Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro cây ráy mũi tên lá dài (alocasia longiloba)

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
------------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN
NHANH IN VITRO CÂY RÁY MŨI TÊN LÁ DÀI
(Alocasia longiloba)

HÀ NỘI - 2022


HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
------------

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN
NHANH IN VITRO CÂY RÁY MŨI TÊN LÁ DÀI
(Alocasia longiloba)

Người thực hiện

: BẾ TRÚC QUỲNH

Khóa

: 63

Ngành

: CƠNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn

: TS. NINH THỊ THẢO

HÀ NỘI – 2022


1

LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây tồn bộ là kết quả nghiên cứu do tôi thực hiện. Số
liệu và kết quả trong khóa luận này là trung thực và chưa được sử dụng để bảo
vệ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng các thơng tin trích dẫn đều được ghi rõ nguồn gốc
và mọi sự giúp đỡ đều được cảm ơn.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2022

Sinh viên thực hiện

BẾ TRÚC QUỲNH

i


2

LỜI CẢM ƠN

Trong q trình nghiên cứu đề tài khóa luận, tôi đã nhận được sự giúp đỡ
của thầy/cô khoa Công nghệ Sinh học cùng các bạn và các anh chị trong khoa.
Xin chân thành cảm ơn lãnh đạo cùng các thầy/cô khoa Công nghệ Sinh
học Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã quản lý và tổ chức hiệu quả và chất
lượng giúp đỡ tơit rong suốt q trình học tập và nghiên cứu.
Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và lịng biết ơn sâu nhất sắc đến
TS.Ninh Thị Thảo người trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ và tận tình chỉ dạy cho
tơi về cả mặt kiến thức, thái độ làm việc cũng như các kỹ năng cần có trong q
trình thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn các bạn cùng lớp và các anh chị trong khoa đã hỗ
trợ và góp ý để tơi hồn thành tốt bài khóa luận này.
Lời cuối cùng tôi xin phép được gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn
bè đã ln bên cạnh giúp đỡ và động viên tơi trong q trình thực hiện đề tài.
Tuy rằng bài viết cịn nhiều thiếu sót và hạn chế nhưng rất mong nhận
được sự góp ý và nhận xét từ các thầy cô.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2022

Sinh viên thực hiện

BẾ TRÚC QUỲNH

ii


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... ii
MỤC LỤC ........................................................................................................ iii
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... vi
DANH MỤC ẢNH .......................................................................................... vii
TÓM TẮT ....................................................................................................... viii
CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU ...................................................................................... 1
1.1

Đặt vấn đề ................................................................................................ 1

1.2

Mục đích và yêu cầu của đề tài ................................................................. 2

1.2.1

Mục đích đề tài ....................................................................................... 2

1.2.2

Yêu cầu ................................................................................................... 2

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
2.1

Giới thiệu về cây ráy mũi tên lá dài .......................................................... 3

2.1.1

Nguồn gốc và phân bố ............................................................................ 3

2.1.2

Đặc điểm sinh học .................................................................................. 3

2.1.3

Các giá trị sử dụng ................................................................................. 4

2.2

Các phương pháp nhân giống các cây họ ráy ............................................ 5

2.3

Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro cây họ ráy................................ 5

CHƯƠNG III:VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 10
3.1

Đối tượng, vật liệu nghiên cứu ............................................................... 10

3.2

Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................... 10

3.3

Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 10

3.3.1

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng
đến hệ số nhân chồi và chất lượng chồi ráy mũi tên lá dài ................... 10

3.3.2

Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng thích nghi câyráy mũi tên lá dài
ngoài điều kiện vườn ươm .................................................................... 13

3.4

Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 15

3.4.1

Phương pháp bố trí thí nghiệm ............................................................. 15

3.4.2

Phương pháp xử lý số liệu .................................................................... 15

iii


CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 16
4.1

Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến hệ số nhân
chồi và chất lượng chồi cây ráy mũi tên lá dài ...................................... 16

4.1.1 Ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân,chất lượng chồicây ráy mũi tên lá
dài ........................................................................................................ 16
4.1.2 Ảnh hưởng của kinetin đến hệ số nhân và chất lượng chồicây ráy mũi
tên lá dài ...... ……………………………………………………….......19
4.1.3

Ảnh hưởng của TDZ đến hệ số nhân, chất lượng chồicây ráy mũi tên
lá dài ........................... ………………………………………………...21

4.1.4

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và auxin a-NAA đến hệ số nhân chồi và
chất lượng chồi cây ráy mũi tên lá dài.................................................. 23

4.1.5

Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và auxin a-NAA đến hệ số nhân chồi
và chất lượng chồi cây ráy mũi tên lá dài ............................................. 26

4.1.6

Ảnh hưởng của tổ hợp TDZ và auxin a-NAA đến hệ số nhân chồi và
chất lượng chồi cây ráy mũi tên lá dài.................................................. 28

4.2
4.2.1

Nghiên cứu khả năng thích nghi cây ngoài điều kiện vườn ươm............. 30
Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện cây in vitro trong
điều kiện tự nhiên đến tỉ lệ cây sống, khả năng sinh trưởng phát triển
của cây ................................................................................................. 31

