tăng độ đạm của nước mắm bằng phương pháp phối trộn dịch chiết từ bã men bia

LỜI MỞ ĐẦU

Trong những thập niên gần đây đã có nhiều ứng dụng của công nghệ sinh học
trong công nghiệp sản xuất thực phẩm, làm đa dạng hóa các sản phẩm, đáp ứng nhu cầu
phát triển xã hội. Đó là con đường hết sức ưu việt, kinh tế, đầy triển vọng, trong đó con
đường tổng hơp các chất nhờ VSV được áp dụng rộng rãi và phổ biến nhất.
Thực tiễn khoa học đã chứng minh khả năng tuyệt vời của vi sinh vật như khả
năng sinh sản, phát triển nhanh, tốc độ tổng hợp protein cao hơn hẳn các loại động vật,
thực vật khác; nguyên liệu làm môi trường nuôi chúng là các phế phẩm, phụ liệu của
công nghiệp nên rẻ, dễ kiếm do vậy giá thành sản phẩm thấp; vi sinh vật còn có khả năng
tổng hợp các chất khác như vitamin, kháng sinh, acid amin, enzyme.
Sinh khối nấm men bia là nguồn bổ sung dinh dưỡng quan trọng trong chăn nuôi,
có thể bổ sung cho cả người. Sinh khối nấm men bia giàu protein, dễ dàng thủy phân để
thu được acid amin đã có nhiều ứng dụng trong sản xuất dịch chiết nấm men – yeast
extract, được sử dụng như là một chất điều vị trong chế biến thực phẩm, làm thành phần
bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
Tuy nhiên ở Việt Nam hiện nay các nhà máy bia vẫn chưa ứng dụng bã men bia
một cách hiệu quả đa số chỉ dùng làm thức ăn cho gia súc, một số nhà máy chỉ thải ra môi
trường bên ngoài, điều này sẽ gây ô nhiễm môi trường.
Do đó, để giải quyết được vấn đề ô nhiễm môi trường, tạo ra một hướng đi mới
trong việc sử dụng protein trong bã men bia, em đã chọn đề tài: “Tăng độ đạm nước mắm
bằng phương pháp phối trộn dịch chiết từ bã men bia”.
Chương 1 Tổng quan
- 1 -

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

Chương 1 Tổng quan
- 2 -
1.1 NƯỚC MẮM:
1.1.1 Nước mắm là gì: [4]
Nước mắm là dung dịch thủy phân từ các loại cá được ướp muối lâu ngày trải qua
một quá trình lên men phức tạp để tạo ra những hương vị đặc trưng cho từng chủng loại
sản phẩm khác nhau. Nó được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực của các quốc gia Đông
Nam Á như một loại gia vị nước chấm cho các món ăn như cá, tôm, thịt, rau…
Ở Việt Nam, nước mắm là sản phẩm lên men từ các loại cá đặc biệt như cá cơm,
là sản phẩm truyền thống của dâu tộc. Nước mắm được sản xuất từ rất lâu, cho đến nay
chưa có tài liệu nào xác định được thời điểm chính xác và ai là người Việt Nam đầu tiên
đưa ra quy trình sản xuất sản phẩm này. Chỉ biết rằng, nước mắm đã gắn liền với đời
sống hằng ngày và là một bản sắc rất riêng của dân tộc Việt Nam.
Nước mắm là hỗn hợp các acid amin. Các acid amin này được tạo thành do sự
thủy phân của protease. Các protease này là do vi sinh vật tổng hợp nên. Muối có tác
dụng ức chế vi sinh vật gây thối. Tỷ lệ muối thích hợp là 2025%. Tác dụng làm ngấu và
tạo hương ngoài protease của vi sinh vật còn do các enzyme tiêu hóa cơ trong nội tạng cá.
Nhiệt độ có tác dụng rất lớn đến hoạt động của các enzyme trong quá trình sản xuất nước
mắm. Nhiệt độ thích hợp là 3644
o
C.
Trong quá trình thủy phân, độ acid tăng. Ban đầu của quá trình làm nước mắm,
môi trường kiềm yếu có tác dụng rất tốt. Nguyên liệu chính được dùng sản xuất các loại
nước mắm là các loại cá. Tuy nhiên, chất lượng nước mắm lại phụ thuộc rất nhiều vào
từng loại cá. Cũng chính vậy cho dù dùng cùng một công nghệ sản xuất nhưng chất lượng
nước mắm ở mỗi nơi mỗi khác.
1.1.2 Công nghệ sản xuất nước mắm: [4]

