Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hoa huệ hương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ Y THANH
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN
GIỐNG IN VITRO CÂY HOA HUỆ HƯƠNG
(POLIANTHES TUBEROSA L.)
LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP
Chuyên ngành : Trồng trọt
Mã số : 60.62.01
Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. NGUYỄN QUANG THẠCH
HÀ NỘI – 2009
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung
thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho luận văn này đã được cảm ơn và các
thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Tác giả

Nguyễn Thị Y Thanh
i
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã
nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo, bạn bè,
người thân và các cơ quan đơn vị.
Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo đã trực tiếp
giảng dạy, trang bị những kiến thức bổ ích cho tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo trong Bộ môn
Công nghệ sinh học – Sinh học phân tử và công nghệ vi sinh đã chân thành đóng
góp ý kiến quý báu giúp cho luận văn của tôi được hoàn thiện hơn.
Đặc biệt tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Nguyễn Quang

Thạch đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện
luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ công nhân viên Phòng Công nghệ
sinh học, Trung tâm Ứng dụng tiến bộ khoa học và công nghệ - Sở Khoa học và
Công nghệ tỉnh Bình Định đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong suốt thời gian thực tập.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả người thân, bạn bè,
những người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực
hiện đề tài.
Tác giả

Nguyễn Thị Y Thanh
ii
MỤC LỤC
Lời cam đoan Error: Reference source not found
Lời cảm ơn Error: Reference source not found
Mục lục Error: Reference source not found
Danh mục chữ viết tắt Error: Reference source not found
Danh mục bảng Error: Reference source not found
Danh mục hình Error: Reference source not found
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
1. MỞ ĐẦU
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
MS : Murashige and Skoog, 1962.
BA : benzyl adenin
IBA : indol butyric acid
α-NAA : α-naphtyl acetic acid
2,4-D : 2,4 diclorophenoxy acetic acid
IAA : indol acetic acid
ĐC : Đối chứng
PSHT : Phát sinh hình thái
CT : Công thức
iv
DANH MỤC BẢNG
STT Tên bảng Trang
Bảng 4.1. Ảnh hưởng HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến
hiệu quả khử trùng mẫu (sau 4 tuần nuôi cấy) 38
Bảng 4.2. Ảnh hưởng kết hợp của HgCl2 0,1% trong 15 phút và
Ca(OCl)2 15% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử
trùng mẫu (sau 4 tuần nuôi cấy) 40
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của kinetin ở các nồng độ khác nhau đến khả
năng phát sinh hình thái của mẫu cấy (sau 8 tuần nuôi cấy) 43
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của BA ở các nồng độ khác nhau đến khả năng
phát sinh hình thái của mẫu cấy (sau 8 tuần nuôi cấy) 44
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và các auxin đến khả năng phát
sinh hình thái của mẫu cấy (sau 8 tuần nuôi cấy) 48
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến hệ số nhân chồi và

chiều cao chồi 52
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IAA đến hệ số nhân chồi và
chiều cao chồi (sau 6 tuần nuôi cấy) 54
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và α-NAA đến hệ số nhân và
chiều cao chồi (sau 6 tuần nuôi cấy) 58
Bảng 4.9. Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và IAA đến hệ số nhân chồi
và chiều cao chồi (sau 6 tuần nuôi cấy) 61
Bảng 4.10. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa bổ sung vào môi
trường đến hệ số nhân chồi và chiều cao chồi 64
Bảng 4.11. Ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân và chiều cao chồi khi
nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm (sau 6 tuần nuôi
cấy) 67
Bảng 4.12. Ảnh hưởng của BA và α-NAA đến hệ số nhân và chiều cao
chồi khi nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm (sau 6
tuần) 69
Bảng 4.13. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ và chất
lượng rễ (sau 5 tuần) 72
Bảng 4.14. Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ và chất lượng
rễ (sau 5 tuần) 76
Bảng 4.15. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của
cây huệ (sau 4 tuần) 80
DANH MỤC HÌNH
STT Tên hình Trang
Hình 4.1. Hiệu quả khử trùng của HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau
39
Hình 4.2. Hiệu quả khử trùng của HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2
15% ở các mức thời gian khác nhau 41
Hình 4.3. Ảnh hưởng của Kinetin ở các nồng độ khác nhau đến khả năng phát
sinh hình thái của mẫu cấy 44
g/l agar + 2mg/l kinetin 44

