KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM VIRUS PRRS TRONG ĐÀN HEO CỦA HUYỆN THỦ THỪA TỈNH LONG AN.ppt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BÁO CÁO TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM VIRUS PRRS
TRONG ĐÀN HEO CỦA HUYỆN THỦ THỪA
TỈNH LONG AN

GVHD: TS. LÊ ANH PHỤNG

SVTH:NGUYỂN HOÀNG LÂM


NỘI DUNG
CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU
CHƯƠNG II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
KHẢO SÁT
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ


CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp – PRRS
(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) là
một bệnh truyền nhiễm lây lan nhanh và gây thiệt hại
lớn cho người chăn nuôi ở nước ta với số lượng gia súc
chết hay mắc bệnh phải tiêu hủy cao, bệnh gây hại
không dừng ở các trại chăn nuôi quy mô công nghiệp

mà cịn âm thầm lây lan sang những hộ chăn ni gia
đình nhỏ lẻ tạo tâm lý hoang mang cho người chăn
nuôi, làm giảm sức sản xuất trên con giống tác động lớn
đến nhu cầu thực phẩm và dinh dưỡng hằng ngày của
người dân.


ĐẶT VẤN ĐỀ (tt)
Các nghiên cứu về PRRS (Porcine Reproductive
and Respiratory Syndrome) tại Việt Nam chủ yếu là
kiểm tra sự hiện diện của kháng thể chống lại virus
PRRS ở các mẫu huyết thanh trên các cá thể mắc bệnh
hoặc mang trùng bằng phản ứng ELISA.
Tuy PRRS đang gây thiệt hại lớn, nhưng ta chưa
có những nghiên cứu sâu về hội chứng trên dù đây
đang là vấn đề nóng cho ngành chăn nuôi nước ta hiện
nay.


ĐẶT VẤN ĐỀ (tt)
Long An là một tỉnh ĐBSCL, là cửa ngõ vào miền Tây,
nơi tiếp nhận các luồng luân chuyển từ miền Đông sang
miền Tây. Chăn nuôi gia súc trong tỉnh quy mơ cịn nhỏ lẻ.
Năm 2007 Long An là tỉnh miền Tây đầu tiên cơng bố có
dịch PRRS trên heo tại huyện Cần Đước. Tại Thủ Thừa,
huyện có địa bàn rộng, gần với tâm trung hành chính tỉnh,
hiện vẫn chưa có bệnh xảy ra và chưa có một khảo sát hoàn
chỉnh về sự hiện diện của virus PRRS tại đàn heo nơi đây.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó dưới được sự hướng
dẫn của thầy Lê Anh Phụng và ThS. Kim Văn Phúc tại công

ty Navetco chúng tơi tiến hành đề tài: “Khảo sát tình hình
nhiễm virus PRRS trong đàn heo của huyện Thủ Thừa,
Tỉnh Long An”


MỤC ĐÍCH VÀ U CẦU
 Mục đích:

Xác định tình hình nhiễm virus PRRS trong đàn heo tại
huyện Thủ Thừa và chứng minh có sự hiện diện của
virus PRRS tại địa phương. Từ đó có căn cứ khoa học
để xây dựng các biện pháp phòng chống dịch
 Yêu cầu:

- Xác định tỷ lệ nhiễm virus PRRS bằng kỹ thuật ELISA
phát hiện kháng thể trên cá thể heo chưa tiêm ngừa vacxin
- Phân lập virus từ những mẫu huyết thanh dương tính,
trên môi trường tế bào MARC -145
- Phát hiện virus gây bệnh PRRS từ mẫu huyết thanh
dương tính bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR


CHƯƠNG II
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP KHẢO SÁT


2.1.Thời gian và địa điểm
* Thời gian: 3/10/2008- 30/3/2009
* Địa điểm:

