Luận Án Tiến Sĩ Nông Nghiệp Nghiên Cứu Hệ Gen Phiên Mã (Transcriptome) Của Tôm Sú (Penaeus Monodon) Nhằm Sàng Lọc Các Chỉ Thị Phân Tử Phục Vụ Công Tác Chọn Giống.pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-------

NGUYỄN GIANG THU

NGHIÊN CỨU HỆ GEN PHIÊN MÃ
(TRANSCRIPTOME) CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON)
NHẰM SÀNG LỌC CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ
PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-------

NGUYỄN GIANG THU

NGHIÊN CỨU HỆ GEN PHIÊN MÃ

(TRANSCRIPTOME) CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON)
NHẰM SÀNG LỌC CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ
PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9420201
Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Đinh Duy Kháng
2. PGS.TS. Nguyễn Hữu Ninh

HÀ NỘI - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả
nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa
từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã
được cám ơn, các thơng tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn
gốc.

Hà Nội, ngày

tháng năm2018

Tác giả luận án

Nguyễn Giang Thu

i

LỜI CẢM ƠN
Để hồn thiện luận án, cho phép tơi xin được bày tỏ lịng kính trọng và
biết ơn sâu sắc PGS.TS. Đinh Duy Kháng – Viện Công nghệ sinh học – Viện
Hàn lâm KH&CN Việt Nam và PGS.TS. Nguyễn Hữu Ninh – Viện Nghiên
cứu Nuôi trồng thủy sản 3 đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời
gian và tạo điều kiện cho tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học,
PGS.TS. Đồng Văn Quyền – Phó Viện trưởng, Trưởng phịng Vi sinh vật học
phân tử, TS. Nguyễn Cường – Trưởng phòng Tin sinh học- Viện Công nghệ sinh
học, cùng các anh chị em trong phòng đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tơi trong
suốt q trình thực hiện đề tài.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Nguyễn Văn Sáng, TS. Nguyễn
Văn Hảo, TS. Đặng Tố Vân Cầm, cùng các anh chị em cán bộ - Viện Nghiên
cứu Nuôi trồng thủy sản 2 đã cung cấp mẫu tôm cho nghiên cứu này.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Khoa học
Nông nghiệp Việt Nam, Ban Đào tạo sau đại học đã tận tình giúp đỡ tơi trong
q trình học tập, thực hiện đề tài và hồn thành luận án.
Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng
nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tơi về mọi mặt, động viên
khuyến khích tơi hồn thành luận án./.
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Nghiên cứu sinh

Nguyễn Giang Thu
ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................... ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... i
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................... ii
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................... iii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 5
1.1. TƠM SÚ VÀ TÌNH HÌNH NI TƠM SÚ Ở VIỆT NAM........... 5
1.1.1. Giới thiệu về tơm sú ..................................................................... 5
1.1.2. Tình hình ni tơm sú trên thế giới và Việt Nam ......................... 7
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HỆ GEN VÀ HỆ GEN PHIÊN MÃ
CỦA TÔM SÚ TRÊN THẾ GIỚI .......................................................... 11
1.2.1. Cơng trình nghiên cứu đầu tiên liên quan tới hệ gen phiên mã của
tôm

. .................................................................................................. 12

1.2.2. Xác định các gen liên quan tới hệ miễn dịch của tơm thơng qua
việc phân tích hệ phiên mã .................................................................... 13
1.2.3. Xác định các gen có liên quan tới khả năng sinh sản của tôm ....... .
. .................................................................................................. 14
1.2.4. Xác định các gen có liên quan tới giới tính của tơm sú............... 14
1.2.5. Nghiên cứu giải trình tự hệ gen và hệ phiên mã tôm sú ở Thái Lan
. .................................................................................................. 15
1.2.6. Nghiên cứu lập bản đồ gen tôm sú ở Đài Loan ........................... 16
1.2.7. Nghiên cứu giải mã hệ gen và hệ phiên mã tôm sú ở Việt Nam .... .
. .................................................................................................. 16
1.3. CHỈ THỊ PHÂN TỬ SNP VÀ MICROSATELLITE ................... 18
1.3.1. Chỉ thị phân tử SNP ................................................................... 18

1.3.2. Chỉ thị phân tử Microsatellite..................................................... 21
1.4. TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG VÀ MỘT SỐ GEN DỰ ĐOÁN
LIÊN QUAN Ở ĐỘNG VẬT GIÁP XÁC .............................................. 25
1.4.1. Tính trạng tăng trưởng ............................................................... 25
1.4.2. Các nhóm gen ứng viên liên quan đến tính trạng tăng trưởng đã
được cơng bố trong nhóm giáp xác ........................................................ 26
1.4.3. Các nhóm gen ứng viên trong q trình lột xác .......................... 32
1.4.4. Các gen phân giải và phát triển hệ cơ trong quá trình lột xác ..... 35
1.5. SƠ LƯỢC CÁC PHẦN MỀM LẮP RÁP SỬ DỤNG CHO CƠNG
NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI...................................... 38
1.5.1. Phân loại các phần mềm lắp ráp ................................................. 39
1.5.2. Các phần mềm lắp ráp cho hệ gen .............................................. 39
1.5.3. Các phần mềm lắp ráp cho hệ gen phiên mã .............................. 41
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............ 44
2.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU............................................................ 44
2.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ......................................................... 44
2.3. ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .................................... 44
2.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU........................................................... 47
2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. 47
2.5.1. Phương pháp tách riêng rẽ các mô nghiên cứu ........................... 48
2.5.2. Tách chiết RNA tổng số từ mô tôm bằng Trizol ......................... 48
2.5.3. Tách và tinh sạch mRNA ........................................................... 49
2.5.4. Thiết lập thư viện cDNA ............................................................ 50
2.5.5. Phương pháp tiền xử lý dữ liệu .................................................. 50
2.5.6. Phương pháp lắp ráp de novo hệ gen phiên mã .......................... 51
2.5.7. Phương pháp đánh giá chất lượng lắp ráp hệ phiên mã .............. 51


