LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TỔNG QUAN VỀ THỰC PHẨM PROBIOTIC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
o0o
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
TỔNG QUAN VỀ THỰC
PHẨM PROBIOTIC
Chuyên nghành: Công Nghệ Sinh Học
Mã số nghành: C73
GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
SVTH: CAO THỊ KIM YẾN
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2010.
LỜI CẢM ƠN
Xin được tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
TS. Nguyễn Hoài Hương người đã khơi gợi cho tôi đề tài và đã hướng dẫn
tận tình chu đáo, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Chân thành cảm ơn tất cả quý thầy cô trường Đại Học Kỹ Thuật Công
Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy dỗ tôi trong suốt quá trình học tập
tại trường, đặc biệt các thầy cô Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học đã
truyền đạt cho tôi những kiến thức quý giá về chuyên môn.
Với tất cả lòng yêu thương và kính trọng con xin cảm ơn ba mẹ đã động
viên và tạo mọi điều kiện cho con học tập trong thời gian qua.
Và tôi cũng xin cảm ơn bạn bè thân thương đã động viên gắn bó với tôi
trong những năm tháng học tập.
Tp. Hồ Chí Minh, Tháng 07 năm 2010
Cao Thò Kim Yến
MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình

Trang
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ 2
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ 3
1.2. MỤC ĐÍCH 4
1.3. NỘI DUNG 4
CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
2.1. TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT PROBIOTIC 6
2.1.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG 6
2.1.1.1. Lên men lactic đồng hình 7
2.1.1.2. Lên men lactic dò hình 8
2.1.2. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN VI SINH VẬT PROBIOTIC 9
2.1.2.1. Ảnh hưởng của quá trình tiêu hóa ở dạ dà 9
2.1.2.2. Ảnh hưởng của các yếu tố trong môi trường ruột 9
2.1.2.3. Ảnh hưởng của prebiotic 10
2.1.2.4. Ảnh hưởng trong quy trình sản xuất tạo chế phẩm probiotic 11
2.1.3. TIÊU CHUẨN XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT PROBIOTIC 12
2.1.4. CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG CỦA VI SINH VẬT PROBIOTIC 14
2.1.4.1. Khả năng kết bám trên biểu mô ruột 14
2.1.4.2. Tổng hợp các chất có hoạt tính kháng vi sinh vật 16
2.1.5. VAI TRÒ CỦA VI SINH VẬT PROBIOTICS 24
2.1.5.1. Lợi ích về dinh dưỡng 25
2.1.5.2. Gia tăng khả năng tiêu hóa Lactose 25
2.1.5.3.Làm giảm Cholesterol trong máu 25
2.1.5.4. Cải thiện sự chuyển động của ruột 26
2.1.5.5. Ngăn chặn và xử lí nhiễm khuẩn Helicobacter pylori 26
2.1.6. ỨNG DỤNG CỦA VI SINH VẬT PROBIOTICS 26
2.1.6.1. Trong công nghiệp thực phẩm 26
2.1.6.2. Công nghiệp hóa chất 27
2.1.6.3. Ứng dụng trong nơng nghiệp và mơi trường 28

2.1.6.4. Ứng dụng trong y học 29
2.2. TỔNG QUAN VỀ THỰC PHẨM PROBIOTIC 29
2.2.1. ĐỊNH NGHĨA BẰNG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG 29
2.2.2. CÁC DẠNG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG 30
2.2.2.1. Nhóm thực phẩm chức năng bổ sung vitamin và khoáng chất 30
2.2.2.2. Nhóm thực phẩm chức năng dạng viên 30
2.2.2.3. Nhóm thực phẩm chức năng “không béo” , “không đường”, “giảm
năng lượng” 30
2.2.2.4. Nhóm các loại giải khát và tăng lực 31
2.2.2.5. Nhóm thực phẩm giàu chất xơ tiêu hóa 31
2.2.2.6. Nhóm các chất tăng cường chức năng đường ruột 31
2.2.2.7. Nhóm thực phẩm chứ năng đặc biệt 31
2.2.3. BỔ SUNG VI SINH VẬT PROBIOTICS VÀO THỰC PHẨM 33
2.2.4. CÁC DẠNG THỰC PHẨM PROBIOTIC TRÊN THẾ GIỚI 34
2.2.5. THỊ TRƯỜNG PROBIOTICS VÀ TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN 37
2.3. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT
PROBIOTIC 39
2.3.1. PHÂN LẬP CHỦNG THUẦN KHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP
TRẢI 40
2.3.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VI KHUẨN LACTIC 40
2.3.2.1. Đònh tính nhuộm Gram 40
2.3.2.3. Phương pháp nhuộm bào tử 41
2.3.2.4. Phương pháp thử Catalase 42
2.3.2.5. Phương pháp khảo sát đặc tính sinh acid 43
2.3.2.6. Phương pháp kiểm tra khả năng di động 44
2.3.2.9. Phương pháp khảo sát khả năng sinh bacteriocin 45
2.3.2.8. Phương pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn 45
2.3.2.10. Phương pháp xác đònh nhanh vi sinh vật probiotics bằng PCR
(Polymerase Chain Reaction) 46
2.4. QUY TRÌNH SẢN XUẤT SỮA UỐNG PROBIOTIC CỦA CÔNG TY

