Bước đầu xác định hàm lượng daidzein geristrin và 17 acid amin trong đậu tương và sản phẩm chế biến

BỘ Y TẾ
VIỆN DINH DƯỠNG
][\^





Báo cáo kết quả đề tài khoa học công nghệ






BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG DAIDZEIN, GENISTEIN VÀ
17 ACID AMIN TRONG ĐẬU TƯƠNG VÀ SẢN PHẨM CHẾ BIẾN


Chủ nhiệm đề tài: ThS. Lê Hồng Dũng
ThS. Lê Thị Hồng Hảo
Nơi thực hiện:
Khoa Thực phẩm - VSATTP

Cơ quan chủ quản: Viện Dinh dưỡng

6626
06/11/2007

HÀ NỘI - 2007


BỘ Y TẾ
VIỆN DINH DƯỠNG
][\^




Báo cáo kết quả đề tài khoa học công nghệ







BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG DAIDZEIN, GENISTEIN VÀ
17 ACID AMIN TRONG ĐẬU TƯƠNG VÀ SẢN PHẨM CHẾ BIẾN





Chủ nhiệm đề tài:
ThS. Lê Hồng Dũng

ThS. Lê Thị Hồng Hảo
Cán bộ phối hợp:
PGS. TS. Hà Thị Anh Đào
KS. Vũ Thị Hồi
CN. Bùi Thị Ngoan
KS. Trần Thắng

Kinh phí:
40 triệu đồng
Nguồn:
Chiến lược dinh dưỡng Quốc gia



HÀ NỘI - 2007
1. Đặt vấn đề
Đậu, đỗ là nhóm thực phẩm quan trọng cung cấp một lượng đáng kể protein cho cơ thể. Các
loại đậu hạt thường chứa từ 20 đến 24% protein và 3 đến 5% chất xơ. Hạt đậu đã già thậm chí
còn chứa nhiều protein hơn (30–42%) [1]. Ngoài việc cung cấp một nguồn protein quan trọng
cho con người, một số loại đậu, đỗ chứa nhiều các acid amin rất quan trọng như lysin và
tryptophan. Acid amin là một thành phần quan trọng trong cấu tại nên protein, tham gia nhiều
chức năng quan trọng như cấu tạo tế bào, phục hồi mô, cấu tạo nên các kháng thể chống lại vi
khuẩn và virus, cấu tạo enzym và hệ thống hormon. Acid amin tạo nên ARN (acid ribo nucleic),
ADN (acid deoxy nucleic) vận chuyển oxy đi khắp cơ thể và tham gia vào hoạt động của các cơ.
Acid amin được cung cấp cho cơ thể từ thực phẩm giàu protein. Có 22 acid amin quan trọng đối
với cơ thể
, trong đó có 9 acid amin thiết yếu, là các acid amin cơ thể không tự tổng hợp được
gồm histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin, threonin, tryptophan và valin. Sự
thiếu hụt acid amin dẫn đến cơ thể mệt mỏi, hạ đường huyết, dị ứng [30].
Giá trị của một loại thức ăn không những phụ thuộc vào số lượng chất đạm có trong thức ăn

ấy mà còn phụ thuộc vào số lượng và tỷ lệ cân đối các acid amin, nghĩ
a là chất lượng của protein
thức ăn. Ngoài ra đối với các nước đang phát triển, thức ăn động vật mà protein có chất lượng
tốt còn chưa đủ, thì việc phân tích các acid amin cần thiết trong thức ăn thực vật lại càng cần
thiết. Nó giúp ta phương hướng phối hợp các thức ăn với nhau để nâng cao chất lượng của
protein trong khẩu phần. Vì vậy xác định hàm lượng các acid amin trong thực phẩm là rất c
ần
thiết.
Một nhóm các chất hóa thực vật trong các cây họ đậu được quan tâm nhiều nhất hiện nay là
phytoestrogen. Phytoestrogen có cấu trúc hóa học tương tự các hormon oestrogen, oestradiol ở
cơ thể động vật và cũng có hoạt tính của oestrogen. Tuy nhiên hoạt tính này thấp hơn nhiều lần
so với oestrogen động vật (chỉ bằng khoảng 1/500 đến 1/1000 hoạt tính oestradiol). Vì vậy các
phytoestrogen có thể có tác dụng kháng oestrogen bằng cơ chế cạnh tranh tại các receptor của
oestrogen [2,3]. Các nhóm phytoestrogen chính trong tự
nhiên là isoflavon, coumestan và lignan,
trong đó isoflavon là các hợp chất được quan tâm nhất. Isoflavon có nhiều ở thực vật họ đậu,
nhất là đậu tương
(Glycine max, G. hispida, G. soja)
. Hai hợp chất isoflavon quan trong nhất là
genistein và daidzein.
Gần đây, nhiều nghiên cứu dịch tễ đã cho thấy chế độ ăn có nhiều isoflavon và các lignan có
khả năng làm giảm nguy cơ mắc một số bệnh ung thư, tim mạch và các rối loạn ở phụ nữ sau
thời kỳ mãn kinh [2,3,4]. M
ặc dù chưa có những khẳng định chắc chắn về tác dụng sinh học
trong cơ thể người, nhưng nhiều nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ các phytoestrogen có thể
đóng vai trò bảo vệ một số bệnh mãn tính, đặc biệt là khả năng phòng và điều trị bệnh ung thư
tuyến tiền liệt nhờ khả năng kháng androgen của các hợp chất nhóm này [5,6]. Bên cạnh những
tác dụng có lợi c
ủa phytoestrogen, tác dụng bất lợi trên cơ thể người cũng đang được nghiên
cứu. Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu trên động vật cho thấy chế độ ăn giàu phytoestrogen gây ra

một số tác dụng phụ nhưng chưa có nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng bất lợi trên người. Một
số nghiên cứu quan sát thấy nguy cơ tăng hội chứng bệnh tự miễn tuyến yên ở trẻ nhỏ khi dùng
bột dinh dưỡng bổ sung đậu tương và có liên quan đến sự ức chế hệ thống men peroxidase tuyến
yên do isoflavon [33, 34, 35]. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu kỹ lưỡng nào về tác dụng lâu dài
của phytoestrogen kể cả tác dụng có lợi và tác dụng bất lợi. Nghiên cứu năm 2001 của Julie và
cộng sự [32] khi bổ sung 40mg/ngày trên nam giới tình nguyện khỏe mạnh (lượng isoflavon ăn
vào tương đương như ở nhiều nước châu Á) cho thấy không có ảnh hưởng đối v
ới hormon


gonadotrophin hoặc hormon sinh dục nam. Nghiên cứu này cũng không loại trừ khả năng khi bổ
sung phytoestrogen liều cao và trong thời gian dài có thể ảnh hưởng đến sức khỏe sinh sản ở
nam giới.
Thành phần và hàm lượng các isoflavon trong thực phẩm đã được nghiên cứu và công bố từ
nhiều nghiên cứu khác nhau trên thế giới [7,8,9,10,11]. Nhiều cơ sở dữ liệu về các isoflavon
hiện nay đã được công bố [7,10]. Để phân tích thành phần các phytoestrogen nói chung và các
isoflavon nói riêng, nhiều phương pháp
đã được phát triển và được chuẩn hóa tại các phòng thí
nghiệm trên thế giới. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha ngược được ứng dụng rộng rãi
nhất trong phân tích các isoflavon. Cột sắc ký thường dùng nhất là cột C18 với pha động gồm
acetonitril và acid acetic hoặc acid phosphoric. Detector thường dùng trong phân tích các
isoflavon là detector UV hoặc photodiode array (PDA) ở bước sóng 249nm và 260nm. Ngoài ra
detector điện hóa cũng được ứng dụng trong một số nghiên cứu cho thấy có độ nhạy và chọn lọc
cao vớ
i các isoflavon. Gần đây, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đã được sử dụng trong phân
tích đồng thời các hợp chất daidzein và genistein trong thực phẩm cũng như các mẫu phẩm sinh
hóa. Phương pháp sắc ký khí khối phổ thường được áp dụng để xác định lượng vết các isoflavon
với độ nhạy cao và rất đặc hiệu. Các phương pháp phân tích isoflavon và phytoestrogen trong
thực phẩm hiện vẫn tiếp tục được hoàn thiện nhằ
m cung cấp cơ sở dữ liệu phục vụ các nghiên