2.5.8. Phương pháp chú giải chức năng của unigene trong hệ gen phiên
mã ………………………………………………………………………53

2.5.9. Phương pháp phân tích biểu hiện hệ gen phiên mã ..................... 54
2.5.10. Xác định các SNP trong ngân hàng unigene ............................... 54
2.5.11. Xác định các microsatellite trong ngân hàng unigene................. 55
2.5.12. Phát hiện SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ................... 55
2.5.13. Phương pháp định lượng Real-time PCR (qPCR) ...................... 56
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 57
3.1. XÂY DỰNG BỘ CƠ SỞ DỮ LIỆU HỆ GEN PHIÊN MÃ
(TRANSCRIPTOME) TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) ................. 57
3.1.1. Sàng lọc mẫu tôm sạch bệnh ...................................................... 57
3.1.2. Chuẩn bị thư viện cDNA............................................................ 58
3.1.3. Giải trình tự, đánh giá và tiền xử lý dữ liệu đọc trình tự thơ ....... 66
3.1.4. Lắp ráp và chú giải chức năng hệgen phiên mã .......................... 70
3.1.5. Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu hệ gen phiên mã (transcriptome) tôm
sú (Penaeus monodon)........................................................................... 78
3.2. SÀNG LỌC CÁC GEN GIẢ ĐỊNH (UNIGENE) LIÊN QUAN
ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG CỦA TÔM SÚ (PENAEUS
MONODON) ............................................................................................ 85
3.2.1. Sàng lọc các unigene .................................................................. 85
3.2.2. Phân tích sự biểu hiện khác nhau của hệ gen phiên mã tôm sú
(Penaeus monodon) ............................................................................... 90
3.3. SÀNG LỌC CÁC SNP LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG
TRƯỞNG CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON)TỪ DỮ LIỆU HỆ
PHIÊN MÃ. ............................................................................................. 96


3.4. SÀNG LỌC CÁC SNP LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG
TRƯỞNG TỪ NHĨM TƠM SÚ GIA HĨA TĂNG TRƯỞNG NHANH
VÀ TĂNG TRƯỞNG CHẬM ................................................................ 99
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 101
KẾT LUẬN ........................................................................................... 101

KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 102
DANH MỤC CƠNG TRÌNH CÔNG BỐ................................................ 103
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................ 104
PHỤ LỤC.................................................................................................. 123


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Nghĩa Tiếng Việt

3’UTR

3’ untranslated region (trình tự khơng dịch mã đầu 3’)

cDNA

Complementary Deoxyribonucleic Acid (DNA bổ sung
được tổng hợp từ mRNA)

Contig

Contiguous nucleotide sequence

DNA

deoxyribonucleic acid

EC

Enzyme commission

IHHNV

Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus
(virus gây gệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan tạo
biểu mô)

MBV

Monodon baculovirus (virus gây bệnh còi)

Nr-NCBI

Non redundant protein database-National Center for
Biotechnology Information

PCR

Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuếch đại gen)

RNA

Ribonucleic acid

RNA-seq

RNA sequencing (giải trình tự RNA)

TSV

Taura syndrome virus (virus gây hội chứng Taura)

WSSV

White spot syndrome virus (virus gây hội chứng đốm
trắng)

YHV

Yellow head virus (virus gây bệnh đầu vàng)

QC

Quality score (Điểm chất lượng đánh giá trình tự)

i


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Các mẫu tôm sú thu từ vùng biển khác nhau của Nghệ An-Hà Tĩnh
..................................................................................................................... 45
Bảng 2.2: Thông tin về 10 mẫu tôm tăng trưởng nhanh và 10 mẫu tơm tăng
trưởng chậm sử dụng trong phân tích hệ gen phiên mã (transcriptome) ........ 46
Bảng 2.3: Cặp mồi sử dụng cho qPCR ......................................................... 56
Bảng 3.1: Nồng độ mRNA của các mô nghiên cứu ...................................... 61
Bảng 3.2: Nồng độ DNA sử dụng cho giải trình tự transcriptome bằng hệ
thống Illumina MiSeq platform .................................................................... 62
Bảng 3.3: Mô tả bộ dữ liệu sau khi giải trình tự ........................................... 66
Bảng 3.4: Thống kê số lượng, độ dài trình tự đọc theo từng mô................... 68

Bảng 3.5: Thống kê kết quả lắp ráp hệ gen phiên mã tinh sạch từ các mô tôm
sú Penaeus monodon .................................................................................... 70
Bảng 3.6: Thống kê kết quả chú giải chức năng tôm sú P.monodon ............ 72
Bảng 3.7: Thống kê kết quả các microsatellite trong hệ phiên mã tôm sú
P.monodon. .................................................................................................. 81
Bảng 3.8: Thống kê miền lặp của các microsatellite trong hệ phiên mã tôm
sú.................................................................................................................. 82
Bảng 3.9: Thống kê unigene liên quan đến tăng trưởng trong hệ gen phiên mã
tôm sú .......................................................................................................... 87
Bảng 3.10: Sự biểu hiện của hệ phiên mã tôm sú ......................................... 91
Bảng 3.11: Thống kê một số SNPs được chú giải ở một số gen chính liên
quan đến tính trạng tăng trưởng .................................................................... 97