Quá trình sản xuất nước mắm bao gồm hai quá trình chuyển hóa cơ bản. Quá trình
thủy phân protein nhờ enzyme protease và quá trình tạo hương thơm cho nước mắm.
Quá trình thủy phân protein thành các acid amin là quá trình chính trong sản xuất
nước mắm, nhờ protease của vi sinh vật và protease có trong tụy tạng cá, nếu quá trình
này xảy ra quá mạnh sẽ dẫn đến sản phẩm cuối cùng là acid amin và một số loại khí như
H
2
S, NH
3
Các sản phẩm này có thể hòa tan trong nước mắm, cũng có thể bay hơi tạo
sản phẩm rất khó chịu và làm hao tổn đạm, chính vì thế trong sản xuất nước mắm người
ta rất hạn chế hiện tượng này.
Chương 1 Tổng quan
- 3 -
Quá trình tạo hương là một quá trình phức tạp, đòi hỏi phải có thời gian nhất định
để sản phẩm tích lũy năng lượng tập trung cho sự chuyển hóa các hợp chất hữu cơ tạo
thành hương. Mùi vị đặc trưng do sự tạo thành các acid hữu cơ như acid formic, acid
acetic, acid propionic, acid butylic đồng phân tạo ra bởi vi khuẩn Pediococcus halophilus
trong quá trình lên men. Ngoài ra, theo những nghiên cứu về nước mắm cho thấy tác
nhân quan trọng hình thành mùi thơm đặc trưng của nước mắm là các vi khuẩn yếm khí.
Năm 1930, Eoer và Guillerm đã tách được từ nước mắm một loại vi khuẩn kỵ khí sinh
nha bào là Clostridium, đem cấy vào môi trường thạch – pepton sinh ra mùi nước mắm.
Như vậy, nước mắm là một dung dịch, dung dịch đó không chỉ có acid amin,
NaCl mà còn phải có các hương vị đặc trưng của nó. Sự chuyển hóa này rất phức tạp đòi
hỏi phải có thời gian cần thiết. Do đó, ta cần phải có thời gian nhất định để sản phẩm tích
lũy được hương vị đặc trưng của nước mắm, nếu thiếu quá trình này thì nước mắm không
còn là « nước mắm » mà chỉ là dung dịch acid amin.
1.1.3 Thành phần hóa học của nước mắm:[4, 13]
Tùy theo xuất xứ của nước mắm mà thành phần hóa học của nó có khác nhau. Vì
vậy nước mắm ở mỗi nước dựa trên những kỹ thuật sản xuất khác nhau sẽ cho ra những

loại nước mắm có thành phần khác nhau.
Bảng 1.1 pH và hàm lượng NaCl, Nitơ tổng của nước mắm sản xuất từ các quốc gia khác
nhau [13]
Các nước
pH
NaCl
(g/100ml)
Nitơ tổng
(g/100ml)
Thái Lan
5,63
21,4
1,7
Việt Nam
5,75
20,2
2,6
Trung Quốc
6,15
11,0
1,5
Hàn Quốc
5,49
22,2
1,3
Nhật Bản
5,54
18,0
1,8

Chương 1 Tổng quan
- 4 -
Bảng 1.2 Hàm lượng các acid amin trong nước mắm sản xuất từ các quốc gia khác nhau
(mg/100ml)[13]
Acid amin
Thái Lan
Việt Nam
Trung
Quốc
Hàn Quốc
Nhật
Bản
Taurine
119
171
117
192
223
Aspartate
583
1.002
511
349
657
Threonine
384

584
285
207
420
Serine
233
483
95
128
369
Glutamate
1.489
1.584
1.164
550
1.088
Proline
135
322
127
181
230
Glycine
267
461
265
346
298
Alanine
574

985
597
715
611
Cysteine
17
45
125
36
23
Valine
478
709
493
427
517
Methionine
222
230
206
197
237
Isoleucine
334
374
348
347
392
Leucine
439

427
471
544
541
Tyrosine
91
128
88
110
128
Phenylalanine
323
415
328
257
374
Triptophan
323
50
328
12
24
Lysine
767
1.269
653
655
801
Histidine
275

370
191
103
318
Arginine
3
217
191
50
280
Tổng cộng
6.732
9.626
6.061
5.406
7.532

Các hợp chất chứa N chiếm tỉ lệ cao trong thành phần chất khô của nước mắm,
quyết định đến giá trị dinh dưỡng của nước mắm. Các hợp chất chứa N trong nước mắm
bao gồm đạm hữu cơ (acid amin, peptide, polypeptide, acid nucleic), đạm vô cơ (NH
3
,
Chương 1 Tổng quan
- 5 -
muối amoni, muối nitrate…). Trong nước mắm có đầy đủ acid amin thiết yếu cho cơ thể
trong đó chiếm hàm lượng cao là lysine, aspartic acid, glutamic acid…
Các chất bay hơi trong nước mắm có thành phần khá phức tạp, quyết định hương
vị của nước mắm. Theo một số nghiên cứu cho thấy: trong các hợp chất bay hơi có 12
loại trung tính, 4 loại acid bay hơi, 8 loại amin bay hơi và 6 loại carbonyl bay hơi.
Bảng 1.3 Hàm lượng các chất bay hơi trong nước mắm

Chất bay hơi
Hàm lượng (mg/100mL)
Các hợp chất Carbonyl
407-512
Acid
404-533
Amin
9,5-13,2
Trung tính
5,1-13,2

Trong nước mắm ngoài NaCl còn có các chất vô cơ khác như S, Ca, Mg, P, I, Br.
Ngoài ra còn chứa các vitamin (B1, B2, B12, PP) nhưng hàm lượng rất thấp.
Bảng 1.4 Hàm lượng một số chất vô cơ trong nước mắm
Các chất vô cơ
Hàm lượng (g/L)
NaCl
200-280
S
0,546-1,165
Ca
0,439-0,541
P
2,208-2,31
Mg
0,266-0,566
I
5,08-7,61
Br
68,8-97,5

Bảng 1.5 Hàm lượng các vitamin trong nước mắm
Các vitamin
Hàm lượng (mg/L)
B1
7
B2
8,7
B12
3,3
PP
4,4

