào buổi
chiều trong nhà lưới
32

Hình 2.2a Thao tác thụ phấn 33

Hình 2.2b Thao tác gắn thẻ lai 33

Hình 2.2c Hạt lai thu được sau khi bông lúa đã được thụ phấn
thành công
33

Hình 2.3 Đánh giá mùi thơm trên lá 34

Hình 2.4 Đánh giá mùi thơm trên thân 34

Hình 2.5 Đánh giá mùi thơm trên hạt 34

Hình 2.6 Thư viện BAC sau khi được cấy chuyền 39

Hình 2.7 Hệ thống array thực hiện cấy chuyền 39

Hình 2.8 Dòng BAC được chuyển vào môi trường LB lỏng và
ủ qua đêm trên máy lắc
40

Hình 2.9 Sơ đồ tổng quát quá trình ly trích DNA BAC 42

Hình 2.10 Sơ đồ thí nghiệm khai thác thư viện BAC 44

Hình 3.1 Tỷ lệ các giống có mùi thơm trên lá, thân và hạt ở
103 giống lúa mùa địa phương
48

Hình 3.2 Tỷ lệ các giống có mùi thơm trên lá của 103 giống
lúa mùa địa phương
49

Hình 3.3 Tỷ lệ các giống có mùi thơm trên thân của 103 giống
lúa mùa địa phương
50

Hình 3.4 Tỷ lệ các giống có mùi thơm trên hạt của 103 giống
lúa mùa địa phương

52

Hình 3.5 Biểu đồ phân nhóm di truyền dựa vào kiểu hình mùi
thơm trên hạt
58

xi

Hình 3.6 Biểu đồ phân nhóm di truyền dựa vào kiểu hình mùi
thơm trên lá
60

Hình 3.7 Biểu đồ phân nhóm di truyền dựa vào kiểu hình mùi
thơm trên thân
62

Hình 3.8 Biểu đồ phân nhóm di truyền dựa vào kiểu hình mùi
thơm trên thân, lá và hạt
64

Hình 3.9 Kết quả kiểm tra chất lượng DNA trên gel agarose
0.9%
66

Hình 3.10 Sản phẩm PCR với mồi RM223 67

Hình 3.11 Tỷ lệ các giống có mùi thơm trên thân, lá và hạt của
các giống lúa cao sản
71

Hình 3.12 Sản phẩm PCR với mồi RM223 trên 30 giống thuộc
bộ cao sản được khuếch đại gen mùi thơm điện di
trên agarose gel 3%
72

Hình 3.13 Sản phẩm PCR với mồi RG28FL-RB trên 30 giống
thuộc bộ cao sản được khuếch đại gen mùi thơm
điện di trên agarose gel 1,2%
73

Hình 3.14 Sản phẩm PCR với mồi SP6 trên 30 giống thuộc bộ
cao sản được khuếch đại gen mùi thơm điện di trên
agarose gel 3%
74

Hình 3.15 Tỷ lệ các giống có mùi thơm trên lá, thân và hạt của
các giống lúa bố mẹ
77

Hình 3.16 Tỷ lệ các giống có mùi thơm trên lá và thân của các
tổ hợp lai
79

Hình 3.17 Biểu đồ phân nhóm di truyền dựa vào kiểu hình mùi
thơm trên 9 giống lúa bố mẹ và 20 tổ hợp lai
81

Hình 3.18 Kết quả điện di sản phẩm PCR của mồi RG28FL-RB 85

Hình 3.19 Tỷ lệ các cá thể BC2F2 từ tổ hợp lai

OM2517/OM3536 có mùi thơm trên lá, thân và hạt
87

xii

Hình 3.20 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên quần thể BC2F2
của tổ hợp lai OM2517/OM3536 với chỉ thị RM223
88

Hình 3.21 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên quần thể BC2F2
của tổ hợp lai OM2517/OM3536 với chỉ thị SP6
89

Hình 3.22 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên quần thể BC2F2
của tổ hợp lai OM2517/OM3536 với chỉ thị
RG28FL-RB
90

Hình 3.23 Ba trăm tám mươi tư (384) dòng BAC phát triển
trong đĩa petri tương đương với 1 đĩa (plate)
92

Hình 3.24 Môi trường LB tại thời điểm 0 giờ (hình A) và 20
giờ (hình B) sau khi đã được chuyển dòng BAC
93

Hình 3.25 Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA BAC trên gel
agarose 0.9%
94