4.2.2

Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ cây sống và khả năng sinh trưởng
của cây ráy mũi tên lá dài..................................................................... 33

4.2.3

Ảnh hưởng của thời điểm ra cây đến tỉ lệ cây sống và khả năng sinh

trưởng của cây ráy mũi tên lá dài ......................................................... 36
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN, KIẾN NGHI .........................................................
̣
39
TÀI LIỆU KHAM KHẢO ................................................................................ 39

PHỤ LỤC ........................................................................................................ 42

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Tên đầy đủ

Viết tắt
BA

Benzyladenin

CT

Công thức

ĐC

Đối chứng

LSD 0,05

Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5%

MS

Môi trường Murashige và Skoog, 1962

PM

Peatmoss

P-value

Probability value

TDZ

Thidiazuron

TB

Trung bình

α-NAA

α -Naphthalene Acetic Acid

v


3

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân và chất lượng chồi cây ráy mũi tên
lá dài sau 5 tuần ........................................................................................ 17
Bảng 4.2: Ảnh hưởng của kinetin đến hệ số nhân và chất lượng chồi cây ráy mũi
tên lá dài sau 5 tuần................................................................................... 19

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của TDZ đến hệ số nhân và chất lượng chồicây ráy mũi tên
lá dài sau 5 tuầ n ........................................................................................ 21
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của tổ hợp BA và auxin α-NAA đến hệ số nhân chồi và chất
lượng chồi cây ráy mũi tên lá dài sau 5 tuầ n.............................................. 24
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và auxin α-NAA đến hệ số nhân chồi và
chất lượng chồi cây ráy mũi tên lá dài sau 5 tuầ n ...................................... 26
Bảng 4.6: Ảnh hưởng của tổ hợp 0,1 mg/l TDZ và a α-NAA đến hệ số nhân chồi
và chất lượng chồi cây ráy mũi tên lá dài sau 5 tuầ n .................................. 28
Bảng 4.7: Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến khả năng sinh trưởng của cây
ráy mũi tên lá dài in vitro trong điều kiện tự nhiên .................................... 32
Bảng 4.8:Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ ra cây sống và khả năng sinh trưởng của
cây ráy mũi tên lá dài ................................................................................ 34
Bảng 4.9: Ảnh hưởng của thời điểm trồng đến tỷ lệ ra cây sống và khả năng sinh
trưởng của cây ráy mũi tên lá dài .............................................................. 36

vi


4

DANH MỤC ẢNH

Hình 2.1: Cây ráy mũi tên lá dài (Alocasia longiloba).................................................. 4
Hình 3.1: Chồi in vitro cây ráy mũi tên lá dài............................................................. 10
Hình 4.1: Chồi cây ráy mũi tên lá dài trên môi trường bổ sung BA ở nồng độ 0 mg/l
(a); 0,1 mg/l(b); 0,5 mg/l (c); 1,0 mg/l (d) và 2,0 mg/l (e) sau 5 tuần ............... 18
Hình 4.2. Chồi cây ráy mũi tên lá dài trên môi trường bổ sung kinetin ở nồng độ ...... 20
Hình 4.3: Chồi cây ráy mũi tên lá dài trên môi trường bổ sung TDZ ở các nồng độ
0mg/l (a); 0,05 mg/l (b); 0,1 mg/l (c); 0,5 mg/l (d); 1,0 mg/l (e) sau 5 tuần .... 22
Hình 4.4: Chồi cây ráy mũi tên lá dài trên môi trường bổ sung α-NAA ở các nồng

độ 0mg/l (a); 0,1 mg/l (b); 0,25 mg/l (c); 0,5 mg/l (d); 0,75 mg/l (e)
sau 5 tuần .................................................................................................. 25
Hình 4.5: Chồi cây ráy mũi tên lá dài trên môi trường bổ sung α-NAA ở các nồ ng
đô ̣ 0 mg/l (a); 0,1 mg/l (b); 0,25 mg/l (c); 0,5 mg/l (d); 0,75 mg/l (e);
1,0 mg/l (f) sau 5 tuần ............................................................................... 27
Hình4.6: Chồi cây ráy mũi tên lá dài trên mơi trường bổ sung α-NAA ở các nồng độ
0 mg/l (a); 0,1 mg/l (b); 0,25 mg/l (c); 0,5 mg/l (d); 0,75 mg/l (e) sau 5 tuần ... 29
Hình 4.7: Chồi cây ráy mũi tên lá dài trên môi trường MS + 30g/l đường sau 6
tuần ni cấy............................................................................................. 31
Hình 4.8: Cây ráy mũi tên lá dài huấn luyện trước khi ra cây 0 ngày (a); 5 ngày
(b); 10 ngày (c); 15 ngày (d) sau 4 tuần. .................................................... 33
Hình 4.9: Cây ráy mũi tên lá dài trồng ở giá thể Đất: PM: Cát (1:1:1) (a); Đất: PM
(1:2) (b); Đất: PM: Cát (2:2:1) (c); Đất: PM(1:1) (d) sau 4 tuần ................ 35
Hình 4.10: Cây ráy mũi tên lá dài trồng ngày 20/04/2022 (a); 11/05/2022 (b) ;
01/06/2022 (c) vào giá thể đất: PM (1:1) sau 4 tuần .................................. 37