YAKULT 52
2.4.1. NGUYÊN LIỆU LÊN MEN 52
2.4.2. NGUYÊN LIỆU ĐÓNG GÓI 53
2.4.3. QUY TRÌNH SẢN XUẤT 54
2.5. PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA CHẤT LƯNG SẢN PHẨM 59
2.5.1. KỸ THUẬT PHÂN TÍCH CẢM QUAN THỰC PHẨM 59
2.5.2. TIÊU CHUẨN HÓA LÝ 60
2.5.3. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CHỈ TIÊU VI SINH 61
2.5.3.1. Phương pháp xác đònh vi sinh vật tổng số hiếu khí 61
2.5.3.2. Phương pháp xác đònh tổng số Coliforms 63
2.5.3.3. Phương pháp đònh tính E. coli 64
2.5.3.4. Đònh lượng Starphilococcus aureus 66
2.5.3.5. Xác đònh Salmonella 67
2.5.3. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG ACID LACTIC 68
2.5.4. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH BACTERIOCIN 69
CHƯƠNG III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN
NGHỊ 71
3.1. KẾT LUẬN ……………………………………………………………………72
3.2. KIẾN NGHỊ………………………………… ……………………………….73
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MRS Deman – Rogosa – Sharpe.
PCR Polymerase Chain Reaction – Phản ứng tổng hợp dây chuyền.
DNA Desoxyribonucleic Acid
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis – Điện
di trên gel polyacrylamide có SDS.
LAB Lactic acid bacteria – Vi khuẩn lactic.
Lb. Lactobacillus.
Lc. Lactococcus.

L. Listeria.
E. Coli Escherichia coli.
S. Streptococcus.
P. Pediococcus.
St Staphilococcus.
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Danh sách bacteriocin do LAB tổng hợp và hoạt tính kháng khuẩn của
chúng (Piard, 1992) 21
Bảng 2.2.2. Hệ thống phân loại thực phẩm probiotic trên thị trường theo hệ thống
phân loai FOSHU (Food for Specific Health Use) 32
Bảng 2.2.3. Một số thực phẩm probiotics bổ sung vi khuẩn Lactobacillus hoặc kết
hợp với một số vi khuẩn lactis khác 34
Bảng 2.2.4 Các dạng thực phẩm lên men trên thế giới sử dụng Lactobacillus hoặc
kết hợp với các vi khuẩn khác 36
Bảng 2.5.1. Tiêu chuẩn cảm quan đối với sản phẩm sữa chua Yoghurt ( TCVN
7030:2002) 60
Bảng 2.5.2. Tiêu chuẩn hóa lý đối với sản phẩm sữa chua Yoghurt ( TCVN
7030:2002) 60
Bảng 2.5.3. Tiêu chuẩn vi sinh đối với sản phẩm sữa chua Yoghurt( TCVN
7030:2002) 61
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1.1. Gới thiệu một số vi sinh vật có hoạt tính probiotics 7
Hình 2.1.4.1. Tác động của Probiotic trong đường tiêu hóa (Davis CP, 1996) 15
Hình 2.1.4.2. Cơ chế kháng vi sinh vật của bacteriocin 19
Hinh 2.3. Sơ đồ phân lập và đònh danh vi khuẩn lên men lactic đến cấp giống
bằng phương pháp cổ điển (theo Bergey
,
s Manual, 1957.) 39

