Sàng lọc và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm fusarium oxysporum gây bệnh trên cây cà phê (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
------------------***------------------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ
KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM
FUSARIUM OXYSPORUM GÂY BỆNH TRÊN
CÂY CÀ PHÊ

Hà Nội, 2022


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
------------------***------------------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ
KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM
FUSARIUM OXYSPORUM GÂY BỆNH TRÊN
CÂY CÀ PHÊ

Họ và tên sinh viên

: Nguyễn Lan Nhi

Mã sinh viên

: 637161

Lớp

: K63CNSHB

Giảng viên hƣớng dẫn : PGS. TS. Nguyễn Văn Giang

Hà Nội, 2022


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận này là
trung thực và chƣa hề sử dụng trong bất kỳ công bố nào.
Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khố luận đã đƣợc
cảm ơn và các thơng tin trích dẫn đã đƣợc ghi rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2022
Sinh viên

Nguyễn Lan Nhi

i


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn tới quý thầy cô trong Bộ môn Công
nghệ Vi sinh, Khoa công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã
tạo điều kiện và giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp.

Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Thầy PGS.TS Nguyễn Văn Giang đã quan tâm,
chỉ bạo, dạy dỗ và giúp đỡ tơi trong suốt q trình làm đề tài tốt nghiệp.
Cảm ơn các bạn, các anh chị đang học tập và làm việc tại Bộ môn Công
nghệ vi sinh đã đồng hành cùng tôi và giúp đỡ tôi rất nhiều trong công việc.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bố mẹ và gia đình, bạn bè đã ln bên tơi, động
viên, giúp đỡ tơi trong q trình học tập tại Học viện.

Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2022
Sinh viên

Nguyễn Lan Nhi

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC ............................................................................................................ iii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................ vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................ ix
TÓM TẮT ............................................................................................................. x
I. MỞ ĐẦU......................................................................................................... 1
1.1.

Đặt vấn đề. ................................................................................................ 1

1.2.

Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................. 2

II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1.

Tổng quan về xạ khuẩn. ............................................................................ 3

2.1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn. ............................................................................. 3
2.1.2. Đặc điểm về hình thái, cấu trúc. ............................................................... 4
2.1.3. Đặc điểm sinh hóa lý. ................................................................................ 8
2.1.4. Ứng dụng của xạ khuẩn ............................................................................ 9
2.2.

Tổng quan về nấm gây bệnh trên cây cà phê. ......................................... 12

2.2.1. Tổng quan về cây cà phê. ........................................................................ 12
2.2.2. Tổng quan về tình hình sản xuất cà phê ở trên thế giới và Việt Nam. ... 13
2.2.3. Các bệnh thƣờng gặp trên cây cà phê. .................................................... 15
2.2.4. Tổng quan về chủng nấm Fusarium oxysporum .................................... 18
III. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 22
3.1.

Nội dung nghiên cứu. .............................................................................. 22

3.2.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu. .......................................................... 22

3.3.

Vật liệu nghiên cứu. ................................................................................ 22

3.3.1. Các chủng vi sinh vật .............................................................................. 22
3.3.2. Hóa chất và thiết bị. ................................................................................ 22

iii


3.4.

Phƣơng pháp nghiên cứu. ....................................................................... 24

3.4.1. Khảo sát khả năng kháng nấm của các chủng xạ khuẩn. ........................ 24
3.4.2. Bảo quản giống. ...................................................................................... 25
3.4.3. Đặc điểm sinh học. .................................................................................. 25
3.4.4. Đánh giá đặc điểm sinh hóa của xạ khuẩn. ............................................. 26
3.4.5. Khả năng sinh enzyme ngoại bào. .......................................................... 28
3.4.6. Định danh chủng xạ khuẩn đƣợc tuyển chọn.......................................... 29
IV. KẾT QUẢ ..................................................................................................... 31
4.1. Sàng lọc khả năng đối kháng với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh
cây của các chủng xạ khuẩn. ................................................................... 31
4.2.

Đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn. .......................................... 32

4.2.1. Đặc điểm nuôi cấy của 2 chủng XK16 và XK88H trên môi trƣờng
Gause và ISP. .......................................................................................... 32
4.2.2. Đặc điểm hệ sợi và cuống sinh bào tử. ................................................... 34
4.3.

Đặc điểm hóa sinh. .................................................................................. 35

4.3.1. Khả năng sinh sắc tố Melanin. ................................................................ 35
4.3.2. Ảnh hƣởng của pH. ................................................................................. 36
4.4.

Ảnh hƣởng của nhiệt độ. ......................................................................... 39

4.5.

Khả năng đồng hóa nguồn Carbon.......................................................... 40

4.6.

Khả năng đồng hóa nguồn Nitơ .............................................................. 42

4.7.

Ảnh hƣởng của nồng độ muối................................................................. 42

4.8.

Khả năng phân giải Citrate...................................................................... 44

4.9.

Khả năng sinh Enzyme ngoại bào........................................................... 45

5.

Định danh chủng xạ khuẩn XK16........................................................... 47

5.1.

Tách chiết DNA. ..................................................................................... 47

5.2.

Khuếch đại trình tự 16S rRNA bằng phản ứng PCR. ............................. 47

5.3.

