(Đồ án HCMUTE) đánh giá khả năng ngăn ngừa đái tháo đường loại 2, mỡ máu và thừa cân béo phì của cao chiết 99 5% ethanol từ thân cây cà phê bằng thử nghiệm in vivo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
NGÀNH CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG NGĂN NGỪA
ĐÁI THÁO ĐƯỜNG LOẠI 2, MỠ MÁU VÀ THỪA CÂN
BÉO PHÌ CỦA CAO CHIẾT 99,5% ETHANOL
TỪ THÂN CÂY CÀ PHÊ BẰNG THỬ NGHIỆM IN VIVO

GVHD: PGS.TS. TRỊNH KHÁNH SƠN
TS. VÕ THỊ NGÀ
SVTH: PHẠM THU UYÊN
LÂM THẢO VY

SKL009149

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 8/2022

i


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC VÀ THỰC PHẨM
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
MÃ SỐ: 2022-18116143

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG NGĂN NGỪA
ĐÁI THÁO ĐƯỜNG LOẠI 2, MỠ MÁU VÀ
THỪA CÂN BÉO PHÌ CỦA CAO CHIẾT
99,5% ETHANOL TỪ THÂN CÂY CÀ PHÊ
BẰNG THỬ NGHIỆM IN VIVO
GVHD: PGS. TS. TRỊNH KHÁNH SƠN
TS. VÕ THỊ NGÀ
SVTH: PHẠM THU UYÊN
LÂM THẢO VY

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 08/2022

i

18116143
18116147


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC VÀ THỰC PHẨM
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
MÃ SỐ: 2022-18116143

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG NGĂN NGỪA
ĐÁI THÁO ĐƯỜNG LOẠI 2, MỠ MÁU VÀ
THỪA CÂN BÉO PHÌ CỦA CAO CHIẾT
99,5% ETHANOL TỪ THÂN CÂY CÀ PHÊ
BẰNG THỬ NGHIỆM IN VIVO

GVHD: PGS. TS. TRỊNH KHÁNH SƠN
TS. VÕ THỊ NGÀ
SVTH: PHẠM THU UYÊN
LÂM THẢO VY

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 08/2022

i

18116143
18116147


i


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên nhóm chúng tơi xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa công
nghệ Hóa Học và Thực Phẩm và Khoa Đào Tạo Chất Lượng Cao đã hướng dẫn, giảng dạy
và truyền đạt các kiến thức, kỹ năng, cũng như tạo điều kiện thuận lợi nhất để chúng tơi có
thể hồn thành Khóa luận tốt nghiệp này. Đồng thời, chúng tôi xin gửi lời cảm ơn chân
thành nhất vì sự tận tình giúp đỡ và chỉ bảo đến hai giảng viên là thầy PGS. TS. Trịnh
Khánh Sơn và cô TS. Võ Thị Ngà. Chúng tơi xin cảm ơn thầy cơ vì đã ln đồng hành
cùng nhóm suốt khóa luận này. Thầy cơ khơng chỉ mang đến cho chúng tơi những kiến
thức bổ ích mà bên cạnh đó, sự nhiệt tình giúp đỡ nhóm giải quyết thắc mắc hay những
góp ý, đánh giá và nhận xét q giá đó từ thầy cơ để nhóm có thể hồn thành khóa luận
đúng hạn và một cách tốt nhất. Tuy nhiên, trong q trình thực hiện khóa luận, khơng thể
tránh khỏi những thiếu sót về mặt kiến thức chun mơn cịn nhiều hạn chế. Do đó, nhóm
chúng tơi rất mong nhận được những đánh giá, nhận xét cũng như góp ý để nhóm có thể
hồn thiện khóa luận chỉnh chu và đầy đủ tốt hơn. Chúng tôi xin chân thành cảm ơn!

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 09 tháng 08 năm 2022

ii

i


LỜI CAM ĐOAN
Chúng tơi xin cam đoan tồn bộ nội dung được trình bày trong khóa luận tốt nghiệp
này được chúng tôi, gồm giáo viên hướng dẫn và sinh viên, thực hiện. Các nội dung nghiên
cứu được thực hiện dựa trên các yêu cầu, thiết kế, hướng dẫn và được xác nhận kết quả bởi
giáo viên hướng dẫn. Toàn bộ nội dung của khóa luận tốt nghiệp đã được kiểm tra chống
đạo văn bằng phần mềm Turnitin và đảm bảo sự trùng lặp không quá 30%. Chúng tôi xin
cam đoan các nội dung được tham khảo trong bài khóa luận tốt nghiệp đã được trích dẫn
chính và xác đầy đủ theo qui định.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2022
Ký tên

iii

i


i


i


i

i


i


i


i


i


i


i


i


MỤC LỤC
NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ..................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................................................ii
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................................iii

DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................................ vii
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................................... viii
TÓM TẮT KHÓA LUẬN ................................................................................................................ x
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1.1.