Hình 2.4.1.2. Giới thiệu chủng vi khuẩn sử dụng trong quá trình sản xuất 52
Hình 2.4.1.3. Sữa bột gầy 52
Hình 2.4.1.4. Đường Glusose 52
Hình 2.4.1.5. Đường cát trắng 52
Hình 2.4.2.1. Nhựa polystyren 53
Hình 2.4.2.2. Phôi nhựa 53
Hình 2.4.2.3. Nắp nhôm 53
Hình 2.4.2.4. Phôi nhôm 53
Hình 2.4.2.5. Bao bì (nhựa Opp) 53
Hình 2.4.3 Quy trình sản xuất sữa uống lên men Yakult 54
Hình 2.4.3.1. Sơ đồ thuyết trình quy trình sản xuất sữa uống lên men Yakult 56
Hình 2.4.3.2. Giới thiệu một hình ảnh trong q trình sản xuất sữa uống lên men
Yakult (ngn Cơng Ty TNHH Yakult)……………………………………………57
LỜI MỞ ĐẦU
Sức khỏe con người, hệ vi sinh vật đường ruột và bệnh tật luôn là vấn đề
được mọi người quan tâm. Trong hệ vi khuẩn đường ruột có hai loại đó là vi
khuẩn có lợi và vi khuẩn có hại. Sự hiện diện của vi khuẩn có lợi trong đường
ruột là một yếu tố vô cùng quan trọng, khi vi khuẩn có lợi cân bằng hoặc chiếm
ưu thế sẽ tạo các ảnh hưởng tốt cho sức khỏe không chỉ cho chức năng tiêu hóa
thức ăn, bài tiết, chuyển hóa mà còn liên quan đến sự tổng hợp các yếu tố vi
lượng, các nội tiết tố đường ruột và đặc biệt là các chất kháng sinh tự nhiên giúp
con người chống lại một số bệnh tật. Ngày nay với sự phát triển không ngừng của
khoa học và kỹ thuật, cùng với nhu cầu sống ngày càng nâng cao của con người
vì vậy việc tiêu thụ sản phẩm có chất lượng cao và đảm bảo các tính năng bổ
dưỡng là điều cần thiết. Do vậy vấn đề tìm hiểu và nghiên cứu về thực phẩm
probiotics đang cần được quan tâm nhiều hơn. Khi biết được các yếu tố như sinh
lý, sinh hóa, con đường trao đổi chất của vi sinh vật probiotics hay các tác nhân
có thể làm ảnh hưởng đến chúng thì hiệu quả của quá trình sản xuất sẽ tăng đồng
thời giảm chi phí vận hành và thời gian sản xuất.
1

CHÖÔNG I:
ÑAËT VAÁN ÑEÀ
2
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Việc sử dụng vi sinh vật sống nhằm tăng cường sức khỏe con ngưới không
phải là mới. Từ hàng nghìn năm về trước, khi chưa tìm ra thuốc kháng sinh, con
người đã biết tiêu thụ các thực phẩm chứa vi sinh vật sống có lợi như các sản
phẩm lên men có nguồn gốc từ sữa. Theo Ayurveda, một trong những ngành y
học lâu đời nhất khoảng 2500 năm trước công nguyên, sự tiêu thụ sữa chua (1 sản
phẩm sữa lên men) đã được ủng hộ để duy trì sức khỏe tốt (Chopra và Doiphode,
2002). Các vi khuẩn có lợi trong ruột tạo ảnh hưởng tốt cho cơ thể bằng cách
ngăn cản các khối ung thư, làm bất hoạt các virus, tạo ra các enzyme và các
kháng thể tự nhiên, làm giảm cholesterol Bên cạnh đó chúng còn có thể ức chế
sự tăng trưởng của các vi khuẩn có hại qua việc tiết ra môi trường các acid hữu
cơ, các chất kháng khuẩn, đặc biệt là sự tạo thành bacteriocin.
Trong khi đó các vi khuẩn có hại lại tạo ra các sản phẩm có hại cho vật
chủ như các độc tố và các chất gây ung thư. Khi các vi khuẩn có hại này chiếm ưu
thế, sẽ cạnh tranh các chất dinh dưỡng với tế bào vật chủ và đồng thời nồng độ
các chất có hại tăng lên. Các chất này đôi khi không tác động ngay lập tức mà có
thể tích lũy trong cơ thể vật chủ theo thời gian, vì vậy chúng được xem như là là
các yếu tố gây ra sự lão hóa, ung thư, xơ vữa động mạch, giảm khả năng miễn
dòch
Ngoài ra, các rối loạn chức năng nhu động ruột, phẫu thuật dạ dày, các
bệnh gan thận, rối loạn chức năng miễn dòch, ung thư, sử dụng thuốc kháng sinh,
chế độ ăn uống thiếu các chất dinh dưỡng tạo điều kiện cho vi khuẩn có hại
phát triển mạnh gây mất cân bằng hệ vi sinh đường ruột. Tuy nhiên, sự cân bằng
của hệ vi sinh vật đường ruột có thể được duy trì hoặc phục hồi bằng một chế độ
ăn uống hợp lý hay sử dụng các chế phẩm chứa vi sinh vật sống gọi là probiotics.
Probiotic là một loại sản phẩm chứa vi sinh vật sống trong thành phần đồ
ăn thức uống, khi tiêu thụ loại sản phẩm này sẽ có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe

3
vật chủ như điều hòa hệ thống miễn dòch, đồng thời cải thiện cân bằng dinh
dưỡng và cân bằng vi sinh trong bộ máy dạ dày- ruột.
1.2. MỤC ĐÍCH
Mục đích của khóa luận này là tìm hiểu về thực phẩm chứa các vi sinh vật có
hoạt tính probiotic và quy trình sản xuất thực phẩm probiotic.
1.3. NỘI DUNG
Nội dung chính của khóa luận này gồm các phần như sau:
Chương I: Đặt vấn đề
Chương II: Tổng quan tài liệu
2.1. Tổng quan về vi sinh vật probiotic.
2.2. Tổng quan về thực phẩm probiotic.
2.3. Phương pháp phân lập tuyển chọn vi sinh vật probiotic.
2.4. Quy trình sản xuất sữa uống probiotic của Công ty Yakult.
2.5. Phương pháp kiểm tra chất lượng sản phẩm.
Chương III: Kết luận và kiến nghò
4
CHÖÔNG II:
TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU
5
2.1. TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT PROBIOTIC
2.1.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG
Vi sinh vật probiotic có thể tìm thấy ở nhiều nơi như ở các cơ chất chứa
carbohydrat, các môi trường khác nhau như màng niêm mạc người và gia súc
(khoang bụng, ruột và âm đạo), ở thực vật hoặc các vật liệu có nguồn gốc thực
vật, trong phân và thực phẩm lên men.
Vi sinh vật probiotics thường là các vi khuẩn lactic thuộc họ
Lactobacterianceae, chúng được phân thành các giống như: Lactobacillus,
Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconstoc [18]. Đây là những trực
khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện.

Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không có
khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột. Môi trường sinh trưởng của
vi khuẩn lactic ngoài glucid, muối amonium, còn cần vitamin nhóm B, vitamin
nhóm H, folic acid, nicotinic acid và các amino acid. Để vi khuẩn lactic hoạt động
tốt nhất trong quá trình lên men thì phải đạt điều kiện pH từ 5,5 ÷ 6, khoảng nhiệt
độ thích hợp 10
0
C ÷ 40
0
C [63].
Lactobacillus casei. Streptococcus lactis.
6
Lactobacillus bulgaricus. Streptococcus cremorie.
Hình 2.1.1. Gới thiệu một số vi sinh vật có hoạt tính probiotics.
Len men lactic là một trong những loại hình lên men phát triển nhất trong
thiên nhiên. Acid lactic được tạo ra từ quá trình chuyển hóa kò khí đường nhờ các
vi khuẩn lactic như Bacterium lactis hay Streptococcus lactis nhằm ức chế sự
phát triển của các vi khuẩn có hại. Người ta dựa vào quá trình lên men và các cơ
chế hạt động khác nhau của các vi khuẩn lactic cho ra sản phẩm chính , phụ khác
nhau từ đó chia vi khuẩn lactic thành hai loại: vi khuẩn lactic lên men đồng hình
và dò hình.
2.1.1.1. Lên men lactic đồng hình
Acid lactic tạo thành chiếm hơn 90%. Chỉ một lượng nhỏ pyruvate bò khử
cacbon để tạo thành acid acetic, ethanol, acetone và CO
2
. Lượng sản phẩm phụ
tạo thành phụ thuộc vào sự có mặt của O
2
.
 Một vài đại diện:

+ Lactobacillus casei: Đây là những trực khuẩn rất ngắn gây chua sữa tự
nhiên. Yếm khí tùy tiện, lên men tốt glucose, maltose, lactose tạo ra môi trường
có từ 0,8 ÷ 1% acid lactic. điều kiện bình thường gây chua sữa trong vòng 10
đến 12 giờ, nguồn N
2
cho vi khuẩn này là peptone. Nhiệt độ tối thiểu cho chúng
phát triển là 10
0
C tối ưu là 35
0
C và tối đa là 45
0
C, chúng phân hủy cazein và
gelatin rất yếu.
7
+ Streotococcus cremoris: Thường tạo thành chuỗi dài, phát triển ở nhiệt độ
thấp hơn Lactobacterium casei, nhiệt độ tối ưu từ 25
0
C ÷ 30
0
C, lên men glucose và
galactose.
+ Lactobacterium bulgaricus: Đây là trực khuẩn rất dài, nhiệt độ phát triển
tối ưu là 20
0
C, có khả năng lên men glucose, lactose. Có khả năng tạo độ acid cao
(3,7% acid lactic).
+ Lactobacterium delbruckii: Thường gặp trên hạt dại mạch, đây là trực
khuẩn lớn. Trong quá trình phát triển chúng có khả năng tạo thành sợi. Nhiệt độ
phát triển tối ưu từ 45

0
C ÷ 50
0
C, sự khác biệt giữa Lactobacterium delbruckii
đốivới những loài khác như Lactobacterium bulgaricus; Streptococcus cremoris;
Lactobacterium casei là chúng không có khả năng lên men đường lactose vì vậy
chúng không được dùng trong chế biến sữa.
+ Lactobacterium cueumerisfermenti: Thường tìm thấy trong sữa ủ chua. Là
trực khuẩn không di động, thường tạo thành tế bào đơn và có khi tạo thành chuỗi
trong quá trình lên men. Khả năng tạo acid tối đa trong môi trường từ 0,9% ÷
1,2%.
2.1.1.2. Lên men lactic dò hình
Lên men lactic dò hình (không điển hình) 50% lượng đường tạo thành acid
lactic, ngoài ra còn có các sản phẩm phụ khác như acid acetic, ethanol, CO
2
. Các
sản phẩm phụ tương tác với nhau tạo thành ester có mùi thơm.
 Một vài đại diện:
+ Streptobacterium hassicefermentatae: Lên men rau cải chua tạo thành acid
lactic, acid axetic, rượu etylic và CO
2
. Lên men đường saccharose tốt hơn đường
lactose.
+ Lactobacterium lycopersici: Là trực khuẩn Gram +, sinh hơi và có khả năng
tạo bào tử, tế bào sinh dưỡng thường chết ở nhiệt độ 80
0
C. Khi lên men chúng tạo
thành acid lactic, rượu etylic, acid axetic và CO
2
.