vii


5

TÓM TẮT

Ráy mũi tên lá dài là một loại cây lâu năm nhiệt đới, có củ và hoa thường
được dùng làm trang trí nhà cửa được phân bố rộng rãi trên thế giới và đặc biệt
là với giới chơi cây kiểng lá tại Việt Nam. Nghiên cứu này với mu ̣c đić h nghiên
cứu xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro cây ráy mũi tên lá dài, khảo sát các
môi trường nhân nhanh in vitro và các yế u tố ảnh hưởng đế n khả năng sinh
trưởng của cây ở giai đoa ̣n vườn ươm, nhằm góp phần xây dựng quy trình nhân
giống vớihệ số nhân giống cao, chất lượng tốt làm cơ sở cho việc cung cấp đủ

nhu cầu thị trường hiện nay cũng như tạo ra nguồn vật liệu sạch để tiến hành các
nghiên cứu khoa học của cây ráy mũi tên lá dài.
Kế t quả cho thấ y rằ ng, bổ sung BA ảnh hưởng tić h cực tới hê ̣ số nhân
chồ i và chấ t lươṇ g chờ i. Tuy nhiên mơi trường thích hơ ̣p để nhân nhanh chồi
cây ráy mũi tên lá dài là MS + 0,05 mg/l TDZ cho hệ số nhân chồi đạt cao nhấ t
là 4,63 lần. Bổ sung kinetin vào mơi trường nhân nhanh khơng có ảnh hưởng
khác biệt đến hệ số nhân và chất lượng chồi. Bên cạnh đó, các chồi ráy mũi tên
lá dài có thể tạo rễ trên môi trường MS cơ bản.
Ở giai đoa ̣n vườn ươm, thời gian huấ n luyê ̣n cây ở điều kiện tự nhiên
trước khi ra cây không làm ảnh hưởng gì đế n tỷ lê ̣ số ng và sự sinh trưởng của
cây. Giá thể phù hơ ̣p để tiếp nhận với cây ráy mũi tên lá dài in vitro là đấ t:
peatmoss (tỷ lê ̣ 1:2), cho tỷ lệ cây sống đạt 100%.Thời điể m thích hơ ̣p để ra cây
là cuố i tháng 4 – đầu tháng 5 (20/4 - 11/5) là thời giao mùa giữa xuân và ha ̣,
ngược lại khi nuôi trồng cây trong điều kiện nhiệt độ cao ảnh hưởng tới sự phát
triển của cây.
Kế t quả nghiên cứu đã giúp thiế t lâ ̣p đươ ̣c quy trình nhân nhanh in vitro
của cây ráy mũi tên lá dài, góp phầ n sản xuấ t lươṇ g lớn cây chấ t lươṇ g cao đế n
thi trươ
̣
̀ ng cây cảnh Viê ̣t Nam.

viii


1

CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay, cùng với sự phát triển của kinh tế – xã hội, nhu cầu sử dụng cây

cảnh của con người càng ngày càng tăng nhanh. Trong đó có cây Alocasia
longiloba – Ráy mũi tên lá dài được mọi người ưa thích và sưu tầm.Cây ráy mũi
tên lá dài sở hữu tán lá lớn bắt mắt, là loại cây thích hợp trang trí nhà ở, cơ quan,
các nhà hàng khách sạn khiến cho không gian trở nên sang trọng, tươi mát và
trong lành hơn. Bên cạnh đó cây ráy mũi tên lá dài có tác dụng tiêu viêm, sát
khuẩn. Do vậy, loài cây này còn được dùng làm thuốc để hỗ trợ điều trị bệnh, là
nguyên liệu trong số bài thuốc chữa ho, giảm đau đầu, đau khớp (Nguyễn Văn
Dư và cs. 2003). Ở Ấn Độ, người ta dùng dịch từ thân cây để chữa bọ cạp cắn
(). Chính vì có nhiều cơng dụng nên loại cây này đang
đang rất được ưa chuộng và làm tăng cao nhu cầu của thị trường.
Các cây họ ráy được nhân giống chủ yếu bằng các phương pháp tách cây
con (). Các phương pháp truyền thống này rất dễ bị ảnh
hưởng bởi các yếu tố ngoại cảnh như điều kiện môi trường, cây non dễ bị nhiễm
bệnh và có thể mang các mầm bệnh từ cây mẹ hoặc cây con khơng giữ được
những tính trạng tốt của cây mẹ. Bên cạnh đó, việc thiếu nguồn ngun liệu vơ
trùng sẽ gây khó khăn khi tiến hành các nghiên cứu sâu hơn trong các lĩnh vực
khoa học ở loại cây này. Ở thế giới và Việt Nam nói riêng đã có những nghiên
cứu về phương pháp nhân nhanh in vitro đối với một số cây họ ráy nhưng chưa
có cơng bố chính thức nào về nghiên cứu nhân nhanh in vitro cây ráy mũi tên lá
dài.
Nhằm góp phần xây dựng quy trình nhân giống vớihệ số nhân giống cao,
chất lượng tốt làm cơ sở cho việc cung cấp đủ nhu cầu thị trường hiện naycũng
như tạo ra nguồn vật liệu sạch để tiến hành các nghiên cứu khoa học của cây ráy
mũi tên lá dài, tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh
in vitro cây ráy mũi tên lá dài (Alocasia longiloba)”.