Địa điểm thu thập mẫu xét nghiệm:
10 xã thuộc Huyện Thủ Thừa Tỉnh Long An
Địa điểm xét nghiệm mẫu:
Phòng xét nghiệm – công ty Navetco: Thực
hiện kỹ thuật ELISA và ni cấy phân lập
Phịng xét nghiệm – Trung tâm Thúy vùng
VI: Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR


2.2. Sinh hóa phẩm chất
Thành phần bộ kít ELISA tìm kháng thể
Sử dụng bộ kít của ELISA phát hiện kháng thể của IDEXX
Đối chứng dương (kháng thể Virus PRRS)
Kháng nguyên tế bào chủ bình thường( NHC)
(Vỉ ELISA 96 giếng trong có chứa kháng nguyên PRRS)
Anti-Porcine HRPO conjugate chứa trong chất bảo quản ổn
định. Được bảo quản trong sodium azide
Đối chứng âm: Huyết thanh của heo không phản ứng với
PRRS trong đệm phosphate với protein ổn định
Dung dịch rửa 10x phosphate/Tween wash
Chất phản ứng TMB (3,3’, 5,5’ Tetramethylbenzidine)
Dung dịch dừng phản ứng (stop solution)


Vật liệu dùng phân lập virus PRRS
- Dòng tế bào MARC-145 do Australia Animal Health
Laboratory (AAHL) cung cấp.
Hóa chất
- Mơi trường sinh trưởng
- MEM (Minimum Essential Medium)

- Sodium Hydrogen carbonate
- HCl 1N
- Dung dịch đệm pH 7
- Nước cất
- 8% FCS
- 0,5% LAH (Lactabumin hydrolysate)
- 1% Natri pyruvate
- Tryosine
- Dung dịch PBS (phosphate buffer saline) pH= 7,2


Vật liệu cho phản ứng Realtime RT-PCR

Sinh phẩm
- Mẫu huyết thanh dương tính trong phản ứng ELISA dùng
làm nguyên liệu cho xét nghiệm
- 2 mẫu gene RNA của virus Châu Âu và Châu Mỹ làm đối
chứng
- Bộ kít Viral ARN Isolation
Hóa chất
- (Lysis/Binding Solution Concentrate) có guanidinium
thiocynate
- Dung dịch rửa 1 có Isopropanol
- Dung dịch rửa 2 có Ethanol
- Nước đã xử lí, loại bỏ RNase (RNase free water)
- ARN Binding Beads (Hạt từ tính có khả năng giữ RNA)
- Carrier ARN (xúc tác tạo kết dính RNA)
- Elution Buffer (dung dịch thu hồi RNA)

Realtime-PCR
- Bộ kít RealTime-PCR của hãng Qiagen
- Primer chủng châu Âu và chủng Châu Mỹ
- EU-PRRSV ( Texas Red/ BHQ2) (95bp)
- US-PRRSV ( HEX/BHQ1) (104bp)
- 5X Buffer
- MgCl2 25 Mm
- dNTPs 10Mm
- Chất khử RNase (RNase Inhibitor)
- Enzyme Mix/ Taq polymerase


2.3. Nội dung khảo sát
Lấy mẫu huyết thanh heo, xét nghiệm ELISA phát
hiện kháng thể trên các cá thể không tiêm phòng
vaccine.
 Đồng thời khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng lên
tỷ lệ nhiễm trên heo ở huyện Thủ Thừa, Long An
như : Khu vực, giới tính, hạng heo…
 Nuôi cấy phân lập PRRSV trên môi trường tế
bào một lớp từ các mẫu huyết thanh dương tính.
 Thực hiện xét nghiệm Realtime RT-PCR phát
hiện virus từ các mẫu huyết thanh dương tính qua kết
quả phản ứng ELISA.