ii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Tơm sú thu được từ vùng biển Nghệ An, Việt Nam. ...................... 5
Hình 1.2: Sản lượng tôm sú của một số nước trên thế giới vào năm 2011
(Nguyễn Bích, 2013) ...................................................................................... 8
Hình 1.3: Mơ hình SNP ............................................................................... 19
Hình 2.1: Mẫu tơm sú tự nhiên thu từ một điểm của vùng biển Nghệ An .... 44
Hình 2.2: Sơ đồ nghiên cứu ......................................................................... 47
Hình 2.3: Tơm sú và hình ảnh giải phẫu ...................................................... 48
Hình 2.4: Cách tính N50. ............................................................................. 53
Hình 3.1: Minh họa chất lượng của RNA trên kết quả đo bằng Bioanalyzer
( />_prep_kit_v2/input_req.html) ....................................................................... 59
Hình 3.2: Mẫu RNA không thể hiện được chỉ số RIN trên máy Bioanalyzer
(đánh dấu màu đỏ) ....................................................................................... 60
Hình 3.3: Xác định nồng độ cDNA mơ tim bằng hệ thống Bioanalyzer ....... 63

Hình 3.4: Xác định nồng độ cDNA mô cơ và mô gan tụy bằng hệ thống
Bioanalyzer .................................................................................................. 64
Hình 3.5: Xác định nồng độ cDNA mơ gốc mắt bằng hệ thống Bioanalyzer 65
Hình 3.6: Kết quả đánh giá chất lượng dữ liệu trình tự đọc thơ và dữ liệu
trình tự đọc tinh sạch của các mơ ................................................................. 69
Hình 3.7: Phân bố độ dài toàn bộ unigene trên hệ gen phiên mã tinh sạch ... 71
Hình 3.8: Thống kê kết quả chú giải BLASTX trên cơ sở dữ liệu NR-NCBI,
A: Thống kê phân bố giá trị E-value, B: Thống kê phân bố độ tương đồng, C:
Thống kê phân bố loài trong bộ kết quả tin cậy nhất (E-value thấp nhất)...... 74
Hình 3.9: Thống kê thông tin chú giải chức năng trên ngân hàng Gene
Ontology. ..................................................................................................... 76
Hình 3.10: Thống kê thơng tin chú giải chức năng trên ngân hàng COG. .... 77
iii


Hình 3.11: Thống kê 10 con đường chuyển hóa có số lượng unigene tham gia
nhiều nhất ..................................................................................................... 78
Hình 3.12: Số lượng SNP ở các mơ ............................................................. 79
Hình 3.13: Sự phân bố SNP trong các mô từ bộ cơ sở dữ liệu hệ phiên mã . 80
Hình 3.14: Giao diện tìm kiếm SNP trên ngân hàng transcriptome tôm sú thu
tại vùng biển Việt Nam ................................................................................ 83
Hình 3.15: Giao diện tìm kiếm microsatellite trên ngân hàng transcriptome
tôm sú thu tại vùng biển Việt Nam ............................................................... 84
Hình 3.16. Biểu đồ nhiệt (heatmap) minh họa thể hiện mức độ biểu hiện của
125 unigene liên quan đến tính trạng tăng trưởng trên từng mơ. ................... 93
Hình 3.17: Biểu đồ nhiệt (heatmap) minh họa thể hiện mức độ biểu hiện của
20 unigene top đầu liên quan đến tính trạng tăng trưởng tìm thấy trong mơ
tim. ............................................................................................................... 94
Hình 3.18: Biểu đồ nhiệt (heatmap) minh họa thể hiện mức độ biểu hiện của
20 unigene top đầu liên quan đến tính trạng tăng trưởng tìm thấytrong mơ cơ.

..................................................................................................................... 94
Hình 3.19: Biểu đồ nhiệt (heatmap) minh họa thể hiện mức độ biểu hiện của
20 unigenetop đầu liên quan đến tính trạng tăng trưởng tìm thấy trong mơ gan
tụy. ............................................................................................................... 95
Hình 3.20: Biểu đồ nhiệt (heatmap) minh họa thể hiện mức độ biểu hiện của
20 unigene top đầu liên quan đến tính trạng tăng trưởng tìm thấy trong mơ
gốc mắt......................................................................................................... 95
Hình 3.21: Đánh giá mức độ biểu hiện của unigen bằng qPCR.................... 96
Hình 3.22: Số lượng SNP trong nhóm tơm tăng trưởng nhanh và tăng trưởng
chậm........................................................................................................... 100

iv


MỞ ĐẦU
Tôm sú (Penaeus monodon) là một trong những đối tượng thủy sản có
giá trị kinh tế cao và được nuôi phổ biến ở hơn 22 quốc gia trên thế giới như
Thái Lan, Việt Nam, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia, Indonesia, Ấn Độ…Tại
Việt Nam, nghề nuôi tôm sú phát triển mạnh mẽ, với trên 600.000 ha diện tích
ni, sản lượng mỗi năm đạt khoảng 300.000 tấn. Theo thông tin của Hiệp hội
Chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), xuất khẩu tôm tăng
trưởng mạnh trong năm 2017, kim ngạch đạt 3,85 tỷ USD, tăng 22,3% so với
năm 2016. Ở Việt Nam, tôm sú là đối tượng quan trọng thứ hai sau tôm thẻ
chân trắng, với kim ngạch xuất khẩu chiếm khoảng 1/3 kim ngạch xuất khẩu
về tôm nước lợ.
Nghề ni tơm sú có ưu thế lớn là nguồn tài ngun bản địa có thể ni
và khai thác lâu dài, đóng góp quan trọng vào vấn đề an tồn lương thực, xóa
đói giảm nghèo và phát triển kinh tế xã hội của mỗi nước nhưng đang đối mặt
với nhiều thách thức và có xu hướng giảm dần. Nguyên nhân chính của hiện
tượng này là khơng chủ động được tơm bố mẹ do khai thác từ tự nhiên và các