cứu trong lĩnh vực khoa học thực phẩm và y học [12,13,14,15, 16, 17, 18, 19].
Phương pháp cổ điển để phân tích acid amin được phát triển bởi Moore và Stein [44]. Các
acid amin tự do được xác định bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion với dẫn xuất sau cột
(ninhydrin hoặc o-phthalaldehyde). Cùng với kỹ thuật này, nhiều phương pháp mới đã được phát
triển và ứng dụng để phân tích acid amin như sắ
c ký điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối
phổ (LC/MS), sắc ký khí (GC/FID), sắc ký khí khối phổ [36, 37, 39, 40, 41, 42, 46, 47]. Mỗi
phương pháp có ưu điểm và những hạn chế riêng. Trong điều kiện phòng thí nghiệm của Viện
Dinh dưỡng phương pháp dẫn xuất trước cột với 6-aminoquinolyl-N-hydroxysucinimidyl
carbamate (AQC) cho phép xác định cả acid amin bậc 1 và bậc 2 với detector huỳnh quang
(
λ
Ex
=250 nm;
λ
Em
=395 nm). Phương pháp sử dụng AQC làm chất tạo dẫn xuất là đã được áp
dụng phổ biến trên thế giới để xác định acid amin trong nhiều đối tượng thực phẩm, như phân
tích acid amin trong thức ăn trẻ em [42].
Hiện nay, không chỉ riêng nước ta mà nhiều nước khác trên thể giới đang phải tiếp tục giải
quyết tình trạng nghèo đói và suy dinh dưỡng. Trong khi đó, thừa dinh dưỡng kèm theo các bệnh
mẵn tính như tim mạ
ch và tiểu đường đang trở nên một thách thức lớn trong giai đoạn chuyển
tiếp hiện nay. Vấn đề thừa cân và béo phì ở một bộ phận dân cư đô thị (trẻ em, học sinh, lứa tuổi
trung niên) và một số bệnh mạn tính có liên quan đến dinh dưỡng như tăng huyết áp và đái tháo
đường đang nổi lên có ý nghĩa sức khỏe cộng đồng [20]. Để giải quyết vấn đề này c
ần thiết phải
kết hợp nhiều giải pháp chiến lược, trong đó đảm bảo một chế độ ăn lành mạnh và phù hợp là
một trong những giải pháp rất quan trọng. Các nghiên cứu về vai trò các chất có hoạt tính sinh
học trong chế độ ăn đối với các bệnh mãn tính như tim mạch, béo phì và tiểu đường là rất cần

thiết trong giai đoạn hiện nay. Để thực hiện những nghiên cứ
u này, cần thiết phải xây dựng các
cơ sở dữ liệu đối với các hoạt chất sinh học trong tự nhiên như các carotenoids, sterols,
flavonoid, isoflavonoid
Trong chế độ ăn của người châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng, các thực phẩm từ đậu
tương chiếm một vị trí quan trọng. Theo kết quả Tổng điều tra dinh dưỡng năm 2000 của Viện
Dinh dưỡng, mức tiêu thụ thực phẩm nhóm đậu, đỗ đã tă
ng lên đáng kể trong năm 2000, với


khoảng 6 g/người/ ngày so với 2,8g/người/ngày trong năm 1990. Đậu phụ, loại thực phẩm giàu
đạm thực vật thông dụng ở Việt Nam cũng có mức tiêu thụ tăng lên đến 13,4 g/người/ngày trong
năm 2000 so với 6,8g/người/ngày trong năm 1990 [31].
Tuy nhiên, việc phân tích các thành phần có hoạt tính sinh học trong thực phẩm Việt Nam
còn hạn chế, chủ yếu mới có số liệu của một số loại carotenoid trong rau, quả. Số liệu phân tích
các acid amin trong thực ph
ẩm Việt Nam còn thiếu, đặc biệt đối với một số acid amin quan trọng
như lysin. Những nghiên cứu, phân tích về thành phần dinh dưỡng và đặc biệt các thành phần có
hoạt tính sinh học trong thực phẩm nhóm đậu, đỗ và các sản phẩm chế biến ở nước ta còn chưa
đầy đủ. Nhằm bổ sung và hoàn thiện số liệu của Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam và cung
cấp số liệu cho các nghiên cứu dinh d
ưỡng, việc xác định thành phần một các acid amin quan
trọng như lysin, methionin và số chất hóa thực vật như genistein và daidzein là rất cần thiết.
Vì vậy, đề tài này được thực hiện nhằm bước đầu xác định hàm lượng một số isoflavon và
acid amin trong thực phẩm nhóm đậu, đỗ và sản phẩm chế biến, phục vụ cho công tác nghiên
cứu chế độ ăn trong phòng và điều trị bệnh.
2. Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu chung:
Phân tích hàm lượng genistein, daidzein và 17 acid amin quan trọng trong đậu
tương và hai loại sản phẩm chế biến nhằm bước đầu cung cấp số liệu cho Bảng thành phần thực

phẩm Việt Nam
Mục tiêu cụ thể:
- Áp dụng và chuẩn hóa phương pháp phân tích genistein, daidzein và 17 acid amin trong đậu
và sản phẩm chế biến
- Xác định hàm lượng hai loại phytoestrogen chủ yếu (genistein, daidzein) và 17 acid amin
chính trong đậu tương và sản phẩm chế biến
3. Phương pháp nghiên cứu
3.1. Hóa chất, dụng cụ
3.1.1. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong đề tài là các hóa chất tinh khiết phân tích. Acetonitril, methanol,
ethanol, n-hexan, acid chlorhydric và acid acetic được mua của hãng Merck (Đức), aceton được
mua của hãng Riedel-de Haen (Đức). Nước cất sử dụng trong phân tích là nước cất 2 lần và
được lọc qua màng lọc 0,45
µ
m. Các dung môi pha động đều được lọc qua màng 0,45
µ
m trước
khi sử dụng. Chất chuẩn daidzein (tinh khiết 98%) và genistein (tinh khiết 98%) được mua từ
hãng Sigma (Mỹ). Màng lọc dung môi pha động PVDF 47 mm x 0,45
µ
m của hãng Pall
Coporation (M
ỹ), giấy chỉ thị màu vạn năng pH 1-14 của Merck (Đức). Chất tạo dẫn xuất 6-
aminoquinolyl-N-hydroxy-succinimidyl carbamat, hỗn hợp chuẩn 17 acid amin của hãng Waters
(Mỹ), các chuẩn đơn từng acid amin của hãng Prolabo (Pháp).
Pha các dung dịch chuẩn:
Chất chuẩn gốc daidzein và genistein được pha trong methanol và có nồng độ tương ứng là 120
µ
g/ml và 80
µ

g/ml tương ứng. Dung dịch chuẩn làm việc được pha loãng bằng methanol đến
nồng độ 1,2
µ
g/ml và 0,8
µ
g/ml tương ứng. Các dung dịch chu
ẩn được bảo quản ở 0
o
C.
Chuẩn hỗn hợp (17 acid amin) được pha từ dung dịch có chứa 2,5 mmol/
µ
l cho tất cả các acid


amin và 1,25 mmol/
µ
l đối với cystin trong HCl 20 mmol để được dung dịch chuẩn làm việc có
chứa 100 pmol/
µ
l đối với 17 acid amin và 50 pmol/
µ
l đối với cystein. Dung dịch chuẩn làm việc
được bảo quản trong lọ màu sẫm bảo quản bằng tủ lạnh âm sâu -20
0
C dùng được trong vòng 1
tháng. Các chuẩn đơn được hoà tan trong nước và bảo quản trong môi trường acid với các điều
kiện tương tự như chuẩn hỗn hợp.
3.1.2. Dụng cụ, thiết bị
Hệ thống sắc ký được sử dụng là của hãng Waters (Mỹ), gồm bơm dung môi 2690 có bộ phận
bơm mẫu tự động, detector PDA 2996, detector huỳnh quang 2475, phần mềm Empower. Cột

sắc ký dùng cho phân tích acid amin là cột Amino acid AccQ-Tag (150mm x 4,6mm x 3,5
µ
m)
của hãng Waters (Mỹ
). Đề tài sử dụng các dụng cụ thông thường phòng thí nghiệm gồm máy ly
tâm, bể siêu âm, máy lắc ngang, máy lắc ống nghiệm, bếp cách thủy và các dụng cụ thủy tinh.
3.2. Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích
Đề tài triển khai áp dụng một số phương pháp đã công bố trên thế giới, khảo sát và chọn lựa các
điều kiện phân tích phù hợp nhất với phòng thí nghiệm. Phương pháp được lựa chọn sẽ được
thẩm đị
nh và đưa ra quy trình phân tích trên mẫu thực.
3.3. Phương pháp lấy mẫu phân tích
Nghiên cứu này sử dụng phương pháp lấy mẫu phân tầng [21]. Đây là phương pháp phù hợp
nhất trong việc phân tích và xây dựng cơ sở dữ liệu các thành phần thực phẩm. Quần thể thực
phẩm được phân tầng theo vùng địa lý, theo mùa, theo mức độ tiêu thụ, hoặc theo khu vực phân
phối trên thị trường, các điểm bán lẻ Trong đề tài này, mẫu được lự
a chọn ngẫu nhiên từ các
chợ bán lẻ trên thị trường Hà Nội và số liệu thu được sẽ đại diện cho khu vực này.
Đối tượng mẫu:
gồm 3 loại thực phẩm

1. Đậu tương (đậu nành)
2. Các sản phẩm chế biến từ đậu tương: đậu phụ, sữa đậu nành
Cỡ mẫu
Cỡ mẫu được tính toán và ước lượng theo công thức sau [21]
N ≥ (t
α n-1
)
2
SD