Tính cấp thiết và lý do hình thành đề tài .................................................................................1

1.2.

Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................................... 1

1.3.

Nội dung nghiên cứu ...............................................................................................................2

1.4.

Đối tượng, phạm vi và giới hạn của đề tài .............................................................................. 2

1.5.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ................................................................................................ 2

1.6.

Bố cục của báo cáo ..................................................................................................................2

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN .............................................................................................................4
2.1.

Tổng quan về cây cà phê .........................................................................................................4

2.1.1.

Giới thiệu chung ..................................................................................................................4

2.1.2.

Đặc điểm thân cây cà phê ................................................................................................... 4

2.1.3.

Thành phần hóa học của thân cây cà phê ............................................................................5

2.2.

Các phương pháp chiết xuất thu nhận cao chiết ..................................................................... 6

2.2.1.

Phương pháp ngâm dầm kết hợp đun hồi lưu ..................................................................... 6

2.2.2.

Phương pháp Soxhlet .......................................................................................................... 7

2.2.3.

Phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn ...................................................................... 8

2.2.4.

Phương pháp sử dụng dung mơi hữu cơ có hỗ trợ vi sóng ................................................. 9

2.2.5.

Các phương pháp trích ly khác ........................................................................................... 9

2.3.

Các quá trình chuyển hố các hợp chất dinh dưỡng ............................................................... 9

2.3.1.

Q trình chuyển hóa carbohydrate .................................................................................... 9

2.3.2.

Q trình chuyển hố lipid ................................................................................................12

2.3.3.

Q trình chuyển hố protein ............................................................................................15

2.4.

Khả năng ức chế enzyme α–glucosidase .............................................................................. 16

iv

i


2.5.

Thử nghiệm in vivo trên động vật thí nghiệm ...................................................................... 17

2.5.1.

Nguồn gốc giống chuột ..................................................................................................... 17

2.5.2.

Lợi ích và hạn chế khi sử dụng động vật thí nghiệm ........................................................ 18

2.5.3.

Điều kiện ni chuột thí nghiệm .......................................................................................19

2.5.4.

Quy định đạo đức trong thử nghiệm trên động vật ........................................................... 21

2.5.5.

Các mơ hình gây bệnh thừa cân béo phì, đái tháo đường loại 2 ở chuột thí nghiệm ........22

2.5.5.1.

Mơ hình gây bệnh tự phát do di truyền .........................................................................23

2.5.5.2.

Mơ hình gây bệnh do chế độ ăn giàu béo hoặc giàu đường ..........................................23

2.5.5.3.

Mơ hình gây bệnh sử dụng streptozotocin .................................................................... 24

2.5.5.4.

Mơ hình gây bệnh kết hợp chế độ ăn giàu béo và tiêm streptozotocin .........................26

2.6.

Các nghiên cứu liên quan ......................................................................................................26

2.6.1.

Nghiên cứu trong nước ..................................................................................................... 26

2.6.2.

Nghiên cứu ngoài nước ..................................................................................................... 27

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...........................................................................28
3.1.

Vật liệu ..................................................................................................................................28

3.1.1.

Thân cây cà phê Robusta .................................................................................................. 28

3.1.2.

Streptozotocin ................................................................................................................... 28

3.1.3.

Khẩu phần thức ăn ............................................................................................................ 28

3.1.4.

Động vật thí nghiệm ..........................................................................................................30

3.2.

Phương pháp định tính các thành phần hóa học của thân cây cà phê ................................... 30

3.2.1.

Dụng cụ và hóa chất ..........................................................................................................30

3.2.2.

Phương thức thực hiện ...................................................................................................... 31

3.2.2.1.

Chuẩn bị dịch chiết ....................................................................................................... 31

3.2.2.2.

Xác định hợp chất trong các dịch chiết Ether ............................................................... 33

3.2.2.3.

Xác định hợp chất trong dịch chiết Ethanol ..................................................................35

3.2.2.4.

Xác định hợp chất trong dịch chiết Ethanol thủy phân .................................................37

3.2.2.5.

Xác định hợp chất trong dịch chiết nước ...................................................................... 37

3.2.2.6.

Xác định hợp chất trong dịch chiết nước thủy phân ..................................................... 39

3.3.