loại dịch bệnh tràn lan gây chết tôm hàng loạt. Nếu như trước năm 2003, đối
tượng tôm nuôi chủ yếu ở châu Á là tôm sú, chiếm tới 80% thị phần trên tồn
thể giới, thì từ năm 2004, tơm thẻ chân trắng từ châu Mỹ tràn sang với lợi thế
là chủ động được tôm bố mẹ, tạo được đàn tôm giống sạch bệnh đã lấn át dần
tôm sú. Tại Thái Lan, tỷ lệ phần trăm giữa tôm sú/tôm thẻ chân trắng năm
2003 là 60/40, thì đến nay chỉ cịn khoảng 1/99.
Chiến lược phát triển lâu dài của các nước còn diện tích ni tơm sú
trong đó có Việt Nam là có được ngành sản xuất tôm sú bền vững, hạn chế tối
thiểu các tác động tiêu cực đến môi trường sinh thái. Nền tảng cho chiến lược
phát triển này là phát triển nguồn tơm bản địa với các chương trình nhân
giống khoa học để nâng cao tỷ lệ sống và sự tăng trưởng. Để đạt được mục
1


đích này, việc nghiên cứu cấu trúc và chức năng của tồn bộ hệ gen tơm sú là
một vấn đề khoa học cơ bản có định hướng ứng dụng hết sức quan trọng.
Nghiên cứu hệ gen tôm sú sẽ cung cấp thơng tin chính xác cho việc xác
định các tính trạng quan trọng như: tính trạng tăng trưởng, tính kháng bệnh,
tính chống chịu với điều kiện mơi trường, các tính trạng liên quan đến chất
lượng tơm. Do kích thước hệ gen tơm sú khá lớn, ước tính khoảng 2,17 Gb,
nên việc giải mã tồn bộ hệ gen tơm sú địi hỏi thời gian và tốn nhiều kinh
phí. Vì vậy, để có thể từng bước khai thác các thơng tin cần thiết từ hệ gen
tôm sú, đặc biệt là khai thác các chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn giống
thì việc giải trình tự và phân tích hệ gen phiên mãvới phương pháp xác định
trình tự gen thế hệ mới NGS (Next generation sequencing), chú giải chức
năng gen và sàng lọc các chỉ thị phân tử liên quan tới các tính trạng quan
trọng như tăng trưởng nhanh, chống chịu bệnh tốt...để phục vụ công tác chọn
giốnglà cách tiếp cận hợp lý và khả thi.
Với những luận cứ nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hệ
gen phiên mã (Transcriptome) của tôm sú (Penaeus monodon) nhằm sàng

lọc các chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn giống”.
Đề tài được thực hiện tại Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công
nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
Mục tiêu chung: Nghiên cứu phân tích hệ gen phiên mã của tôm sú
(Penaeus monodon) nhằm sàng lọc chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn
giống.
Mục tiêu cụ thể:

2


- Giải mã hệ gen phiên mã (transcriptome) từ 4 mô (mô cơ, môt tim, mô
gan tụy, mô gốc mắt) của tôm sú (Penaeus monodon), thiết lập cơ sở dữ liệu
hệ phiên mã phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
- Sàng lọc các gen giả định liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tơm
sú.
- Xác định các SNP và microsatellite từ cơ sở dữ liệu hệ phiên mã.
- Xác định bộ SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tôm sú.
PHẠM VI NGHIÊN CỨU
- Thu nhận mẫu tơm sú gia hóa và tơm sú tự nhiên từ vùng biển Việt
Nam.
- Kiểm tra, đánh giá, sàng lọc để lựa chọn các mẫu tôm sú không bị
nhiễm một số bệnh nguy hiểm theo tổ chức sức khỏe động vật thế giới (World
Organisation for Animal health – OIE) như bệnh đốm trắng (WSSV), hoại tử
gan tụy cấp (IHHNV), đầu vàng (YHV), bệnh còi (MBV) và bệnh
taura(TSV).
- Tách chiết RNA tổng số, tinh sạch mRNA và tạo thư viện cDNA cho
4 mơ (gan tụy, tim, cơ và gốc mắt).
- Giải trình tự gen hệ phiên mã transcriptome từ 4 mô của tơm sú, phân

tích và đánh giá chất lượng dữ liệu thu nhận được.
- Xây dựng cơ sở dữ liệu transcriptome tôm sú Việt Nam.
- Sàng lọc các gen giả định từ hệ phiên mã liên quan đến tính trạng tăng
trưởng.
- Xác định các SNP và microsatellite từ cơ sở dữ liệu hệ phiên mã.
- Xác định các SNP từ cơ sở dữ liệu hệ phiên mã liên quan đến tính
trạng tăng trưởng.