Định danh và phân tích bằng phƣơng pháp giải trình tự đoạn gen 16S
rRNA. ...................................................................................................... 48

iv


V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 50
5.1. Kết luận ........................................................................................................ 50
5.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 50
VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 51
PHỤ LỤC ............................................................................................................ 62

v


DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1. Hoạt tính đối kháng của các chủng xạ khuẩn với một số nấm gây

bệnh(%). .............................................................................................. 31
Bảng 4.2. Đặc điểm hình thái của chủng XK16 và chủng XK88H trên các
môi trƣờng khác nhau ......................................................................... 33
Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của pH tới khả năng sinh trƣởng và phát triển của hai
chủng xạ khuẩn XK16 và XK88H. ..................................................... 37
Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh trƣởng và phát triển của
hai chủng xạ khuẩn XK16 và XK88H. ............................................... 40
Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nguồn carbon tới khả năng sinh trƣởng và phát
triển của hai chủng xạ khuẩn XK16 và XK88H. ................................ 41
Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ tới khả năng sinh trƣởng và phát triển
của hai chủng xạ khuẩn XK16 và XK88H. ........................................ 42
Bảng 4.7. Nồng độ muối thích hợp của 2 chủng xạ khuẩn XK16 và XK88H.... 43
Bảng 4.8. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng xạ khuẩn XK16 và
XK88H ................................................................................................ 46

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh xạ khuẩn. ............................................................................... 5
Hình 1.2. Sự hình thành hai loại khuẩn ty sau khi bào tử xạ khuẩn nẩy mầm. .... 6
Hình 1.3. Một số dạng cuống sinh bào tử của xạ khuẩn. ...................................... 8
Hình 2.1. Cây cà phê. .......................................................................................... 13
Hình 2.2. Cây cà phê bị lở cổ rễ ( ......... 15
Hình 2.3. Cây cà phê bị thối cổ rễ ( ...... 16
Hình 2.4. Cây cà phê bị thối nứt thân ................................................................. 17
Hình 2.5. Cây cà phê bị thối rễ tơ ( 17
Hình 2.6. Bào tử nấm Fusarium oxysporum ....................................................... 20
Hình 4.1. Khả năng ức chế nấm Fusarium oxysporum 3 của chủng XK16
sau 10 ngày ni cấy. .......................................................................... 32

Hình 4.2. Khả năng ức chế nấm Fusarium oxysporum 1 của chủng XK88H
sau 14 ngày nuôi cấy. .......................................................................... 32
Hình 4.3. Đặc điểm hình thái của chủng XK16 trên các môi trƣờng khác
nhau sau 21 ngày nuôi cấy .................................................................. 34
Hình 4.4. Khuẩn ty khí sinh (A), cuống sinh bào tử (B) của xạ khuẩn
XK88H. ............................................................................................... 35
Hình 4.5. Đặc điểm khuẩn ty khí sinh (A) và cuống sinh bào tử (B) của xạ
khuẩn XK16. ....................................................................................... 35
Hình 4.6. Xạ khuẩn XK88H(A) và XK16(B) trên môi trƣờng ISP6 sau 7
ngày ni cấy. ..................................................................................... 36
Hình 4.7. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng kháng nấm sau 7 ngày nuôi cấy
của chủng XK88H............................................................................... 38
Hình 4.8. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng kháng nấm sau 6 ngày nuôi cấy
của chủng XK16.................................................................................. 38

vii


Hình 4.9. Khả năng sinh trƣởng của chủng xạ khuẩn XK16(A) và
XK88H(B) tƣơng ứng với nồng độ muối 0,5 %. ................................ 43
Hình 4.10. Khả năng phân giải Citrate của hai chủng XK16 và XK88H. .......... 44
Hình 4.11. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng xạ khuẩn XK16.......... 46
Hình 4.12. Kết quả điện di tổng số của chủng XK16. ........................................ 47
Hình 4.13. Sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại với đoạn mồi thuộc vùng 16S
rRNA của chủng xạ khuẩn XK16. ...................................................... 48
Hình 4.14. Xác định lồi của chủng XK16 nhờ so sánh trình tự nucleotide
trên GenBank. ..................................................................................... 48
Hình 4.15. Cây phân loại dựa trên trình tự 16S rRNA của chủng XK16. .......... 49

viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

µl

: Microliter

CMC : Carboxymethyl cellulose
Cs

: Cộng sự

DNA : Deoxyribonucleic acid
KTCC : Khuẩn ty cơ chất
KTKS : Khuẩn ty khí sinh
ISP

: International Streptomyces Project

PDA : Potato dextrose agar
RNA : Ribonucleic acid
XK

: Xạ khuẩn

mm

: Milimet

g

: Gram

ml

: Mililit

G + C : Guanine + Cytosine

ix


TĨM TẮT
Fusarium oxysporum có khả năng gây bệnh cho các loài thực vật
khác nhau đặc biệt là trên cây cà phê, chúng xâm nhập vào rễ gây thối rễ hoặc
nhiễm trùng hô hấp khi chúng xâm nhập vào hệ thống mao mạch. Trong số các
tác nhân sinh học thƣờng đƣợc sử dụng để ức chế vi sinh vật gây bệnh, xạ khuẩn
là một trong những nguồn tác nhân sinh học có khả năng kháng khuẩn, kháng
nấm. Với mục đích phát hiện thêm nhiều nguồn vật liệu sinh học có thể đối
kháng với các tác nhân gây bệnh hại cà phê, tôi đã sàng lọc và tuyển chọn các
chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với nấm Fusarium oxysporum gây
bệnh trên cây cà phê. Kết quả, từ 16 chủng xạ khuẩn đƣợc lƣu trữ tại bộ mơn, có
6 chủng có hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum. Trong số đó, chủng
XK16 và XK88H có khả năng đối kháng mạnh nhất. XK88H sinh trƣởng tốt ở
nhiệt độ 30℃, pH 7–8, chịu đƣợc độ mặn đến 3%, sử dụng tốt nguồn carbon:
Dextrin, nguồn nitơ: Cao thịt, Peptone. Chủng XK16 sinh trƣởng tốt ở nhiệt độ
35℃, pH 6 – 7, chịu đƣợc độ mặn đến 7%, sử dụng tốt các nguồn carbon:
Dextrin, Sucrose, nguồn nitơ: Cao thịt và có khả năng sinh enzyme ngoại bào:
cellulase, xylanase và amylase. Kết quả so sánh và phân tích trình tự nucleotide