2.1.2. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN VI SINH VẬT PROBIOTIC
8
2.1.2.1. Ảnh hưởng của quá trình tiêu hóa ở dạ dày
Vi khuẩn từ thực phẩm và môi ttrường vào miệng được rữa trôi với nước
bọt rồi vào dạ dày. Hầu hết vi khuẩn bò tiêu diệt trong dạ dày bởi acid dạ dày và
các enzyme tiêu hóa trong dòch vò. Dòch vò được tiết vào mỗi ngày khoảng 1,5-
2lít. pH của dạ dày của trẻ sơ sinh từ 3.8- 5.8, ở người lớn pH từ 1.5- 2. Thành
phần chủ yếu gồm: nước, acid HCl; các enzyme: pepsin, lipase và prezue (men
sữa có ở trẻ còn bú).
Trong hệ thống dạ dày ruột thì acid dạ dày là bộ máy phòng vệ chính của
vật chủ chống lại sự lây nhiễm những vi khuẫn gây bệnh từ con đường ăn uống.
Acid dòch vò cũng góp phần quan trọng trong việc duy trì một lượng nhỏ vi khuẩn
trong phần trên của ruột non, bởi vì chỉ những vi sinh vật kháng lại acid tốt nhất
mới có thể sống sót khi đi qua dạ dày.
2.1.2.2. Ảnh hưởng của các yếu tố trong môi trường ruột
Trong môi trường ruột dòch mật và các enzyme tiêu hóa tác động lên hệ vi
sinh vật đường ruột trong đó có dòch mật là yếu tố quan trọng nhất. Cơ chế tác
động của dòch mật đối với vi khuẩn là phân chia lớp đôi lipid khi màng tiếp xúc
với dòch mật làm mất sự nguyên vẹn của màng và hình thành hỗn hợp chuỗi phân
tử. Trong dòch mật thì muối mật là thành phần chính tác động lên vi khuẩn.
Muối mật là muối natri của các acid mật và chúng được tổng hợp từ
cholesterol. Muối mật được tạo thành trong gan, lưu trữ trong túi mật và vận
chuyển qua ống mật đến ruột non khi thực phẩm được chuyển qua. Muối mật là
steroid được sử dụng để nhũ hóa lipid. Khi thực phẩm được chuyển qua ruột muối
mật nhũ hóa mỡ và hấp thu chúng qua thành ruột non.
Ngoài ra ác chuyển động của ruột cũng ảnh hưởng khả năng cư trú của vi
khuẩn trong ruột. Nếu vi khuẩn không kết bám được vào niêm mạc ruột thì các
loại chuyển động ruột sẽ nhanh chóng đào thải chúng ra ngoài.
2.1.2.3. Ảnh hưởng của prebiotic
9

Prebiotic là những thành phần không thể tiêu hóa được có trong thức ăn,
chúng có ảnh hưởng tốt cho cơ thể bằng việc kích thích có chọn lọc sự tăng trưởng
và hoạt động của một số loài vi khuẩn đã có trong ruột già, vì thế cải thiện sức
khỏe cho cơ thể. Prebiotic trong thức ăn có thể điều hòa đáng kể hệ vi sinh đường
ruột bằng cách tăng một số loài vi khuẩn đặc biệt và như thế làm thay đổi số
lượng của các thành phần trong hệ vi sinh.
Nhìn chung những oligosaccharid không tiêu hóa được và một số fructo-
oligosaccharide là prebiotic. Prebiotic điều hòa sự trao đổi lipid chủ yếu qua sự
lên men các sản phẩm. Những ảnh hưởng có lợi của prebiotic có lẽ từ sự ức chế
những vi khuẩn có hại hoặc kích thích những vi khuẩn có lợi cho sức khỏe của cơ
thể.
Những oligosacccharid không tiêu hóa được bao gồm: chicory
fructooligosaccharid (một thành phần thực phẩm tự nhiên); chuỗi ngắn
fructooligosaccharid (sản phẩm thủy phân bởi enzyme của cơ chất sucrose và
lactose); oligosaccharid của đậu nành và polydextro hoặc polydextrin (là sản
phẩm sau khi xử lí carbohydrate với hóa chất.
Chicory fructooligosaccharid có thể xem như là thành phần trung tính. Bên
cạnh hoạt động kích thích vi khuẩn có lợi, hợp chất chicory còn có thể gây ra
nhiều hoạt động chức năng khác bao gồm sự điều hòa những thông số lý hóa của
sự tiêu hóa cũng như cải thiện giá trò sinh học của những chất khoáng cần tiết và
làm giảm triglyceridemia bằng việc giảm tạo mỡ trong gan.
Cả hai loại (probiotic và prebiotic) bổ sung tương ứng với sự cố gắng tái
tạo lại hệ vi sinh ruột để các thành phần vi sinh tác động qua lại một cách có lợi
hơn chống lại những ảnh hưởng có hại do thói quen ăn uống và áp lực môi trường
dẫn đến.
2.1.2.4. Ảnh hưởng trong quy trình sản xuất tạo chế phẩm probiotic
a) Quá trình lên men
10
Trong quá trình lên men yếu tố ảnh hưởng quyết đònh đến sinh khối của
cuối cùng là thành phần môi trường nuôi cấy. Ngoài các yếu tố môi trường và

điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ, oxy cũng ảnh hưởng lên năng suất sinh khối
của sản phẩm. Thông thường LAB có khả năng tăng sinh khối tốt ở pH trung tính,
37
0
C trong điều kiện yếm khí không bắt buộc nên không có nhu cấu sục khí. Sản
phẩm do LAB tổng tích lũy trong môi trường lên men như acid hữu cơ có thể ức
chế tăng trưởng và nhanh chóng dẫn đến pha chết. Sau cùng chính nồng độ tế bào
ảnh hưởng lên khối lượng bacteriocin được tổng hợp theo cơ chế gọi là biểu hiện
gen phụ thuộc vào nồng độ tế bào (Cotter et al., 2005). Đến lượt khối lượng
bacterriocin quyết đònh hoạt tính kháng vi sinh vật của probiotic.
b) Các quá trình thu hồi sản phẩm
Các quá trình thu hồi sản phẩm lên men thu sinh khối bao gồn tách pha
rắn/ lỏng (ly tâm) và tách ẩm để thu được sản phẩm cuối cùng là pha rắn. Cơ chế
gây tổn thương cho quá trình này là do nhiệt (sấy phun), lạnh (sấy đông khô) và
tình trạng mất nước của tế bào (Santivarangkna et al., 2008).
i) Tổn thương do nhiệt sảy ra khi sấy phun
Vi khuẩn LAB không sinh bào tử nên rất dễ bò tổn thương do nhiệt khi sấy
phun. Trong quá trình sấy phun giai đoạn đầu là giai đoạn phun huyền phù tế bào
vi khuẩn, nhiệt độ chưa lên quá cao vì đây là giai đoạn nước bay hơi. Giai đoạn
tiếp theo là giai đoạn rơi trong buồng sấy, các yếu tố ảnh hưởng đến tỉ lệ sống
sót: nhiệt độ khí vào và ra, thời gian lưu và tốc độ bơm nhu động. Nhiệt độ vi
khuẩn khi rời khỏi buồng sấy được coi là thông số quyết đònh ảnh hưởng đến tỉ lệ
sống sau sấy phun (Santivarangkna, 2008). Nhiệt độ < 64
0
C, tổn thương sảy ra ở
màng tế bào. Khi nhiệt độ vượt quá 65
0
C, quá trình biến tính protein và ribosom
dễ dàng sảy ra và là nguyên nhân gây chết tế bào.
ii) Tổn thương tế bào do sấy đông khô

11
Ngược lại với sấy phun, tổn thương tế bào do sấy đông khô lại do trạng thái
đông đá. Sấy đông khô là quá trình làm mất nước đã được làm lạnh đông nhờ
thăng hoa. Sấy đông khô gồm hai giai đoạn: làm lạnh đông và thăng hoa ở áp
suất thấp. Trong quá trình lạnh đông, tinh thể băn ngoại bào hình thành trước làm
tăng nồng độ chất hòa tan ngoại bào, dẫn đến nước di chuyển từ trong tế bào ra
ngoài. Trong giai đoạn này tốc độ lạnh đông (
0
C/ phút) là yuế tố quyết đònh đến
hiệu suất thu hồi sản phẩm. Nếu tốc độ này quá thấp, nước từ nội bào đủ thời
gian khuếch tán ra bên ngoài, nhưng kéo dài thời gian đông đá không lợi về mặt
năng lượng. Ngược lại với tốc độ làm lạnh quá nhanh, màng phospholipid, các
kênh co thắt hạn chế sự thoát nước đồng thời hình thành đá nội bào sắc cạnh gây
tổn hại các bào quan của vi sinh vật, song song đó là nồng độ môi trường tăng
cao, áp suất thẩm tấu cùng lúc tăng nhanh lên bề mặt màng, gây stress tế bào vi
sinh vật khi hyrate hóa sau này, giảm tỉ lệ phục hồi và gây tổn hại cho ribosomes.
Như vậy tồn tại một tốc độ làm lạnh được gọi là tối ưu hóa khi nồng độ dung dòch
ở môi trường ngoài tăng nhanh hình thành tinh thể cao hơn nhưng vẫn đạt sự
khuếch tán của nước ra môi trường ngoài và giảm thiểu sự tổn thương tế bào do
tinh thể nước đá nội bào (Strasser et al., 2009).
iii) Tổn thương do mất nước
Dù sấy bằng phương pháp nào, khi mất nước màng tế bào (lớp lipid đôi) sẽ
dễ dàng bò tổn thương nhất, làm nất tính lỏng vốn có của màng tế bào và thay đổi
cấu trúc không gian màng tế bào (Strasser et al., 2009) [15-16].
2.1.3. TIÊU CHUẨN XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT PROBIOTIC
Các vi khuẩn lactic ( hay lactic acid bacteria (LAB)) được sử dụng làm
probiotic nhiều nhất vì chúng được sử dụng trong thực phẩm lẹn men truyền
thống từ xa xưa hoặc thuộc hệ vi sinh vật đường rột của các cơ thể khỏe mạnh.
Người ta xếp chúng vào vi sinh vật GRAS (Generally Recognized As Safe) (Lee
Y. K và Salminen S., 2009) [7].

