BÁO cáo THỰC HÀNH VI SINH vật bài 2 PHÂN lập VI SINH vật bài 3 NUÔI cấy, QUAN sát sự PHÁT TRIỂN của VI SINH vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN LANG

KHOA CÔNG NGHỆ ỨNG DỤNG

BÁO CÁO THỰC HÀNH VI SINH VẬT

Lớp: K27CNTM01
Nhóm 1 – Tổ 1
Sinh viên thực hiện:
Nguyễn Phương Thi - 2174202070046
Nguyễn Ngọc Phương Lê 2174202070031 Lê Thị Minh Ngọc 2174202070005 GVHD: VÕ THỊ XUYẾN

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2023


MỤC LỤC
BÀI 1: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ - PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH
VẬT………………………………………………………………………………………. 1
BÀI 2: PHÂN LẬP VI SINH VẬT....................................................................................................... 11
BÀI 3: NUÔI CẤY, QUAN SÁT SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT……………20
BÀI 4: ĐẾM SỐ LƯỢNG TẾ BÀO VI SINH VẬT…………………………………….31
BÀI 5: QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI……..............37

2


BÀI 1: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ - PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG
NI CẤY VI SINH VẬT
I. MỤC ĐÍCH
Pha chế mơi trường nhằm thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống VSV,

đồng thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng. Môi trường
cần phải đủ lượng và đủ chất mới đảm bảo được sự phát triển của vi sinh vật.
Biết cách bao gói, làm nút bơng, khử trùng dụng cụ, biết các bước thực hiện
pha chế và khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
II.

Chuẩn bị dụng cụ
1.Bao gói dụng cụ
1.1 Mục đích

Việc đóng gói dụng cụ có tác dụng như một hàng rào đối với vi sinh vật hay
chất khác (ví dụ, bụi, động vật kí sinh) sau khi q trình khử khuẩn hồn tất, có độ
bền với nhiệt, đủ độ mềm để cho phép gói kín, bọc lại và mở ra; khơng chứa thành
phần gây độc hay thuốc nhuộm; đảm bảo giữ được tình trạng vơ trùng của các dụng
cụ được khử khuẩn và duy trì được tình trạng ngun vẹn của gói đồ. Thời hạn bảo
quản dụng cụ phụ thuộc vào loại giấy gói sử dụng.
1.2 Nguyên tắc
Dụng cụ được bao gói để nuôi cấy vi sinh vật phải đạt độ trung tính, phải thật
sạch và khơ, khơng bị nứt nẻ
Việc bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng vẫn đảm
bảo vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng.
1.3 Phương pháp bao gói dụng cụ
Việc bao gói dụng cụ gồm hai khâu:
- Làm nút bơng: đối với ống nghiệm, bình tam giác, pipet…
- Bao gói: cho hầu hết các dụng cụ thủy tinh
1.4 Cách làm nút bơng
Dùng một miếng gịn không thấm nước cuộn lại, nhét vào miệng ống nghiệm
sao cho vừa đủ chặt
u cầu:
- Nút gịn có kích thước và độ chặt vừa phải

1


- Đầu nút phải trịn, gọn, phần ngồi lớn hơn phần trong ống nghiệm
- Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng.
Cách làm nút gòn này cũng được áp dụng cho các chai lọ, bình cầu, bình tam
giác… cách làm cũng tương tự như đối với ống nghiệm. Nhưng lượng gịn sử dụng
phải nhiều hơn và có thể được bọc bằng một lớp vải gạc.
1.5 Cách bao gói dụng cụ
Với các dụng cụ sau khi làm nút bông, cần được bao gói phần có nút bơng
bằng giấy dầu hay giấy báo để sau khi hấp khử trùng nút bông không bị ướt và đảm
bảo vô trùng tốt hơn. Cách làm như sau:
- Cắt các mảnh giấy hình chữ nhật với kích thước tùy theo dụng cụ cần bao
gói.
- Quấn giấy quanh phần đầu của nút bông.
- Gập ống giấy sát vào nút bông ở mặt trước và hai bên.
- Gập nốt phần giấy còn lại và cài sâu vào bên trong.
u cầu:
+ Phần giấy bao ngồi phải chặt và kín. +
Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt.
+ Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng
Với các dụng cụ như pipet, đĩa petri, que gạt phải dùng giấy bao kín tồn bộ.
Có thể thay giấy báo bằng 1 hộp nhơm kín đựng tất cả các dụng cụ trên để khử trùng.