16S rRNA của chủng xạ khuẩn với trình tự nucleotide trên GenBank cho thấy
chủng xạ khuẩn XK16 có quan hệ họ hàng gần gũi với chủng Streptomyces
krainskii RSU51 với sự giống nhau về trình tự là 98.22%. Vì vậy, chủng này
đƣợc đặt tên là: Streptomyces krainskii XK16.

x


I.
1.1.

MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề.
Cà phê là một loại cây nhiệt đới mọc ở độ cao 600 - 1800 m trên mực

nƣớc biển. Nó có nguồn gốc từ Ethiopia, lan rộng đầu tiên đến Ấn Độ và sau đó
đến Indonesia, Brazil, Colombia và Trung Mỹ (Roberto et al., 2004). Hai giống
cà phê đƣợc trồng phổ biến nhất trên thế giới là cà phê chè, và cà phê vối. Ở
Việt Nam, cà phê thƣờng có 3 lồi : cà phê vối , cà phê chè, cà phê mít. Cà phê
chè (9%) và cà phê vối (90%) đƣợc trồng khá phổ biến trong khi đó cà phê mít
(1%) đƣợc trồng rất ít. Cây cà phê chè đƣợc trồng nhiều ở khu vực Bắc Bộ, đặc
biệt là khu vực Bắc Trung Bộ, trong khi Tây Ngun trở thành khu vực có diện
tích trồng cà phê vối lớn nhất nƣớc ta ( />Cà phê là mặt hàng chủ lực có giá trị xuất khẩu lớn, và là mặt hàng năng
suất đứng thứ hai về kim ngạch sau gạo, góp phần đẩy mạnh q trình chuyển
dịch cơ cấu kinh tế ở các địa phƣơng trồng nhiều cà phê. Trong những năm qua,
cà phê luôn là một trong số ít những mặt hàng trọng yếu của nền kinh tế quốc
dân. Hiện nay Việt Nam là quốc gia có sản lƣợng xuất khẩu cà phê nhân đứng
thứ 2 trên thế giới, chỉ sau Brazil, duy trì đều đặn giá trị trên 3 tỷ USD/năm.
Ngành hàng này đang đƣợc chính phủ hƣớng đến nâng giá trị xuất khẩu lên mức

6 tỷ USD vào năm 2030 (Nguyễn Bá Thanh, 2020).
Tuy nhiên, cây cà phê ở nƣớc ta thƣờng mắc phải một số bệnh phổ biến
nhƣ bệnh thối cổ rễ và thối nứt thân (do Fusarium spp.), thối rễ tơ (do
Rhizoctonia bataticola và Fusarium oxysporum), lở cổ rễ... Các bệnh này chủ
yếu do các chủng nấm gây ra, đặc biệt là chủng nấm Fusarium oxysporum, làm
giảm năng suất và chất lƣợng cây trồng. Cây mắc bệnh thƣờng biểu hiện nhƣ
cây phát triển chậm, lá vàng dần, rễ tơ bị thối đen từ chóp rễ vào. Cây bị bệnh
nặng, rễ lớn cũng bị thối đen từ lớp vỏ ngoài vào làm cho cây bị kiệt sức vì
khơng hấp thu đƣợc dinh dƣỡng ni cây, gốc bị long, phần cổ rễ thối đen, nhỏ
lại so với thân, gỗ bên trong bị khô, bệnh phát triển và lây lan rất nhanh làm lá

1


héo vàng và cây bị chết.
Hiện nay, thế giới đang hƣớng đến một nền nơng nghiệp bền vững. Do
đó, việc sử dụng các chủng vi sinh vật trong đấu tranh sinh học và phịng, trị
bệnh đƣợc ƣa chuộng bởi vì tính thân thiện với mơi trƣờng, khơng ảnh hƣởng tới
chất lƣợng sản phẩm. Trong số các nhóm tác nhân sinh học đó, xạ khuẩn
Streptomyces là nhóm vi sinh vật đƣợc nghiên cứu nhiều vì có nhiều tiềm năng
lớn trong đấu tranh sinh học và phòng trừ các bệnh hại cây trồng, chúng có thể
ức chế mầm bệnh với cơ chế tiết ra các chất kháng sinh. Vì vậy, việc tìm kiếm
các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh kháng nấm bệnh ở cây cà
phê nhƣ nấm Fusarium oxysporum là một trong những hƣớng nghiên cứu tiềm
năng, mang lại nhiều lợi ích cả về kinh tế và bảo vệ môi trƣờng. Với những lý
do cấp thiết trên, tôi đã thực hiện khóa luận với đề tài “Sàng lọc và tuyển chọn
các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với nấm Fusarium oxysporum gây
bệnh cây cà phê”.
1.2.

Mục tiêu nghiên cứu.
 Sàng lọc và tuyển chọn, khảo sát một số đặc điểm của các chủng xạ có

khả năng đối kháng với nấm Fusarium oxysporum.
 Nghiên cứu ảnh hƣởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh
trƣởng và đối kháng với nấm Fusarium oxysporum của các chủng xạ khuẩn
đƣợc chọn.
1.3.