Chương 1 Tổng quan
- 6 -
1.1.4 Tiêu chuẩn TCVN về nước mắm:
Có nhiều TCVN có liên quan đến sản phẩm nước mắm. Các bảng 2.6 đến 2.8
trình bày một số chỉ tiêu trích từ các TCVN.
Theo TCVN 107-1993, nước mắm được phân làm 4 hạng: đặc biệt, thượng hạng,
hạng 1, hạng 2.
Bảng 1.6 Các chỉ tiêu cảm quan của nước mắm theo TCVN 107-1993
Tên chỉ tiêu
Yêu cầu
Đặc biệt
Thượng hạng
Hạng 1
Hạng 2
Màu sắc
Từ vàng, vàng nâu đến nâu vàng
Độ trong

Trong sánh, không vẩn đục
Trong, không vẩn đục
Mùi
Thơm rất đặc trưng của nước
mắm, không có mùi lạ
Thơm đặc trưng của nước
mắm, không có mùi lạ
Vị
Ngọt của đạm
Có hậu vị rõ

Ngọt của đạm
Có hậu vị
Ngọt của đạm
Ít hậu vị
Ngọt của đạm
Không mặn
chat

Bảng 1.7 Chỉ tiêu vi sinh của nước mắm theo TCVN 5526-91
Tên chỉ tiêu
Mức giới hạn
Tổng số vi sinh vật hiếu khí, CFU/ml, không
lớn hơn
2.10
4

Escherichia coli
Không được có
Coliform, CFU/ml, không lớn hơn

10
Clostridium perfringens (Welchi), CFU/ml,
không lớn hơn
2
Salmonella, Shigella, CFU/ml
Không được có
Staphylococcus aureus
Không được có





Chương 1 Tổng quan
- 7 -
Bảng 1.8 Chỉ tiêu hóa học nước mắm theo TCVN 5107-1993
Tên chỉ tiêu
Mức chất lượng
Đặc biệt
Thượng hạng
Hạng 1
Hạng 2
Hàm lượng Nitơ toàn phần
tính bằng g/L không nhỏ hơn
25
20
15
10
Hàm lượng Nitơ acid amin,
tính bằng % so với Nitơ toàn

phần, không nhỏ hơn
46
45
40
34
Hàm lượng Nitơ amoniac,
tính bằng % so với Nitơ toàn
phần, không lớn hơn
25
26
30
35
Hàm lượng acid, tính bằng
g/L theo acid axetic, không
nhỏ hơn
6,5
6
4
3
Hàm lượng muối Natri
clorua, tính bằng g/L, trong
khoảng


260-295

Chỉ tiêu kim loại nặng – giới hạn hàm lượng chì theo TCVN 5685-92, hàm lượng
chì có trong nước mắm được sản xuất từ cá không được quá 1mg/L.
1.1.5 Quy trình sản xuất nước mắm: [4, 1, 7]
Hiện nay, trong sản xuất nước mắm có nhiều phương pháp khác nhau, có thể phân

thành hai công nghệ cơ bản: công nghệ sản xuất nước mắm dài ngày và công nghệ sản
xuất nước mắm ngắn ngày.
 Quy trình sản xuất nước mắm dài ngày:

Chương 1 Tổng quan
- 8 -

Cá
Muối
Chượp
Gài nén

Tháo đảo
Chạy hệ thống que
long
Trữ trong thùng giá
Phá đấu
Bảo ôn
Chai, bình
Nắp

Nhãn

Thùng
N

Nước mắm chai
Chiết rót

Đóng nắp

ROÙT

Dán nhãn

Rút màng co

Đóng thùng

Bảo quản

Nước mắm xái

Hình 1.1 Quy trình sản xuất nước dài ngày
Chương 1 Tổng quan
- 9 -
Đặc điểm:
o Cơ chế tạo sản phẩm: trong công nghệ sản xuất nước mắm dài ngày quá
trình thủy phân protein tạo acid amin và tạo hương cho nước mắm từ hệ vi
sinh vật sẵn có và thời gian tác động chậm để ổn định chất lượng hương vị
cho nước mắm.
o Đặc trưng của sản phẩm: tạo được cảm quan màu, mùi, vị đặc trưng của
nước mắm.
o Thời gian chượp: 6-9 tháng
o Lượng muối cho vào chượp với tỉ lệ cá: muối = 1:4, cho muối nhiều lần.

Chương 1 Tổng quan
- 10 -

 Quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày:

Hình 1.2 Quy trình làm nước mắm ngắn ngày
Cá
Trộn muối lần 1
Trộn muối lần 2
Trộn muối lần 3
Chượp chín
Lọc
Dịch lọc 1
Bã chượp 1
Gây hương
Phá đấu
Thành phẩm
Dịch lọc 2
Bã chượp 2

Kéo rút
Bã
Protease
Chương 1 Tổng quan
- 11 -

Đặc điểm:
o Cơ chế tạo sản phẩm: trong công nghệ sản xuất nước mắm nhằm rút ngắn
thời gian sản xuất là người ta dựa vào hệ enzyme từ bên ngoài bổ sung vào
trong quá trình sản xuất, nhờ hệ enzyme được bổ sung vào làm cho quá
trình thủy phân protein xảy ra nhanh hơn, từ đó rút ngắn được thời gian
sản xuất.
o Đặc trưng của sản phẩm: vì thời gian lên men xảy ra nhanh nên không thể
ổn định được hương vị và màu sắc của nước mắm.
o Thời gian sản xuất nước mắm: 30 ngày
Khi so sánh hai phương pháp sản xuất nước mắm ngắn ngày và dài ngày, người ta
thấy nước mắm ngắn ngày có hàm lượng đạm toàn phần khá cao, tuy nhiên về hương vị
thơm ngon đặc trưng thì kém nước mắm dài ngày. Người ta có thể khắc phục bằng cách
pha trộn với nước mắm dài ngày hoặc bổ sung thêm chất tạo hương vị đặc trưng thơm
ngon, hoặc cho chảy qua lớp xác bã mắm của nước mắm dài ngày.
Bảng1.9 So sánh thành phần hóa học sản xuất nước mắm ngắn ngày có chế phẩm enzyme
VSV và sản xuất nước mắm dài ngày theo phương pháp thông thường [5]
Phương
pháp
Thời gian
thủy phân
Muối
g/L
Acid
g/l