1


1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài

1.2.1 Mục đích đề tài
Xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro cho cây ráy mũi tên lá dài
(Alocasia longiloba) làm cơ sở nhân giống cây chất lượng cao.
1.2.2 Yêu cầu
 Xác định được mơi trường thích hợp để nhân nhanh chồi in vitro cây
Alocasia longiloba.
 Xác định được các yếu tố thích hợp ảnh hưởng đến khả năng thích nghi của
cây ngoài điều kiện vườn ươm.

2


2 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về cây ráy mũi tên lá dài
2.1.1 Nguồn gốc và phân bố
Ráy mũi tên lá dài là một loại cây nhiệt đới, có củ và hoa thường được
dung trang trí nhà cửa được phân bố rộng rãi trên thế giới và đặc biệt là với giới
chơi cây kiểng lá tại Việt Nam.
Ráy mũi tên lá dài (tên khoa học: Alocasia longiloba) là một loài thực vật
thuộc chi ráy (Alocasia) thuộc họ nhà ráy (Araceae) còn được gọi với tên gọi
khác là ráy lá dài. Loài này được Miquel – nhà thực vật học mơ tả khoa học đầu
tiên năm 1856 ().
Lồi cây này xuất phát từ Trung Quốc, Ấn Độ, Lào, Thái Lan, Việt Nam,
Malaysia, Inđônêxia. Ở nước ta, cây ráy mũi tên lá dài mọc khá phổ biến ở rừng
miền Trung (Quảng Nam–Ðà Nẵng, Khánh Hòa, Lâm Ðồng) và ở miền Nam
(Ðồng Nai, Kiên Giang) ().
Cây thường mọc và phát triển tốt vùng khí hậu nhiệt đới, nhưng cũng có
thể phát triển ở các khu vực ôn đới, nơi ấm áp như trong rừng đầm lầy, bụi tre,
vách đá, đá vôi, trên các vách đá và khe núi lộ thiên, ở các bờ sông.
2.1.2 Đặc điểm sinh học

Cây ráy mũi tên lá dài là một loại cây thân thảo có thể cao tới 1,4 – 1,5 m.
Các tán lá lớn, có hình mũi tên màu xanh lục nhạt rộng từ 10-14 cm, có hoặc
khơng có gân trắng, thùy cuối thn tam giác và nhọn ở phần đầu (Hình 1). Hoa
thường mọc thành một chồi dài từ 6 – 13 cm được bao bọc bởi một chiếc lá đã bị
biến đổi màu từ xanh sang trắng dài 9 – 10 cm.Quả mọng, hình cầu, màu camvà
có hạt. Thường ra quả vào tháng 12.
Cây ráy mũi tên lá dài là cây bóng râm và không chịu được lạnh nên
thường được trồng trong nhà hoặc sân vườn có mái che. Khi trồng trong nhà cần
có ánh sáng tốt và cần được phun sương để cây có thể sống tốt trong thời gian

3


dài. Chi alocasia phát triển thuận lợi vào đầu hè, vào thời điểm này lá phát triển
nhanh hơn và có thể to gấp đơi kích thước lúc đầu. Khi vào cuối thu, đầu đông,
thời tiết trở lạnh cây sẽ tiến vào thời kỳ ngủ đông, phát triển chậm và gần như
khơng có sự khác biệt.
Cây cần độ ẩm để phát triển tốt. Cây cần trồng ở loại đất giàu dinh dưỡng,
thoát nước tốt và tưới nước thường xuyên, đặc biệt là khi lớn hơn. Nhưng khi
tưới quá nhiều nước có thể dẫn đến thối rễ.

Hình 2.1: Cây ráy mũi tên lá dài (Alocasia longiloba)
2.1.3 Các giá trị sử dụng
Hiện nay, cây ráy mũi tên lá dài đang được ưa chuộng bởi những người
chơi cây kiểng lá vì mang lại cảm giác tươi mát, sang trọng cho khu vườn, sân,
phòng khách hoặc một số sảnh tòa nhà, khách sạn bởi những tán lá lớn đẹp mắt.
Nhiều nghiên cứu cũng cho thấy, cây ráy mũi tên lá dài cịn có những tác
dụng trong y học như tiêu viêm sát khuẩn, dịch cây còn được dùng nhỏ vào các
vết thương mưng mủ của gia súc như một số nơi tại Trung Quốc
(). Theo y học cổ truyền, cây ráy có tính lạnh, ngứa và độc.

Kinh nghiệm nhân dân thường dùng củ ráy xát vào chỗ bị ngứa do chạm phải lá han,
nấu nước tắm hoặc chế cao chữa mề đay, mụn nhọt, vết thương. Ở Campuchia,
người ta cũng dùng củ ráy để chữa ghẻ ngứa (Nguyễn Văn Dư và cs. 2003;
).