Hình 1: làm nút bơng và bao gói dụng cụ
2.Phương pháp khử trùng
2. 1 Mục đích
2

Làm chết hoàn toàn mọi mầm mống vi sinh vật, kể cả các vi sinh vật có bào tử.
Đây là khâu quan trọng nhất. Khi nghiên cứu vi sinh vật, cần thiết phải khử trùng môi
trường, dụng cụ, thiết bị để tránh sự phát triển lẫn lộn các hệ vi sinh vật ngoại lai vào
giống vi sinh vật đang nghiên cứu.
2.2 Các phương pháp khử trùng
Có thể khử trùng bằng một số tác nhân lý hóa như nhiệt độ, bức xạ, lọc và hóa
chất. Tác nhân khử trùng được chọn tùy mục đích và vật liệu cần khử trùng. - Các
dụng cụ thủy tinh bền với nhiệt nên thường được khử trùng bằng phương pháp nhiệt
khô trong tủ sấy. Các thanh gạt thủy tinh được khử trùng bằng cách đốt với cồn 70 0C
và các que cấy kim loại được khử trùng bằng cách đốt trực tiếp trên ngọn lửa.
Trường hợp cần khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật, phương pháp
nhiệt ẩm bằng nồi hấp áp lực (autoclave, 1atm, 121 0C) thường được sử dụng để các
thành
phần hữu cơ của mơi trường khơng bị cháy, biến tính và môi trường không bị mất
nước
Trường hợp môi trường chứa các chất phân tử lượng nhỏ không bền với nhiệt
như vitamin, amino acid, hoặc huyết thanh chứa các protein là nhân tố tăng trưởng,
phương pháp nhiệt ẩm có thể làm biến tính các thành phần này nên thường được khử
trùng riêng bằng phương pháp lọc qua màng.
2.1 Khử trùng dụng cụ, môi trường bằng nồi hấp áp lực
Phương pháp này thực hiện trong nồi hấp vô trùng ở áp suất cao. Là thiết bị
làm bằng kim loại, chịu được nhiệt độ và áp suất cao, có khả năng tự động điều chỉnh
áp suất và thời gian khử trùng theo yêu cầu của người sử dụng.
- Nguyên tắc hoạt động
Làm gia tăng nhiệt độ bằng hơi nước bão hòa dưới một áp suất lớn hơn áp suất
bình thường của khí quyển. Khi áp suất hơi nước tăng lên thì nhiệt độ cũng tăng theo
nhờ hệ thống van rất chặt chẽ.
Mối quan hệ giữa áp suất ghi trên áp kế với nhiệt độ trong nồi biểu hiện qua
bảng sau đây:

Áp
(atm)
0
0,5
3
1,0


1,5

121

2,0

128


134
Phương pháp khử trùng bằng nhiệt ẩm cho phép diệt cả tế bào dinh dưỡng lẫn
bào tử của vi sinh vật.
- Trình tự các bước sử dụng nồi hấp áp lực như sau
+ Bổ sung nước ở đáy nồi đến vạch quy định.
+
Xếp dụng cụ và vật liệu cần khử trùng vào giá đặt bên trong nồi hấp, không
nên xếp q chặt để hơi nước lưu thơng dễ dàng
+
Đậy kín nắp nồi hấp. Trường hợp nắp có nhiều ốc vặn, cần vặn ốc theo từng
cặp đối xứng nhau.
+ Mở van thông hơi giữa 2 nồi (trường hợp nồi hấp 2 lớp)
+ Bật công tắc, đun nồi hấp.