N-tổng
g/L
N-formol
g/L
N-NH
3

Có bổ sung
enzyme VSV
30 ngày
257
6,2
27,06
17,64
6,1
Không bổ
sung enzyme
6-9 tháng
262
5,09
25,48
14,82
3,82

Chương 1 Tổng quan
- 12 -
1.2 BÃ MEN BIA:
1.2.1 Bã men bia là gì:
Bã men bia là chất thải trong quá trình sản xuất bia. Cặn men ở các thùng lên men
chính sau khi đã chuyển dịch vào lên men phụ chia làm 3 lớp. lớp dưới cùng là những tế
bào già, có lực lên men yếu, lớp giữa là những tế bào trẻ hơn có khả năng lên men mạnh,
và lớp trên cùng là những tế bào có kích thước nhỏ khả năng kết lắng kém cùng với
những vẩn cặn protein và houblon. Vì thế có một lượng bã men thải ra đáng kể từ các nhà
bia rất lớn.
1.2.2 Thành phần hóa học và dinh dưỡng của nấm men bia [2, 9, 15, 7, 10]
Công thức hóa học tổng quát của sinh khối nấm men là:
C
3921
H
6365
O
2070
N
597
P
40
S
6
Bảng 1.10 Thành phần hóa học của nấm men bia
Thành phần
Tỉ lệ %
Polysaccharide
34,1%
Trehalose

5,0%
Acid nucleic và các nucleotide
10,8%
Phospholipide
4,5%
Triglyceride
2,5%
Sterol
1,0%
Tro
3,1%
Protein
39,0%

Thành phần hóa học và dinh dưỡng của nấm men bia phụ thuộc vào giống,
môi trường, trạng thái sinh lý và điều kiện nuôi cấy.
- Protein là thành phần quan trọng nhất của tế bào nấm men, chiếm hơn 45% tổng
thành phần nấm men. Đa số các nấm men đều có khả năng tổng hợp toàn bộ 20 axit amin
vốn tạo nên các phân tử protein của chúng. Do có chứa những axit amin thiết yếu nấm
men từ lâu đã được sử dụng trong thực phẩm cho người và gia súc.
- Hệ enzyme trong tế bào nấm men rất phong phú, ngoài hệ enzyme chuyển hóa
đường rất đặc trưng như alcoholdehydrogenase, còn có một số enzyme nội bào đã được
nghiên cứu -1,3- glucanase, -1,3-glucan transferase( là một hợp chất mannoprotein chủ
Chương 1 Tổng quan
- 13 -
yếu của S.cerevisiae), chitinase, -N-Acetylglucosaminidase, Glutaminyl-peptid--
glutamylyl-transferase, proteinase, phospholipase, phosphatase, trehalase.
- Ngoài ra, trong tế bào nấm men còn có glutathione, một loại tri-peptid của
glutamate, glycine, được nghiên cứu ứng dụng trong y học nhờ có hoạt tính chống oxy
hóa. Theo Rolf Sommer, 1996, hoạt tính chống oxy hóa các hợp chất melanoidine( điển

hình là glutathione) thậm chí còn mạnh hơn buthyhydroxyanisole( BHA) hay propyl
gallate. Thí nghiệm của Rolf Sommer cho thấy sử dụng glutathione với liều lượng 0,01%
- 0,02% làm giảm đáng kể sự trở mùi của bơ ở nhiệt độ phòng.
Bảng 1.11 Thành phần các hợp chất chủ yếu trong bã men bia
Thành phần
Hàm lượng (%)
Nước
75,00
Chất chứa nitơ
14,00
Lipid
0,75
Chất hòa tan không chứa nitơ
8,25
Tro
2,00

Bảng 1.12 Thành phần chất khô của bã men bia
Thành phần
Hàm lượng (%)
Protein
51-58
Lipid
2-3
Glucid
9-11,5
Tro
8,1-9,1
Chất hòa tan không chứa nitơ
25-30

Nhiệt lượng tính bằng calo/gram
4560-4840

Vitamin: nấm men bia cung cấp một lượng lớn vitamin, đặc biệt là vitamin nhóm
B như vitamin B1, B2, B6, acid panthotenic, biotin, acid folic… vì vậy đã được sử dụng
vào mục đích chữa bệnh thiếu vitamin nhóm B. Khi lên men nhào bằng nấm men, người
ta cũng nhận thấy sự gia tăng hàm lượng vitamin. Ngoài ra acid folic còn có tác dụng
kích thích sinh trưởng một số vi sinh vật như Streptococus lactis, Lactobacillus casei.