4


2.2 Các phương pháp nhân giống các cây họ ráy
- Nhân giống bằng tách cây con, cụm rễ:
Họ ráy thường phát triển cây con ở gốc cây mẹ nên thường được nhân
giống chủ yếu bằng các phương pháp tách cây con, cụm rễ. Nên thực hiện vào
cuố i xuân đầu hè, khi cây bắt đầu tiến vào thời kỳ sinh trưởng
(). Khi tách cần tạo độ ẩm cho giá thể để dễ dàng tách
cây ra khỏi chậu. Vì chi alocasia thường mọc rễ thành từng cụm nên cần cẩn thận
tách cụm rễ con ra khỏi rễ chính bằng tay hoặc dao đã sát khuẩn, tránh gây tổn
thương cho cây. Cuối cùng trồng cây con vào giá thể và chậu thích hợp, tưới
nước bằng cách phun sương và chăm sóc cây như bình thường. Sau khoảng 2
tuần cây con sẽ mọc rễ và phát triển tốt (). Đây là một phương
pháp nhân giống được sử dụng phổ biến và rộng rãi.
Tuy nhiên cách nhân giống này lại dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố ngoại
cảnh như điều kiện môi trường, cây con có thể dễ bị nhiễm bệnh, mang theo mầm
bệnh từ cây mẹ hoặc khơng mang những tính trạng tốt của cây mẹ gây nên chất
lượng cây con giảm.
- Nhân giống in vitro: Tuy có yêu cầu về kỹ thuật, máy móc và chi phí cao
nhưng với u cầu về số lượng và chất lượng cây giống hiện nay thì nhân giống
in vitro là một lựa chọn vơ cùng hợp lý khi có thể đáp ứng các yêu cầu của người
tiêu dùng hiện nay.
2.3 Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro cây họ ráy
Hiện nay trên thế giới đã có những nghiên cứu về phương pháp nhân giống

in vitro các giống cây họ ráy nhưng trên đối tượng cây ráy mũi tên lá dài
(Alocasia longiloba) thì cịn rất hạn chế.
2.4.1 Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro cây họ ráy ngồi nước
Trong số ít các nghiên cứu về quá trình nhân nhanh in vitro giống cây ráy
mũi tên lá dài thì có nghiên cứu của Ahmed et al. (2007) đã nghiên cứu quá trình
nhân nhanh in vitro cây Acorus calamus L..Sử dụng thân rễ để làm mẫu cấy và
5


được nuôi trên môi trường MS được bổ sung các nồng độ khác nhau của
cytokinin hoặc kết hợp cytokinin và auxin để nhân nhanh. Môi trường nhân
nhanh phù hợp là MS + 2,0 mg/l kinetin + 0,05mg/l α-NAA với tỷ lệ nhân chồi là
98,99%. Đối với sự ra rễ của chồi môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l IBA cho tỷ lệ
ra rễ là 40,51%. Sau khi cho cây ra ngồi vườn ươm thì có đến 80% cây khỏe
mạnh.
Han Bong-Hee và Park Byoung-Mo (2008) đã nghiên cứu nhân giống in
vitro cây Philodendron cannifolium. Vật liệu chồi đỉnh sau khi khử trùng được
ni cấy trên mơi trường MS có bổ sung 0,5–10,0 mg/l BA hoặc 0,05–0,1
mg/l TDZ. Các cụm đa chồi được hình thành trên mơi trường MS có chứa 2,05,0 mg/l BA hoặc 0,05 – 0,1 mg/l TDZ. Tuy nhiên, các chồi hình thành trên
mơi trường MS có bổ sung TDZ có biểu hiện hoại tử do thiếu chất diệp lục.
Các chồi đơn sau đó được tách từ cụm chồi và nhân nhanh trên mơi trường
MS có chứa BA và TDZ. Hệ số nhân nhanh đạt được cao nhất trên môi trường
MS + 1,0-3,0 mg/l BA. Nghiên cứu cũng đã xác định được mơi trường ra rễ thích
hợp cho chồi Philodendron cannifoliumlà MS + 0,5–2,0 mg/l IBA. Giá thể thích
hợp để tiếp nhận cây in vitro là đất:đá trân châu:đá vermiculite (1:1:1) hoặc đá
vermiculite 100%. Để tăng khả năng thích nghi cây ngoài điều kiện tự nhiên, các
chồi in vitro trước khi chuyển vào trồng trong giá thể được nhúng vào dung dịch
IBA ở nồng độ 500–2000 mg/l trong 10 giây.
Năm 2010 Lai-Keng và Yoke Theng đã có một nghiên cứu thiết lập hệ
thống nhân giống in vitro cho cây cây Alocasia longiloba Miq.Watsoniana. Trong

nghiên cứu đã sử dụng thân rễ để làm mẫu cấy để nhân chồi và chọn được môi
trường nhân nhanh tốt nhất là môi trường MS bổ sung 2,0 mg/l BA và 0,5mg/l
IBA. Mẫu chồi được cắt dọc và cấy trên môi trường nhân nhanh lỏng trên hệ
thống bình lắc có hệ số nhân chồi nhiều hơn so với mẫu không được cắt dọc.
Stanly và cs. (2012) đã tiến hành nhân giống loài cây thiên niên kiện
(Homalomena pineodora Sulaiman & Boyce) (họ Ráy): một loài mới từ
Malaysia. Các chồi in vitro được nuôi cấy trên môi trường MS. Điều kiện tốt nhất
để nhân giống cây thiên niên kiện là môi trường MS + 3% sucrose + 0,5 mg/l BA
6