2.4. Phương pháp khảo sát
Phương pháp:

Huyết thanh heo

(heo con, heo thịt, heo nái)
Thực hiện xét nghiệm
ELISA phát hiện kháng thể

Kết quả dương tính

Tiến hành phản ứng
Realtime RT - PCR

Kết quả âm tính

phân lập virus trên tế
bào MARC - 145


Phương pháp lấy mẫu
Bố trí lấy mẫu
Huyện Thủ Thừa có hai vùng sinh thái rõ rệt: Phía Bắc
và Nam của huyện. Trong đó các xã phía Bắc hằng
năm có nước ngập lũ, các xã phía Nam do có địa hình
cao hơn nên không bị ảnh hưởng lũ
Khảo sát 10 xã : 5 xã phía Bắc và 5 xã phía Nam
- Một đơn vị khảo sát (xã) lấy 15 mẫu
- Người lấy mẫu đi từ đầu xã đến cuối xã, lấy theo
cách chọn ngẫu nhiên, mỗi ấp không lấy quá 4 mẫu


ĐỐI TƯỢNG
Là những nái mang thai, nái khô, heo từ 1-5 tháng tuổi
Hạng Heo

Khu
vực
khảo
sát

Xã

Nái mang
Nái khô
thai

Heo thịt
1-2 T

Heo thịt
3-4T

Heo thịt
Từ 5T

Tổng

Phía
Bắc

LongThuận
Mỹ Lạc
Mỹ Thạnh
Tân Thành

Bình An

3
2
1
2
2

3
3
4
5
4

4
5
3
4
5

3
4
3
2
3

2
1
4
2

1

15
15
15
15
15

Phía
Nam

Thủ thừa
BìnhThạnh
Nhị Thành
Mỹ Phú
Mỹ An

2
4
2
0
3

3
3
4
7
4

3

3
4
4
3

4
2
3
2
1

3
3
2
2
4

15
15
15
15
15

21

40

38

27

24

150

Tổng

10


Kỹ thuật ELISA

(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) tìm kháng thể

Nguyên tắc : Sử dụng kháng nguyên phủ bên ngoài
những giếng nhỏ nhằm mục đích thu giữ những
kháng thể mục tiêu. Những kháng nguyên bị thu giữ
được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ hai
có gắn với enzyme phát tín hiệu thường là
(horseradish peroxidase). Khi cho vào hỗn hợp phản
ứng một cơ chất đặc biệt của enzyme, phản ứng xảy
ra và tạo ra các sản phẩm làm đổi màu phản ứng.
Thông qua đo chỉ số S/P mà chúng ta có thể phát
hiện được sự hiện diện của kháng thể .


Các bước thực hiện phản ứng
(1)Kháng nguyên bao phủ các giếng ELISA do nhà sản
xuất cung cấp
(2)Cho 100 microlit mẫu đối chứng âm PRRS khơng pha

lỗng vào giếng B1và mẫu đối chứng âm NHC khơng
pha lỗng vào giếng B2
(3)Cho 100 microlit mẫu đối chứng dương PRRS khơng
pha lỗng vào giếng A1 và mẫu đối chứng dương NHC
khơng pha lỗng vào giếng A2
(4)Cho 100 microlit mẫu thí nghiệm đã pha lỗng vào các
giếng còn lại (Mỗi mẫu cho vào hai giếng ở hai cột
PRRS và NHC ).
(5)Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng


Các bước thực hiện phản ứng (tt)
(6) Rửa các giếng bằng dung dịch rửa từ 3 đến 5 lần.
Các giếng phải khô trước khi cho HRPO
conjugate
(7) Cho 100 microlit HRPO conjugate vào mỗi giếng
(8) Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng
(9) Rửa các giếng bằng dung dịch rửa từ 3-5 lần
(10) Cho 100 microlit dung dịch phản ứng TMB mỗi
giếng
(11) Ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng
(12) Cho 100 microlit dung dịch dừng P.ứng vào mỗi
giếng để dừng P.ứng
(13) Đo OD (optical density) bằng máy đọc ELISA,
bước sóng 650 nm