Ý nghĩa của đề tài
 Kết quả sơ bộ thu đƣợc từ các thí nghiệm cung cấp một số điều kiện

thích hợp để nhân giống chủng xạ khuẩn phục vụ sản xuất sản phẩm sinh học
kiểm soát bệnh cây trồng tại vùng nghiên cứu.
 Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần bổ sung thêm các nguồn xạ
khuẩn có hoạt tính đối kháng chủng nấm gây bệnh
 Bổ sung thêm nguồn gen vi sinh vật có tiềm năng bảo vệ thực vật.

2


II.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về xạ khuẩn.
2.1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn.
Streptomyces

là

một

chi

của

họ

Streptomycetace,

thuộc

bộ

Actinomycetales của lớp Schizomycetes (Sharma., 1999). Xạ khuẩn bao gồm 10
dƣới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 lồi. Hiện nay, 478 lồi đã đƣợc cơng bố thuộc
chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi cịn lại và đƣợc xếp vào
nhóm xạ khuẩn hiếm (Nguyễn Lân Dũng, 2010). Chi Streptomyces là một trong
những vi sinh vật nhân sơ có số lƣợng lồi và chủng lớn nhất trong họ
Actinomycetaceae. Chúng đƣợc tìm thấy hầu hết trong đất và tạo ra một loạt các
sắc tố đóng vai trò là dấu hiệu phân loại (Sharma et al., 2014).
Xạ khuẩn phân bố trong đất, nƣớc, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả
trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển đƣợc. Sự phân bố của
xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần của đất, mức độ canh tác và thảm
thực vật (Bùi Thị Hà, 2020). Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào
độ pH mơi trƣờng, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc
axit yếu với pH trong khoảng 6,8 - 7,5. Xạ khuẩn có rất ít trong lớp đất kiềm
hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lƣợng xạ khuẩn trong đất
cũng thay đổi theo thời gian trong năm. Streptomyces phát triển nhƣ những sinh

vật có đầy đủ sợi khuẩn ty, và sinh sản bằng cách hình thành các bào tử bất động
ở đầu của các sợi khuẩn ty khí sinh. Về mặt dinh dƣỡng, Streptomyces dễ sinh
trƣởng, phát triển và thƣờng khơng địi hỏi các yếu tố tăng trƣởng đặc biệt trong
mơi trƣờng sống. Đã có khoảng hơn 8000 chất kháng sinh đƣợc biêt đến trên thế
giới, trong đó có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra (Dhanasekaran, 2012). Ngồi
ra, xạ khuẩn cũng đóng vai trị rất lớn trong việc phân giải các chất nhƣ:
cellulose, lignin, phân giải photphat, chất vơ cơ khó tan, cố định nitơ mạnh (Đỗ
Thu Hà, 2013).
Môi trƣờng sống của xạ khuẩn rất đa dạng, chúng đƣợc tìm thấy ở hầu hết
3


mọi nơi. Tuy nhiên, xạ khuẩn là một phần quan trọng của quần thể vi sinh vật
trong hầu hết các loại đất. Hơn hai mƣơi chi đã đƣợc phân lập từ đất. Khoảng
95% các chủng phân lập thuộc về Streptomyces. Hầu hết xạ khuẩn hoạt động
nhƣ những sinh vật ƣa nhiệt, với nhiệt độ phát triển thích hợp từ 25 oC đến 30oC.
Xạ khuẩn cũng đƣợc tìm thấy trong các đống ủ compost. Nhiều xạ khuẩn ƣa
nhiệt hoạt động mạnh trong đống ủ phân hữu cơ trong giai đoạn đầu của q
trình phân hủy. Xạ khuẩn cịn là một phần của sinh vật bản địa hệ vi sinh vật
biển (Chavan et al., 2013).
Cuộc cách mạng trong ngành y học trong giai đoạn 1950 đến năm 1960 còn
đƣợc gọi là giai đoạn vàng trong lịch sử phát triển các chất kháng sinh, từ đó dẫn
đến việc phát hiện khoảng một nửa các loại thuốc có nguồn gốc từ vi sinh vật.
Cho đến nay, một phần lớn của các loại kháng sinh này đã đƣợc phân lập từ
Actinobacteria. Xạ khuẩn chiếm khoảng hơn 61% chất chuyển hóa thứ cấp có
hoạt tính sinh học bao gồm cả chất kháng sinh từ nguồn vi sinh vật. Nhiều loài
xạ khuẩn đƣợc biết đến là tác nhân kiểm sốt sinh học mạnh mẽ và an tồn với
môi trƣờng chống lại nhiều loại bệnh hại trên thực vật. Trong số đó, chi
Streptomyces là một nhóm chính có khả năng sản xuất ra lƣợng kháng sinh
chiếm khoảng gần 70% lƣợng kháng sinh đƣợc phát hiện cho đến ngày nay

(Salwan et al., 2020).
2.1.2. Đặc điểm về hình thái, cấu trúc.
Xạ khuẩn có cấu trúc phức tạp. Hình thái đa bào phức tạp của chúng đã khiến
các nhà vi sinh trƣớc đó đã tin rằng các Actinomycetes là nấm hoặc liên kết trung
gian giữa nấm và vi khuẩn. Tuy nhiên, các nhà khoa học đã chứng minh đƣợc
rằng Streptomycetes là vi sinh vật nhân sơ. Chúng có cấu trúc thành tế bào, vật
liệu di truyền và phage tƣơng tự nhƣ vi khuẩn (Sharma et al., 2014). Mặc dù
Streptomyces là vi khuẩn nhân thật nhƣng chúng phát triển ở dạng sợi hoặc dạng
sợi khuẩn ty và khơng có dạng trực khuẩn hoặc cầu khuẩn của vi khuẩn thông

4


thƣờng. Chúng cũng hình thành bào tử, đƣợc tạo thành chuỗi từ sợi khuẩn ty khí
sinh (Sharma., 1999).