dưới ánh sáng huỳnh quang 24 giờ, tạo ra trung bình 3,8 chồi mỗi mẫu. Mơi
trường MS lỏng + 0,5 mg/l BA thu được hệ số nhân chồi thiên niên kiện cao hơn
so với môi trường MS + 0,5 mg/l BA có bổ sung agar. Tất cả các cây con in vitro
của cây thiên niên kiện đã được chuyển ra vườn ươm thành cơng với tỷ lệ sống
sót 100%.
Một nghiên cứu khác của Bhatt et al. (2013) là nhân giống in vitro năm
lồi Alocasia. Trong đó có nghiên cứu về giống cây giống ráy mũi tên lá dài
(Alocasia longiloba Miq.) tìm ra được mơi trường nhân nhanh tốt nhất là MS bổ
sung BA ở nồng độ 2,0 mg/l. Bên cạnh đó, mơi trường nhân nhanh có cùng thành
phần ở trạng thái lỏng trong hệ thống bình lắc cho hệ số nhân chồi cao hơn so với
môi trường thạch. Cuối cùng các cây in vitro sau khi ra vườn ươm có tỷ lệ sống là
90%.
Ferid et al. (2020) nghiên cứu về vi nhân giống cây Alocasia longiloba
Miq. Nhóm đã nhân nhanh chồi in vitro bằng cách sử dụng nhiều loại cytokinin
đơn lẻ hoặc kết hợp với auxinvà tìm thấy mơi trường nhân nhanh tốt nhất là sử
dụng 6-Benzylaminopurine (BA) ở nồng độ 3,0 mg/l. Bổ sung axit indole-3acetic (IAA) ở nồng độ 0,5 mg/l là thích hợp nhất để tạo rễ cho chồi. Giá thể
thích hợp để tiếp nhận cây in vitro là đất: peatmoss (tỷ lệ 1:2).
2.4.1 Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro cây họ ráy trong nước
Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến hệ số nhân cây

ráy (Alocasia odora c.koch) thực hiện bởi Trần Thị Liên và Phạm Văn Hiển
(2004). Chồi Alocasia odora c.koch được lấy từ các cây trồng, lưu giữ tại vườn
cây thuốc của trung tâm nghiên cứu cây thuốc của Viện dược liệu - Hà Nội. Các
mẫu này được rửa sạch bằng nước xà phịng lỗng, ngâm thuốc diệt nấm và khử
trùng bề mặt, tráng lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng rồi cấy vào môi trường
MS. Các chất điều tiết sinh trưởng được bổ sung vào môi trường MS với các tổ
hợp và nồng độ khác nhau. Mỗi cơng thức thí nghiệm được bố trí 3 lần nhắc lại,
mỗi lần quan sát tối thiểu 12 mẫu. Phịng ni cấy được duy trì ở nhiệt độ 2527°C, độ ẩm 70%, cường độ chiếu sáng 2000 lux với chu kỳ chiếu sáng
7


14h/ngày. Thí nghiệm nghiên cứu khả năng tái sinh chồi Alocasia odora c.koch
trên mơi trường MS có bổ sung agar, cơng thức thích hợp nhất để tái sinh chồi
giống cây trên là: MS + 3 mg/1 BA số chồi trung bình đạt 3,92 chồi/mẫu ni
cấy; cơng thức MS + 3 mg/1 BA + 0,2 mg/l IBA số chồi trung bình đạt 3,7
chồi/mẫu nuôi cấy. Trên nền môi trường lỏng MS + 1 mg/1 BA + 0,2 mg/l IBA
số chồi trung bình đạt 5,25 chồi/mẫu ni cấy. Ở giai đoạn đưa cây ra vườn ươm,
dùng giá thể trấu hun + cát (tỷ lệ 1:1), đạt tỷ lệ sống 93,47% là tốt nhất.
“Quy trình nhân nhanh in vitro cây Trầu bà cánh phượng (Philodendrom
xanadu)” thực hiện bởi Phạm Thị Thu Hằng và cs. (2013). Nhóm nghiên cứu đã
tiến hành ni cấy chồi đỉnh trên các mơi trường MS có bổ sung BA hay kinetin.
Kết quả cho thấy, môi trường MS bổ sung 4,0 mg/l BA là môi trường tối ưu, với
5,01 chồi/mẫu sau 4 tuần nuôi cấy. Nghiên cứu cũng đã tiến hành thí nghiệm sự
ảnh hưởng phối hợp của BA với auxin (IAA, IBA) để xác định mơi trường nhân
nhanh thích hợp tạo cây in vitro hồn chỉnh. Trên mơi trường MS có chứa 4,0
mg/l BA thì bổ sung IAA hay IBA không làm tăng hệ số nhân nhanh. alpha-NAA
hay than hoạt tính đều có ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành rễ của chồi in
vitro. Mơi trường MS có bổ sung 1 g/l than hoạt tính là mơi trường ra rễ thích
hợp nhất sau 4 tuần ni cấy. Sau giai đoạn nhân in vitro, các cây con được
chuyển sang điều kiện vườn ươm trên bốn loại giá thể. Tỉ lệ sống của cây con