2
/ (A x
µ
)
2

trong đó: N là cỡ mẫu
A là độ chính xác của kết quả phân tích (có giá trị 0,1 hoặc 0,05)

µ
là giá trị trung bình (kết quả phân tích) của quần thể, thu được từ các nghiên
cứu trước đây
SD độ lệch chuẩn của giá trị trung bình
t là giá trị thu được từ bảng thống kê chuẩn (bảng Student), với
α
là giới hạn tin
cậy (95% hoặc 99%)
Tính toán cỡ mẫu cụ thể dựa theo bảng sau (đối v
ới đậu nành):
Thông số (đậu nành)
Daidzein (mg/100g) Genistein (mg/100g)
µ
20,16 67,47
SD 3,03 13,40
t (
α
=0,05) 2,069 2,069
Độ chính xác 0,1 (0,05) 0,1 (0,05)
Cỡ mẫu yêu cầu với độ chính xác 0,1 10 17

Cỡ mẫu yêu cầu với độ chính xác 0,05 39 69
Như vậy, để có số liệu đảm bảo độ chính xác 0,1, cần lấy 10 mẫu phân tích daidzein và 17 mẫu
phân tích genistein, tương tự để đảm bảo độ chính xác 0,05, cần lấy 39 mẫu phân tích daidzein
và 69 mẫu phân tích genistein. Trong khuôn khổ của đề tài này chúng tôi chọn cỡ mẫu phân tích
tối thiểu là n = 17, với độ chính xác là 0,1.
Tổng số mẫu phân tích cho 3 loại thực phẩm là 17 x 3 = 51 mẫu
Các chỉ tiêu phân tích: 17 loại acid amin và hai loại isoflavon là daidzein và genistein.
Thu thập mẫu
Mẫu được thu thập bằng cách bốc thăm ngẫu nhiên từ các chợ đại diện cho 9 quận nội thành Hà
Nội, gồm Chợ Thái Hà, chợ Hôm, chợ Mơ, chợ Trương Định, chợ Hàng Da, chợ Ngã Tư Sở,
chợ Thành Công, chợ Lê Quý Đôn và chợ Ngô Sĩ Liên.
4. Kết quả và bàn luận
4.1. Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích acid amin
4.1.1. Giai đoạn thuỷ phân mẫu
Theo một số tác giả [24, 25, 28] phươ
ng pháp chủ yếu dùng để thuỷ phân tách các acid min ra
khỏi thực phẩm là thuỷ phân trong môi trường acid chlorhydric có nồng độ cao.
Quy trình thuỷ phân và phân tích mẫu như sau:
Cân 0,5-1,0 g mẫu (hoặc 10 ml sữa) vào ống nghiệm thành dày

↓

Thêm 10ml HCl 15%

Loại không khí bằng nitơ, đậy kín
↓

Thủy phân ở 125
o

C trong 23 giờ
↓

Để nguội, đuổi hết HCl dư
↓

Định mức bằng HCl 20 mmol
↓

Tạo dẫn xuất
↓

Xác định trên HPLC bằng detector huỳnh quang

Tạo dẫn xuất
Hút 0,5 ml mẫu pha trong HCl 20mM vào lọ 1,5ml có nắp, thêm 70
µ
l borate để tạo môi trường
dẫn xuất có pH = 8,2 - 9,7, lắc trên máy lắc ống nghiệm, thêm 20
µ
l AQC (3mg/ml trong
acetonitril), lắc đều bằng tay khoảng 1 phút. Đậy kín, ủ ở 55
o
C trong 10 phút (mẫu sau dẫn xuất
ổn định ở nhiệt độ phòng trong khoảng 1 tuần).


4.1.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
-
LOD được xác định bằng nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó cho các pic có tín hiệu

bằng 3 lần nhiễu đường nền (S/N =3). Để xác định giới hạn phát hiện, nạp chất chuẩn với
nồng độ thấp nhất định nằm trong khoảng tuyến tính và tính theo công thức sau:

LOD = C
s
*3h
n
/2h
s
(h
n
: chiều cao nhiễu, dung dịch có nồng độ C
s
cho chiều cao h
s
)
-
LOQ: là nồng độ chất phân tích tại đó có tín hiệu 10 lần nhiễu đường nền (S/N = 10).
LOQ = LOD*3,3
Bảng 1: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp

TT Acid amin LOD (µg/ml) LOQ (µg/ml)
1 Acid aspartic
0,033 0,108
2 Serin
0,026 0,086
3 Acid glutamic
0,028 0,093
4 Glycin
0,023 0,075

5 Histidin
0,013 0,042
7 Arginin
0,053 0,174
8 Threonin
0,053 0,176
9 Alanin
0,061 0,200
10 Prolin
0,090 0,298
11 Cystein
0,026 0,085
12 Tyrosin
0,015 0,051
13 Valin
0,009 0,029
14 Methionin
0,043 0,142
15 Lysin
0,181 0,598
16 Isoleucin
0,089 0,295
17 Leucin
0,008 0,026
18 Phenylalanin
0,008 0,026
4.1.3. Khoảng tuyến tính
Để tiến hành xác định khoảng tuyến tính của phương pháp phân tích, chúng tôi pha một
dãy chuẩn có nồng độ từ 0,1 đến 100
µ

g/ml cho 17 acid amin, từ 0,05 đến 50
µ
g/ml đối cystin
và tiến hành đo cho tất cả các acid amin. Kết quả cho thấy đồ thị tuyến tính trong khoảng 0,2
đến 100
µ
g/ml cho 17 acid amin, còn 0,1 đến 50
µ
g/ml đối cystin với hệ số tương quan đạt
được từ 0,997 đến 0,9998 cho tất cả các acid amin.
4.1.4. Độ lặp lạ
i của phương pháp
Để khảo sát độ lặp lại của phương pháp, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm trên 3 loại mẫu. Mỗi
loại mẫu tiến hành phân tích trên 6 mẫu.
Độ lệch chuẩn được tính theo công thức:
1
)(
1
2
2
−
−
=
∑
=
n
mtbmi
S
n
i

Độ lệch chuẩn tương đối được tính theo công thức: RSD = s*100/X
TB
Bảng 2: Kết quả về độ lặp lại hàm lượng trong mẫu hạt đậu
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6
N x
TB
S RSD
Các acid amin
g/ 100g
g/ 100g (%)
Acid aspartic 4,444 4,435 4,511 4,421 4,431 4,507 6 4,453 0,040 0,91
Serin 1,615 1,627 1,634 1,594 1,605 1,629 6 1,613 0,016 1,01
Acid glutamic 8,97 8,952 9,105 8,82 8,943 9,078 6 8,988 0,104 1,15
Glycin 2,406 2,431 2,442 2,382 2,399 2,435 6 2,411 0,024 1,01
Histidin 1,879 1,875 1,907 1,816 1,873 1,901 6 1,882 0,033 1,76
Arginin 4,01 4,051 4,073 3,969 3,997 4,058 6 4,018 0,042 1,03
Threonin 2,062 2,058 2,093 2,041 2,056 2,087 6 2,066 0,020 0,96
Alanin 2,564 2,559 2,603 2,539 2,557 2,595 6 2,569 0,024 0,95
Prolin 2,77 2,765 2,812 2,742 2,762 2,803 6 2,776 0,027 0,96
Cystein 0,172 0,171 0,174 0,173 0,169 0,174 6 0,172 0,002 1,13
Tyrosin 1,702 1,699 1,728 1,685 1,697 1,723 6 1,706 0,016 0,97
Valin 2,108 2,104 2,146 2,087 2,152 2,134 6 2,112 0,028 1,33
Methionin 0,902 0,9 0,915 0,893 0,899 0,913 6 0,904 0,009 0,95
Lysin 1,849 1,845 1,877 1,781 1,843 1,903 6 1,853 0,041 2,22
Isoleucin 2,002 1,998 2,032 1,982 1,996 2,026 6 2,006 0,019 0,95
Leucin 3,582 3,575 3,636 3,547 3,572 3,625 6 3,59 0,034 0,95
Phenylalanin 3,468 3,461 3,52 3,433 3,457 3,509 6 3,475 0,033 0,96

Hình 1: Sắc đồ các chuẩn 17 acid amin bằng dẫn xuất AQC. Cột AccQ-Tag (150mm x 4,6mm x
3,9
µ
m). Tốc độ dòng 1ml/phút, nhiệt độ cột 35
o
C, chương trình dung môi như mục 4.3.1.
Detector huỳnh quang
,
λ
Ex
=250 nm;
λ
Em
=395 nm


Bảng 3: Kết quả độ lặp lại thời gian lưu trong mẫu hạt đậu
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6
N x
TB
S RSD
Các acid amin
Phót

phót (%)
Acid aspartic 14,12 14,16 14,24 14,29 14,13 14,23 6 14,20
0,07
0,48
Serin 15,64 15,69 15,77 15,82 15,59 15,66 6 15,69