v
Hình 4.6. Ảnh hưởng của BA ở các nồng độ khác nhau đến khả năng phát sinh
hình thái của mẫu cấy 47
Hình 4.7. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và các auxin đến khả năng phát sinh hình
thái của mẫu cấy 50
Hình 4.13. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến hệ số nhân chồi 54
Hình 4.14. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến chiều cao chồi tạo thành
54
Hình 4.15. Kết quả nhân nhanh trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5
g/l agar + 0,25mg/l IAA + 3mg/l BA 56
Hình 4.16. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IAA đến hệ số nhân chồi 56
Hình 4.17. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IAA đến chiều cao chồi tạo thành 57
Hình 4.18. Kết quả nhân nhanh trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 6,5
g/l agar + 1,5mg/l kinetin + 0,25mg/l α-NAA 59
Hình 4.19. Ảnh hưởng của tổ hợp Kinetin và α-NAA đến hệ số nhân chồi 60
Hình 4.20. Ảnh hưởng của tổ hợp Kinetin và α-NAA đến chiều cao chồi tạo
thành 60
Hình 4.22. Ảnh hưởng của tổ hợp Kinetin và IAA đến hệ số nhân chồi 62
Hình 4.23. Ảnh hưởng của tổ hợp Kinetin và IAA đến chiều cao chồi tạo
thành 63
+ 6,5 g/l agar + 2mg/l BA + 0,25mg/l α-NAA +150ml/l nước dừa 65
Hình 4.25. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa bổ sung vào môi trường đến
hệ số nhân chồi 65
Hình 4.26. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa bổ sung vào môi trường đến
chiều cao chồi 66
Hình 4.28. Ảnh hưởng của BA đến hệ số nhân khi nhân nhanh bằng phương
pháp nuôi cấy protocorm 68
Hình 4.29. Ảnh hưởng của BA đến chiều cao chồi tạo thành khi nhân nhanh
bằng phương pháp nuôi cấy protocorm 69
Hình 4.31. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến hệ số nhân khi nhân

nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm 71
Hình 4.32. Ảnh hưởng của BA và α-NAA đến chiều cao chồi tạo thành khi
nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm 71
Các chồi sau giai đoạn nhân nhanh có chất lượng tốt nhất, đủ tiêu chuẩn về
chiều cao, số lá, chúng tôi đưa vào môi trường MS có bổ sung thêm than hoạt
tính và α-NAA 72
Hình 4.34. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến số rễ trung bình /chồi 74
Hình 4.35. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến chiều dài trung bình của rễ 75
Hình 4.38. Ảnh hưởng của α-NAA đến số rễ trung bình của chồi 78
Hình 4.39. Ảnh hưởng của α-NAA đến chiều dài trung bình của rễ 78
vi
1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) là cây hoa cắt cành thuộc nhóm thân
thảo, thích cường độ ánh sáng cao và cho hoa quanh năm. Hoa huệ được nhập vào
nước ta từ rất lâu. Cây hoa huệ được trồng phổ biến tại vùng Nam Trung Bộ đem lại
thu nhập khá cao cho người trồng và chính là cây xoá đói giảm nghèo cho vùng
chuyên canh loài cây này.
Hiện nay, việc canh tác cây huệ thường chủ yếu được nhân giống bằng kỹ
thuật nhân giống truyền thống, chủ yếu là lấy củ trồng. Với phương pháp nhân
giống này dễ lây lan các mầm bệnh có sẵn trong củ, đặc biệt là bệnh virus làm giảm
năng suất và phẩm chất hoa, khiến cho giống hoa ngày càng thoái hoá.
Trong những năm gần đây, bệnh hại trên cây hoa huệ xuất hiện nhiều, đặc biệt
trong đó có một bệnh rất khó trị là bệnh chai bông. Tác nhân gây bệnh hiện vẫn
chưa xác định được. Bệnh xuất hiện trên diện rộng làm ảnh hưởng đến năng suất và
phẩm chất hoa. Bệnh không làm cây chết ngay nhưng làm cho chồi, củ và hoa kém
phát triển, làm thất thu nguồn thu nhập của nông dân. Các triệu chứng bệnh do virus
được mô tả bởi Horner và Person (1988), Chen và Chang (1998) gần giống các biểu
hiện của cây huệ ở Nam Trung Bộ. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để tạo nguồn giống
sạch bệnh cung cấp cho nhân dân?