Chương 1 Tổng quan
- 14 -
Bảng 1.13 Hàm lượng vitamine trong bã men bia (

g/g men khô)
Các vitamin
Hàm lượng (

g/g)
Thiamin (vitamin B1)
24-50
Riboflavin (vitamin B2)
30-60
Pyridoxine (vitamin B6)
14-39
Acid pantotenic ( vitamin B3)
2-19
Biotin (vitamin H)
0,6-0,7
Nicotinanit ( vitamin B5)
370-375

1.2.3 Các hướng tận dụng nấm men bia [3]
Khi kết thúc quá trình lên men lượng men tăng lên gấp bốn lần. Khoảng 25%
lượng men này được sử dụng lại, phần bã men còn lại có dạng lỏng sánh trong đó chứa
đến 70% nước. Để sử dụng nấm men đã qua lên men phải xử lý bằng cách thu nhận cặn
nấm men chuyển vào thùng hình trụ, cho nước lạnh vào khuấy nhẹ sau đó để lắng. Tách
bỏ phần trên và phần dưới đáy, chỉ nhận phần ở giữa có chứa nhiều tế bào nấm men
trưởng thành. Phần sinh khối này được rửa bằng nước khử trùng ở 1
o
C nhiều lần.
Đối với bã men bia hiện nay được nhiều nước trên thế giới tận dụng vào các mục
đích khác nhau như sản xuất dịch chiết men (ekisu, Nhật Bản), làm gia vị thực phẩm,
thức ăn gia súc, thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật… Tại Nhật, lượng bã men
vào năm 2000 là khoảng 10.000 tấn, năm 1990, lượng men sử dụng để chế biến thuốc
chiếm 17-18%, chế biến thực phẩm chiếm 20%, thuốc động vật là 12-13% và chế biến
phân bón hỗn hợp là 50%. Ở Việt Nam, các nhà máy bia không chú trọng đến việc tận
dụng nguồn bã men này, thông thường bã men được sấy khô làm thức ăn gia súc hoặc
thải ra ngoài sau giai đoạn xử lý, gần đây một hướng nghiên cứu mới tại Việt Nam tận
dụng bã men bia để sản xuất chế phẩm invertase sử dụng trong công nghiệp sản xuất
nước giải khát, kẹo…
1.2.4 Quá trình thủy phân bã men bia [5, 6]
Tế bào nấm men được bao bọc bởi lớp màng khá dầy, để có dịch chiết từ nấm
men chúng ta cần phải phá vỡ tế bào. Có nhiều cách để phá vỡ tế bào nấm men khác
nhau:
 Phương pháp cơ học:
Chương 1 Tổng quan
- 15 -
o Phương pháp nghiền: do tế bào nấm men rất nhỏ nên phải có chất trợ
nghiền, thường sử dụng những hạt thủy tinh.
o Phương pháp đồng hóa áp lực cao: đây là phương pháp được sử dụng rộng

rãi ở quy mô công nghiệp. Huyền phù của tế bào nấm men được nén với
một áp suất cao và chúng va chạm mạnh vào vành ống. Tế bào được phá
vỡ bởi lực cắt và sức nén.
 Phương pháp vật lý
o Phương pháp sốc nhiệt: bằng cách làm lạnh đông huyền phù tế bào rồi
tăng nhiệt nhanh lên 40
o
C để phá vỡ vách tế bào. Phương pháp này dễ
thực hiện nhưng hiệu suất không cao. Hoặc cũng có thể đun dịch huyền
phù nấm men đến 100
o
C.
o Phương pháp dùng sóng siêu âm: đây là phương pháp rất phổ biến, tốc độ
nhanh, dễ thực hiện, hiệu quả đối với nhiều loại tế bào. Sóng siêu âm
truyền trong môi trường lỏng tạo nên các vi lỗ, khi các lỗ này vỡ ra sẽ tạo
nên một lực cắt rất lớn có khả năng phá vỡ màng tế bào. Theo Miller
(1996), xử lý dịch tế bào trong 40 giây bằng sóng siêu âm có thể phá vỡ
đến 75% lượng tế bào, lượng protein hòa tan tăng lên 65% trong dịch tế
bào.
 Phương pháp hóa học
o Có thể sử dụng axit hoặc kiềm để phá vỡ tế bào nấm men. Ưu điểm của
phương pháp hóa giải bằng axit là hiệu suất cao, rút ngắn được thời gian.
Tuy nhiên việc sử dụng axit đậm đặc là rất độc hại đối với công nhân, yêu
cầu thiết bị phải chống ăn mòn. Acid có thể làm biến đổi một số tính chất
của các sản phẩm bên trong tế bào, phá hủy các axit amin như lizin,
arginine, cysteine, tryptophan. Và đặc biệt là nó có thể tạo ra các chất gây
đột biến.
Khi xử lý bằng kiềm có thể phá hoảng một số axit amin như: cysteine,
cystin, arginine, một vài acid amin bị racemic hóa.
 Phương pháp sinh học