+
Khi nhiệt độ lên đến 800C hoặc 0,5 atm, mở từ từ van xả để đuổi hết khơng
khí ra khỏi nồi trong vịng 3 – 5 phút cho đến khi luồng hơi nước thoát ra liên tục,
đóng van lại.
+ Khi áp suất lên đến mức cần thiết thì bắt đầu tính thời gian khử trùng.
+
Khi đủ thời gian khử trùng, tắt điện, chờ nhiệt độ và áp suất hạ xuống giá trị
0 mới được mở nắp để tránh gây ra tai nạn hoặc tránh áp suất thay đổi đột ngột làm hư
môi trường.
Một số nồi hấp hiện đại có thể tự kiểm sốt thời gian, áp suất và tự đuổi khí ra
khỏi nồi, cho phép bỏ qua một số thao tác tương ứng ở phần trên.
Chú ý: để đảm bảo an toàn và hiệu quả của việc hấp khử trùng, ngoài việc thận
trọng thực hiện đúng qui trình đã chỉ dẫn, người làm thí nghiệm cần phải:
+ Kiểm tra mực nước và bổ sung lượng nước cần thiết trước khi sử dụng.
+
Với nắp nồi có nhiều ốc vặn, cần phải xiết ốc theo từng cặp đối xứng để đảm
bảo độ kín, tránh làm nắp nồi bị chênh hoặc hư vòng đệm cao su.
+ Tuyệt đối không mở nắp nồi khi kim chỉ nhiệt độ và áp suất chưa trở về 0.
+
Trực tiếp theo dõi quá trình hấp khử trùng cho đến khi kết thúc và ngắt điện.
Các bình tam giác, chai lọ, ống nghiệm chứa môi trường trước khi được khử trùng
4


bằng phương pháp nhiệt ẩm cần được đậy chặt nhưng đảm bảo cho phép khơng khí và
hơi nước thơng qua.
Thơng thường, các hộp petri hoặc nút bơng cịn được bao gói bằng giấy hoặc
giấy nhơm để tránh nguy cơ bị nhiễm sau khi khử trùng. Sau khi hấp, các hộp petri
cần được sấy khô trước khi dùng.
2.2 Khử trùng dụng cụ thủy tinh bằng phương pháp nhiệt khô

Các hộp petri, ống hút thủy tinh bền với nhiệt có thể được khử trùng bằng
phương pháp sấy ở 1700C trong 2 giờ trong tủ sấy. Trong trường hợp này, các ống hút
cần được nhét nút bông không thấm nước ở đầu hút. Hộp petri, ống hút, các dụng cụ
cần khử trùng khác được gói kín bằng giấy hoặc giấy nhơm trước khi sấy.
III.

PHA CHẾ MƠI TRƯỜNG
1.Khái niệm chung

Mơi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có
nhiệm vụ duy trì thế oxi hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định pH của
môi trường.
2. Các yêu cầu cơ bản của môi trường dinh dưỡng
Bất kỳ một môi trường dinh dưỡng nào để nuôi cấy vi sinh vật cũng cần đạt
được các yêu cầu cơ bản sau đây:
- Có đủ chất dinh dưỡng cần thiết
- Có độ pH thích hợp
- Có độ nhớt nhất định
- Hồn tồn vơ khuẩn
- Khơng chứa các yếu tố độc hại
3. Phương pháp làm môi trường
3.1 Nguyên tắc
Tùy theo mục đích khảo cứu mà ta điều chế loại mơi trường cho hợp lí.
Khi điều chế mơi trường, ta dựa trên các nguyên tắc sau đây:
Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các
chất dinh dưỡng của từng loại vi sinh vật.
Đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh
vật nên cần điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường.