Hình 1.1. Hình ảnh xạ khuẩn.
( />Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gram (+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo
dạng sợi, phân nhánh (khuẩn ty) (Nguyễn Lân Dũng, 2010). Chúng có DNA với
giá trị GC từ 69-78% (Sharma., 1999). Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tƣơng tự nhƣ
vi khuẩn Gram (+), toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần
chính nhƣ thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, nhân và các thể ẩn
nhập. Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lƣới, dày 10 - 20 nm có tác
dụng duy trì hình dạng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào và chủ yếu cấu tạo từ các lớp
glucopeptide bao gồm các gốc N - axetyl glucozamine liên kết với N - axetyl
muramic acid bởi các liên kết 1,4 - β glucoside, gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng dày
khoảng 60 - 120 Å, lớp giữa rắn chắc dày khoảng 50 Å, lớp trong dày khoảng 50
Å. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose và chitin nhƣng chứa nhiều
enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất
qua màng tế bào. Dƣới lớp thành tế bào của chúng là màng sinh chất dày khoảng

50 nm và đƣợc cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần chính là phospholipid và
protein. Chúng có vai trị đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và
tham gia vào quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn. Tế bào chất của xạ
khuẩn có chứa mezoxom, thể nhân, và các vật thể ẩn nhập gồm các hạt
polyphosphate và polysaccharides. Nhân của tế bào xạ khuẩn khơng có cấu trúc

5


điển hình mà chỉ là những nhiễm sắc thể khơng có màng tế bào. Khi cịn non,
tồn bộ tế bào của xạ khuẩn chỉ có 1 nhiễm sắc thể và sau đó sẽ hình thành
nhiều hạt rải rác trong tồn bộ hệ khuẩn ty (Nguyễn Lân Dũng, 2010).
Đa số xạ khuẩn có cấu tạo dạng sợi, các sợi này sẽ kết với nhau tạo thành
khuẩn lạc và chúng có nhiều màu sắc khác nhau: trắng, vàng, nâu, tím, xám ...
Màu sắc của xạ khuẩn là một đặc điểm phân loại quan trọng dùng để phân loại.
Đƣờng kính sợi của xạ khuẩn thƣờng khoảng từ 0,1- 0,5 μm. Có thể phân biệt
đƣợc hai loại sợi khác nhau là sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh) và sợi cơ chất
(khuẩn ty cơ chất) dựa vào các đặc điểm khác nhau của chúng khi ni cấy trên
mơi trƣờng. Sợi khí sinh là hệ sợi mọc trên bề mặt môi trƣờng nuôi cấy, tạo
thành bề mặt của khuẩn lạc xạ khuẩn, từ đây phát sinh ra bào tử. Sợi cơ chất là
sợi mọc sâu vào môi trƣờng làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dƣỡng. Sợi cơ chất
cịn có thể tiết sắc tố vào mơi trƣờng, sắc tố này thƣờng có màu khác với màu
của sợi khí sinh. Một số xạ khuẩn khơng có sợi khí sinh mà chỉ có sợi cơ chất,
loại sợi này làm cho bề mặt xạ khuẩn trên môi trƣờng nhẵn và khó tách ra khi
cấy chuyển. Loại xạ khuẩn chỉ có sợi khí sinh thì ngƣợc lại, rất dễ tách tồn bộ
khuẩn lạc khỏi mơi trƣờng (Nguyễn Lân Dũng, 2010).