3


- Xác định các SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở nhóm tơm sú
tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm.
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Lần đầu tiên ở Việt Nam xây dựng được Cơ sở dữ liệu hệ gen phiên mã
tôm sú tự nhiên ()trên cơ cở giải mã và phân tích
04 mơ (cơ, gan tụy, tim và gốc mắt). Đây là cơ sở dữ liệu quan trọng phục vụ
cho các nghiên cứu tiếp theo ở tôm sú nuôi và tôm sú tự nhiên thu tại vùng
biển Việt Nam.
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Ý nghĩa khoa học
Các thông tin khoa học về hệ gen phiên mã tôm sú tự nhiên thu tại vùng
biển Việt Nam có nghĩa khoa học lớn đối với các nghiên cứu tiếp theo về tôm
sú. Kết quả khoa học nghiên cứu này (bài báo đăng trên tạp chí quốc tế
Aquaculture) đã được hàng trăm cơng trình đọc, trích dẫn và các tác giả đã
được mời báo cáo tham luận tại các hội nghị quốc tế về nuôi trồng thủy sản.
Ý nghĩa thực tiễn
Luận án tạo được cơ sở dữ liệu hệ gen phiên mã ở tôm sú tự nhiên và
bước đầu phân tích hệ gen phiên mã tơm sú tăng trưởng nhanh và chậm, tìm
kiếm các chỉ thị phân tử SNP chỉ có ở tơm tăng trưởng nhanh với mục tiêu có

được bộ chỉ thị phân tử chất lượng để phát triển các chip sử dụng trong nghiên
cứu tạo giống tôm sú bố mẹ sạch bệnh, sức sinh sản cao, tăng trưởng tốt bằng
công nghệ “Nghiên cứu tương quan toàn phần hệ gen” (GWAS, Genome
Wide Association Study).

4


CHƯƠNG I. T
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TƠM SÚ VÀ TÌNH HÌNH NI TƠM SÚ Ở VIỆT
T NAM
1.1.1. Giới thiệu về tơm sú
Tơm sú là mộtt trong các lồi tơm ni quan trọng
tr
thuộcc hhọ Penaeidae,
và được phân loại(Holthuis,
(Holthuis, 1980; Thái Trần
Tr Bái, 2013)như sau::
Ngành: Arthropoda (Chân khớp)
Lớp: Crustacea (Giáp xác)
Bộ: Decapoda (Mười
(Mư chân)
Họ: Penaeidae (Tơm he)
Chi: Penaeus
Lồi: Penaeus monodon
Tên tiếng
ng Anh: Black Tiger Shrimp
Tên địaa phương: Tơm Sú

Hình 1.1: Tơm sú thu đư
được từ vùng biển Nghệ An, Việtt Nam.
Về đặc điểm sinh học,
h tơm sú là lồi sống ở nơi chấtt đáy bùn pha với
v cát
ở độ sâu ven bờ đến
n 40 m nước
nư và độ mặn từ 5 – 34‰.
‰. Tôm sú sinh trư
trưởng
nhanh, trong 3 – 4 tháng có th
thể đạt cỡ trung bình 40 – 50 g. Tơm sú thu
thuộc loại
dị hình phái tính, con cái có kích thước
th
lớn hơn con đực ở cùng đđộ tuổi. Tơm
5


trưởng thành tối đa với con cái có chiều dài từ 220 – 250 mm, trọng lượng đạt
từ 100 – 300 g, con đực dài từ 160 – 200 mm, trọng lượng đạt từ 80 – 200 g.
Tơm có tính ăn tạp, thức ăn ưa thích là các lồi nhuyễn thể, giun nhiều tơ và
giáp xác. Về mặt phân bố, ở nước ta tôm sú phân bố từ Bắc vào Nam, vùng
phân bố chính là vùng biển các tỉnh Trung bộ (Nguyễn Văn Chung và Phạm
Thị Dự, 1995; Nguyễn Văn Thường và Trương Quốc Phú, 2009).
Tơm sú là lồi giáp xác có vỏ kitin bao bọc bên ngồi cơ thể nên sự phát
triển của chúng mang tính gián đoạn và đặc trưng bởi sự gia tăng đột ngột về
kích thước và trọng lượng. Sau mỗi lần lột xác, tôm sú tăng trưởng về chiều
dài và trọng lượng trung bình từ 10-15% so với trước khi lột xác. Quá trình
này tùy thuộc vào môi trường nước, điều kiện dinh dưỡng và các giai đoạn

phát triển của cá thể (Nguyễn Văn Chung và Phạm Thị Dự, 1995; Nguyễn
Văn Thường và Trương Quốc Phú, 2009).
Trong tự nhiên, tôm sú sống trong môi trường nước mặn, tới mùa sinh
sản chúng tiến vào gần bờ đẻ trứng. Có hai đặc điểm cần chú ý trong vịng đời
tơm sú: tăng trưởng ở giai đoạn hậu ấu trùng xảy ra ở vùng cửa sông (đặc
trưng bởi vùng nước lợ); sự thành thục sinh dục, kết cặp xảy ra ở ngồi khơi
nơi có nồng độ muối dao động từ 28-34 ‰ và ổn định. Sau khi trứng tôm sú
được đẻ 14-15 giờ, ở nhiệt độ 27-280C sẽ nở thành ấu trùng. Ấu trùng theo
các làn sóng biển dạt vào các vùng nước lợ. Trong môi trường này, ấu trùng
(larvae) chuyển sang thời kỳ hậu ấu trùng (postlarvae) rồi tơm giống
(juvenile) và bơi ra biển tiếp tục chu trình sinh trưởng, phát triển và sinh sản
của chúng (Nguyễn Văn Thường và Trương Quốc Phú, 2009).