Hai phương pháp thường dùng là phương pháp tự phân và phương pháp thủy
phân.
Chương 1 Tổng quan
- 16 -
o Tự phân: là phương pháp phá vỡ tế bào được sử dụng nhiều nhất đối với
nấm men. Trong quá trình tự phân, nấm men sẽ bị phân hủy bởi hệ
enzyme nội bào của nó, trong đó quan trọng nhất là proteinase và
peptidase. Bình thường các enzyme này không hoạt động mạnh, nhưng
nếu điều kiện nhiệt độ, pH, độ ẩm ở bên ngoài tế bào thích hợp thì chúng
sẽ tiến hành thủy phân các thành phần có trong tế bào và cả vách tế bào.
Các phần tử bên trong sẽ đi ra khỏi tế bào xâm nhập vào môi trường bên
ngoài. Thông thường người ta tiến hành tự phân huyền phù nấm men ở
nhiệt độ 48-52
o
C.
o Phương pháp thủy phân: người ta dùng enzyme tương ứng với cơ chất có
trong vách tế bào để phá vỡ tế bào như cellulase hay protease. Phương
pháp này có thể kiểm soát được quá trình sản xuất, dễ thực hiện, không
gay hư hỏng các chất trong tế bào.Tuy nhiên việc sử dụng các chế phẩm
enzyme để thu được sản phẩm theo ý muốn làm tăng chi phí cho quá trình
sản xuất.
1.2.5 Sản xuất dịch tự phân nấm men [3, 15]
Dịch tự phân nấm men bao gồm các thành phần hòa tan và không hòa tan của tế
bào nấm men, chủ yếu được sử dụng trong công nghiệp lên men như một chất nền và
trong công nghiệp thực phẩm như chất gia tăng hương vị. Trong dịch tự phân nấm men
còn có các thành phần không hòa tan do vách tế bào nấm men không được tách ra khỏi
sản phẩm.
Tại chân Âu, nguyên liệu để sản xuất dịch tự phân nấm men là các loại men có
sinh khối giàu protein (S.cerevisiae) phát triển trên môi trường mật rỉ. Tại Anh và Mỹ,
người ta còn dùng men bia đã loại chất đắng để sản xuất dịch chiết nấm men

(S.cerevisiae và S.uvarum). Ngoài ra một số nấm men khác cũng được sử dụng như
Kluyveromyces fragilis (lên men nhũ thanh sữa) hay Candida utilis (phát triển ethanol).
Quy trình sản xuất dịch tự phân nấm men bao gồm giai đoạn tự phân (có thể bổ
sung thêm enzyme), sau đó toàn bộ dich tự phân được đem đi sấy khô để thu thành phẩm
dạng bột.
Ta có thể tác động để quá trình tự phân bắt đầu bằng cách thay đổi nhiệt độ hay
áp suất thẩm thấu nhằm làm chết nấm men nhưng không bất hoạt các enzyme nội bào.
Chương 1 Tổng quan
- 17 -
Cần phải điều chỉnh pH, nhiệt độ, thời gian để có được một quá trình tự phân hiệu quả
nhất, đây cũng chính là ba yếu tố quyết định đến chất lượng của dịch tự phân nấm men.
Theo Satake, pH từ 46, nhiệt độ khoảng trên dưới 50
o
C là thích hợp nhất, khi đã kết
thúc giai đoạn này, để ức chế hoạt động của nấm men, kiềm chế vi khuẩn và loại bỏ khí
gas thì phải tăng thêm nhiệt độ.
Tỉ lệ giữa acid amin tự do với các di-, tri-, tetra- và oligopeptid trong dịch tự phân
nấm men tương đối ổn định. Để tăng tỉ lệ acid amin tạo thành trong sản phẩm người ta
còn thêm các enzyme từ bên ngoài vào như protease hay hỗn hợp protease và peptidase.
Sự bổ sung enzyme còn làm cho dịch tự phân nấm men có hương vị đặc biệt, mở ra khả
năng ứng dụng dịch tự phân nấm men trong chế biến thực phẩm.
Bảng 1.14 Hàm lượng axit amin và axit amin tự do trong dịch tự phân nấm men
Amino Acid
% Trong sản phẩm
% acid amin tự do
trong sản phẩm
Asparaginic acid
6.66
2.49
Threonine

3.20
2.02
Serine
3.28
2.35
Glutamic acid
9.18
6.01
Glycine
3.17
1.11
Alanine
5.53
4.78
Cystein
0.45

Valine
4.09
3.30
Methionine
1.12
1.08
Isoleucine
3.38
2.64
Leucine
4.83
4.34
Tyrosine

1.92
1.46
Phenylalanine
2.80
2.72
Histidine
1.63
1.80
Lysine
5.51
3.08
Arginine
1.71
0.24

Chương 1 Tổng quan
- 18 -
Từ bảng trên cho thấy không có một tỉ lệ nhất định nào giữa lượng acid amin và
lượng acid amin tự do. Trong đó, ít nhất 85% các loại acid amin như methionine, leucine,
alanine và phenylalanine là axit amin tự do, phần acid amin tự do còn lại chỉ chiểm
khoảng 14 – 37% là asparaginic acid. Nguyên nhân bắt nguồn từ quá trình tự phân bởi
các enzyme protease của chính tế bào nấm men bao gồm các endopeptidase và
exopeptidase.
Bảng 1.15 Hàm lượng các vitamin có trong dịch tự phân nấm men
Vitamin
Hàm lượng (mg/100g)
Thiamine – B1
3,0
Riboflavin – B2
11,9

Niacin
68,0
B6
2,3
Folic axit
3,1
Ca-Pathothenate
30,0
Biotin
0,25

Hàm lượng vitamin có thể thay đổi tùy theo quy trình sản xuất, điểu chỉnh pH
cũng như điều kiện tiệt trùng có ảnh hưởng rất lớn đến việc giữ được phẩm chất vitamin.
Ngoài ra trong dịch tự phân nấm men còn có các chất khoáng.
Bảng 1.16 Hàm lượng chất khoáng trong dịch tự phân nấm men
Chất khoáng
Hàm lượng, mg%
Canxi
120
Magie
200
Kali
3.300
Natri
 500
Sắt
5
Photpho
1800