0,09
0,55
Acid glutamic 16,46 16,52 16,60 16,66 16,53 16,54 6 16,55
0,07
0,42
Glycin 17,76 17,35 17,91 17,95 17,65 17,77 6 17,73
0,22
1,22
Histidin 18,41 18,49 18,58 18,64 18,59 18,58 6 18,55
0,08
0,45
Arginin 21,26 21,29 21,31 21,33 21,27 21,32 6 21,30
0,03
0,13
Threonin 21,42 21,50 21,48 21,53 21,53 21,47 6 21,49
0,04
0,19
Alanin 22,07 22,10 22,13 22,14 22,18 22,12 6 22,12
0,04
0,17
Prolin 23,37 23,40 23,42 23,42 23,39 23,41 6 23,40
0,02
0,08
Cystein 26,42 26,13 26,16 26,45 26,13 26,16 6 26,24
0,15
0,57
Tyrosin 26,76 26,80 26,82 26,80 26,75 26,78 6 26,79
0,03
0,10
Valin 27,90 27,93 27,96 27,95 27,94 27,95 6 27,94

0,02
0,08
Methionin 28,46 28,50 28,52 28,51 28,51 28,53 6 28,50
0,02
0,09
Lysin 31,12 31,15 31,17 31,16 31,14 31,16 6 31,15
0,02
0,06
Isoleucin 31,91 31,94 31,96 31,96 31,95 31,95 6 31,95
0,02
0,06
Leucin 32,51 32,55 32,57 32,56 32,56 32,56 6 32,55
0,02
0,07
Phenylalanin 33,99 34,04 34,06 34,05 34,05 34,06 6 34,04
0,03
0,08

Bảng 4: Kết quả về độ lặp lại hàm lượng trong mẫu đậu phụ
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6
N x
TB
S RSD
Các acid amin
g/ 100g
g/ 100g (%)
Acid aspartic
0,303
0,312 0,307 0,290 0,302 0,306 6 0,303 0,008 2,51
Serin

0,371
0,370 0,367 0,367 0,369 0,375 6 0,370 0,003 0,80
Acid glutamic
1,071
1,069 1,087 1,102 1,068 1,084 6 1,080 0,014 1,25
Glycin
0,379
0,379 0,385 0,376 0,368 0,384 6 0,379 0,006 1,62
Histidin
0,435
0,434 0,454 0,431 0,434 0,440 6 0,438 0,008 1,93
Arginin
1,514
1,511 1,505 1,499 1,509 1,532 6 1,512 0,011 0,74
Threonin
0,612
0,611 0,621 0,606 0,610 0,619 6 0,613 0,006 0,95
Alanin
0,162
0,161 0,164 0,157 0,161 0,164 6 0,162 0,003 1,61
Prolin
0,235
0,234 0,238 0,221 0,234 0,237 6 0,233 0,006 2,71
Cystein
0,068
0,068 0,069 0,066 0,068 0,069 6 0,068 0,001 1,41
Tyrosin
0,601
0,600 0,610 0,589 0,599 0,608 6 0,601 0,008 1,25
Valin

0,204
0,204 0,207 0,212 0,204 0,207 6 0,206 0,003 1,58
Methionin
0,070
0,070 0,071 0,068 0,070 0,071 6 0,070 0,001 1,91
Lysin
0,413
0,412 0,419 0,409 0,412 0,418 6 0,414 0,004 0,95
Isoleucin
0,213
0,212 0,216 0,221 0,212 0,215 6 0,215 0,003 1,51
Leucin
0,349
0,348 0,354 0,356 0,348 0,353 6 0,351 0,003 0,95
Phenylalanin 0,752 0,751 0,763 0,756 0,750 0,761 6 0,755 0,006 0,75


B¶ng 5: KÕt qu¶ ®é lÆp l¹i thêi gian l−u trong mÉu ®Ëu phô
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6
N x
TB
S RSD
Các acid amin
Phót

phót (%)
Acid aspartic 13,91 13,98 13,89 14,10 13,58 13,71 6 13,86
0,19
1,36
Serin 15,50 15,57 15,47 15,64 15,13 15,26 6 15,43

0,20
1,27
Acid glutamic 16,35 16,42 16,30 16,45 15,94 16,07 6 16,26
0,21
1,26
Glycin 17,22 17,30 17,17 17,32 16,80 16,94 6 17,13
0,21
1,21
Histidin 18,41 18,49 18,34 18,44 17,95 18,08 6 18,28 0,22 1,20
Arginin 21,30 21,31 21,28 21,30 21,15 21,18 6 21,25
0,07
0,32
Threonin 21,48 21,49 21,46 21,50 21,33 21,14 6 21,40
0,14
0,67
Alanin 22,13 22,13 22,10 22,13 21,98 22,02 6 22,08
0,07
0,31
Prolin 23,43 23,41 23,40 23,45 23,29 23,34 6 23,39
0,06
0,26
Cystein 26,14 26,10 26,11 26,16 25,99 26,04 6 26,09
0,06
0,24
Tyrosin 26,80 26,75 26,77 26,80 26,32 26,69 6 26,69
0,19
0,70
Valin 27,94 27,90 27,91 27,97 27,79 27,85 6 27,89
0,06
0,23

Methionin 28,51 28,47 28,47 28,52 28,36 28,40 6 28,45
0,06
0,22
Lysin 31,73 31,67 31,69 31,74 30,97 31,07 6 31,48
0,36
1,13
Isoleucin 31,96 31,88 31,91 31,97 31,77 31,85 6 31,89
0,07
0,23
Leucin 32,57 32,48 32,51 32,57 32,37 32,44 6 32,49
0,08
0,24
Phenylalanin 34,06 33,94 33,97 34,04 33,79 33,88 6 33,95
0,10
0,30

B¶ng 6: KÕt qu¶ vÒ ®é lÆp l¹i hµm l−îng trong mÉu s÷a ®Ëu nµnh
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6
N x
TB
S RSD
Các acid amin
g/ 100g
g/ 100g (%)
Acid aspartic
0,433
0,432 0,430 0,429 0,432 0,438 6 0,432 0,003 0,78
Serin
0,508
0,507 0,515 0,522 0,506 0,514 6 0,512 0,006 1,20

Acid glutamic
1,228
1,226 1,247 1,226 1,225 1,243 6 1,232 0,010 0,79
Glycin
0,540
0,539 0,548 0,554 0,538 0,546 6 0,544 0,006 1,18
Histidin
0,528
0,527 0,535 0,532 0,526 0,534 6 0,530 0,004 0,77
Arginin
1,916
1,912 1,944 1,996 1,910 1,939 6 1,936 0,033 1,70
Threonin
0,701
0,699 0,711 0,679 0,699 0,709 6 0,700 0,011 1,61
Alanin
0,287
0,287 0,292 0,274 0,286 0,291 6 0,286 0,006 2,15
Prolin
0,409
0,408 0,415 0,405 0,417 0,414 6 0,411 0,005 1,19
Cystein
0,051
0,051 0,052 0,050 0,061 0,051 6 0,053 0,004 7,59
Tyrosin
1,032
1,030 1,048 1,022 1,129 1,044 6 1,051 0,039 3,76
Valin
0,329
0,328 0,334 0,326 0,338 0,333 6 0,331 0,004 1,35

Methionin
0,220
0,219 0,223 0,217 0,229 0,222 6 0,222 0,004 1,84
Lysin
0,678
0,677 0,688 0,671 0,686 0,686 6 0,681 0,007 0,99
Isoleucin
0,324
0,324 0,329 0,321 0,323 0,328 6 0,325 0,003 0,95
Leucin
0,567
0,566 0,576 0,561 0,545 0,574 6 0,565 0,011 1,93
Phenylalanin
1,168
1,166 1,185 1,156 1,064 1,182 6 1,154 0,045 3,90


B¶ng 7: KÕt qu¶ ®é lÆp l¹i thêi gian l−u trong mÉu s÷a ®Ëu nµnh
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6
N x
TB
S RSD
Các acid amin
Phót

phót (%)
Acid aspartic 13,74 13,87 13,84 13,85 13,86 13,72 6 13,81
0,07
0,48
Serin 15,30 15,44 15,41 15,43 15,45 15,31 6 15,39

0,07
0,44
Acid glutamic 16,11 16,27 16,24 16,27 16,26 16,12 6 16,21
0,08
0,46
Glycin 16,99 17,12 17,10 17,14 17,12 17,09 6 17,09
0,05
0,31
Histidin 18,13 18,28 18,26 18,32 18,28 18,19 6 18,24
0,07
0,39
Arginin 21,20 21,24 21,25 21,26 21,23 21,18 6 21,23
0,03
0,15
Threonin 21,42 21,42 21,43 21,44 21,42 21,43 6 21,43
0,01
0,04
Alanin 22,03 22,06 22,07 22,09 22,06 22,12 6 22,07
0,03
0,14
Prolin 23,34 23,36 23,37 23,39 23,37 23,34 6 23,36
0,02
0,08
Cystein 26,06 26,07 26,08 26,10 26,07 26,04 6 26,07
0,02
0,07
Tyrosin 26,70 26,75 26,76 26,76 26,75 26,69 6 26,73
0,03
0,12
Valin 27,87 27,89 27,91 27,91 27,89 27,78 6 27,87