6


1.1.2. Tình hình ni tơm sú trên thế giới và Việt Nam
1.1.2.1. Tình hình ni tơm sú trên thế giới
Tổng quan lịch sử phát triển của ngành ni tơm, có hai đối tượng quan
trọng là: tôm sú - bắt đầu từ các nước châu Á, ngay đầu những năm của thập
niên 80 và tôm he Nam Mỹ - từ những năm giữa thập niên 80. Ngành nuôi
tôm sú của thế giới phát triển nhanh chóng vào cuối những năm 1980 đến đầu
những năm 2000 với sản lượng cao nhất là 700.000 tấn vào năm 2003 (Aziz
và cs., 2011). Ở Châu Á, nghề ni tơm đã có từ lâu với mơ hình ni truyền
thống, năng suất thấp và chỉ tiêu thụ nội địa. Việc xuất khẩu sản phẩm tơm
ni chỉ hình thành trong những năm giữa thập kỷ 70. Với những tiến bộ về
kỹ thuật nuôi và công nghệ chế biến thức ăn thủy sản thì cơng nghiệp ni
thủy sản bắt đầu phát triển mạnh ở những thập kỷ tiếp theo. Năm 1975, sản
lượng tôm nuôi công nghiệp chỉ chiếm 2,5% tổng sản lượng tôm của thế giới.
Trong những năm của thập kỷ 90, sản lượng tôm nuôi công nghiệp đã tăng lên

30%. Ngày nay, sản lượng tôm nuôi chiếm 3-4% tổng sản lượng thủy sản
nuôi nhưng chiếm 15% tổng giá trị của thế giới. Các nước châu Á như Thái
Lan, Trung Quốc, Indonesia, Ấn độ, Việt Nam là những nước sản xuất tôm
chủ yếu, sản xuất 80% sản lượng tôm và Nam Mỹ sản xuất khoảng 20% sản
lượng.
Theo một khảo sát gần đây,tôm thẻ chân trắng chiếm tỷ trọng 80% và
tôm sú 20%, mặc dù trước năm 2003 tỷ lệ này là 60:40 và giữa những năm
của thập niên 90 thì tỷ lệ đó là 25:75. Tơm thẻ chân trắng đã được du nhập
vào các nước châu Á một cách ồ ạt để thay thế tôm sú. Sản lượng tôm thẻ
chân trắng của Trung Quốc, Thái Lan, Indonexia đã vượt trên 1,5 triệu tấn
(Nguyễn Hữu Ninh, 2010).

7


Các chuyên gia cho rằng, sở dĩ tôm chân trắng được nuôi rộng rãi ở các
nước trên thế giới là do cơng nghệ gia hố thành cơng cũng như tạo được đàn
lớn tôm bố mẹ sạch bệnh. Cùng lúc, sản lượng tơm sú (có nguồn gốc chủ yếu
từ châu Á) lại liên tục giảm, mặc dù hơn 20 năm qua, kinh nghiệm và kết quả
nuôi tôm sú của các nước châu Á đã thu được nhiều thành công đáng kể, giá
cả luôn cao hơn và được nhiều thị trường ưa chuộng hơn. Sự giảm sút sản
lượng cũng như việc các nước châu Á từ bỏ đối tượng bản địa quan trọng này,
theo các chuyên gia, chủ yếu là do chưa gia hố và kiểm sốt được dịch bệnh
nên khơng đảm bảo chất lượng tốt của con giống. Trong lịch sử phát triển tơm
sú, có ba quốc gia và vùng lãnh thổ là Đài loan, Trung Quốc, Thái Lan đã
từng đạt đỉnh cao của công nghệ nuôi tôm sú, sản lượng cao nhất nhưng cuối
cùng cũng bịthất bại và chuyển sang ni tơm chân trắng. Tuy nhiên, Việt
Nam vẫn duy trì tốt tỷ trọng nuôi tôm sú và đã trở thành quốc gia ni tơm sú
đứng đầu thể giới (Nguyễn Bích, 2013).

Hình 1.2:Sản lượng tơm sú của một số nước trên thế giới vào năm
2011(Nguyễn Bích, 2013)
Trong số các hướng nghiên cứu về lĩnh vực nuôi tôm được thực hiện
trong ba thập niên qua, có lẽ nghiên cứu cơng nghệ sản xuất tôm giống nhằm

8


chủ động con giống cho nuôi thương phẩm, giảm thiểu sự phụ thuộc đối với
nguồn lợi tôm thiên nhiên được triển khai sớm nhất và cũng đạt được nhiều
thành công.Trong hơn 30 năm qua, công nghệ sản xuất tôm giống đã đạt được
nhiều kết quả khả quan, nhờ vậy nguồn tôm giống hầu như đã đáp ứng được
nhu cầu của sản xuất. Nhìn chung, xu thế hiện nay ở các quốc gia trên thế giới
là nhà sản xuất tôm giống từng bước gia hóa đàn tơm, tiến hành các giải pháp
cơng nghệ để khép kín vịng đời, chọn giống và tạo ra các dịng mới có sự
tăng trưởng đáng kể, chất lượng cao đặc biệt áp dụng các giải pháp an toàn
sinh học để tạo ra con giống sạch bệnh. Những nỗ lực trong vấn đề gia hố
(tạo tơm bố mẹ) trong điều kiện giám sát môi trường chặt chẽ và tiếp theo là
nâng cao chất lượng di truyền được coi là những vấn đề mấu chốt nhằm đảm
bảo được nhiều ưu thế, đồng thời giúp ổn định cho nghề ni tơm, nâng cao
hiệu quả và đảm bảo an tồn mơi trường (Pullin et al., 1998).
1.1.2.2. Tình hình ni tơm sú ở Việt Nam
Tôm nước lợ là đối tượng nuôi trồng thủy sản chủ lực, có vai trị quan
trọng đối với kinh tế, xã hội, đặc biệt là tại các địa phương ven biển.
Tômđang được nuôi tại 30 tỉnh thành và trở thành sản phẩm hàng hóa lớn ở
nước ta gồm 2 lồi: tơm sú (lồi bản địa) và tơm thẻ chân trắng. Tôm sú bắt
đầu được sản xuất giống nhân tạo và nuôi tại Việt Nam từ những năm đầu của
thập kỷ 80 (thế kỷ 20). Từ năm 1998, tôm chân trắng bắt đầu được du nhập
Việt Nam với hình thức ni cơng nghiệp. Hiện kim ngạch xuất khẩu tơm
nước lợ ln dẫn đầu tồn ngành thủy sản với tỷ lệ khoảng 45% tổng giá trị

kim ngạch. Trước diễn biến của tình trạng biến đổi khí hậu và xâm nhập mặn,
tôm nước lợ đã nổi lên như một sản phẩm đầy tiềm năng, và lợi thế để phát
triển (Báo cáo tại hội nghị phát triển ngành tôm Việt Nam, Bộ NN&PTNT,
2017).