5

Đảm bảo các điều kiện hóa lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi
sinh vật.
3.2 Các bước làm mơi trường dinh dưỡng
a. Pha chế
Cân, đong chính xác từng thành phần của môi trường và pha chế đúng theo
trình tự đã hướng dẫn.
+ Với mơi trường lỏng: các chất cân đong xong cho hòa tan vào nước
+
Với mơi trường đặc: là mơi trường lỏng có bổ sung thêm agar (1,5 – 2,5%).
Cân hóa chất cho hịa tan vào nước, bổ sung lượng nước đủ theo công thức. Cho agar
vào, đun sôi và khuấy đều cho đến khi agar vừa tan.
b. Làm trong môi trường
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật – nhất là môi trường lỏng cần phải hoàn toàn
trong để dễ quan sát sự phát triển của chúng. Có thể làm trong mơi trường bằng
những phương pháp sau:
+
Với môi trường lỏng: người ta lọc qua vải màn nhiều lớp, qua bông thấm
nước hoặc qua giấy lọc.
+
Với môi trường đặc thường lọc qua vải màn 2 lớp hoặc giấy lọc trong điều
kiện có phễu lọc nóng.
c. Điều chỉnh pH của môi trường
Độ pH của môi trường tùy theo đối tượng vi sinh vật nuôi cấy và tùy theo u
cầu khảo cứu. Vì vậy khi làm mơi trường cần điều chỉnh pH cho thích hợp. Muốn
điều chỉnh pH của môi trường, người ta dùng HCl, NaOH 0,1N hoặc nồng độ 10%.
Cũng có thể dùng các chất khác như H3PO4, H2PO4, H2SO4, KOH….
Để kiểm tra pH của môi trường tốt nhất là dùng máy đo pH. Phương pháp này
nhanh nhạy và độ chính xác cao. Trong phịng thí nghiệm, người ta thường dùng chỉ

thị màu xanh bromotinol (ở pH = 7,3 chỉ thị màu xanh có màu lam lục. Ở pH ≤ 6 có
màu vàng, ở pH ≥ 7,6 có màu lam lục) hay giấy quỳ để đo pH. Phương pháp này tiện
lợi, nhanh nhưng độ chính xác khơng cao.
d. Phân phối môi trường vào dụng cụ
Người ta thường phân phối mơi trường vào ống nghiệm, đĩa petri, bình tam
giác. Nếu là môi trường đặc, cần phải đun cho agar vừa tan rồi mới phân phối vào
dụng cụ. Khi phân phối mơi trường vào các dụng cụ thì cần phải chú ý:

6


+
Đối với ống nghiệm: nếu dùng làm môi trường thạch nghiêng thì lượng mơi
trường cần được phân phối chiếm ¼ thể tích ống nghiệm. + Nếu dùng làm thạch đứng
thì lượng mơi trường là 1/2 - 1/3 thể tích ống nghiệm.
+
Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng mơi trường được phân phối chiếm
1/2 - 2/3 thể tích của bình.
+
Các thao tác phải nhanh, gọn, khéo léo để mơi trường khơng dính lên miệng
dụng cụ hoặc nút bơng và việc phân phối cần thực hiện xong trước khi môi trường bị
đơng đặc.
e. Khử trùng mơi trường
Tùy theo tính chất và điều kiện cụ thể của từng loại môi trường mà chế độ và
phương pháp khử trùng khác nhau như sau:
+ Phương pháp Pasteur
+ Phương pháp Tyndal
+ Phương pháp lọc bằng dụng cụ lọc vô khuẩn
+ Phương pháp hấp bằng hơi nước bão hòa ở áp suất
cao f. Phương pháp làm môi trường đặc

- Làm thạch nghiêng
Sau khi khử trùng xong, ta lấy các ống nghiệm còn lỏng đặt nghiêng trên thước
gỗ hoặc que thủy tinh sao cho thạch trong ống nghiêng tới 2/3 chiều dài của ống.
Tuyệt đối không để thạch chạm vào nút bông. Để yên cho đến khi thạch đông đặc.
Yêu cầu mặt thạch phải phẳng, nhẵn, không bị đứt
- Làm thạch đứng
Cho các ống nghiệm với lượng mơi trường đặc chiếm ½ đến 2/3 ống nghiệm.
Thạch cịn nóng ta để đứng ống thạch vào giá, để yên cho đến khi môi trường nguội
và đông đặc
- Đỗ thạch vào đĩa petri
Trong tồn bộ qui trình đổ thạch vào đĩa petri đều thực hiện trong tủ cấy vô
trùng và gồm các thao tác sau:
+ Mở bao gói giấy các đĩa petri
+ Tay phải cầm dụng cụ chứa môi trường
+ Tay trái lấy nút bông ra và hơ miệng bình trên ngọn đèn cồn.