Chương 1 Tổng quan
- 19 -
1.3 ENZYME THỦY PHÂN PROTEIN (PROTEASE) [5]
Protease là loại enzyme thuộc nhóm hydrolase xúc tác phản ứng thủy phân liên
kết peptid trong phân tử protein để tạo thành các peptid ngắn và cuối cùng tạo thành các
axit amin và NH
3
.
Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các liên kết peptid trong phân tử protein,
người ta chia protease ra làm hai nhóm chính:
o Endopeptidase (proteinase): phân giải các liên kết peptid nằm sâu trong
phân tử protein tạo thành những đoạn peptid có trọng lượng phân tử nhỏ,
bao gồm pepsin, rennin, trypsin và chymotripsin.
o Exopeptidase (pedtidase): phân giải liên kết peptid ở hai đầu mạch
polypeptid. Trong đó có aminopeptidase và carboxypeptid có nhóm amin
và carboxyl tự do, Ngoài ra còn có dipeptidase phân giải dipeptid thành
các acid amin tự do.
Dựa vào thành phần acid amin và vùng pH tối ưu của protease, người ta chia ra
các nhóm:
o Protease acid: pepsin, rennin…
o Protease kiềm: trypsin, chymotripsin…
o Protease trung tính: papain
Dựa vào cấu tạo của trung tâm hoạt động, protease được chia làm 4 nhóm theo
Hartley năm 1960[l]
o Nhóm 1: bao gồm các loại protease có serin trong trung tâm hoạt động
như trypsin, chymotripsin, elastase…
o Nhóm 2: gồm các protease chứa nhóm thiol như bromelin, papain, ficin.

o Nhóm 3: gồm các protease có chứa kim loại trong trung tâm hoạt động và
trực tiếp tham gia quá trình xúc tác, điển hình là các protease trung tính
của vi sinh vật.
o Nhóm 4: gồm các protease có chứa nhóm -carboxyl như pepsin, remin
và các protease acid của vi sinh vật.
Protease được thu nhận từ các nguồn động vật, thực vật và vi sinh vật. Protease
động vật gồm pepsin (E.C.3.4.4.1), rennin (E.C.3.4.4.3), trypsin (E.C.3.4.21.4),
chymotrypsin (E.C.3.4.21.1), chế phẩm pancreatin. Protease thực vật gồm có papain
Chương 1 Tổng quan
- 20 -
(E.C.3.4.22.2) có trong mủ cây đu đủ, bromelin (E.C.3.4.22.5) được sản xuất từ vỏ và
chồi của quả dứa, ficin ( E.C.3.4.22.3) có nhiều trong nhựa cây họ sung.
Protease vi sinh vật được nghiên cứu và ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực bao
gồm cả protease kiềm, protease acid và protease trung tính. Người ta thu nhận protease vi
sinh vật chủ yếu từ các nguồn vi khuẩn và nấm mốc, thông thường protease nấm mốc có
khả năng phân cắt protein triệt để hơn protease vi khuẩn. Vi sinh vật có khả năng sinh
tổng hợp mạnh protease thuộc các giống Bacillus, Clostridium, Aspergillus, Rhizopus. .
Các loại protease từ vi khuẩn được sử dụng là protease kiềm và protease trung tính. Các
loại protease vi khuẩn thường có hoạt tính cao khả năng chịu nhiệt độ cao rất tốt.
Protease nấm mốc thuộc protease acid, kiềm và cả trung tính. Tính chất của một
số protease nấm mốc được thể hiện trong bảng :
Bảng 1.17 Tính chất của một số protease nấm mốc
Stt
Vi sinh vật
Khoảng pH hoạt động
pH ổn
định tối
ưu
Hemoglobin
Casein

1
Aspergillus oryzae (Protease
acid)
3,0 – 4,0
2,5 – 3,0
5,0
2
Aspergillus oryzae (Protease
trung tính)
5,5 – 7,5

7,0
3
Aspergillus oryzae (Protease
kiềm)
6,0 – 9,5
6,5 - 10
7,0 – 8,0
4
Rhizopus chinensis
5,0
2,9 – 3,3
3,8 – 6,5
5
Mucor pusillus
3,5 – 4,5
5,6
3,0 – 6,0

Thông thường các chế phẩm enzyme thương mại được sản xuất từ hỗn hợp vi sinh

vật gồm nấm mốc (Asperglillus, Rhizopus, Phycomycetes), vi khuẩn (Bacillus) và một vài
bộ phận của thực vật (đu đủ, dứa). Hỗn hợp này có chứa cả peptidase và proteinase nên
hiệu suất thủy phân cao, có khoảng pH hoạt động rộng (3-7) và chịu nhiệt cao (70
o
C).
Các hãng sản xuất chế phẩm protease thương mại lớn trên thế giới phải kể đến là
các thương hiệu Novo (Đan Mạch), Gist – Brocades (Hà Lan), Genencor International và
Miles Laboratories (Mỹ) [8, 16].
Chương 1 Tổng quan
- 21 -
Ở Việt Nam, công nghệ enzyme chưa phát triển. Các nghiên cứu trước đây có đề
cập đến hầu hết các loại enzyme có nguồn gốc từ động vật, thực vật và vi sinh vật, nhưng
chưa có enzyme đang được sử dụng nhiều ở quy ở mô công nghiệp tại Việt Nam hiện nay
đều do hãng NOVO của Đan Mạch cung cấp [5].
Bảng 1.18 Các chế phẩm enzyme protease phổ biến của hãng sản xuất Novo Nordisk
[11, 14]
Enzyme
Loại
Khoảng
nhiệt độ
hoạt động
T
opt