Phương pháp thu nhận cao chiết ........................................................................................... 39

3.4. Phương pháp thử nghiệm in vitro hoạt tính ức chế enzyme α–glucosidase của cao chiết từ
thân cây cà phê và acarbose .............................................................................................................. 40

v

i


3.5.

Thiết kế thí nghiệm in vivo ................................................................................................... 41

3.5.1.

Tính cỡ mẫu thí nghiệm .................................................................................................... 41

3.5.2.

Quy trình thử nghiệm trên chuột .......................................................................................42

3.6.

Các phương pháp thực hiện trên động vật ............................................................................ 45

3.6.1.

Tính tốn thể trọng và lượng thức ăn tiêu thụ ...................................................................45

3.6.2.

Phương pháp cho chuột sử dụng cao chiết và acarbose qua đường miệng .......................45

3.6.3.

Phương pháp đo đường huyết khi đói và khả năng dung nạp glucose ..............................46

3.6.4.

Phương pháp đánh giá khả năng vận động và hành vi (locomotion) ................................47

3.6.5.

Phương pháp giải phẫu và lấy máu tim .............................................................................47

3.6.6.

Phương pháp đo khối lượng nội tạng và làm tiêu bản mô nội tạng .................................. 48

3.7.

Phương pháp xử lý thống kê ................................................................................................. 48

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................................................................... 49
4.1.

Thành phần hóa học thân cây cà phê .................................................................................... 49

4.2.

Đánh giá hoạt tính ức chế α-glucosidase của các mẫu cao chiết .......................................... 51

4.3.

Đánh giá tác dụng của phân đoạn cao đặc trong q trình thí nghiệm ................................. 52

4.3.1.

Thể trọng và năng lượng tiêu thụ của các nhóm chuột trong q trình thí nghiệm .......... 52

4.3.2.
Đường huyết khi đói và khả năng dung nạp glucose qua đường miệng (OGTT) trong q
trình thí nghiệm .................................................................................................................................54
4.3.3.

Chỉ số lipid máu ................................................................................................................ 58

4.3.4.

Khối lượng và hình thái giải phẫu mơ gan, thận, mỡ ........................................................60

4.3.5.

Đánh giá hành vi hoạt động của các nhóm chuột thí nghiệm ........................................... 66

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .....................................................................................71
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................................. 72
PHỤ LỤC .........................................................................................................................................89

vi

i

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Cà phê Robusta ....................................................................................................... 5
Hình 2.2 Thiết bị chiết Soxhlet thương mại .......................................................................... 7
Hình 2.3 Thiết bị chiết Soxhlet trong phịng thí nghiệm ....................................................... 8
Hình 2.4 Q trình tiêu hóa và hấp thụ lipid (Mann & Truswell, 2002) ............................. 13
Hình 2.5 Quá trình vận chuyển lipid và chuyển hóa lipoprotein (Mann & Truswell, 2002)
............................................................................................................................................. 14
Hình 2.6 Cấu tạo Acarbose .................................................................................................. 17
Hình 2.7 Chuột nhắt nhà được sử dụng trong phịng thí nghiệm ........................................ 18
Hình 2.8 Streptozotocin ....................................................................................................... 25
Hình 3.1 Thân cây cà phê Robusta ...................................................................................... 28
Hình 3.2 Sơ đồ chế biến thức ăn giàu béo ........................................................................... 30
Hình 3.3 Sơ đồ chuẩn bị các dịch chiết ............................................................................... 32
Hình 3.4 Sơ đồ phân tích các hợp chất trong dịch chiết Ether ............................................ 34
Hình 3.5 Sơ đồ phân tích các hợp chất trong dịch chiết Ethanol .........................................36
Hình 3.6 Sơ đồ phân tích các hợp chất trong dịch chiết Ethanol thủy phân ........................37
Hình 3.7 Sơ đồ phân tích các hợp chất trong dịch chiết nước ............................................. 38
Hình 3.8 Sơ đồ phân tích các hợp chất trong dịch nước thủy phân .....................................39
Hình 3.9 Quy trình điều chế cao chiết Ethanol của thân cây cà phê ................................... 40
Hình 3.10 Sơ đồ quy trình thử nghiệm in vivo .................................................................... 43
Hình 4.1 Thể trọng (BW, body weight, g) (A) và năng lượng tiêu thụ (CI, caloric intake,
kcal/cá thể/ngày) (B) của các nhóm thí nghiệm .................................................................. 52
Hình 4.2 Đồ thị đường huyết khi đói (fasting glucose, mg/dl) của các nhóm thí nghiệm ...54
Hình 4.3 Đồ thị khả năng dung nạp glucose khi đói qua đường miệng (mg/dl) của các
nhóm thí nghiệm .................................................................................................................. 56
Hình 4.4 Diện tích phần dưới đường cong đường huyết (Area Under the Curve (AUC),
đvdt) của các nhóm thí nghiệm ............................................................................................57
Hình 4.5 Vi phẫu mơ mỡ của các nhóm chuột thử nghiệm ................................................. 61
Hình 4.6 Vi phẫu mơ gan của các nhóm chuột thí nghiệm ..................................................63
Hình 4.7 Vi phẫu mơ thận của các nhóm chuột thử nghiệm ............................................... 64