Hình 3.26 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR của các
dòng BAC dự tuyển với chỉ thị RM223
97

Hình 3.27 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR của các
dòng BAC dự tuyển với chỉ thị RG28FL-RB
98

Hình 3.28 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR của các
dòng BAC dự tuyển với chỉ thị SP6
99

Hình 3.29 Xác định những dòng BAC dự tuyển ở locus mùi
thơm bằng điện di phân tích PFGE trên các dòng

BAC được phân cắt bởi enzyme giới hạn HindIII
101

Hình 3.30a Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR của 2 dòng
BAC chồng lấp sử dụng chỉ thị RG28FL-RB
105

Hình 3.30b Lai Southern Blot của 2 dòng BAC chồng lấp được
phân cắt với HindIII sử dụng RG28FL-RB làm con
dò


105

xiii

Hình 3.31 Bản đồ liên kết gen tại locus mùi thơm trên quần thể
BC2F2 từ tổ hợp lai OM2517/OM3536
106

Hình 3.32 Sản phẩm PCR của chỉ thị 25D10 trên quần thể
BC2F2 từ cặp lai OM2517/OM3536
107

Hình 3.33 Sản phẩm PCR của chỉ thị 31F5 trên quần thể
BC2F2 từ cặp lai OM2517/OM3536
108

xiv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT


% phần trăm
2AP 2-acetyl-1-pyrroline
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
ALP Amplicon Length Polymorphism
AP-PCR Arbitrary Mồi-PCR

BAC Bacterial Artificial Chromosome
BC Lai hồi giao (Backcross)
BES BAC-Ends Sequence
bp base pair
CHEF Contour-clamped Homogeneous Electric Field
cM centimorgan
cm centimeter
ctv cộng tác viên
ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long
DNA Deoxyribo Nucleic Acid
E.coli Escherichia coli
EAP External Antisense Primer
EDTA Ethylene diamine tetra acetate
ESP External Sense Primer
ETS Expressed Tagged Site
F Forward
F1 Filial 1
F2 Filial 2
F3 Filial 3
fgr fragrant gene
FISH Flourescence in situ hybridization
FPC Fingerprinting Contig
FSTs Flanking Sequence Tags
I/E Integration/Excision
xv

IFAP Internal Fragrant Antisense Primer
INSP Internal Non-fragrant Sense Primer
IPTG Isopropyl thiogalactoside
IRRI International Rice Research Institute

Kbp Kilo base pair
KDM 105 Khao Dawk Mali 105
LB Luria Bertani
LRR Leucine Rich Repeat
MAS Marker-Assisted Selection
MRDHV-
DNA
Moderately Repeat, Dispersed and Highly Variable DNA,
minisatellite
mRNA message Ribonucleic Acid
NBS Nucleotide Binding Site
NIL Nearly Isogenic Line
NST Nhiễm sắc thể
Nu Nucleotide
Ori Origin of replication
PAC P1-derivative Artificial Chromosome
pBR322 plasmid Bolivar & Rodrigues 322
PCR Polymerase Chain Reaction
PFGE Pulse Field Gel Electrophoresis – Điện di trong trường xung
QTL Quantitative Trait Loci
R Reverse
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
RG Rice Genome
RILs Recombinant inbred line
RM Rice Microsatellite
RT-PCR Reverse Transcriptase –PCR
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
SFP Single Functional Polymorphism
xvi

SNPs Single Nucleotide Polymorphism
SSCP Simple Strand Conformation Polymorphism
SSR Single Sequence Repeat (microsatellite)
STRs Short Tandom Repeats
STS Sequence Tagged Site
TAE Tris Acetate EDTA
Taq Thermus aquaticus
TBE Tris base, Boric acid, EDTA
TE Tris/EDTA
µl Microliter