0,05
0,17
Methionin 28,44 28,47 28,49 28,48 28,45 28,42 6 28,46
0,03
0,09
Lysin 31,06 31,66 31,68 31,69 31,68 31,05 6 31,47
0,32
1,03
Isoleucin 31,86 31,89 31,91 31,91 31,79 31,84 6 31,87
0,05
0,15
Leucin 32,47 32,49 32,52 32,52 32,43 32,43 6 32,47 0,04 0,12
Phenylalanin 33,91 33,95 33,99 33,99 33,89 33,97 6 33,95
0,04
0,12

4.1.5. Xác định độ thu hồi của phương pháp
Dựa vào việc thêm mẫu chuẩn vào mẫu thực, cùng với việc tiến hành làm mẫu thực
không có mẫu chuẩn song song chúng tôi tiến hành tính độ thu hồi như sau.
M
2

Độ thu hồi = x 100%
M
1

M
1
: acid amin (
µ

g) biết trước (thêm vào).
M
2
: acid amin (
µ
g) xác định được.
Dựa vào đường chuẩn làm song song với mẫu thực chúng tôi thu được kết quả của mẫu
thêm chuẩn và đem so với giá trị cho vào, mỗi nồng độ làm 3 mẫu và lấy kết quả trung bình. Ta
có kết quả ở bảng 8,9,10 với các nền mẫu là hạt đậu, đậu phụ, sữa đậu nành.


Bảng 8: Kết quả độ thu hồi với nền mẫu hạt đậu
Các thông số
Các acid amin
Hm lng trong mu
(mg/100g) n = 3
Hm lng chun thờm
vo (mg/100g)
Hm lng tỡm thy
(mg/100g) n = 3
thu hi
(%)
Acid aspartic
3,096
0,022
3,117
95,5
Serin
1,538
0,018

1,555
94,6
Acid glutamic
6,590
0,025
6,614
96,7
Glycin
2,229
0,013
2,241
94,9
Histidin
2,032
0,026
2,056
93,7
Arginin
4,207
0,029
4,235
96,2
Threonin
2,033
0,020
2,052
97,8
Alanin
1,933
0,015

1,947
93,6
Prolin
2,257
0,019
2,276
98,2
Cystein
0,186
0,010
0,196
92,1
Tyrosin
1,892
0,030
1,922
97,3
Valin
1,771
0,019
1,790
98,2
Methionin
0,902
0,025
0,927
99,1
Lysin
0,967
0,024

0,991
98,7
Isoleucin
1,648
0,022
1,669
97,6
Leucin 2,936 0,022 2,958 98,2
Phenylalanin
3,759
0,028
3,786
98,4

Bảng 9: Kết quả độ thu hồi với nền mẫu đậu phụ
Các thông số
Các acid amin
Hàm lợng trong
mãu (g/100g) n = 3
Hàm lợng chuẩn thêm
vào (mg/100g)
Hàm tìm thấy
(mg/100g) n = 3
Độ thu hồi
(%)
Acid aspartic 0,292 0,022 0,313 96,7
Serin 0,341 0,018 0,358 95,4
Acid glutamic 1,035 0,025 1,059 98,2
Glycin 0,348 0,013 0,360 99,1
Histidin 0,391 0,026 0,415 95,4

Arginin 1,333 0,029 1,362 98,3
Threonin 0,559 0,020 0,578 96,7
Alanin 0,158 0,015 0,173 98,2
Prolin 0,233 0,019 0,252 99,1
Cystein 0,059 0,010 0,068 95,3
Tyrosin 0,553 0,030 0,582 97,6
Valin 0,198 0,019 0,217 98,2
Methionin 0,102 0,025 0,126 99,1
Lysin 0,373 0,024 0,397 99,2
Isoleucin 0,205 0,022 0,227 99,0
Leucin 0,342 0,022 0,364 99,1
Phenylalanin 0,677 0,028 0,705 98,9



B¶ng 10: KÕt qu¶ ®é thu håi víi nÒn mÉu s÷a ®Ëu nµnh
C¸c th«ng sè
C¸c acid amin
Hµm l−îng trong mÉu
(mg/100ml) n = 3
Hµm l−îng chuÈn thªm
vµo (mg/100ml)
Hµm l−îng cuèi
(mg/100ml) n = 3
§é thu håi
(%)
Acid aspartic 0,052
0,022 0,072
93,4
Serin 0,064

0,018 0,081
92,7
Acid glutamic 0,159
0,025 0,182
94,0
Glycin 0,066
0,013 0,078
90,8
Histidin 0,069
0,026 0,092
91,6
Arginin 0,199
0,029 0,226
94,6
Threonin 0,077
0,020 0,095
94,2
Alanin 0,028
0,015 0,042
95,1
Prolin 0,046
0,019 0,065
96,2
Cystein 0,008
0,010 0,017
90,3
Tyrosin 0,121
0,030 0,150
96,4
Valin 0,034

0,019 0,053
95,3
Methionin 0,026 0,025 0,050 95,4
Lysin 0,085
0,024 0,108
96,7
Isoleucin 0,035
0,022 0,056
97,2
Leucin 0,062
0,022 0,083
98,1
Phenylalanin 0,139
0,028 0,166
97,8

Qua kết quả trên hiệu suất thu hồi của cả 3 loại nền đều trên 90% trong khoảng tuyến tính. Độ
thu hồi với nền mẫu là đậu phụ cao hơn so với nền mẫu là hạt đỗ tương và thấp nhất là trên nền
mẫu sữa đậu nành. Do đó có thể kết luận, phương pháp này cho phép xác định hàm lượng các
acid amin có độ thu hồi đều trong khoảng 92 - 99%.
4.2. Khảo sát và chuẩn hóa phương pháp phân tích daidzein và genistein
4.2.1. Lựa chọn cột tách và điều kiện sắc ký
Đề tài đã khảo sát một số pha động trong phân tách isoflavon và sử dụng các cột sắc ký hiện có,
bao gồm cột Novapak (150mm x 3,9 mm, 5
µ
m, Waters, Mỹ), cột Symmetry C18 (150mm x 3,9
mm, 5
µ
m, Waters, Mỹ), cột Luna (2) C18 (250mm x 3,9 mm, 5
µ

m, Phenomenex, Mỹ). Hệ pha
động chính đã được áp dụng rộng rãi trong các nghiên cứu trên thế giới là hỗn hợp acid acetic
0,1-1% và acetonitril. Kết quả khảo sát đã lựa chọn được hệ pha động phù hợp là hỗn hợp acid
acetic 0,1 % và acetonitril 80% trong acid acetic 0,1%. Chương trình dung môi thích hợp để tách
được các isoflavon trong đậ
u tương (dịch chiết thu được từ một trong các quy trình khảo sát ở
mục 4.2.2) như sau:
Pha động A: Acid acetic 0,1 %
Pha động B: Acetonitril 80% trong acid acetic 0,1%
Chương trình dung môi: Bảng 11


Bảng 11: Chương trình dung môi pha động phân tích daidzein và genistein

Thời gian
(phút)
Tốc độ dòng
(ml/ phút)
Tỷ lệ % A Tỷ lệ % B
0 1,0 88 12
5 1,0 88 12
9 1,0 78 22
20 1,0 70 30
30 1,0 70 30
35 1,0 60 40
45 1,0 88 12
Các isoflavon được định tính và định lượng bằng detector PDA 2996 ở bước sóng 260 nm, nhiệt
độ buồng cột là 35
o
C. Sắc đồ chuẩn daidzein và genistein thu được theo điều kiện phân tích này

được thể hiện ở hình 2.
4.2.2. Điều kiện chiết xuất isoflavon
Để lựa chọn được điều kiện chiết xuất isoflavon phù hợp, một số phương pháp trên thế giới đã
được áp dụng và khảo sát tại phòng thí nghiệm. Dịch chiết và dịch làm sạch các isoflavon được
phân tích trên sắc ký lỏng để xác định khả năng chiết xuất dựa vào sự có mặt của các pic
isoflavon đối chiếu với tài liệu đã công bố. Các quy trình chiết xuất đã khảo sát bao gồm:

Quy trình 1: Áp dụng theo Hutabarat và cộng sự [15]
1 g bột đậu xay mịn(hoặc 25 ml sữa đậu nành) /bình cầu 100 ml
↓