9


Theo báo cáo của Viện kinh tế qui hoạch thủy sản (2015), năm 2014, chỉ
tính riêng đồng Bằng sơng Cửu Long diện tích ni tơm sú đạt 604.130 ha
(ĐBSCL chiếm 93,73% so với cả nước). Sản lượng tôm sú đạt 269.711 tấn
(ĐBSCL chiếm 85,46%) về kim ngạch xuất khẩu tôm năm 2014 đạt 3.952,9
triệu USD chiếm 50,45% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản toàn quốc, tăng
gấp 1,56 lần so với năm 2010, bình quân tăng trưởng 17,04%/năm (20102014). Trong đó, mặt hàng tơm sú đạt 1.385,5 triệu USD chiếm 35,05.
Tại Hội nghị ngành tôm Việt Nam, theo báo cáo của Bộ NN&PTNT,
năm 2016, sản lượng tôm cả nước đạt 191.560 tấn (bằng 28,2% so với kế
hoạch năm 2016). Tổng diện tích thả ni tơm là 694.645 ha (100,1% cùng kỳ
2015) trong đó diện tích thả ni tơm sú là 600.399 ha; diện tích thả ni tơm
thẻ chân trắng là 94.246 ha (năm 2014 là 95.000 ha). Tổng sản lượng thu
hoạch đạt 657.282 tấn, bằng 109,5% so với năm 2015, trong đó sản lượng tơm
sú là 263.853 tấn, tơm thẻ chân trắng là 393.429 tấn. Năm 2016, Việt Nam đã
xuất khẩu tôm sang 90 thị trường, đạt kim ngạch 3.150.723 USD, tăng 6,7%
so với năm 2015. Trong đó, tơm chân trắng chiếm 62,1%, tôm sú chiếm gần
29,5%, tôm biển khác chiếm 8,3%.
Ngày 18 tháng 10 năm 2017, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã
phê duyệt đề án khung phát triển sản phẩm quốc gia “Tôm nước lợ” bao gồm
tôm sú và tôm chân trắng. Một trong những mục tiêu quan trọng là gia hóa,
chọn giống và sản xuất giống tôm sú, chất lượng cao (sạch/kháng một số bệnh
thường gặp, sinh trưởng nhanh, thích nghi với các điều kiện môi trường)
tương đương thế giới.

Mặc dù nghề nuôi tôm sú có tăng trưởng nhưng cịn phải đối mặt với
nhiều thách thức và kém bền vững trong đó có chất lượng con giống. Nguồn
tôm bố mẹ hiện nay chủ yếu dựa vẫn vào khai thác tự nhiên và nhập khẩu.
Môi trường ngày càng ô nhiễm làm cho dịch bệnh trên tôm sú hàng năm đều
10


xảy ra gây thiệt hại hàng nghìn tỷ đồng. Kết quả của việc chọn giống tơm sú
với tính trạng tăng trưởng nhanh và kháng bệnh còn rất khiêm tốn và chậm vì
thiếu nguồn lực và thơng tin khoa học về vật liệu chọn giống. Do đó, việc xây
dựng cơ sở dữ liệu hệ phiên mã tôm sú Việt Nam là rất cần thiết.
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HỆ GEN VÀ HỆ GEN PHIÊN MÃ
CỦA TÔM SÚ TRÊN THẾ GIỚI
Cho đến nay, những hiểu biết cơ bản về sự điều khiển sinh trưởng, sinh
sản và hệ thống miễn dịch ở tôm sú cịn rất hạn chế do thiếu những thơng tin
vềhệ gen và sự biểu hiện gen của chúng. Kích thước hệ gen tôm sú khá lớn,
khoảng 2,17 Gb (You và cs., 2010), nên việc giải mã tồn bộhệ gen tơm sú
địi hỏi nhiều thời gian và chi phí lớn, ước tính hàng chục triệu đơ la. Vì vậy,
các nghiên cứu vềhệ gen tôm sú từ trước tới nay trên thế giới được lựa chọn là
tập trung phát triển bản đồ di truyền liên kết dựa vào các chỉ thị phân tử
microsatellite, single-nucleotide polymorphism (SNP) và amplified fragment
length polymorphism (AFLP) (Wilson và cs., 2002; Maneeruttanarungroj và
cs., 2006; You và cs., 2010); nghiên cứu và phân tích các đoạn trình tự gen
biểu hiện (Express sequence tag-EST) bằng phương pháp Sanger (Lehnert và
cs., 1999; Supungul và cs., 2002; Liu và Cordes, 2004; Supungul và cs., 2004;
Maneeruttanarungroj và cs., 2006; Preechaphol và cs., 2007); giải trình tự hệ
gen ty thể tơm sú (Wilson và cs., 2000); nghiên cứu cấu trúc và chức năng của
các gen liên quan (Supungul và cs., 2002; Supungul và cs., 2004; Glenn và
cs., 2005; De la Vega và cs., 2007; Tangprasittipap và cs., 2010; Brady và cs.,
2013); lựa chọn các chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn giống (Glenn và

cs., 2005; Maneeruttanarungroj và cs., 2006). Trong thời gian gần đây, nhóm
nghiên cứu của Baranski và cs. (2014) đã sử dụng dữ liệu giải trình tự thế hệ
mới để phát triển bản đồ di truyền liên kết ở tôm sú P. monodon, nhưng