Hình 4.8 Vi phẫu mơ cầu thận của các nhóm chuột thử nghiệm .........................................65
Hình 4.9 Qng đường đi được (m) của các nhóm chuột thí nghiệm trước và sau khi ăn của
các tuần 0, 2, 4, 7, 10 và 12 ................................................................................................. 67
Hình 4.10 Quá trình di chuyển của các nhóm thí nghiệm trước và sau khi ăn của các tuần 0,
2, 4, 7, 10 và 12 ....................................................................................................................69

vii

i


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1 Hàm lượng thành phần dinh dưỡng và giá trị dinh dưỡng trong 100 g thức ăn của
khẩu phần ăn tiêu chuẩn và khẩu phần ăn giàu béo .............................................................29
Bảng 4.1 Kết quả đánh giá định tính các hợp chất trong mẫu dịch chiết Ether ...................49
Bảng 4.2 Kết quả đánh giá định tính các hợp chất trong mẫu dịch chiết Ethanol ...............49
Bảng 4.3 Kết quả đánh giá định tính các hợp chất trong mẫu dịch chiết Ethanol thủy phân
............................................................................................................................................. 49
Bảng 4.4 Kết quả đánh giá định tính các hợp chất trong mẫu dịch chiết Nước .................. 49
Bảng 4.5 Kết quả đánh giá định tính các hợp chất trong mẫu dịch chiết Nước thủy phân . 50
Bảng 4.6 Hoạt tính ức chế α–glucosidase của các mẫu cao chiết và acarbose ....................51
Bảng 4.7 Kết quả chỉ số lipid máu (cuối tuần 12) của các nhóm chuột thí nghiệm ............ 58
Bảng 4.8 Khối lượng nội tạng của các nhóm chuột thí nghiệm .......................................... 60

viii

i


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt
AUC
BW

DG
ESE

HDL-C/HDL
HFD
HFA
HFE-50
HFE-100
HFE-200
LDL-C/LDL
MG
ND
STZ
TC
TG
VLDL
WHO

Tiếng Việt
Diện tích phần dưới đường cong
đường huyết
Thể trọng
Diglyceride
Chiết xuất dung môi nâng cao
Lipoprotein tỉ trọng cao

Tiếng Anh
Area Under the Curve

Body Weight
Diglyceride
Enhanced Solvent Extraction
High Density Lipoprotein
Cholesterol
Nhóm TN sử dụng khẩu phần ăn giàu High Fat Diet
béo
Nhóm TN ăn chế độ giàu béo + uống High Fat Diet + Acarbose
Acarbose 100mg/kg thể trọng/ngày
(100mg/kg/ngày)
Nhóm TN ăn chế độ giàu béo + sử
High Fat Diet + Ethanol
dụng cao ethanol 50mg/kg thể
(50mg/kg/day)
trọng/ngày
Nhóm TN ăn chế độ giàu béo + sử
High Fat Diet + Ethanol
dụng cao ethanol 100mg/kg thể
(100mg/kg/day)
trọng/ngày
Nhóm TN ăn chế độ giàu béo + sử
High Fat Diet + Ethanol
dụng cao ethanol 200mg/kg thể
(200mg/kg/day)
trọng/ngày
Lipoprotein tỉ trọng thấp
Low Density Lipoprotein

Cholesterol
Monoglyceride
Monoglyceride
Nhóm thí nghiệm sử dụng thức ăn Normal Diet
thương mại
Streptozotocin
Streptozotocin
Cholesterol toàn phần
Total Cholesterol
Triglyceride
Triglyceride
Cholesterol tỉ trọng rất thấp
Very Low Density
Lipoprotein Cholesterol
Tổ chức Y tế Thế giới
World Health Organization

ix

i


TĨM TẮT KHĨA LUẬN
Trong nghiên cứu này, các chất có hoạt tính sinh học có trong thân cây Cà phê
Robusta (Coffea canephora Pierre ex A. Froehner) được trích ly bằng ethanol thành cao
chiết. Sau đó, hoạt tính sinh học của cao chiết được đánh giá bằng các thử nghiệm in vitro
và in vivo. Đối với thử nghiệm in vitro, cao chiết Ethanol được xác định có hoạt tính ức
chế α-glucosidase và có kết quả khả năng kháng α-glucosidase của cao chiết từ thân cây Cà
phê cao hơn so với acarbose (một loại thuốc điều trị đái tháo đường loại 2) khoảng 4 lần.
Từ đây, nhóm quyết định thử nghiệm in vivo với các nhóm chuột nhắt trắng (Mus