12
Vi sinh vật probiotics phải đạt được nhiều tiêu chuẩn quan trong như:
chúng phải an toàn, kháng được acid trong thời gian đủ dài để vượt qua quá trình
tiêu hóa, tăng trưởng được trong môi trường có dòch mật, kết bám với tế bào biểu
mô ruột, tạo ra nhiều chất kháng khuẩn, điều hòa đáp ứng miễn dòch và kháng lại
quá trình xử lí trong qui trình sản xuất chế phẩm probiotics. Do đó cơ sở khoa học
cho sự lựa chọn vi sinh vật probiotics gồm: sự an toàn, các hoạt động chức năng
probiotics và các đặc điểm về kỹ thuật sản xuất [11].
Các tiêu chuẩn an toàn trong những năm gần đây đã được xác minh xác
minh trong nhiều nghiên cứu của Lee và Salminen (1995), Domohue và Salminen
(1996), Salminen và cộng sự(1996, 1998), Adams (1999). Người ta thấy rằng hầu
hết các chủng có khả năng Probiotic có nguồn gốc từ người. Do vậy các tiêu
chuẩn đánh giá mức độ an toàn gồm:
+ Các chủng có nguồn gốc từ người thích hợp hơn cho các chế phẩm
Probiotic cho người.
+ Chúng được phân lập tử bộ máy dạ dày- ruột của những người khỏe mạnh.
+ Không gây bệnh hoặc liên hệ đến các bệnh viêm nhiễm hoặc rối loạn tiêu
hóa.
+ Không mang gen kháng kháng sinh [11].
 Các tiêu chuẩn về hoạt động chức năng probiotics gồm:
- Có khả năng sống sót qua đường tiêu hóa nghóa là chòu được acid và dòch
tiêu hóa dạ dày (dòch mật, dòch vò, dòch tụy ). đ
- Có khả năng kết dính trên biểu mô ruột và tồn tại lâu dài bên trong đường
tiêu hóa người.
- Có hoạt tính đối kháng chống lại các vi sinh vật gây bệnh như Escherichia
coli, Listeria monocytogenes, Samonella spp., Helicobacter pylori
- Kích thích miễn dòch nhưng không có những phản ứng tiền viêm .
- Kháng đột biến và kháng ung thư (Mattila et al., 2002 ) [7-8].
13
2.1.4. CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG CỦA VI SINH VẬT PROBIOTIC

Vi sinh vật Probiotic góp phần tạo nên hệ vi sinh vật đường ruột lành
mạnh. Chúng kết bám vào biểu mô ruột với số lượng lớn và đa dạng và nhờ đó
cải thiện chế độ bảo vệ đối với vật chủ bằng cách:
(1) Cạnh tranh với VSV gây bệnh về thức ăn và vò trí kết bám.
(2) Tổng hợp các chất kháng VSV gây bệnh.
(3) Cảm ứng huy động tế bào miễn dòch và hoạt hóa đáp ứng miễn dòch thích
hợp [8].
2.1.4.1. Khả năng kết bám trên biểu mô ruột
Vò trí hoạt động của Probiotic là trên bề mặt của biểu mô ruột. Vì vậy việc
duy trì tế bào vi khuẩn trong bộ máy dạ dày ruột là cần thiết nhằm ngăn cản sự
đào thải nhanh chóng bởi sự co bóp của ruột. Tại đó, trước tiên chúng phải có khả
năng bám dính để cạnh tranh vò trí và nguồn dinh dưỡng với vi sinh vật gây bệnh
và duy trì vi khuẩn trong bộ máy dạ dày- ruột người. Muốn vậy chúng phải sống
sót khi đi qua dạ dày, nơi có pH acid và enzyme tiêu hóa (Hình 1.1) [8].
Hình 2.1.4.1. Tác động của Probiotic trong đường tiêu hóa (Davis CP, 1996).
Chauviere và cộng sự (1989) thấy rằng chỉ một vài chủng LAB là có khả
năng kết bám với tế bào ung thư ruột kết (Caco-2) hoặc dòng tế bào HT-29.
14
Conway và Kjellberg (1989) đã xác đònh một loại protein ngoại bào từ Lb.
fermentum là trung gian cho sự kết bám đặc trưng giữa vi khuẩn và cơ thể vật chủ.
Một số nghiên cứu khác (Brooker và Fuller, 1975) cũng cho thấy vai trò
của carbohydrat trong sự kết bám của LAB.
Thành phần protein cũng chứng tỏ có ảnh hưởng đến sự kết bám của vi
khuẩn tới biểu mô vảy trong dạ dày heo (Henrickson, Szewzyk và Coway, 1991).
Các nhân tố kết bám của LAB dựa vào nhiều bộ máy gồm nhiều cấu trúc bề mặt
tế bào khác nhau cần cho sự xâm chiếm của LAB trong ruột.
Elo và cộng sự (19910 báo cáo rằng Lactobacillus casei GG từ sản phẩm
mẫu sữa và sản phẩm đông khô đều liên kết với dòng tế bào Caco-2 trong môi
trường có ái lực mạnh, chúng đònh cư nhanh chóng và tồn tại được trong đường
ruột của người.