11


khơng nghiên cứu phân tích biểu hiện hay sàng lọc các gen ứng viên liên quan
tới tính trạng tăng trưởng.
Hiện nay nguồn dữ liệu về hệ gen tơm sú cịn khá khiêm tốn. Trên ngân
hàng Genbank có tổng cộng 39.908 EST được ứng dụng vào tìm kiếm các
điểm đa hình (ví dụ như SNP) và có khoảng 600 trình tự microsatellite (cập
nhật tháng 10 năm 2013) (Andriantahina và cs., 2013).
1.2.1. Cơng trình nghiên cứu đầu tiên liên quan tới hệ gen phiên mã của
tôm
Đối với các sinh vật đa bào, gần như mỗi tế bào đều có cùng chung một
hệ gen và do đó có chung các gen. Tuy nhiên, không phải tất cả các gen đều
phiên mã trong mỗi tế bào, nói cách khác những tế bào khác nhau thể hiện
một mơ hình biểu hiện khác nhau. Việc chọn lọc và so sánh hệ gen phiên mã
của các loại tế bào cũng như các mô khác nhau giúp các nhà nghiên cứu có
cái nhìn sâu sắc về cấu tạo của các loại tế bào đặc biệt và các thay đổi trong
hoạt động phiên mã có liên quan đến những tính trạng quan trọng. Hệ gen
phiên mã đại diện cho một phần hệ gen được dịch ra thành các phân tử RNA.
Tuy nhiên, mỗi gen có thể tạo ra nhiều biến thể của mRNA do sự thay đổi vị
trí cắt, sửa đổi RNA hay thay đổi vị trí khởi đầu và kết thúc của phiên mã. Do
đó, hệ gen phiên mã đạt được mức độ phức tạp mà hệ gen khơng có. Bằng
cách nghiên cứu hệ gen phiên mã, các nhà nghiên cứu có thể xác định được
thời điểm và vị trí các gen bật, tắt trong các dạng tế bào hoặc mơ. Số lượng
bản phiên mã có thể được xác định để đánh giá hoạt động của gen hay mức độ
biểu hiện của gen trong tế bào (Brown, 2002).

Công trình đầu tiên nghiên cứu về hệ gen phiên mã tôm sú đã được
Lehnert và cs. (1999) công bố. Trong cơng trình nghiên cứu này, 3 thư viện
cDNA đã được thiết lập từ 3 mô khác nhau của tôm sú, bao gồm chân bơi,

12


gốc mắt và hạch ngực. Các tác giả đã giải mã được 172 trình tự EST, trong đó
có 88 trình tự từ hạch ngực, 56 trình tự từ gốc mắt và 32 trình tự từ chân bơi.
1.2.2. Xác định các gen liên quan tới hệ miễn dịch của tôm thông qua việc
phân tích hệ phiên mã
Sau cơng bố của Lehnert, cơng trình thứ hai nghiên cứu về hệ gen tơm
do Gross và cộng sự thực hiện năm 2001 (Gross và cs., 2001) được tập trung
vào hai đối tượng quan trọng trong công nghiệp nuôi tôm của Hoa Kỳ là tôm
thẻ chân trắng Thái Bình Dương (Litopenaeus vannamei) và tơm thẻ chân
trắng Đại Tây Dương (Litopenaeus setiferus). Bốn thư viện cDNA đã được
thiết lập từ hai mơ có liên quan tới hệ miễn dịch của tôm (tế bào máu và tổ
chức gan tụy) của hai lồi tơm thẻ chân trắng nêu trên. Tổng cộng đã có 2045
EST được giải trình tự, xác định được 44 gen có liên quan tới hệ miễn dịch
của tơm. Chủ yếu các gen có liên quan tới hệ miễn dịch thuộc về thư viện
cDNA thu từ tế bào máu (chiếm tới 27,6% ở Litopenaeus setiferus và 21,2%
ở Litopenaeus vannamei). Trong khi đó tìm thấy tỷ lệ này thấp hơn nhiều ở
thư viện cDNA thu từ mô gan tụy (4,4% ở Litopenaeus setiferus và 5,6% ở
Litopenaeus vannamei). Trong số các EST liên quan tới khả năng phòng vệ
của tơm thì những EST liên quan tới các peptide kháng khuẩn được tìm thấy
nhiều nhất (chiếm tới 64%, 172/268) chủ yếu thuộc về thư viện được hình
thành từ mơ tế bào máu. Lectin chiếm 6,7% chỉ tìm thấy ở mơ gan tụy. Các
EST khác có liên quan tới tính miễn dịch của tơm mã hóa cho các serine
protease, protease inhibitor, các protein sốc nhiệt, protein liên kết beta-1,3glucan. So sánh các EST thu được từ hai loại mô khác nhau là mô tế bào máu
và mô gan tụy nhận thấy có sự khác biệt về hình thái biểu hiện các gen có liên

quan tới khả năng phịng vệ của tôm. Các EST liên quan tới các enzyme phân
giải và các protein liên kết acid béo chỉ tìm thấy trong thư viện mơ gan tụy. Ở
các lồi động vật giáp xác, các tế bào máu chủ yếu tham gia vào đáp ứng

13