Musculus var albino) được dùng để đánh giá ảnh hưởng của các liều cao chiết dạng lỏng
khác nhau (50, 100, 200mg/kg thể trọng/ ngày) và so sánh với acarbose. Kết quả cho thấy
sau 3 tháng thử nghiệm, thể trọng trung bình của các nhóm chuột sẽ giảm dần theo các liều
cao chiết cao dần từ liều 50mg/kg đến 200mg/kg thể trọng. Các kết quả sau khi thử nghiệm
cho thấy cao chiết mà có khả năng ức chế hoạt động của enzyme α – glucosidase, tác động
tích cực, giảm đáng kể tình trạng thừa cân béo phì, đái tháo đường loại 2 thơng qua các kết
quả về khả năng dung nạp glucose, chỉ số lipid máu, thể trọng chuột, mô bệnh học (gan,
thận, mỡ trắng) và cả hành vi vận động khi so sánh với acarbose.

x

i


CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết và lý do hình thành đề tài
Thừa cân béo phì và đái tháo đường loại 2, là vấn đề nghiêm trọng liên quan sức
khỏe, đang gia tăng trên toàn thế giới. Theo một số ước tính gần đây của Tổ chức Y tế Thế
giới – WHO (2016), hơn 1,9 tỷ người lớn từ 18 tuổi trở lên bị thừa cân. Ngoài ra, ước tính
có khoảng 462 triệu người bị ảnh hưởng bởi bệnh đái tháo đường loại 2, tương ứng với
6,28% dân số thế giới (Khan, et al., 2020) . Đa số những người mắc bệnh đái tháo đường
đều thuộc đái tháo đường loại 2, đây là hệ quả của thừa cân béo phì và ít vận động. Sự gia
tăng của căn bệnh đái tháo đường loại 2 là một mối quan tâm lớn về sức khỏe trên toàn thế
giới. Mặc dù, nhiều nghiên cứu đã giới thiệu một số chất có thể ức chế hoạt động của αglucosidase trong nghiên cứu lâm sàng nhưng hiệu quả của chúng vẫn còn hạn chế và cịn
nhiều tác dụng phụ. Vì vậy, việc phát triển các loại thuốc mới hiệu quả cao và an toàn có
nguồn gốc từ thực vật đang là hướng nghiên cứu để phát triển các chất ức chế α –
glucosidase hữu dụng hơn (Nga, Hao, Tuyet, Tuyen, & Son, 2021). Trước đây đã có rất
nhiều cơng bố trong và ngồi nước về các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ
các loại thực vật với khả năng hạn chế thừa cân béo phì. Riêng đối với thân cây Cà phê
(Coffea canephora Pierre ex A. Froehner), một số công bố đã xác nhận có sự hiện diện của

các hợp chất được đánh giá là có hoạt tính ức chế α–glucosidase, thậm chí có hoạt lực
mạnh hơn so với acarbose. Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có cơng bố nào liên quan đến
việc thử nghiệm in vivo nhằm đánh giá hiệu quả ngăn ngừa/điều trị bệnh đái tháo đường
của thân cây Cà phê. Vì vậy, để bổ sung cho sự thiếu hụt này, chúng tơi đã sử dụng mơ
hình động vật với chế độ ăn giàu béo đồng thời với việc tiêm streptozotocin trong thử
nghiệm in vivo để thực hiện đề tài ‘Đánh giá khả năng ngăn ngừa đái tháo đường loại 2,
mỡ máu và thừa cân béo phì của cao chiết 99,5% ethanol từ thân cây cà phê bằng thử
nghiệm in vivo’
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá khả năng ngăn ngừa bệnh ngăn ngừa đái tháo đường loại 2, mỡ máu và
thừa cân béo phì của cao chiết 99,5% ethanol từ thân cây Cà phê (Coffea canephora Pierre
ex A. Froehner), cũng như đánh giá tình trạng sinh lý, hành vi và khả năng hoạt động của
động vật thí nghiệm sử dụng chế độ ăn giàu béo và Strepzotocin liều thấp.

1

i