1

MỞ ĐẦU

1.Tính cấp thiết của đề tài
Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những loại cây lương thực chính nuôi
sống hơn 50 % dân số thế giới [62]. Trước đây, với điều kiện vật chất còn thiếu
thốn, lương thực không đủ ăn người ta chỉ có nhu cầu là ăn no. Nhưng ngày nay do
mức sống của người dân ngày càng nâng cao thì nhu cầu ăn no đã thay đổi, việc ăn
ngon, có dinh dưỡng cao dần dần trở thành nhu cầu quan trọng không thể thiếu đối
với con người. Mặt khác, ngày nay nước ta đã qua thời kỳ thiếu lương thực chuyển
sang thời kỳ sản xuất phải có lời và đang xuất hiện những mô hình sản xuất vừa có
lời, vừa bền vững trong môi trường sinh thái trong lành. Một trong những mô hình
này là làm lúa thơm đặc sản, do đó chất lượng gạo được xem như là một trong
những mục tiêu hàng đầu, trong đó mùi thơm được đánh giá rất cao trên thị trường
xuất khẩu gạo của thế giới. Sản lượng gạo thơm từ các giống lúa thơm cổ truyền
như: Tám Thơm, Nàng Thơm Chợ Đào, Séng Cù, Nếp Cái Hoa Vàng, Khao Dawk
Mali, Basmati, thì có rất ít không đủ đáp ứng nhu cầu thị trường và khó mở rộng

diện tích. Do đó các nhà chọn giống đã liên tục nghiên cứu và lai tạo ra những
giống lúa mới có chất lượng cao và giữ được mùi thơm đặc trưng của giống.
Trong những năm gần đây, với sự tiến bộ của ngành công nghệ sinh học đã
ứng dụng những kỹ thuật trong sinh học phân tử như tái tổ hợp DNA, giải mã chuỗi
trình tự gen. Ứng dụng thư viện nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (BAC -
Bacterial Artificial Chromosome) như là một công cụ có sức thuyết phục mạnh mẽ
nhất để xây dựng thư viện bộ gen cho cây lúa, thành lập bản đồ vật lý có chất lượng
cao và dùng để hợp nhất bản đồ vật lý với bản đồ di truyền. Bên cạnh đó, việc sử
dụng chỉ thị phân tử PCR và dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây lúa cũng
là một trong những ứng dụng từ thư viện BAC.
Xuất phát từ những cấp thiết trên, đề tài: ”Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR và
dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây lúa (Oryza sativa L.)” được thực
hiện.

2

2.Mục tiêu nghiên cứu
- Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA liên kết chặt với gen qui định mùi thơm “fgr”
trên các dòng giống làm bố mẹ và quần thể con lai nhằm xác định những dòng con
lai có chứa gen mùi thơm.
- Khai thác thư viện BAC để hổ trợ tìm kiếm những chỉ thị liên kết với tính
trạng mùi thơm trên cây lúa.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1 Ý nghĩa khoa học
- Xác định những dấu chuẩn phân tử riêng biệt liên kết với gen “fgr” trên cây
lúa giúp cho việc chọn dòng con lai hiệu quả hơn.
- Xác định những dòng BAC DNA để tạo các chỉ thị mới liên kết với gen qui
định mùi thơm khai thác từ nguồn dòng BAC để hiểu rõ hơn về kỹ thuật dòng hóa
gen mục tiêu, phục vụ nghiên cứu sâu hơn về chức năng gen này.
3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Đề tài đã góp phần bổ sung những dòng lúa có triển vọng biểu thị mùi thơm
thông qua ứng dụng những dấu chuẩn phân tử riêng biệt liên kết chặt với gen “fgr”
phục vụ cho việc phát triển những giống lúa thơm cao sản ở ĐBSCL.
- Với những kết quả đạt được từ việc khai thác thư viện BAC, đề tài đã tìm
và phân tích chỉ thị mới từ đó chuyển sang chỉ thị chứa đoạn gen mùi thơm phục vụ
cho chọn giống lúa.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu trên các đối tượng là các giống lúa mùa và các giống lúa cao
sản hiện đang được duy trì và nhân giống.
- Khai thác thư viện BAC DNA để xác định những dòng BAC chứa gen mùi
thơm.
- Phạm vi nghiên cứu:
+ Chỉ xác định nội dung có liên quan đến các chỉ thị phân tử liên kết
với gen “fgr” trên nhiễm sắc thể số 8 và ứng dụng kết quả trên để chọn giống lúa
cao sản có gen mục tiêu.
3