7


+
Nghiêng bình và rót nhẹ mơi trường vào đĩa petri sau khi tay trái mở hé nắp
trên của đĩa
+ Đậy nắp trên lại, xoay trịn đĩa petri để mơi trường được phân phối đều
trên
mặt đĩa.
+ Để yên cho môi trường nguội và đông đặc.
+ Lật ngược hộp cho đáy lên trên.
Chú ý:
Thao tác đổ thạch phải hết sức khẩn trương và khéo léo để hạn chế sự nhiễm vi
sinh vật

Mặt thạch phải phẳng, nhẵn, có độ dày khoảng 2 mm.
Sau 1 – 2 ngày kiểm tra xem mơi trường có nhiễm khuẩn không rồi mới sử
dụng.
Nhớ viết vào nhãn tên môi trường, ngày pha chế.
g. Bảo quản và kiểm tra môi trường
Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánh
sáng, nhiệt độ từ 0o – 5oC và không để môi trường bị khô.
Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường người ta thường
đặt chúng vào tủ ấm 37oC, trong 48 – 72h. Sau lấy ra quan sát loại bỏ các mơi trường
có vi sinh vật phát triển và chỉ sử dụng những ống nghiệm, những đĩa petri có mơi
trường đạt tiêu chuẩn.
3.3 Pha chế một số mơi trường thông dụng
Môi trường PGA (potato glucose agar): dùng phân lập và nuôi cấy nấm mốc
Môi trường Hansen: dùng để phân lập và nuôi cấy nấm men
Môi trường Pepton lỏng và đặc: nuôi cấy vi khuẩn
Môi trường Baird Parker Agar (BPA) và môi trường mannitol salt phenol red:
dùng để phân lập và nuôi cấy Staphylococcus
Môi trường MRSA: dùng để phân lập và nuôi cấy
Lactobacillus Môi trường MSPR
IV. BÁO CÁO KẾT QUẢ
1.
Trình bày mục đích và ngun tắc cơ bản của việc bao gói dụng cụ? (đã
trình bày ở trên)
8


2. Trình bày nguyên tắc hoạt động và các bước sử dụng nồi hấp vô trùng?
Nguyên tắc hoạt động
Làm gia tăng nhiệt độ bằng hơi nước bão hòa dưới một áp suất lớn hơn áp suất
bình thường của khí quyển. Khi áp suất hơi nước tăng lên thì nhiệt độ cũng tăng theo

nhờ hệ thống van rất chặt chẽ. Phương pháp khử trùng bằng nhiệt ẩm cho phép diệt cả
tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử của vi sinh vật.
Các bước sử dụng
- Bổ sung nước ở đáy nồi đến vạch quy định
Xếp dụng cụ và vật liệu cần khử trùng vào giá đặt bên trong nồi hấp, không
nên xếp quá chặt chẽ để hơi nước lưu thông dễ dàng
Đậy kín nắp nồi hấp. Trường hợp nắp có nhiều ốc vặn, cần vặn ốc theo từng
cặp đối xứng nhau.
- Mở van thông hơi giữa 2 nồi (trường hợp nồi hấp 2 lớp)
- Bật công tắc, đun nồi hấp
Khi nhiệt độ lên đến 80oC hoặc 0.5 atm, mở từ từ van xả để đuổi hết khơng
khí khỏi nồi trong vịng 3 – 5 phút cho đến khi luồng hơi nước thoát ra liên tục, đóng
van lại.
- Khi áp suất lên đến mức cần thiết thì bắt đầu tính thời gian khử trùng.
Khi đủ thời gian khử trùng, tắt điện, chờ nhiệt độ và áp suất hạ xuống giá trị 0
mới được mở nắp để tránh gây ra tai nạn hoặc tránh áp suất thay đổi đột ngột làm hư
môi trường.
Một số nồi hấp hiện đại có thể tự kiểm sốt thời gian, áp suất và tự đuổi khí ra
khỏi nồi, cho phép bỏ qua một số thao tác tương ứng ở phần trên.
3.
Trình bày những nguyên tắc và yêu cầu cơ bản của việc pha chế mơi
trường dinh dưỡng? (đã trình bày ở trên)
4.
phân