Hình 1.2. Sự hình thành hai loại khuẩn ty sau khi bào tử xạ khuẩn
nẩy mầm.
( />

6


Khuẩn lạc xạ khuẩn thƣờng có cấu tạo 3 lớp: lớp vỏ ngồi có dạng sợi bện
chặt, lớp giữa có cấu trúc tổ ong, lớp trong tƣơng đối xốp. Khuẩn lạc xạ khuẩn
có nhiều hình thái nhƣ rắn chắc, xù xì, có thể có dạng da, dạng phấn, dạng
nhung, dạng vơi phụ thuộc vào kích thƣớc bào tử. Trƣờng hợp khơng có sợi khí
sinh thì khuẩn lạc thƣờng có có dạng màng dẻo. Kích thƣớc khuẩn lạc thay đổi
tùy lồi xạ khuẩn và tùy vào điều kiện nuôi cấy khác nhau. Khuẩn lạc thƣờng có
dạng phóng xạ, một số có dạng những vòng tròn đồng tâm cách nhau một
khoảng nhất định. Nguyên nhân xuất hiện hiện tƣợng vòng tròn đồng tâm khi
nuôi cấy là do xạ khuẩn sinh ra chất ức chế sinh trƣởng, khi sợi mọc qua vùng
này chúng sinh trƣởng yếu đi, qua đƣợc vùng có chất ức chế chúng lại sinh
trƣởng mạnh thành vòng tiếp theo, vòng này lại sinh ra chất ức chế sinh trƣởng
sát với nó khiến khuẩn ty lại phát triển yếu đi. Cứ thế chúng tạo thành các khuẩn
lạc có dạng các vịng tròn đồng tâm (Nguyễn Lân Dũng, 2010).
Bào tử xạ khuẩn đƣợc hình thành từ các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí
sinh và đƣợc gọi là cuống sinh bào tử. Đó là cơ quan sinh sản đặc trƣng cho xạ
khuẩn, có nhiều dạng khác nhau: thẳng, lƣợn sóng, xoắn, mọc đơn, mọc vòng...
Trên mỗi cuống sinh bào tử mang từ 30 - 100 bào tử, đơi khi có thể mang tới
200 bào tử, nhƣng cũng có khi chỉ mang 1 - 2 bào tử. Sự hình thành bào tử ở xạ
khuẩn có thể xảy ra do sự kết đoạn hoặc do sự cắt khúc của cuống sinh bào tử.
Bào tử xạ khuẩn có nhiều hình dạng khác nhau, thƣờng có hình trụ, ovan, hình
cầu, hình que với kích thƣớc trung bỡnh khong (0,7 - 0,9 ì 0,7 - 1,9) àm. Kích
thƣớc của bào tử thay đổi khác nhau tùy lồi, tùy cá thể trong lồi thậm chí ngay
trên cùng một chuỗi bào tử. Bề mặt bào tử xạ khuẩn có thể nhẵn, có gai, khối u,
nếp nhăn hay dạng tóc. Bào tử xạ khuẩn đƣợc bao bọc bởi màng
mucopolysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 - 400 Å, gồm có 3 lớp,
giúp cho bào tử tránh đƣợc những ảnh hƣởng bất lợi của ngoại cảnh nhƣ: nhiệt
độ, độ ẩm, pH, dinh dƣỡng… Hình dạng, kích thƣớc của chuỗi bào tử và cấu

7


trúc màng của xạ khuẩn có thể thay đổi khi ni cấy trên những mơi trƣờng có
nguồn nitơ khác nhau (Nguyễn Lân Dũng, 2010).

Hình 1.3. Một số dạng cuống sinh bào tử của xạ khuẩn.
( />2.1.3. Đặc điểm sinh hóa lý.
Streptomyces ƣa kiềm, phát triển tốt trong điều kiện đất kiềm. Chúng có thể
phát triển trong khoảng pH 5 - 11, nồng độ NaCl tới 10% và nhiệt độ từ 20oC
đến 40oC. Streptomyces cũng có khả năng chịu đựng thuốc diệt nấm Bavistin,
Thiram và Captan, rất nhạy cảm với Radonil, Benomyl và Benlate
(Gopalakrishnan et al., 2012; Sadeghi et al., 2012). Streptomyces cũng đƣợc
phát hiện có khả năng kháng ampicillin và trimethoprim (với nồng độ lớn hơn
800 ppm) và nhạy cảm với chloramphenicol, kanamycin và axit nalidixic
(Gopalakrishnan et al., 2012). Streptomyces có thể có khả năng tồn tại trong mơi
trƣờng khắc nghiệt bao gồm nƣớc muối và axit đến đất pH kiềm và do đó có thể
là một phần của các chƣơng trình quản lý bệnh hại tổng hợp (ICM). Hơn nữa,
kháng sinh nhƣ ampicillin và trimethoprim (kháng cao; > 800 ppm) và
streptomycin và tetracycline (rất nhạy cảm; <25 ppm) có thể đƣợc sử dụng làm
điểm đánh dấu để nhận dạng của chúng trong các nghiên cứu về môi trƣờng tự
nhiên (Gopalakrishnan et al,. 2020).

8


2.1.4. Ứng dụng của xạ khuẩn
Streptomyces đóng một vai trị quan trọng trong sự thúc đẩy tăng trƣởng của
thực vật (PGP), tăng đề kháng cho cây trồng, bảo vệ cây trồng, giảm dƣ lƣợng

hữu cơ và sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp trong lĩnh vực nơng nghiệp và y
tế (Gopallakrishnan et al., 2020).
2.1.4.1. Ứng dụng trong nông nghiệp.
Trong lĩnh vực nông nghiệp, Streptomyces đã đƣợc khảo sát, đánh giá
về vai trị kiểm sốt sinh học của chúng đối với các loại nấm gây bệnh thực vật
khác nhau (Gonzalez-Franco, 2009; Law et al., 2017). Ngồi ra, Streptomyces
có thể ức chế hoặc thúc đẩy mối quan hệ cộng sinh cố định nitơ giữa thực vật và
vi khuẩn (Tokala et al., 2002). Streptomyces sống nội sinh có khả năng kiểm
sốt mầm bệnh thực vật, phần lớn là do khả năng tiết ra các chất chuyển hóa thứ
cấp có hoạt tính sinh học. Ví dụ, chủng xạ khuẩn nội sinh trong thí nghiệm của
El-Tarabily và cộng sự có khả năng tăng cƣờng sự phát triển của cây và ngăn
chặn nấm Pythium aphanidermatum lây nhiễm cho cây dƣa chuột. Tƣơng tự,
Streptomyces sp. S96 nội sinh làm giảm bệnh héo xanh do Fusarium và
Magnaporthe oryzae (Cao et al., 2005; Zeng et al., 2018).
Streptomyces giúp cây trồng tăng cƣờng phát triển, tăng trƣởng rễ và tổng
hợp nitơ sinh học, hịa tan khống chất (nhƣ phosphate và kẽm), là tác nhân
kiểm sốt sinh học của cơn trùng gây hại và mầm bệnh thực vật (Aggarwal et
al., 2016). Nhiều tài liệu khoa học đã báo cáo khả năng của Streptomyces
(Tsavkelova et al., 2005; Khamna et al., 2010) trong thúc đẩy tăng trƣởng thực
vật trực tiếp (sản xuất phytohormone) hoặc gián tiếp (sản xuất các enzyme).
Tiềm năng ứng dụng trong thúc đẩy sự sinh trƣởng và phát triển thực vật của
Streptomyces đƣợc ghi nhận tốt với cà chua, lúa mì, gạo, đậu, đậu xanh, bồ câu,
và hạt đậu (Gopalakrishnan et al,. 2020). Actinomycetes đƣợc phát hiện ở vùng
rễ thực vật thể hiện tác động lớn đến quá trình phát triển và sinh lý của chúng.