Sự phát triển của công nghệ sinh học trong lĩnh vực chọn giống đã giúp các
nhà chọn giống rất nhiều trong việc giải quyết vấn đề trên. Phương pháp nhân giống
in vitro với rất nhiều ưu điểm, tạo được cây con trẻ hoá và sạch bệnh nên tiềm năng
sinh trưởng, phát triển và năng suất cao, khắc phục được nhược điểm của phương
pháp nhân giống truyền thống, khôi phục lại các phẩm chất vốn có của giống. Đồng
thời hệ số nhân của phương pháp nhân giống này cao đáp ứng được nhu cầu về số
lượng giống có chất lượng cao, ổn định đáp ứng nhu cầu sản xuất trên quy mô rộng.
Cho đến nay kĩ thuật nuôi cấy mô đã được nghiên cứu ứng dụng rất có hiệu quả trong
việc nhân giống hàng loạt các loại cây trồng tạo ngân hàng cây giống sạch bệnh, khỏe
mạnh cho năng suất cao, phẩm chất tốt cung cấp cho sản xuất.
1
Cây hoa huệ là đối tượng mới của sản xuất cây giống bằng phương pháp nuôi
cấy mô ở nước ta, cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu nào được công bố,
chỉ có một thông báo khoa học của các tác giả trường Đại học Cần Thơ. Năm 2007,
xuất phát từ yêu cầu bức xúc của thực tiễn, nhằm khắc phục hiện tượng chai bông
trên cây hoa huệ và yêu cầu nhân nhanh giống huệ hương, một giống huệ quý mang
lại hiệu quả cao cho nông dân, tỉnh Bình Định đã có chủ trương xây dựng quy trình
nhân giống cây hoa huệ bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào. Trên cơ sở đó, Bộ Khoa
học và Công nghệ giao cho tỉnh Bình Định dự án xây dựng quy trình nhân giống
cây hoa huệ, đặc biệt là cây huệ hương. Chính vì thế, Trung tâm Ứng dụng tiến bộ
Khoa học và Công nghệ tỉnh Bình Định (Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bình
Định) đã bước đầu tiến hành nghiên cứu thử nghiệm nhân nhanh giống huệ này
bằng kỹ thuật nuôi cấy mô.
Có thể nói, việc nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây huệ là
một yêu cầu bức xúc của thực tiễn, đề tài được nghiên cứu sẽ có nhiều phát hiện
mới về khoa học. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu xây
dựng quy trình nhân giống in vitro cây hoa huệ hương (Polianthes tuberosa L.)”
1.2. Mục đích, yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Xác định được những khâu cơ bản trong quy trình nhân giống cây hoa huệ

bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào, làm cơ sở cho việc hình thành quy trình nhân
giống in vitro cây hoa huệ hương, góp phần giải quyết những bức xúc của thực tiễn
sản xuất hoa tỉnh Bình Định.
1.2.2. Yêu cầu
Xác định được phương pháp khử trùng mẫu thích hợp.
• Xác định được môi trường nuôi cấy phù hợp nhất cho các giai đoạn khởi
động mẫu, nhân nhanh, tạo rễ và tạo cây hoàn chỉnh trong nuôi cấy in vitro.
• Xác định được giá thể ra cây nuôi cấy thích hợp.
• Bước đầu đề xuất quy trình nhân giống cây huệ hương in vitro.
2
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài đã cung cấp các dẫn liệu khoa học mới về nhân
giống vô tính cây hoa huệ hương bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào, góp phần
làm phong phú hơn cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuôi cấy mô cây hoa.
Đề tài đã đưa ra được các minh chứng về tác động của phương pháp khử trùng
đến tỷ lệ sống của mẫu cấy, tác động của chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng
phát sinh hình thái, hệ số nhân nhanh chồi, nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy
protocorm, tác động của chất điều tiết sinh trưởng và than hoạt tính đến khả năng
tạo cây hoàn chỉnh, tác động của giá thể đến khả năng sống và sinh trưởng của cây
in vitro.
Các kết quả nghiên cứu của đề tài có thể được sử dụng để giảng dạy và nghiên
cứu trong nuôi cấy mô, tế bào cây hoa.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ giúp chúng tôi đề xuất một quy trình nhân
giống cây huệ hương bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào, góp phần sản xuất cây
giống có hiệu quả cao, chất lượng tốt, khắc phục được những hạn chế của phương
pháp nhân giống truyền thống.
Kết quả nghiên cứu được ứng dụng vào sản xuất sẽ góp phần phục tráng giống
và nâng cao hiệu quả kinh tế của ngành sản xuất cây hoa huệ.

3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về cây hoa huệ
2.1.1. Nguồn gốc
Cây hoa huệ có tên khoa học là Polianthes tuberosa L. Đây là loài hoa cắt
cành, thuộc nhóm cây thân thảo, cho hoa quanh năm, nở hoa vào ban đêm có
nguồn gốc chủ yếu từ Mexico và hiện đã có mặt ở nhiều nước trên thế giới như:
Singapore, Indonexia, Iran, Hawaii [51].
Loài cây này đã được du nhập vào nước ta từ rất lâu và được trồng phổ
biến tại một số tỉnh thuộc vùng Nam Trung Bộ và Nam Bộ như: Bình Định,
Khánh Hòa, Tiền Giang, Cần Thơ… Hiện nay nó đang là cây trồng chính của
người dân nơi đây [18].
2.1.2. Phân loại
Trong hệ thống phân loại thực vật học [5], cây hoa huệ là cây thuộc:
- Giới: Cây trồng.
- Lớp: Một lá mầm (Monocotylendon).
- Bộ: Hành (Liliadae).
- Họ: Thủy tiên (Amaryllidaceae).
Theo kết quả thống kê trên thế giới thì hiện tại ở Mexico có khoảng 12 loài
tuberosa [51].
Riêng ở Việt Nam hiện nay, dựa vào đặc điểm của hoa thì chia thành 2 giống,
chủ yếu là huệ đơn và huệ kép:
- Huệ đơn hay còn gọi là huệ xẻ: cây thấp, mảnh khảnh, cánh hoa nhỏ, bông
chỉ có một lớp cánh nhưng hương thơm rất đậm.
- Huệ kép còn gọi là huệ tứ diện: cây cao, hoa dày và bông dài hơn huệ đơn
nhưng hương thơm kém hơn [52].
2.1.3. Đặc điểm thực vật học
2.1.3.1. Thân
Huệ thuộc cây thân thảo, thân hành hay còn gọi là thân giả được kết bởi các
bẹ lá xếp chồng lên nhau, bẹ lá trước xếp phủ lên bẹ lá sau. Thân thẳng đứng không