Trình bày các bước chế mơi trường dinh dưỡng mà nhóm được

cơng?
Nhóm được phân cơng đổ mơi trường Baird Parker Agar (BPA)
Bước 1: Cân 95g bột BPA có sẵn vào 1500 ml nước cất và khuấy đều cho hỗn

hợp hòa tan với nhau.
Bước 2: Sau khi hỗn hợp đã hịa tan thì phân vào 10 bình tam giác 250 ml mỗi
bình khoảng 150 ml. Tất cả đều làm nút bơng, gói giấy và đem đi hấp vơ trùng.
9


Hình 2: Bình tam giác chứa mơi trường BPA

Bước 3: Đổ mơi trường vào đĩa petri (Vì mơi trường có agar (đặc) nên phải
làm môi trường lỏng ra bằng cách cho vào lị vi sóng đun cho mơi trường tan ra)

Hình 3: Làm lỏng mơi trường

Hình 4: Đổ mơi trường vào

đĩa

Bước 4: Xoay trịn hộp petri để cho mơi trường có thể phân phối đều trên mặt
đĩa. Để yên cho môi trường được nguội và đông đặc lại. Lập ngược hộp petri lại để
cho hơi nước bốc ra và khô dần đi.
Sau khi đổ môi trường vào hộp, để 1 – 2 ngày để xem mơi trường có bị nhiễm
hay không rồi mới sử dụng để cấy hay phân lập.
Bước 5: Ghi tên môi trường và ngày pha chế.

10


BÀI 2: PHÂN LẬP VI SINH VẬT
I. Mục đích:
Tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu tạo thành các dòng khuẩn

thuần khiết.
II.

Tiến hành – phương pháp thực hiện:
1.Phân lập nấm men:

- Nguồn phân lập: dùng 0,5 gam bánh men giã nhuyễn. Dùng nước cất vô trùng để
pha loãng nồng độ tới N=10-3/ N=10-4/ N=10-5 . Sau đó chọn 2 nồng độ liên tiếp nhau
để tiếp tục thí nghiệm.
- Mơi trường phân lập: Hansen.
- Tiến hành phân lập:
+
Trải mẫu bằng phương pháp ria: dùng que cấy vòng đã nhúng cồn khử trùng
lấy dịch nấm men đã pha theo nồng độ rồi ria trên đĩa petri có chứa mơi trường
Hansen theo đường zíc-zắc. Sau đó gói đĩa petri, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày.
+
Trải mẫu bằng que gạt: cho 0,1ml dịch nấm men đã pha loãng theo nồng độ
lên đĩa petri có chứa mơi trường Hansen. Dùng que gạt đã nhúng cồn khử trùng gạt
dịch lên khắp bề mặt thạch cho đến khi có cảm giác nó khơ lại, sau đó tiếp tục gạt lên
đĩa thứ 2, 3). Cuối cùng gói các đĩa petri lại và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày.
11


Hình 1: Phân lập nấm men trên mơi trường Hansen lần
1 - Làm thuần:
Sau hai ngày ủ ở nhiệt độ phịng, quan sát các khuẩn lạc xuất hiện trên mơi
trường Hansen. Chọn khuẩn lạc có đặc tính điển hình của nấm men (khuẩn lạc to,
màu đục sữa, khô, gồ cao…)
Dùng que cấy vịng tách khuẩn lạc nói trên sang petri chứa môi trường Hansen
khác (nếu đường cấy trên petri đầu tiên nhiễm nhiều) hoặc ria trên ống thạch

nghiêng (nếu khuẩn lạc rời và ít nhiễm)
Tiếp tục cấy nhiều lần cho đến khi các khuẩn lạc đồng nhất.