Thêm 10ml HCl 2M + 40ml ethanol 96% + 0,02g BHT
↓

Lắc đều, siêu âm 20 phút
↓

Đun hồi lưu ở 80
o
C trong 1 giờ
↓

Để nguội, định mức vừa đủ 50ml bằng ethanol 96%
↓

Lọc, bơm vào HPLC

Quy trình 2: Theo Hsieh và cộng sự [18]
2 g bột đậu xay mịn /ống ly tâm 30ml
↓

Thêm 10 ml hexan, lắc đều, siêu âm 30 phút
↓

Ly tâm 3500 v/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch trong
↓

Thêm 2ml hexan, vortex kỹ, ly tâm, loại bỏ lớp hexan (2 lần)
↓

Bã: dùng đũa thủy tinh đánh tơi cho bay hết dung môi
↓

Thêm 10 ml acetone + 2 ml HCl 0,1M
↓

Siêu âm 1 giờ
↓

Ly tâm 3500 v/phút trong 30 phút
↓

Hút toàn bộ dịch trong vào ống nghiệm 30 ml, thổi khô
↓

Hòa tan cặn bằng 5 ml MeOH, định mức 10 ml bằng MeOH
↓

Bơm vào HPLC

Quy trình 3: Theo Murphy và cộng sự [19]
1 g mẫu
↓

Thêm 10 ml acetonitril, 2 ml HCl 0,1M và 5 ml nước cất
↓

Khuấy hoặc lắc qua đêm ở nhiệt độ phòng
↓

Chuyển vào ống ly tâm, ly tâm 3000 vòng/ phút
↓

Hút lấy dịch chiết trong vào ống nghiệm sạch
↓

Thổi khô dịch chiết bằng khí nitơ
↓

Hòa tan bằng methanol 50% và định mức 100ml
↓

Lọc qua màng PTFE 0,45
µ
m
↓

HPLC


Dịch chiết thu được từ 3 quy trình nói trên được bơm vào sắc ký lỏng, xác định các pic tách
được và so sánh với các tài liệu đã công bố. Kết quả so sánh cho thấy đối với quy trình 1, dịch
chiết thu được gồm chủ yếu là daidzein và genistein (hình 3). Theo phương pháp này, các
isoflavon dạng kết hợp (glycosid) trong đậu tương bị thủy phân thành dạng tự do (daidzin thành
daidzein, genistin thành genistein). Tuy nhiên nếu áp dụng phương pháp này sẽ không phân biệt
được daidzein và genistein dạng tự do và dạng kết hợp trong đậu tươ
ng. Một số nghiên cứu gần
đây [16] cho thấy isoflavon dạng glycosid khi vào cơ thể sẽ bị các men tiêu hóa (ở nước bọt và
ruột non) chuyển thành dạng tự do như daidzein và genistein và được hấp thụ vào cơ thể. Tuy
nhiên một nghiên cứu khác cho thấy isoflavon glycosid cũng có khả năng tăng cường sự hấp thụ
các isoflavon qua ruột non [5]. Vì vậy, đề tài lựa chọn phương pháp không thủy phân để xác
định cả các isoflavon dạng tự do và dạng kế
t hợp, nhằm tạo cơ sở cho các nghiên cứu kế tiếp.
So sánh hai phương pháp chiết xuất 2 (hình 4) và phương pháp 3 (hình 5) cho thấy cả hai
quy trình đều chiết được các loại isoflavon chủ yếu, cả dạng tự do và dạng kết hợp. Tuy nhiên,
quy trình 2 phải áp dụng việc loại chất béo trước khi chiết xuất, tốn dung môi và thời gian phân
tích, có thể ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi. Vì vậy, phương pháp thứ 3 (theo Murphy và cộng
sự
) được lựa chọn để tiếp tục khảo sát và chuẩn hóa phương pháp phân tích đối với đậu tương và
hai sản phẩm chế biến.

Hình 2: Sắc đồ chuẩn daidzein và genistein. Cột Luna C18 (2), tốc độ dòng 1ml/phút. Gradient
như
Bảng 11
. Detector PDA ở 260 nm.

Hình 3: Sắc đồ các isoflavon thu được theo quy trình 1. Cột Luna C18 (2), tốc độ dòng 1ml/phút.

Gradient như
Bảng 11
. Detector PDA ở 260 nm.



Hình 4: Sắc đồ các isoflavon thu được theo quy trình 2. Cột Luna C18 (2), tốc độ dòng 1ml/phút.
Gradient như
Bảng 11
. Detector PDA ở 260 nm.


Hình 5: Sắc đồ các isoflavon thu được theo quy trình 3. Cột Luna C18 (2), tốc độ dòng 1ml/phút.
Gradient như
Bảng 11
. Detector PDA ở 260 nm.
4.2.3. Độ lặp lại của phương pháp
Để xác định độ lặp lại, một mẫu được chọn và phân tích lặp lại 5 lần. Tính toán kết quả trung
bình và hệ số biến sai (CV), thể hiện ở bảng 12. Phương pháp phân tích có độ biến thiên đối với
daidzein là 11,6 % và đối với genistein là 8,6%.
Bảng 12: Kết quả khảo sát độ lặp lại trong phân tích daidzein và genistein

Mẫu Daidzein (mg/100g) Genistein (mg/100g)
1 5,5 6,4
2 4,7 6,0
3 6,2 5,9
4 5,1 6,5
5 4,9 5,2
Trung bình
5,1 6,0

Độ lệch chuẩn (SD)
0,6 0,5
Hệ số biến thiên (CV)
11,6 8,6


4.2.4. Khoảng tuyến tính
Hỗn hợp chuẩn được pha loãng thành các nồng độ từ 60
µ
g/ml đến 1,2
µ
g/ml đối với daidzein
và từ 40
µ
g/ml đến 0,8
µ
g/ml đối với genistein. Các dung dịch chuẩn được bơm vào máy sắc ký
lỏng và đường chuẩn hồi quy tuyến tính được xác định dựa vào nồng độ chuẩn và diện tích pic.
Kết quả (hình 5) cho thấy phương pháp có độ tuyến tính khi xác định daidzein từ 1,2
µ
g/ml đến
120
µ
g/ml và xác định genistein từ 0,8
µ
g/ml đến 80
µ
g/ml.

Hình 6: Đồ thị chuẩn daidzein với nồng độ từ 1,2

µ
g/ml đến 120
µ
g/ml và genistein nồng độ từ
0,8
µ
g/ml đến 80
µ
g/ml.
4.2.5. Độ thu hồi của phương pháp
Độ thu hồi được xác định bằng cách nạp chuẩn có nồng độ thích hợp vào ba loại mẫu. Chọn từ
các mẫu đậu tương, đậu phụ và sữa đậu nành mỗi loại một mẫu đã phân tích (đã biết hàm lượng
trung bình) để nạp chuẩn, tiến hành 3 lần song song. Dùng dung dịch chuẩn hỗn hợp daidzein
120
µ
g/ml và genistein 80
µ
g/ml để nạp vào mẫu. Phân tích các mẫu nạp chuẩn và tính toán hệ
số thu hồ
i, kết quả thu được thể hiện ở bảng 13 và 14. Sắc đồ mẫu sữa đậu nành không nạp
chuẩn và mẫu sữa nạp chuẩn được thể hiện ở hình 7 và 8.
Bảng 13. Kết quả khảo sát độ thu hồi đối với daidzein
Tên mẫu
HL daidzein
ban đầu (
µ
g/g)
Lượng chuẩn
nạp vào (
µ

g/g)
HL daidzein
tìm thấy (
µ
g/g)
Hệ số thu
hồi (%)
TB
338,9 240 591,4 103,7 103,7
338,9 240 623,2 113,1
Đậu tương: nạp 1 ml
chuẩn vào 0,5g mẫu
338,9 240 587,7 102,6
55,2 60 124,1 116,1 107,6
55,2 60 119,4 107,6
Đậu phụ: nạp 0,5 ml
chuẩn vào 1 g mẫu
55,2 60 116,3 102,0
11,2 12 25,1 117,0 111,6
11,2 12 24,5 111,6
Sữa đậu nành: nạp 0,1
ml chuẩn vào 1ml mẫu
11,2 12 24,2 108,9


Bảng 14. Kết quả khảo sát độ thu hồi đối với genistein
Tên mẫu
HL genistein
ban đầu (
µ

g/g)
Lượng chuẩn
nạp vào (
µ
g/g)
HL genisstein
tìm thấy (
µ
g/g)
Hệ số thu
hồi (%)
TB
238,4 160 423,6 110,6 110,6
238,4 160 430,0 113,3
Đậu tương: nạp 1 ml
chuẩn vào 0,5g mẫu
238,4 160 412,7 106,0
56,1 40 106,3 118,2 112,1
56,1 40 102,5 111,4
Đậu phụ: nạp 0,5 ml
chuẩn vào 1 g mẫu
56,1 40 102,9 112,1
9,7 8 18,4 107,2 107,2
9,7 8 18,1 104,1
Sữa đậu nành: nạp 0,1
ml chuẩn vào 1ml mẫu
9,7 8 19,3 116,5
Kết quả trên cho thấy độ thu hồi đối với daidzein trong đậu tương và sản phẩm là 103,7% đến
111,6%, còn đối với genistein là từ 107,2% đến 112,1%. Theo nghiên cứu của Jose và CS [16],
hệ số thu hồi cao hơn 100% có thể là do trong quá trình phân tích, một phần isoflavon ở dạng

glycosid đã bị chuyển sang dạng tự do (daidzein và genistein) trong môi trường acid yếu.