9


Vai trò của Streptomyces đƣợc đánh giá cao do tiềm năng tăng trƣởng thực vật
của chúng, có tác dụng thúc đẩy sinh trƣởng và chống lại một số loại sinh vật

gây bệnh trên các loại cây trồng nhƣ đậu (Nassar et al., 2003), đậu (Tokala et
al., 2002), bông (Sakurea et al., 2015), lúa mì (Sadeghi et al., 2012). Khả năng
thúc đẩy tăng trƣởng thực vật của Streptomyces đƣợc đánh giá qua quá trình sản
xuất Siderophores và axit Indole-3-axit (Gopalakrishnan et al., 2014). Sản xuất
siderophore cũng là một khía cạnh quan trọng khá của xạ khuẩn trong việc góp
phần làm tăng trƣởng ở thực vật, đƣợc quan sát thấy trong một số chủng
Actinomycetes (Sharma et al., 2020). Streptomyces chiếm khoảng 10% vi sinh
vật trong đất cho thấy vai trò quan trọng khơng thể thiếu của chúng. Các hoạt
động có lợi cho cây trồng của Streptomyces phần lớn là do sự cạnh tranh về chất
dinh dƣỡng và không gian, chất kháng sinh và sản xuất enzyme lytic (Sharma et
al., 2020).
Streptomyces có khả năng sản xuất các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh
học, đó là các chất diệt khuẩn sinh học tiềm năng để phòng trừ các bệnh thực vật
khác nhau (Sharma et al., 2020). Việc sử dụng các chất chuyển hóa thứ cấp do
Streptomyces

sản

xuất

nhƣ

blasticidin-s,

kusagamycin,

streptomycin,

oxytetracycline, polyoxin, natamycin, actinovate, audamectin, audmectin,
eMamectin benzoate, polynactin và milbemycin để kiểm sốt cơn trùng gây hại

và mầm bệnh thực vật ngày càng tăng vì đây là những hoạt chất có tính ứng
dụng cao, dễ phân hủy và ít độc hơn đối với môi trƣờng (Aggarwal et al., 2016).
Ví dụ, Streptomyces sp. Di-944 đã ngăn chặn bệnh héo rũ do Rhizoctonia solani
gây ra ở cây cà chua (Sabaratnam and Traquair, 1996; Sabaratnam and Traquair,
2002) trong khi S. roseolus đƣợc sử dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học chống
lại sự ô nhiễm aflatoxin B1 (Caceres et al., 2018). Tƣơng tự, S. yanglinensis làm
giảm đáng kể sự phát triển của sợi nấm A. flavus, bảo vệ thực phẩm và thức ăn
chăn nuôi khỏi bị nhiễm aflatoxin (Kong et al., 2010; Shakeel et al., 2018). Tại
Nhật Bản, chất chuyển hóa thƣơng mại đầu tiên blasticidin-S đƣợc nghiên cứu
10


từ S. griseochromogenesi, là chất kháng sinh đƣợc sử dụng để quản lý bệnh đạo
ôn (Fukunaga et al., 1955; Takeuchi et al., 1958; Tapadar and Jha, 2013). Sau
đó, một loại kháng sinh khác là Kasugamycin đƣợc phát hiện vào năm 1965 có
nguồn gốc từ S. kasugaensis (Umezawa et al., 1965). Hiện tại, việc sử dụng
blasticidin-S đã giảm đi và nó hiện đƣợc thay thế bằng thuốc diệt nấm mới với ít
độc tính hơn (Copping and Duke, 2007). Kasugamycin hiện vẫn đƣợc bán trên
thị trƣờng. Do độc tính của kasugamycin đối với động vật có vú thấp và khơng
có độc tính thực vật đối với hầu hết các loại cây trồng, nó vẫn đƣợc sử dụng để
bảo vệ chống lại bệnh đạo ơn (Yamaguchi, 1982; Copping and Duke, 2007).
Streptomycetes đóng một vai trò quan trọng trong việc phân hủy các hợp
chất tạo kháng sinh khác nhau, chẳng hạn nhƣ lignin, cellulose, tinh bột, xylan
(hemicellulose), pectin (polygalacturonic acid) và kitin. Khả năng phân giải
chitin phổ biến của Streptomycetes đã thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu
bệnh học thực vật bởi tiềm năng mà nó mang lại. Các chủng Streptomyces spp.
có khả năng phân giải chitin đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi để kiểm sốt sinh học
Fusarium. Enzyme chitinase thơ và một phần tinh khiết của S. griseus có hiệu
quả tƣơng tự nhƣ việc nhúng vào huyền phù bào tử chống lại bệnh héo
Fusarium của cà chua (50-60%). Hoạt động của chitinase và β-1,3-glucanase đã