Hình 2: Phân lập nấm men trên môi trường Hansen lần 2

12


Hình 3: Phân lập nấm men trên mơi trường Hansen lần 3

2.

Phân lập nấm mốc ( Aspergillus orryzae, Aspergillus niger, Mucor)

Nguồn phân lập: cơm nguội
Môi trường phân lập: PGA
Tiến hành phân lập:
Dùng que cấy móc (đã khử trùng), gạt nhẹ lên hệ sợi tơ hoặc trên bào tử
đính (dạng bụi phấn), chuyển sang ống nghiệm thạch nghiêng. Đánh ngược
phần lưng móc lên thành bên trong của ống nghiệm cho bào tử rơi xuống hay
cắm đầu móc xuống mặt thạch thành ba điểm theo chiều dọc mặt thạch. Ủ ở
nhiệt độ phòng trong 2 ngày.

13


Hình 4: Phân lập nấm mốc ở mơi trường PGA lần 1
Sau hai ngày, lấy ra quan sát. Nếu trên mặt thạch chỉ có một loại tơ hoặc
bào tử nấm mốc phân lập là đạt.
Còn nếu lẫn nấm mốc khác hoặc vi khuẩn, thì cần tiếp tục cấy chuyền cho

đến khi thuần khiết (chỉ cịn loại nấm mốc mong muốn).
Thơng qua màu sắc của mốc để nhận diện.
+

Mốc có màu trắng: có thể là Mucor hay Rhizopus

+

Mốc có màu đen có thể là Aspergillus niger

+

Mốc có màu xanh lục có thể là Aspergillus oryzae hay Penicillium

Hình 5: Phân lập nấm mốc trên môi trường PGA lần 2
14


Hình 6: Phân lập nấm mốc trên mơi trường PGA lần 3
3. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis:
Nguồn phân lập: cỏ khô đã đun ngâm 2
ngày Môi trường: peptone –agar
Tiến hành phân lập và làm thuần: trải mẫu bằng phương pháp gạt hoặc phương
pháp ria. Sau đó để trong tủ ấm ở nhiệt độ sau 2- 3 ngày lấy ra chọn khuẩn lạc riêng
rẽ để cấy chuyền.

Hình 7: Phân lập cỏ khô ở môi trường peptone lần 1

15

Hình 8: Phân lập cỏ khơ trên mơi trường peptone lần 2
4. Phân lập Staphylococcus:
Nguồn phân lập: trên da

Môi trường phân lập: BPA, MSPR
Tiến hành: trải mẫu bằng phương pháp gạt hoặc phương pháp ria. Sau đó để trong
tủ ấm 280C từ 7 – 15 ngày mới lấy ra chọn khuẩn lạc riêng rẽ để cấy chuyền.

Hình 9: Phân lập môi trường trên da trên môi trường BPA lần 1

16


Hình 10: Phân lập mơi trường trên da trên mơi trường BPA lần 2

Hình 11: Phân lập mơi trường trên da trên môi trường MSPR lần 1

17


Hình 12: Phân lập mơi trường trên da trên mơi trường MSPR lần 2

Hình 13: Phân lập mơi trường trên da trên môi trường MSPR lần 3
6. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus:
Nguồn phân lập: sữa chua
Môi trường phân lập: môi trường MRSA
Tiến hành: trải mẫu bằng phương pháp gạt hoặc phương pháp ria. Sau đó để trong
tủ ấm 370C trong 48 giờ. Chọn lọc vi khuẩn lactic dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn
lạc để cấy chuyền.

18


Hình 14: Phân lập sữa chua trên mơi trường MRSA lần 2

Hình 15: Phân lập sữa chua trên mơi trường MRSA lần 3
III. Thực hành và báo cáo kết quả
Thực hành phân lập và làm thuần vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, xạ
khuẩn 1. Mục đích của việc phân lập?
Tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu tạo thành các dòng khuẩn thuần
khiết.
2. Nêu các bước tiến hành phân lập và làm thuần các chủng vi sinh vật từ tự
nhiên? ( Đã trình bày mục trên)
19


3. Quan sát và ghi nhận kết quả thu được?
( Đã trình bày mục trên)

20


BÀI 3: NUÔI CẤY, QUAN SÁT SỰ PHÁT TRIỂN
CỦA VI SINH VẬT
I. Mục đích:
Để phát triển và duy trì một mẫu vi sinh vật thích hợp cho các thí nghiệm. Việc
nuôi cấy con sẽ kéo dài tuổi thọ của tế bào hoặc vi sinh vật, cho phép duy trì lâu dài
và quan sát q trình ni cấy.
II.