Hình 7. Sắc đồ mẫu sữa đậu nành chưa nạp chuẩn. Cột Luna C18 (2), tốc độ dòng 1ml/phút.
Gradient như
Bảng 11
. Detector PDA ở 260 nm.

Hình 8. Sắc đồ mẫu sữa đậu nành nạp chuẩn daidzein và genistein. Cột Luna C18 (2), tốc độ
dòng 1ml/phút. Gradient như
Bảng 11
. Detector PDA ở 260 nm.


4.3. Tng kt cỏc iu kin phõn tớch
4.3.1. iu kin phõn tớch acid amin
T cỏc kt qu kho sỏt thu c, ti a ra quy trỡnh v cỏc iu kin phõn tớch acid
amin nh sau:

-
Quy trỡnh chit xut thu phõn v phõn tớch theo quy trỡnh (mc 4.1.1).
Các thông số Các điều kiện đợc chọn
Cột tách
AccQ-Tag (150mm x 4,6mm x 3,9
à
m)
Nhiệt độ cột 37
O
C
Thể tích bơm mẫu

20
àl
Nhiệt độ buồng chứa mẫu 30
O
C
Detector
Huỳnh quang,

Ex
=250 nm;

Em
=395 nm

-
Chng trỡnh dung mụi:
Thi gian (phỳt) Tc dũng (ml/phỳt) m borat (%) Acetonitril (%) H
2
O (%)
0,5 1,0 99 1 0
18,0 1,0 95 5 0
19,0 1,0 91 9 0
29,5 1,0 83 17 0
33,0 1,0 0 60 40
36,0 1,0 100 0 0
65,0 1,0 0 60 40
100,0
1,0 0 60 40
4.3.2. iu kin phõn tớch daidzein v genistein
T cỏc kt qu kho sỏt thu c, ti a ra quy trỡnh v cỏc iu kin phõn tớch

daidzein v genistein nh sau:
-
Quy trỡnh chit xut isoflavon: theo quy trỡnh 3 (mc 4.2.2). Lng mu v dung mụi
chit nh sau:
Loi mu Lng cõn Acetonitril HCl 0,1M Nc ct
Bt u tng 1 g 10 ml 2 ml 5 ml
u ph 5 g 20 ml 5 ml 10 ml
Sa u nnh 20 ml 20 ml 5 ml 0 ml
- iu kin sc ký: Ct Luna (2) C18, 250 mm x 4.6 mm, c ht 5
à
m
Pha ng A: Acid acetic 0,1 %; pha ng B: Acetonitril 80% trong acid acetic 0,1%
Chng trỡnh dung mụi: bng 11 (mc 4.2.1)
Detector PDA bc súng 260 nm, nhit bung ct l 35
o
C.
4.4. Kết quả phân tích mẫu
4.4.1. Kết quả phân tích các acid amin
Bảng 15. Hàm lượng trung bình các acid amin trong mẫu hạt đậu tương.
Hàm lượng các acid amin (g/100g)
Tên mẫu

Asp Ser Glu Gly His Arg Thr Ala Pro Cys Tyr Val Met Lys Ile Leu Phe
Đậu mơ Hải Dương, chợ Mơ
2,59 1,44 6,01 1,91 1,80 3,63 1,87 1,63 2,01 0,15 1,82 1,55 0,82 0,83 1,48 2,57 3,45
Đậu Hưng Yên, chợ Mơ
2,51 1,40 5,82 1,85 1,74 3,52 1,81 1,58 1,95 0,15 1,76 1,50 0,79 0,80 1,43 2,49 3,35
Đậu Thường Tín, chợ Mơ
2,77 1,54 6,43 2,04 1,92 3,89 2,00 1,74 2,15 0,16 1,94 1,66 0,87 0,88 1,58 2,75 2,69
Đậu mơ Hà Bắc, chợ Mơ

2,84 1,58 6,58 2,09 1,97 3,98 2,05 1,78 2,20 0,16 1,99 1,70 0,89 0,91 1,62 2,82 2,78
Đậu tương, chợ Hàng Da
2,80 1,55 6,49 2,06 1,94 3,93 2,02 1,76 2,17 0,16 1,96 1,67 0,88 0,89 1,60 2,78 3,73
Đậu Hải Dương, chợ Thái Hà
2,39 1,55 6,21 1,69 1,88 2,62 1,78 1,39 1,76 0,19 1,85 1,51 0,71 1,02 1,47 2,47 2,86
Đậu mơ Hưng Yên, chợ Thái Hà
2,47 1,60 6,43 1,75 1,53 2,71 1,84 1,44 1,82 0,09 1,40 1,56 0,73 1,06 1,52 2,56 2,96
Đậu Hà Bắc, chợ Thái Hà
2,33 1,51 6,05 1,65 1,44 2,55 1,74 1,36 1,72 0,09 1,32 1,47 0,69 0,99 1,43 2,41 2,79
Đậu Đông Anh, chợ Lê Quý Đôn
2,35 1,82 6,57 1,67 1,33 3,26 2,46 1,38 2,05 0,11 2,12 1,63 0,59 1,63 1,57 2,59 2,65
Đậu Hưng Yên, chợ Lê Quý Đôn
2,88 1,23 6,05 2,05 1,63 3,99 3,01 1,69 1,51 0,13 2,60 2,00 0,72 0,95 1,92 2,17 2,25
Đậu tương, chợ Lê Quý Đôn
2,87 2,22 6,01 2,04 1,62 3,98 2,89 1,68 2,50 0,13 2,59 1,99 0,72 1,99 1,91 2,16 2,23
Đậu mơ Hà Bắc, chợ Hôm
2,74 2,12 7,65 1,94 1,55 3,80 2,86 1,61 2,39 0,13 2,47 1,90 0,69 1,90 1,83 2,02 2,09
Đậu tương, chợ Hôm (1)
3,10 1,54 6,59 2,20 2,03 4,21 2,03 1,93 2,26 0,19 1,89 1,77 0,90 0,97 1,65 2,94 2,76
Đậu tương chợ Hôm (2)
3,19 1,59 6,79 2,27 2,09 4,34 2,09 1,99 2,33 0,20 1,95 1,82 0,93 1,00 1,70 2,03 3,87
Đậu Bắc Ninh, chợ Ô chợ Dừa
2,12 2,16 6,03 1,83 1,78 3,77 2,01 1,07 1,63 0,10 2,74 1,44 0,71 0,73 1,34 2,31 3,51
Đậu tương, chợ Ngô Sĩ Liên (1)
2,86 2,92 6,14 2,47 2,40 4,09 2,71 1,44 2,20 0,14 2,70 1,94 0,96 0,99 1,81 2,12 2,74
Đậu tương, chợ Ngô Sĩ Liên (2)
2,22 2,26 6,30 1,91 1,86 3,94 2,10 1,12 1,70 0,10 2,86 1,50 0,74 0,76 1,40 2,41 3,07
Đậu tương (USA) [7]
4,59 2,12 7,01 1,68 0,98 2,83 1,59 1,71 2,13 0,59 1,38 1,82 0,49 2,43 1,77 2,97 1,90

Bảng 16. Hàm lượng trung bình các acid amin trong mẫu đậu phụ.
Hàm lượng các acid amin trong đậu phụ (g/100g)
Tên mẫu
Asp Ser Glu Gly His Arg Thr Ala Pro Cys Tyr Val Met Lys Ile Leu Phe
Đậu phụ chợ Hôm 1
0,46 0,37 1,44 0,31 0,37 1,32 0,59 0,27 0,35 0,07 0,51 0,27 0,12 0,24 0,28 0,50 0,67
Đậu phụ chợ Hôm 2
0,45 0,36 1,40 0,30 0,36 1,28 0,57 0,26 0,34 0,07 0,49 0,26 0,12 0,23 0,27 0,49 0,65
Đậu phụ chợ Thành Công 1
0,30 0,37 1,07 0,38 0,44 1,51 0,61 0,16 0,24 0,07 0,60 0,20 0,07 0,41 0,21 0,35 0,75
Đậu phụ chợ Thành Công 2
0,31 0,36 1,05 0,37 0,43 1,48 0,60 0,16 0,23 0,07 0,59 0,20 0,07 0,40 0,21 0,34 0,73
Đậu phụ chợ Thành Công 3
0,32 0,40 1,15 0,41 0,47 1,62 0,66 0,17 0,26 0,08 0,65 0,22 0,08 0,44 0,23 0,38 0,81
Đậu phụ chợ Thành Công 4
0,30 0,36 1,05 0,37 0,43 1,49 0,60 0,16 0,24 0,07 0,59 0,20 0,07 0,40 0,21 0,34 0,74
Đậu phụ chợ Trương Định 1
0,31 0,38 1,09 0,39 0,45 1,54 0,62 0,16 0,24 0,07 0,61 0,20 0,07 0,42 0,21 0,36 0,76
Đậu phụ chợ Trương Định 2
0,29 0,36 1,03 0,36 0,42 1,45 0,59 0,15 0,23 0,07 0,58 0,19 0,07 0,39 0,20 0,34 0,72
Đậu phụ chợ Trương Định 3
0,34 0,42 1,21 0,43 0,50 1,71 0,69 0,18 0,27 0,08 0,68 0,23 0,08 0,46 0,24 0,40 0,85
Đậu phụ chợ Mơ 1
0,66 0,48 2,13 0,34 0,46 1,53 0,69 0,32 0,41 0,05 0,54 0,33 0,10 0,38 0,35 0,60 0,82
Đậu phụ chợ Mơ 2
0,68 0,50 2,21 0,35 0,48 1,58 0,71 0,33 0,42 0,05 0,56 0,34 0,10 0,39 0,36 0,62 0,85
Đậu phụ Thái Hà 1
0,29 0,34 1,04 0,35 0,39 1,33 0,56 0,16 0,23 0,06 0,55 0,20 0,10 0,37 0,21 0,34 0,68