Khoảng
pH hoạt
động
pH
opt

Alcalase
Savinase
Esperase
Purafect L
Properase L
Flavourzyme
CIPzyme
Neutrase

Protease
Protease
Protease
Protease
Protease
Endo- và
exoprotease
Protease/lipase
Protease
< 70
< 65
< 75
25 – 65
25 – 65
< 50
30 – 75
45 – 55
60
50
60
55

55



< 11,5
< 12
< 12
7 – 12
7 – 12
5,5-7,5
7 – 11

9,0
9.5
9,5
10,0
9,5
6,0

6,5

1.3.1 Thủy phân với enzyme Flavozyme
- Giới thiệu enzyme Flavozyme: [20,18, 19]
Nguồn gốc: Aspergillus oryzae
Protein có thể được làm ngắn mạch với Flavozyme nhờ endo-protease/exo-
peptide tạo sản phẩm cuối cùng là các peptide mạch ngắn và acid amin tự do.
Dùng Flavozyme để thủy phân protein chịu được nồng độ muối tốt (<5%) để tăng
tốc độ thủy phân, không tạo ra các phản ứng có hại, sau thủy phân sản phẩm có vị
tinh khiết và dịu, hạn chế tạo ra vị đắng sau thủy phân.
Chương 1 Tổng quan

- 22 -
- Ứng dụng Flavozyme trong thủy phân protein của các chất đạm khác nhau:
s
Hình 1.3 Thủy phân protein bằng Flavozyme
Tùy thuộc pH ban đầu của hỗn hợp nền, có thể dùng 2 phương pháp thủy phân
khác nhau:[q]
o A. pH hỗn hợp nền gần trung tính:
Đạm thực vật (đậu nành, các loại hạt), có thể dễ dàng thủy phân bằng Flavozyme,
pH thông thường của các chất này gần như là trung tính khi được nhũ hóa trong nước.
Trong trường hợp này, ban đầu nên thủy phân với Protamex TM hoặc Alcalase, sau đó
với Flavourzyme:
- Thủy phân sơ bộ với Protamex hoặc Alcalase bắt đầu ở pH = 8
- Nồng độ chất nền: 8-16% protein
- Nhiệt độ: 50-55
o
C
- Lượng enzyme dùng: 6- 15 kg Protamex 1.5MG hay 4-10kg Alcalase 2.4L
/tấn protein
- Thời gian: 15- 30 phú.
pH sẽ tự giảm xuống trong quá trình thủy phân đến khoảng 7.
Kế đến thủy phân với Flavozyme, pH sẽ giảm xuống thêm đến khoảng 6
- Nhiệt độ: 50
o
C
- Lượng enzyme dùng : 20,000 – 25,000 LAPU Flavourzyme/kg protein,
tương ứng 20 – 25kg Flavourzyme/kg protein).
- Thời gian : 4-16 giờ
Chương 1 Tổng quan
- 23 -
Cũng cần lưu ý rằng nếu giai đoạn thủy phân ban đầu dùng Alcalase, sản phẩm

thủy phân trong một số trường hợp sẽ hơi đắng do sự tạo thành các peptid có vị đắng. Vị
đắng này sẽ mất đi trong giai doạn thủy phân với Flavourzyme, vì các peptid đã bị phân
hủy.
o B. pH của hỗn hợp nền hơi axit, khoảng 5,0- 5,5
Trong trường hợp này, có thể chia ra hai giai đoạn thủy phân với Flavourzyme ở
những khoảng pH khác nhau:
Đầu tiên thủy phân với Flavourzyme bắt đầu ở pH hỗn hợp nền. pH này sẽ gần
như không thay đổi trong quá trình thủy phân, vì hầu hết các amino acid có giá trị pK
a

trong vùng hơi acid.
o Nồng độ chất nền: 8-16% protein
o Nhiệt độ: 50-55
o
C
o Lượng enzyme dùng: 20,000-50,000 LAPU Flavourzyme/kg protein.
o Thời gian : 4-8 giờ.
Quá trình này thì thuận tiện hơn nếu chất nền hơi acid, và muối sẽ thêm vào ít chỉ
cần một lần điều chỉnh pH thay vì 2.
Thời gian phản ứng dài, thích hợp hơn cho sự tạo thành hương vị, nhưng thường
đòi hỏi hỗn hợp phản ứng phải được ổn định để ngăn ngừa nhiễm khuẩn. Flavourzyme
chịu được muối tốt.
- Những chất đạm khác như: gelatine, cá, đậu hà lan, nấm men… có thể thủy phân
bằng Flavourzyme.
1.3.2 Khử hoạt enzyme [19]
Các enzyme có thể ngưng hoạt động ở 85
o
C trong 5-10 phút sau khi giai đoạn
thủy phân hoàn tất.

Chương 1 Tổng quan
- 24 -
Bảng 1.19 Hiệu suất thủy phân của các loại enzyme
Protease
pH opt
T
o
opt
DH, %
Alcalase
8
50-60
15-25
Alcalase AF
2.4 L
8
50-60
15-25
Novo- Pro D
7-10
55-65
15-25
Neutrase
7

40-50
10-15
Protamex
7-8
50
10-20
Flavourzyme
5.5-7.5
50-55
60

Để tăng hiệu suất thủy phân của Flavozyme người ta còn kết hợp với nhiều loại
enzyme khác nhau trên thị trường, tạo điều kiện để enzyme Flavozyme hoạt động hiệu
quả.


Hình 1.4 Hiệu suất thủy phân của enzyme protease