Phương pháp ni cấy vi sinh vật

1. Khái niệm
Q trình ni cấy vi sinh vật thực chất gồm 2 khâu : nuôi và cấy
Nuôi là quá trình đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất cho
sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật.
Cấy là những thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường đang sống sang
môi trường thuận lợi hơn cho sự phát triển của chúng.
Hai khâu này khơng thể tách rời nhau trong q trình nghiên cứu và ứng
dụng của vi sinh vật.
2.Mục đích của việc ni cấy:
- Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật
- Tiến hành việc nhân giống vi sinh vật một cách nhanh chóng
- Cấy chuyền từ canh trường cũ sang canh trường mới để giữ giống
- Nghiên cứu các đặc tính sinh học của vi sinh vật
3.Nguyên tắc
Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để
tránh tạp nhiễm.
Môi trường và dụng cụ nuôi cấy phải được khử trùng triệt để.
-

Duy trì tốt các điều kiện nuôi cấy để vi sinh vật phát triển.

4.Các phương pháp nuôi cấy
a. Phương pháp chung của việc cấy chuyền
Gồm các thao tác chính sau:
-

Đốt đèn cồn lên.

Tay trái cầm 2 ống nghiệm: ống giống nằm ở ngồi, ống mơi trường ở
trong, giữ cả hai ống hơi nghiêng.
Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn đèn cồn cho đến khi
nóng
21


đỏ dây cấy.
Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bơng vào lịng bàn tay xoay nhẹ,
kéo nút bơng ra và giữ trên tay đến khi đậy lại.
Hơ nóng để khử trùng khơng khí ở miệng 2 ống nghiệm.
Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc
trong ống giống.
Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa
vào ống nghiệm môi trường để thực hiện thao tác cấy chuyền.
Rút que cấy ra, khử trùng lại phần không khí nơi miệng ống nghiệm rồi
đậy nút bơng lại.
Để các ống nghiệm vào giá, đốt lại que cấy trên đèn cồn rồi để
vào chỗ
cũ.
-

Dán nhãn ghi tên giống vi sinh vật, ngày cấy, tên môi trường vào thành

ống nghiệm
b. Phương pháp cấy trên thạch nghiêng
Phương pháp này dùng để cấy chuyền các vi sinh vật hiếu khí.
Thơng thường dùng que cấy vịng, trình tự tiến hành giống như trên.
Nhưng sau khi lấy được giọt canh trường vi sinh vật vào đầu que cấy rồi, ta tiếp
tục như sau:

Đưa đầu que cấy vào tận đáy ống nghiệm
Nhẹ nhàng hòa giọt canh trường vi sinh vật vào giọt nước ngưng tụ ở
đáy ống nghiệm.
Nhẹ nhàng và từ từ kéo đầu que cấy trên mặt thạch từ đáy lên trên theo
các kiểu như sau:
+ Theo kiểu hình chữ chi
+

Theo hình vịng xoắn

+

Theo đường vạch ngang song song.

c. Cấy đâm sâu trên thạch đứng
Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật kị khí. Khi cấy ta dùng que
cấy nhọn và đâm sâu vào môi trường. Cách tiến hành tương tự như trên, chỉ
thay đổi một ít như sau:
Quay ngược ống mơi trường cho miệng ống nghiệm hướng xuống dưới
để tránh nhiễm lúc cấy.
Đưa que cấy đã có vi sinh vật đâm sâu vào dọc theo ống thạch cho đến
tận đáy ống nghiệm. Tùy yêu cầu mà có thể đâm 1 – 3 đường, có thể đâm chính
giữa ống hoặc sát thành ống.
22