đƣợc khảo sát ở Paenibacillus sp. 300 và Streptomyces sp. 385, làm giảm 71%
hoặc 64% tỷ lệ héo Fusarium ở dƣa chuột khi đƣợc thêm vào giá thể trồng cây
(Bubici, 2018).
2.1.4.2. Ứng dụng trong y dƣợc.
Actinomycetes đã đƣợc biết đến là nguồn kháng sinh lớn nhất. Hơn 75% tất
cả các loại kháng sinh tự nhiên đƣợc biết đến (nhƣ chloramphenicol, cypemycin,
grisemycin, neomycin và bottromycins) và một phạm vi rộng các hợp chất đa
dạng về cấu trúc với các ứng dụng dƣợc phẩm khác nhau đã đƣợc phân lập từ
Streptomyces (Sathya et al., 2016a). Các loại kháng sinh quan trọng từ

11


Actinomycetes bao gồm anthracyclines, aminoglycoside,  - lactams,
cloramphenicol, macrolides, tetrolacyclines, nucleoside, peptide và polyethers.
Actinomycetes cũng đƣợc sử dụng để tổng hợp chất ức chế enzyme của trọng
lƣợng phân tử thấp. Umezawa và cộng sự (1965) đã báo cáo chất ức chế enzyme
trọng lƣợng phân tử thấp đầu tiên đƣợc sinh ra bởi một chủng streptomycetes.
Kể từ đó, hơn 60 chất ức chế đã đƣợc báo cáo bao gồm cả Leupeptins, ức chế
Papain, Plasmin và trypsin. Một số loại thuốc ức chế enzyme cũng đang đƣợc
nghiên cứu và ứng dụng trong điều trị ung thƣ (Chavan et al. 2013). Các chất
chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính khác nhau đƣợc sử dụng trong y học nhƣ thuốc
chống nhiễm trùng, tăng cƣờng miễn dịch và chống khối u (Challis & Hopwood,
2003), ở ngƣời, động vật và thậm chí trong quản lý bệnh thực vật (Firn & Jones,
2003; Salwan & Sharma, 2018). Các hợp chất hoạt tính sinh học này đã cách
mạng hóa ngành công nghiệp dƣợc phẩm trong thế kỷ 20 và đóng vai trị quan
trọng trong việc phát triển các quy trình cứu sống tiềm năng cho phẫu thuật tim,
trồng rừng chuyển đổi và các lĩnh vực khác (Seipke et al., 2012).
2.2.Tổng quan về nấm gây bệnh trên cây cà phê.
2.2.1. Tổng quan về cây cà phê.

Cà phê thuộc họ thực vật Rubiaceae, chi Coffea (Farah et al., 2015). Hình
dạng của cây cà phê khác nhau tùy thuộc vào loài và giống. Nói chung, cây cà
phê bao gồm một chồi chính (thân) thẳng đứng với các nhánh bên sơ cấp, thứ
cấp và cấp ba. Những cành này đƣợc gọi là chồi ở giai đoạn phát triển và thân ở
giai đoạn cuối. Các lá mọc đối nhau ở các mấu. Mỗi cặp lá đƣợc đặt chéo vị trí
với cặp lá tiếp theo. Lá có vẻ bóng, gợn sóng và có màu xanh đậm với các
đƣờng gân dễ thấy. Ở nách của mỗi lá có bốn đến sáu chồi nối tiếp, và ngay trên
chúng là một chồi lớn hơn một chút gọi là chồi ngồi nách. Cà phê là cây ngắn
ngày, do đó quá trình ra hoa bắt đầu diễn ra trong điều kiện ánh sáng ban ngày

12


8-11h. Về mặt kỹ thuật, hoa hình thành trên cây 1 năm tuổi chỉ hơi cứng. Quá
trình thụ phấn diễn ra trong vịng 6h sau khi cây ra hoa.

Hình 2.1. Cây cà phê.
( />Q trình thụ tinh hồn thành trong vịng 24 - 48h sau khi thụ phấn. Sau
khi thụ phấn, một quả phát triển thành một quả anh đào dài từ 10 đến 15 mm
chứa hai hạt (hạt cà phê). Quả bao gồm lớp vỏ (lớp màng đệm hoặc lớp vỏ
ngoài), là lớp đơn bào chứa chất sáp bảo vệ quả; nó thƣờng có màu đỏ, hồng
đậm, hoặc vàng; lớp thịt quả (mesocarp), bao gồm phần thịt quả có nhiều thịt và
trong quả chín có một lớp dịch nhầy; lớp vỏ trấu là một lớp polysaccharide
mỏng, dễ vỡ vụn, bao phủ nhƣ giấy; lớp vỏ lụa là lớp vỏ hạt đƣợc cấu tạo chủ
yếu bởi polysaccharide, đặc biệt là cellulose và hemicellulose, ngồi ra cịn có
monosaccharide, protein, polyphenol và các hợp chất phụ khác; và hai hạt hình
elip hoặc hình trứng có chứa nội nhũ và phơi (Farah et al., 2015).
2.2.2. Tổng quan về tình hình sản xuất cà phê ở trên thế giới và Việt Nam.
Trên thế giới hiện nay có khoảng 75 nƣớc trồng cà phê với diện tích trên
10 triệu hecta và sản lƣợng hàng năm biến động trên dƣới 6 triệu tấn. Trong đó ở

châu Phi có khoảng 28 nƣớc với năng suất bình qn khơng vƣợt quá 400kg
nhân/ha. Nam Mỹ đạt dƣới 600kg nhân/ha. Bốn nƣớc có diện tích cà phê lớn
nhất đó là: Brazil trên 3 triệu hecta chiếm 25% sản lƣợng cà phê thế giới, Côte
D’lvoire (châu Phi), Indonesia (Châu Á) mỗi nƣớc khoảng 1 triệu hecta và

13