trên các giá thể khác nhau đạt 100% sau bốn tuần ra cây, trong đó, giá thể xơ dừa:
trấu hun (tỉ lệ 1:1) cho chất lượng cây tốt nhất.
Trần Văn Tiến và cs. (2017) đã nghiên cứu nhân giống in vitro loài Nưa
konjac (Amorphophallus konjac). Chồi đỉnh Nưa konjac được khử trùng sau đó
ni cấy trên mơi trường MS có bổ sung cytokinin để tái sinh chồi và mơi trường
MS có bổ sung auxin để tạo cây hồn chỉnh. Cơng thức mơi trường dinh dưỡng
thích hợp nhất để tái sinh chồi Nưa konjac in vitro là MS + 2,0 mg/l BA+ 0,2
mg/l KI + 8 g/l agar + 30 g/l sucrose, trung bình đạt 5,22 chồi/mẫu và chiều cao
trung bình của chồi là 3,84 cm, chất lượng chồi tốt. Công thức môi trường ra rễ
tốt nhất là ½ MS + 0,4 mg/l IBA + 1 g/l than hoạt tính+ 8 g/l agar + 14 g/l
sucrose, tỷ lệ chồi ra rễ đạt 100%, số rễ trung bình/chồi là 4,98, chiều dài trung

8


bình của rễ đạt 2,67 cm, sau 7 ngày ni chồi bắt đầu ra rễ. Giá thể thích hợp nhất
để cây in vitro thích nghi trong điều kiện tự nhiên là 50% đất + 30% cát + 20%
trấu hun, tỷ lệ cây sống cao nhất đạt 94,07% (sau 4 tuần trồng). Cây khỏe mạnh,
sinh trưởng và phát triển bình thường.

9


CHƯƠNG III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: cây ráy mũi tên lá dài (Alocasia longiloba) in vitro
được cung cấp bởi bộ môn CNSH Thực vật, khoa Công nghệ sinh học, Học viện
Nông nghiệp Việt Nam.
- Vật liệu nghiên cứu: chồi in vitro cây ráy mũi tên lá dài.

Hình 3.1: Chồi in vitro cây ráy mũi tên lá dài
3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Phịng thí nghiệm Bộ mơn CNSH Thực vật, Khoa Công nghệ
sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Từ tháng 2/2022 – 7/2022.
3.3 Nội dung nghiên cứu
3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến
hệ số nhân chồi và chất lượng chồi ráy mũi tên lá dài
Các chồi ráy mũi tên lá dài in vitro có chiều cao 1-2 cm được cấy trên mơi
trường MS + 30 g/l đường có bổ sung BA, kinetin, TDZ riêng rẽ hoặc kết hợp với
α-NAA ở các nồng độ khác nhau để khảo sát ảnh hưởng của chất điều tiết sinh
trưởng đến hệ số nhân và chất lượng chồi.
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân và chất lượng chồi ráy
mũi tên lá dài

10


Cơng thức

BA (mg/l)

1

0

2

0,1

3

0,5

4

1,0

5

2,0

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của kinetin đến hệ số nhân và chất lượng chồi
ráy mũi tên lá dài
CT

Kinetin (mg/l)

1

0

2

0,5

3

1,0

4

2,5

5

5,0

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của TDZ đến hệ số nhân và chất lượng chồi ráy
mũi tên lá dài
CT

TDZ (mg/l)

1

0

2

0,05

3

0,1

4

0,5

5

1,0

11


Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của tổ hợp BA và auxin α-NAA đến hệ số nhân
chồi và chất lượng chồi ráy mũi tên lá dài
CT

Nồng độ BA (mg/l)

1
2
3

Nồng độ α-NAA (mg/l)
0

Chọn nồng độ tối ưu từ
TN1

0,1
0,25

4

0,5

5

0,75

Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và auxin α-NAA đến hệ số
nhân chồi và chất lượng chồi ráy mũi tên lá dài
CT

Nồng độ kinetin (mg/l)

1
2
3

Nồng độ α-NAA (mg/l)
0

Chọn nồng độ tối ưu từ
TN2

0,1
0,25

4

0,5

5

0,75

12


Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của tổ hợp TDZ và auxin α-NAA đến hệ số
nhân chồi và chất lượng chồi ráy mũi tên lá dài
CT

Nồng độ TDZ (mg/l)

Nồng độ α-NAA (mg/l)

1

0

2

0,01

3

Chọn nồng độ tối ưu từ

0,025

TN3

4

0,05

5

0,075

3.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến q trình thích nghi
cây ráy mũi tên lá dài in vitro ngoài điều kiện vườn ươm
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện cây in vitro
trong điều kiện tự nhiên đến tỉ lệ cây sống và khả năng sinh trưởng phát triển của
cây
Các thí nghiệm sử dụng mẫu cây invitro cao từ 4-5 cm, 1 - 2 lá, bô ̣ rễ khỏe,
cây sinh trưởng phát triển tốt đươ ̣c đă ̣t ra ngoài tự nhiên trong 5,10,15 ngày. Sau
đó lấ y cây in vitro ra khỏi môi trường agar, rửa sạch agar. Chuẩn bị giá thể bằng
cách trộn các thành phần gồm đất: peatmoss: cát (tỷ lệ 1:1:1) và tạo độ ẩm phù
hợp cho giá thể. Tiếp đó trồng cây vào giá thể. Cuối cùng sử dụng túi nilong
trắng bọc khay trồng để giữ độ ẩm cho giá thể và cây trong vịng 5-7 ngày. tưới ¼
MS bắt đầu từ tuần thứ 2, 1 lần/tuần.