+ Phân lập được đoạn phân tử mang gen mục tiêu.
+ Chưa phân tích phổ chức năng (gene profile).
+ Chưa nghiên cứu được điều kiện để gen thể hiện (gene expression)
ở các qui mô khác nhau.
4
CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài
1.1.1 Hợp chất tạo mùi thơm, gen thơm và một số yếu tố môi trường ảnh
hưởng đến việc hình thành mùi thơm trên lúa
1.1.1.1 Hợp chất tạo mùi thơm và sự thể hiện của chúng trên các bộ

phận của cây lúa
Mùi thơm của hạt gạo được xác định do nhóm formaldehyde, ammonia và
hydrogen sulfide tạo nên. Một vài nghiên cứu còn ghi nhận mùi thơm là do sự tăng
của propanol, pentanol và hexanol trong quá trình tồn trữ. Ngày nay bằng phương
pháp hiện đại đã xác định mùi thơm được tạo thành bởi hàng trăm lọai
hydrocacbon, alcohol, aldehyde, keton, acid, phenol, pyridine và những hợp chất
khác đã được ghi nhận trong cơm [3], [70].
Tác giả Kim [64] báo cáo rằng các hợp phần hydrocacbon không khác nhau
có ý nghĩa giữa lúa thơm và không thơm, tuy nhiên lúa thơm có mức độ cao hơn về
alcohol, aldehyde, keton, acid; trong đó lúa thơm có nồng độ 2-acetyl-1-pyrroline
cao gấp 15 lần so với lúa không thơm.
Lorieux và ctv [76] đã phân tích mẫu gạo của 2 giống lúa Azucena (thơm) và
IR64 (không thơm), kết quả không tìm thấy chất 2-acetyl-1-pyrroline ở IR64
(không thơm), trong khi đó giống lúa thơm Azucena có hàm lượng cao về chất này.
Trong số 89 hợp chất phân tích, xử lý thống kê cho thấy các chất sau có sự khác biệt
giữa giống lúa thơm và không thơm đó là: pentanol, 2-acetyl-1-pyrroline,
benzaldehyde, octanol, pentadecan-2-1,6,10,14-imethylpentadecan-2-1 và hexanol.
Tác giả Buttery và ctv [39] đề nghị rằng sự khác nhau giữa lúa thơm và
không thơm không chỉ ở sự hiện diện hay vắng mặt của chất 2-acetyl-1-pyrroline
mà còn trong sự khác nhau về số lượng của hoạt chất có trong lúa gạo. Nhiều alen
5

của một gen thơm có thể tạo ra sự biến đổi nhỏ trong cùng một enzyme kết quả là
dẫn đến tính thơm khác nhau.
Tác giả Buttery và ctv [40] đã phân tích và xác định 2-acetyl-1-pyrroline (2-
AP) như là một thành phần quan trọng đóng góp vào mùi thơm của các giống lúa
thơm. Theo đánh giá về chất lượng mùi thơm của 2-acetyl-1-pyrroline được mô tả
giống như mùi của ngô nổ. Xác định nồng độ mùi thơm của 10 giống lúa, khoảng
nồng độ từ 6 ppb đến 90ppb với lúa chà trắng. Lúa chưa chà trắng nồng độ 2-acetyl-
1-pyrroline là 100-200ppb. Vì thế có thể nghĩ rằng bề mặt lớp aloron của hạt gạo

giữ một vai trò quan trọng trong việc hình thành mùi thơm của cơm khi nấu. Mũi
của người có thể phát hiện được hợp chất thơm 2-acetyl-1-pyrroline ở nồng độ
0,007ppm. Do đó, đánh giá bằng cảm quan trong điều kiện nhất định và với những
người có khứu giác bình thường kết quả có thể tin tưởng được.[47]
Các tác giả Ahmed và ctv [31], Lin và ctv [74] đã khẳng định lại báo cáo của
Buttery và ctv [40], Paule và ctv [84] rằng 2-acetyl-1-pyrroline là hợp chất chính
tạo nên mùi đặc trưng cho các giống lúa thơm.
Bên cạnh đó, Buttery và ctv [38] đã phân tích lá của cây lá dứa (Pandabases
amaryllifolius) nhận thấy rằng thành phần bay hơi chính cũng là 2-acetyl-1-
pyrroline (2AP) và có một sự liên hệ rất mật thiết giữa chất 2-acetyl-1-pyrroline
trong lá của cây lá dứa và lúa thơm. Nồng độ của chất 2-acetyl-1-pyrroline trong lá
của cây lá dứa cao hơn gấp 10 lần trong lúa thơm và cao hơn gấp 100 lần trong lúa
không thơm.
Tóm lại, hiện nay có hai quan điểm về thành phần chất thơm của lúa gạo.
Quan điểm thứ nhất cho rằng chất thơm được tạo ra từ các hợp chất aldehyde
(CHO) và keton (C=O) và các hợp chất với lưu hùynh. Quan điểm thứ hai cho rằng
chất thơm lúa gạo, do vòng ryrrol kiểm sóat tính thơm của chất 2-acetyl-1-pyrroline
[34]. Tác giả Kader và Delseny [59] cho rằng có sự khác nhau trong việc thể hiện
mùi thơm trên các bộ phận của cây lúa, hợp chất 2AP được thể hiện một cách tự
nhiên từ giai đoạn mạ cho đến khi chín và đặc biệt là trong giai đoạn hạt trưởng
thành trên các bộ phận của cây lúa ngoại trừ rễ, mùi thơm được tích lũy nhiều nhất
6