4
phân nhánh vươn lên thành ngồng hoa cao khoảng 0,8 -1m [9].
2.1.3.2. Lá
Cây hoa huệ có lá đơn mọc quanh gốc, xanh và dài, cuống lá góc rộng và to
thành hình như cái bao bao lấy củ, giữa phiến lá và bẹ lá không phân biệt rõ ràng.
Chiều dài lá khoảng 20-30cm, bề rộng của lá từ 0,5-1cm [9].
2.1.3.3. Hoa
Cây hoa huệ là cây cho hoa quanh năm, nhưng hoa nở chủ yếu vào mùa hè
còn mùa đông tỷ lệ ra hoa ít, hoa nhỏ và bông ngắn hơn.
Hoa huệ có màu trắng, bao hoa hình phễu, thường tỏa hương vào ban đêm.
Hoa có vị ngọt, hơi chát, thơm, không độc. Cành hoa thường dài, ở nách mỗi lá
bắc có 2 hoa màu trắng, có tràng đơn hay tràng kép, nhị gắn giữa ống, bầu dưới 3
ô [5], [53].
2.1.3.4. Củ và rễ
Cây huệ có bộ rễ chùm phát triển mạnh, rễ phân bố chủ yếu ở lớp đất mặt
0-15cm. Có 2 loại rễ: rễ mọc từ củ mẹ ban đầu (củ mẹ), gọi là rễ sơ cấp và rễ
mọc từ củ con do củ mẹ đẻ ra gọi là rễ thứ cấp, củ huệ thực chất chính là thân
ngầm của cây huệ [9].
2.1.4. Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa huệ
2.1.4.1. Nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố vật lý có ảnh hưởng lớn đến thời gian sinh trưởng, phát
triển cũng như khả năng phân hóa hoa của cây hoa huệ.
Cây hoa huệ là cây ưa nhiệt độ mát mẻ (20-25
0
C), nhưng chịu nóng tốt, phân
bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, cho hoa tốt vào mùa hè. Tuy vậy, khi
nhiệt độ mùa hè quá cao kéo dài sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới khả năng sinh
trưởng của cây, chất lượng hoa và nhất là sâu bệnh phá hại mạnh.
Trước khi phân hóa hoa và lúc cây có 5-6 lá cần nhiệt độ mát mẻ (15-22
0

C)
nếu không tỷ lệ nở hoa sẽ rất thấp và chất lượng hoa kém [9].
2.1.4.2. Ánh sáng
Cây huệ là cây ưa ánh sáng mạnh. Giai đoạn đầu sau khi trồng, cây sống chủ
yếu nhờ vào nguồn dinh dưỡng từ củ. Khi cây ra lá, cây sử dụng chất dinh dưỡng từ
quá trình quang hợp. Trong thời kỳ phân hóa mầm hoa nếu không cung cấp đủ ánh
5
sáng thì tỷ lệ ra hoa thấp, hoa nhỏ…
Ngoài ra nếu thiếu ánh sáng cây hoa huệ rất dễ bị nhiễm bệnh. Trong điều
kiện ngày ngắn, ánh sáng yếu thì ảnh hưởng mạnh đến sự sinh trưởng phát triển của
cây. Cường độ ánh sáng cũng là yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phân hóa
mầm hoa. Nếu cường độ chiếu sáng dưới 3500lux thì cường độ quang hợp và sự
thoát hơi nước giảm, cây mọc vống, cành lá yếu. Do đó khi trồng ở vụ đông cần
đảm bảo chế độ chiếu sáng phù hợp để tạo điều kiện thuận lợi cho sự phân hóa mầm
hoa, hoa tự dài đồng thời tăng chất lượng hoa. Số giờ chiếu sáng thích hợp cho cây
hoa huệ sinh trưởng và phát triển tốt từ 12-16 giờ và cường độ ánh sáng khoảng
6000lux [9].
2.1.4.3. Nước
Cây hoa huệ là cây rễ củ nên khi nảy mầm cũng như quá trình sinh trưởng cần
phải có đủ nước. Các giai đoạn sinh trưởng khác nhau thì có nhu cầu về nước khác
nhau. Sau khi trồng vài ngày, rễ mầm nhú ra và phát triển thì yêu cầu đất xung
quanh củ phải đủ ẩm, vì vậy trước khi trồng nên tưới nước. Khi cây mọc nếu đất
quá khô thì phải tưới nước ngay. Trong suốt thời kỳ sinh trưởng, cây hoa huệ cần
rất nhiều nước, đặc biệt là ở giai đoạn có 3-7 lá, đây là thời kỳ cây có nhu cầu về
nước lớn, nếu thiếu nước cây sẽ sinh trưởng chậm ảnh hưởng đến khả năng phân
hóa của hoa.
2.1.4.4. Đất
Cây hoa huệ có thể trồng trên bất cứ loại đất nào, tuy vậy cây chỉ sinh trưởng
tốt, cho hoa đẹp trên loại đất hơi kiềm (pH = 6 -7), có cấu trúc mịn, giữ ẩm tốt. Tuy
vậy, huệ không thích hợp nơi đất quá trũng, chua hay cớm bóng [20].