1

Thời gian huấn luyện
(ngày)
0

2

5

3

10

4

15

CT

13


Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ cây sống và khả năng sinh
trưởng của cây
Các thí nghiệm sử dụng mẫu cây in vitro cao từ 4 - 5cm, 1 – 2 lá, bộ rễ
khỏe, cây sinh trưởng, phát triển tốt. Sau đó lấ y cây in vitro ra khỏi môi trường
agar, rửa sạch agar. Chuẩn bị giá thể bằng cách trộn các thành phần theo từng
công thức và tạo độ ẩm phù hợp cho giá thể. Tiếp đó trồng cây vào giá thể. Cuối
cùng sử dụng túi nilong trắng bọc khay trồng để giữ độ ẩm cho giá thể và cây
trong vòng 5-7 ngày. Tưới nước hàng ngày vào sáng và chiều, tưới ¼ MS bắt đầu
từ tuần thứ 2, 1 lần/tuần.
CT

Giá thể

1

Đất: peatmoss(1:1)

2

Đất: peatmoss(1:2)

3

Đất: peatmoss: cát (2:2:1)

4

Đất: peatmoss: cát (1:1:1)

Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của thời điểm ra cây đến tỉ lệ cây sống và khả
năng sinh trưởng của cây
Trong thí nghiệm này, các cơng thức được trồng vào các ngày khác nhau
(các công thức cách nhau 3 tuần). Chọn những mẫu cây in vitro cao từ 4 - 5 cm, 1
– 2 lá, bô ̣ rễ khỏe, cây sinh trưởng phát triển tốt đươ ̣c đă ̣t ra ngoài tự nhiên trong
5, 10, 15 ngày. Sau đó lấ y cây in vitro ra khỏi môi trường agar, rửa sạch agar.
Chuẩn bị giá thể bằng cách trộn các thành phần gồm đất: peatmoss (tỷ lệ 1:1) và
tạo độ ẩm phù hợp cho giá thể. Tiếp đó trồng cây vào giá thể. Cuối cùng sử dụng
túi nilong trắng bọc khay trồng để giữ độ ẩm cho giá thể và cây trong vòng 5-7
ngày. Tưới nước hàng ngày vào sáng và chiều, tưới ¼ MS bắt đầu từ tuần thứ 2, 1
lần/tuần.

14


CT

Ngày ra cây

Nhiệt độ

1

20/04/2022

24 oC -28 oC

2

11/05/2022

26 oC -30 oC

3

01/06/2022

27 oC -33 oC

3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm
- Các thí nghiệm về nhân nhanh:
+ Mỗi chồi in vitro được coi là một mẫu, mỗi công thức thực hiện khoảng
20-30 mẫu tùy từng thí nghiệm.
+ Các mơi trường ni cấy sử dụng trong thí nghiệm là môi trường MS
(Murashige và Skoog,1962) bổ sung 30 g/l đường và lượng agar khoảng 6g/l với
pH dao động từ 5,7 – 5,8.
+ Môi trường được hấp khử trùng ở 121 oC trong 20 phút.
+ Các mẫu nuôi cấy in vitro được để dưới ánh sáng của đèn neon, thời gian

chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng 2000 - 2500 lux và nhiệt độ
phịng ni cây từ 23 – 25 oC.
3.4.2 Phương pháp xử lý số liệu
- Các chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỷ lệ cây sống (%) =
+ Hệ số nhân chồi =
+ Chiều cao chồi =
+ Số lá/chồi =

𝑆ố 𝑐â𝑦 𝑠ố𝑛𝑔
𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑐â𝑦 𝑡𝑟ồ𝑛𝑔

× 100

𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑐ℎồ𝑖 𝑚ớ𝑖 ℎì𝑛ℎ 𝑡ℎà𝑛ℎ
𝑆ố 𝑐ℎồ𝑖 đ𝑜 đế𝑚

𝑇ổ𝑛𝑔 𝑐ℎ𝑖ề𝑢 𝑐𝑎𝑜 𝑐ℎồ𝑖
𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑐ℎồ𝑖

𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑙á/𝑐ℎồ𝑖
𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑐ℎồ𝑖

+ Mô tả đặc điểm của các chồi: màu sắc, kích thước, hình dạng của chồi,lá
cây invitro.
- Phương pháp xử lý số liệu: Các số liệu được phân tích thống kê bằng
phần mềm Excel, so sánh giá trị trung bình bằng phần mềm Infostat.

15