trên bộ phận hạt lúa. Bên cạnh đó, các tác giả Chen và ctv [42], Vanavichit và ctv
[102] cũng khẳng định mùi thơm không thể hiện hoặc thể hiện rất thấp không đáng
kể trên bộ phận rễ lúa.
1.1.1.2 Gen thơm
Li và Gu [71] cũng nghiên cứu về sự di truyền và vị trí của gen thơm trên
lúa. Sự lai thuận nghịch giữa các giống lúa thơm đã cho thấy rằng các gen của
chúng có alen với nhau.

Tác giả Bradbury và ctv [78] đã phân tích mùi thơm của lúa Basmati và
Jasmine với sự thể hiện của 2-acetyl-1-pyrroline. Một gen lặn fgr trên NST số 8 của
lúa qui định sự thể hiện tính trạng quan trọng này và có một gen tương ứng mã hóa
protein có tên gọi là Betaine Aldehyde Dehydrogenase (BAD) thể hiện sự đa hình
có ý nghĩa trong vùng chứa gen thơm. Gen fgr có sự tương đồng với gen mã hóa
BAD2 trong lúa và có thể xem gen fgr là một dạng đột biến của gen mã hóa BAD2.
Ngược lại, gen mã hóa BAD1 định vị trên nhiễm sắc thể số 4. Gen mã hóa BAD
liên kết với gen kháng stress trong cây trồng.
Tác giả Shi và ctv [107] cũng kết luận gen fgr là gen lặn nằm trên NST số 8
liên quan đến mùi thơm của lúa. Gen này có một alen lặn mất chức năng bad2 và
alen trội BAD2 mã hóa protein BAD2 làm cho lúa không thơm. Tổng số 34 giống
lúa thơm và không thơm đã được nghiên cứu và giải trình tự đoạn phân tử
BAD2/bad2. Trong số 24 giống lúa thơm có 12 giống chứa alen bad2 (bad2-E7),
với sự kiện mất đi 8 cặp bazơ và 3 SNPs trên exon số 7, số còn lại có một alen bad2
mới (bad2-E2) - chuỗi trình tự tương đồng với bad2-E7 nhưng đã mất đi 7 cặp bazơ
trên exon số 2. Cả hai alen này đều qui định mùi thơm của lúa. Dựa trên chuỗi trình
tự khác nhau giữa BAD2 và 2 alen lặn bad2 đã phát triển những chỉ thị phân tử giúp
cho việc xác định dòng lúa thơm, phân biệt rõ dòng không thơm và thơm xét về
kiểu gen. Tuy nhiên, kiểu hình biểu thị ra bên ngoài vô cùng phức tạp điều này có
thể do điều kiện môi trường qui định sự ức chế hoặc kích hoạt promoter để gen thể
hiện mùi thơm.
7

Bên cạnh đó, tác giả Fitzgerald và ctv [80] cũng đã có nhận xét tương tự với
tác giả Shi và ctv [107]: 2-acetyl-1-pyrroline là hợp chất chính tạo nên mùi thơm
trong lúa và được tích lũy do bởi sự mất đi 8 cặp bazơ trong một alen ở locus “fgr”.
Trong nghiên cứu này, 2-acetyl-1-pyrroline được định lượng. Sự thể hiện hay vắng
mặt của alen fgr đã được xác định trong 464 mẫu của các giống lúa truyền thống
của Trung Tâm Ngân Hàng Gen IRRI mang tên T.T.Chang. Kết quả cho thấy rằng
nhiều giống lúa thơm, đặc biệt từ Nam và Đông Nam Á, không biểu thị sự mất đi 8