Đậu phụ Thái Hà 2
0,30 0,36 1,09 0,37 0,41 1,39 0,59 0,17 0,24 0,06 0,57 0,21 0,10 0,39 0,22 0,36 0,71
Đậu phụ Thái Hà 3
0,29 0,37 1,12 0,38 0,42 1,43 0,60 0,17 0,25 0,06 0,59 0,22 0,11 0,40 0,23 0,37 0,73
Đậu phụ Hàng Da 1
0,40 0,47 1,40 0,47 0,53 1,87 0,77 0,22 0,32 0,10 0,65 0,27 0,11 0,56 0,29 0,47 0,95
Đậu phụ Hàng Da 2
0,37 0,44 1,31 0,44 0,50 1,75 0,72 0,21 0,30 0,09 0,61 0,25 0,10 0,52 0,27 0,44 0,89
Đậu phụ Hàng Da 3
0,38 0,45 1,33 0,45 0,50 1,78 0,73 0,21 0,30 0,10 0,62 0,26 0,10 0,53 0,28 0,45 0,99
Đậu Phu (USA) [7]
1,74 0,74 2,72 0,62 0,46 1,05 0,64 0,65 0,85 0,22 0,53 0,79 0,20 1,03 0,78 1,12 0,76



Bảng 17. Hàm lượng trung bình các acid amin trong mẫu sữa đậu nành
Hàm lượng các acid amin trong sữa đậu nành (mg/l)
Tên mẫu
Asp Ser Glu Gly His Arg Thr Ala Pro Cys Tyr Val Met Lys Ile Leu Phe
Sữa đậu nành Văn Chương 1
0,43 0,51 1,23 0,54 0,53 1,92 0,70 0,29 0,41 0,05 1,03 0,33 0,22 0,68 0,32 0,57 1,17
Sữa đậu nành Văn Chương 2
0,42 0,49 1,19 0,52 0,51 1,86 0,68 0,28 0,40 0,05 1,00 0,32 0,21 0,66 0,31 0,55 1,13
Sữa đậu nành Văn Chương 3
0,39 0,46 1,11 0,49 0,48 1,73 0,63 0,26 0,37 0,05 0,93 0,30 0,20 0,61 0,29 0,51 1,05
Sữa đậu nành Nguyễn Cao 1
0,52 0,64 1,57 0,66 0,69 2,00 0,77 0,28 0,46 0,08 1,21 0,34 0,26 0,85 0,35 0,62 1,39
Sữa đậu nành Nguyễn Cao 2
0,42 0,49 1,19 0,52 0,51 1,86 0,68 0,28 0,40 0,05 1,00 0,32 0,21 0,66 0,31 0,55 1,13
Sữa đậu nành Nguyễn Cao 3

0,46 0,55 1,33 0,58 0,57 2,07 0,76 0,31 0,44 0,05 1,11 0,36 0,24 0,73 0,35 0,62 1,26
Sữa đậu nành Ngã Tư Sở 1
0,51 0,63 1,56 0,65 0,67 1,95 0,75 0,28 0,45 0,07 1,18 0,33 0,25 0,83 0,34 0,60 1,36
Sữa đậu nành Ngã Tư Sở 2
0,50 0,61 1,52 0,63 0,65 1,90 0,73 0,27 0,44 0,07 1,15 0,32 0,24 0,81 0,33 0,59 1,33
Sữa đậu nành Chợ Mơ 1
1,11 0,98 3,01 0,79 0,84 2,15 0,93 0,58 0,81 0,05 1,41 0,61 0,35 0,73 0,60 1,13 1,65
Sữa đậu nành Chợ Mơ 2
1,05 0,93 2,86 0,75 0,80 2,04 0,88 0,55 0,77 0,05 1,34 0,58 0,33 0,69 0,57 1,07 1,57
Sữa đậu nành chợ Mơ 3
1,09 0,96 2,96 0,78 0,83 2,12 0,91 0,57 0,80 0,05 1,39 0,60 0,34 0,72 0,59 1,11 1,62
Sữa đậu nành đóng chai 1
0,97 0,85 2,62 0,69 0,73 1,87 0,81 0,50 0,70 0,04 1,23 0,53 0,30 0,64 0,52 0,98 1,44
Sữa đậu nành Trương Định 1
1,01 0,89 2,74 0,72 0,76 1,95 0,85 0,53 0,74 0,05 1,28 0,55 0,32 0,66 0,55 1,03 1,50
Sữa đậu nành Trương Định 2
0,98 0,92 2,82 0,74 0,79 2,01 0,87 0,54 0,76 0,05 1,32 0,57 0,33 0,68 0,56 1,06 1,55
Sữa đậu nành Hàng Da 1
0,53 0,66 1,64 0,68 0,70 2,04 0,79 0,29 0,47 0,07 1,24 0,35 0,26 0,87 0,36 0,63 1,43
Sữa đậu nành Hàng Da 2
0,49 0,60 1,50 0,62 0,64 1,87 0,72 0,27 0,43 0,07 1,13 0,32 0,24 0,80 0,33 0,58 1,30
Sữa đậu nành Thái Hà 1
0,51 0,64 1,57 0,64 0,66 1,92 0,75 0,29 0,46 0,07 1,12 0,34 0,26 0,77 0,35 0,62 1,31
Sữa đậu nành Thái Hà 2
0,59 0,74 1,81 0,74 0,76 2,21 0,86 0,33 0,53 0,08 1,29 0,39 0,30 0,89 0,40 0,71 1,51
Sữa đậu nành (USA)[7]
(g/100g)
0,38 0,18 0,64 0,64 0,08 0,25 0,14 0,14 0,19 0,00 0,11 0,15 0,04 0,17 0,15 0,24 0,15

Kt qu ti Bng 15 cho thy, trong thnh phn ca ht u tng cú cỏc acid amin cn thit cho c th. Trong 7 ch c tin hnh
thu thp mu, phõn tớch v ly giỏ tr trung bỡnh cho thy tng hm lng 18 acid amin nm trong khong 33 40%. Trong ú ngoi acid
glutamic cú t l cao nht mt s acid amin khụng thay th cng cú hm lng khỏ cao nh phenylalanin, leucin, isoleucin, threonin, valin v
lysin. Kt qu hm lng tng 17 acid amin trong ht u tng theo Bng thnh phn ca USA l 37,99%.
Kt qu ti Bng 16 cho thy, trong thnh phn ca u ph cú cỏc acid amin cn thit cho c th. Trong 6 ch c tin hnh thu
thp mu, phõn tớch v ly giỏ tr trung bỡnh cho thy tng hm lng 18 acid amin nm trong khong 7 10%. Trong ú ngoi acid glutamic
cú t l cao nht mt s acid amin khụng thay th cng cú hm lng khỏ cao nh phenylalanin, leucin, isoleucin, tyrosin v lysin. c bit
u ph mua ch m (u m) cho thy cú hm lng tng acid amin l cao nht so vi u cỏc ch khỏc 10,6%. Kt qu hm lng tng
17 acid amin trong u ph theo Bng thnh phn ca USA l 14,9%.
Kt qu ti Bng 17 cho thy, trong thnh sa u nnh cú cỏc acid amin cn thit cho c th. Trong 8 ch c tin hnh thu thp
mu, phõn tớch v ly giỏ tr trung bỡnh cho thy tng hm lng 18 acid amin nm trong khong 11 18mg/lit. Trong ú ngoi acid glutamic
cú t l cao nht mt s acid amin khụng thay th cng cú hm lng khỏ cao nh arginin, phenylalanin, leucin, tyrosin, threonin v lysin.
Kt qu hm lng tng 17 acid amin trong sa u nnh theo Bng thnh phn ca USA l 3,65%. Cú s khỏc bit ln v nng tng 17
acid amin so vi bng thnh phn ca M cú th l do s khỏc nhau v m c ca loi sa u nnh do quy trỡnh sn xut khỏc nhau.



Hình 9. Sắc đồ các acid amin trong hạt đậu tơng. Ct AccQ-Tag (150mm x 4,6mm x 3,9àm). Tc dũng 1ml/phỳt, nhit ct 35
o
C,
chng trỡnh dung mụi nh mc 4.3.1. Detector hunh quang,
Ex
=250 nm;
Em
=395 nm