Green và Klaenhammer (1994) nghiên cứu những yếu tố liên quan đến sự
kết bám của các chủng LAB phân lập thừ người như: L. acidophilus BG2FO4, L.
acidophilus NCFM/N2 và L. gasseri ADH với các tế bào Caco-2 từ người và thấy
rằng: đối với 3 chủng thì sự kết bám phụ thuộc giá trò pH, kết bám tốt hơn ở pH
acid. Sự oxi hóa từng thời kỳ của carbohydrat bề mặt tế bào vi khuẩn rất đáng
quan tâm vì chúng làm giảm sự kết bám của L. gasseri ADH, trung hòa sự kết
bám của L. acidophilus BG2FO4 và không ảnh hưởng đến sự kết bám của L.
acidophilus NCFM/N2 .
Những kết quả trên cho thấy rằng Lactobacillus kết bám với tế bào ruột
qua nhiều bộ máy mà bao gồm nhiều sự kết hợp khác nhau giữa protein và
carbohydrat của vi khuẩn và tế bào nhân thật. Hơn nữa ảnh hưởng của pH trên
những tế bào Caco-2 cũng góp phần đáng kể vào sự kết bám của chủng này trong
dòch nuôi cấy [13, 14, 15].
2.1.4.2. Tổng hợp các chất có hoạt tính kháng vi sinh vật
15
Probiotic có khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh như ngăn cản sự kết
bám, sự cư trú, sự sinh sản và những hoạt động gây bệnh của một số vi khuẩn
đường ruột đăïc trưng. Những hoạt động này có được là do:
+ Làm giảm pH môi trường thông qua sự tổng hợp các acid hữu cơ như acid
lactic, acid acetic và acid propionic.
+ Làm giảm khả năng oxi hóa – khử của môi trường ruột.
+ Sản xuất H
2
O
2
trong điều kiện kò khí.
+ Đặc biệt tạo những hợp chất ức chế như bacteriocin [15].
i) Ảnh hưởng của acid lactic và acid acetic
Acid lactic là sản phẩm cuối chính của quá trình trao đổi chất carbohydrat
tạo ra từ pyruvate bởi enzyme lactic acid dehydrogenase, còn acid acetic là sản

phẩm phụ trong quá trình lên men. Sự tích tụ acid lactic và acid acetic đi kèm với
sự làm giảm pH của môi trường làm hạn chế sự phát triển các vi khuẩn Gram
dương và Gram âm với phổ rộng [15].
Acid acetic có hoạt độ kháng vi sinh cao hơn acid lactic. Dựa vào pH acid,
hằng số phân ly (pK) và nồng độ mole là những nhân tố xác đònh hoạt độ ức chế
của acid lactic và acid acetic trong môi trường. Acid acetic có pK= 4,756; còn acid
lactic pK= 3,860. Ở pH của ruột 8,4% acid acetic và 1,1% acid lactic ở dạng
không phân ly. Đây là yếu tố quan trọng vì acid không phân ly được xem như là
chất đối kháng chống lại sự tăng trưởng của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh và vi
khuẩn gây thối. Những acid lactic và acid ở dạng không phân ly có thể thấm vào
màng tế bào vi khuẩn, khi ở môi trường nội bào với pH cao chúng phân ly tạo ra
ion hydrogene, ảnh hưởng đến các hoạt động chức năng trao đổi chất của tế bào
như sự di chuyển cơ chất và sự phosphoryl hóa .
Acid lactic và acid ecetic được biết là có khả năng hạn chế Staphilococcuss
aureus, tuy nhiên khả năng này chỉ xảy ra ở giai đoạn sớm và không sảy ra ở giai
đoạn sau của sự phát triển của vi khuẩn. Goepfert và Hicks (1986) cho rằng
16