cặp bazơ, nhưng sản phẩm 2-acetyl-1-pyrroline vẫn được xác định trong cả dạng
gạo và dạng cơm của những giống này. Sự mất đi 8 cặp bazơ trong locus fgr không
chỉ là nguyên nhân qui định mùi thơm mà còn có một đột biến khác đã điều khiển
sự tích lũy sản phẩm 2-acetyl-1-pyrroline. Protein tổng số 2-acetyl-1-pyrroline được
mã hóa bởi những gen đồng dạng fgr không biểu thị khác biệt có ý nghĩa so với
kiểu gen n-fgr. Một vài kiểu gen fgr, đặc biệt từ Nam Á mã hóa protein này với sự
tích lũy số lượng lớn 2-acetyl-1-pyrroline như Basmati. Sự đột biến tạo ra 2-acetyl-
1-pyrroline trong các giống lúa thơm n-fgr có thể được tạo ra một vài lần trong quá
trình thuần hóa và tiến hóa. Gen fgr và các alen khác liên quan tới 2-acetyl-1-
pyrroline đã qui tụ lại trong các giống lúa thơm ở Nam Á tạo ra các giống lúa đặc
sản cổ truyền có mùi thơm cao. Sự xác định nhiều đột biến đối với 2-acetyl-1-
pyrroline có thể xảy ra trong các chương trình chọn giống lúa để đa dạng nguồn di
truyền của 2-acetyl-1-pyrroline nhằm phát triển giống lúa có mùi thơm cao và chất
lượng tốt.
1.1.1.3 Một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến việc hình thành mùi
thơm trên lúa
+ Nhiệt độ
Theo tác giả Juliano [57b] việc hình thành mùi thơm trong hạt tăng lên ở
nhiệt độ thấp trong suốt giai đoạn vào chắc của hạt. Giống lúa Basmati yêu cầu
nhiệt độ thấp (25
o
C ban ngày, 21
o
C ban đêm trong suốt quá trình trưởng thành) thì
tốt cho việc hình thành mùi thơm.

8

+ Đất
Nhân tố đất cũng ảnh hưởng đến mùi thơm và các tính trạng chất lượng khác

thông qua dinh dưỡng cây trồng và mối quan hệ tương tác của các chất dinh dưỡng
bay hơi với các thành phần bay hơi có liên quan đến mùi thơm. Singh và ctv [94]
nhận thấy có sự khác nhau một cách có ý nghĩa về mùi thơm của lúa ở hai thửa
ruộng liền kề nhau mặc dù là cùng một giống. Điều kiện đất tơi xốp và đất vùng cao
cũng giúp hình thành mùi thơm được tốt hơn.
Bên cạnh đó, Bocchi và ctv [36] đã đánh giá sự ảnh hưởng của các đặc tính
đất trên chất lượng mùi thơm của lúa trên ruộng thử nghiệm ở Pavia, Italy và kết
luận rằng hàm lượng cao nhất của các chất bay hơi trong hạt có liên quan đến các
loại đất có hàm lượng sét thấp và hàm lượng cát cao. Ảnh hưởng của tương tác kiểu
gen và đất trên chất lượng hạt lúa của lúa Japonica thì cũng được báo cáo bởi Lee
và ctv [68].
+ Tập quán canh tác
Theo Singh và ctv [94] lúa sẽ có mùi thơm hơn khi cây lúa được sạ trực tiếp
so với khi được cấy. Bên cạnh đó thời gian thu hoạch là một nhân tố khác có ảnh
hưởng đến mùi thơm và những tính trạng chất lượng khác ở lúa. Việc trì hoản thu
hoạch sau khi chín có thể làm giảm mùi thơm. Cả năng suất và phẩm chất hạt sẽ
giảm đi nếu việc thu họach vượt quá thời gian này. Sự tác động của việc trì hoãn thu
họach trên phẩm chất lúa gạo thông qua sự giảm hay thay đổi trong các thành phần
hạt do bởi nhiệt độ, ẩm độ, côn trùng dịch hại và các vi sinh vật khác.
+ Độ thuần giống
Theo Singh và Singh [93] trong hầu hết các vùng trồng lúa thơm bản địa ở
Ấn Độ, người nông dân thường sử dụng hạt của các thế hệ trước. Không có chương
trình cải thiện năng suất cho các giống lúa này. Kết quả là hạt không thuần dẫn đến
việc giảm đi mùi thơm.
Tóm lại, các thành phần di truyền, tập quán canh tác, môi trường và các nhân
tố khác có ảnh hưởng đến sự thể hiện của mùi thơm và các tính trạng chất lượng
trên lúa thơm. Cùng một giống được trồng ở các nơi khác nhau có thể không sản