Cây hoa huệ có thể trồng trên các loại đất có thành phần cơ giới sau:
- Đất cát pha có độ tơi xốp cao, độ hổng lớn, thoáng khí, ngấm nước tốt nhưng
có độ phì kém. Do đó, khi trồng hoa huệ trên loại đất này cần phải bón nhiều phân
hữu cơ để bổ sung dinh dưỡng cho cây.
- Đất thịt nhẹ, thoát nước tốt, giàu dinh dưỡng là loại đất trồng thích hợp đối
với cây hoa huệ. Nếu đất quá ẩm, rễ rất dễ bị thối, vì thế vào mùa mưa cần chống
úng, tháo nước kịp thời không để ruộng bị ngập úng.
Mặt khác hoa huệ cũng là cây rất mẫn cảm với các loại muối kim loại nặng.
6
Đặc biệt là loại đất có hàm lượng chì cao, rễ cây sinh trưởng kém, cây phát triển
chậm và khả năng ra hoa kém. Chính vì vậy trước khi trồng huệ cần chú ý đến các
biện pháp canh tác đất [9].
2.1.5. Kỹ thuật trồng và chăm sóc
Theo Đặng Phương Trâm (2005) [19] thì trong quá trình trồng và chăm sóc
cây huệ cần chú ý các khâu sau:
2.1.5.1. Chuẩn bị giống
Theo phương pháp canh tác truyền thống, cây huệ trồng bằng củ, vì vậy khi
cây có nhiều lá úa vàng thì bới củ, tách nhẹ nhàng từng củ, chọn những củ có kích
thước đạt tiêu chuẩn sau đó cắt bỏ lá và rễ tiến hành phơi nắng 2-3 ngày cho lá héo
rồi đem bảo quản nơi thoáng mát, cao ráo, sau 2-3 tháng có thể đem trồng trở lại.
Trong thời gian bảo quản nên thường xuyên kiểm tra tránh hiện tượng củ bị thối.
Trong những năm gần đây, xuất hiện bệnh chai bông trên diện rộng, vì vậy để
phòng trừ bệnh chai bông trên cây huệ cần tiến hành các bước sau:
- Không sử dụng củ bị nhiễm bệnh hoặc lấy củ từ những ruộng đã bị nhiễm
bệnh trước đó làm củ giống.
- Phơi củ trong vòng 1-1,5 tháng trước khi đem ra trồng.
- Nên thay đổi chân đất sau mỗi vụ trồng hoặc luân canh cây huệ với một loại
cây trồng khác.
- Khi phát hiện thấy có triệu chứng bệnh cần loại bỏ cây bệnh ra khỏi ruộng,
phơi khô và đốt bỏ. Khi không có củ giống sạch bệnh, có thể chọn củ ở cây không

có triệu chứng bệnh và tiến hành phơi nắng kỹ từ 1-1,5 tháng, sau đó xử lý củ với
nước nóng khoảng 56-57
0
C.
Quy trình xử lý củ huệ bằng nước nóng để phòng trừ bệnh chai bông gồm các
bước sau:
- Bước 1: Chuẩn bị củ huệ để xử lý.
Sau khi thu hoạch, đem phơi củ trong 1-1,5 tháng, chọn những củ có đường
kính từ 3cm trở lên để xử lý.
- Bước 2: Xử lý củ huệ bằng nước nóng
Đổ nước nóng và nước lạnh vào trong một thùng nhựa với tỷ lệ 6:5, rồi điều
7
chỉnh để nhiệt độ nước trong thùng khoảng 56-57
0
C thì bắt đầu cho củ vào nước.
Lượng nước xử lý cần gấp 6-7 lần lượng củ xử lý. Sau đó đậy nắp thùng khoảng 15
phút và lại chỉnh cho nước trở lại nhiệt độ 56-57
0
C bằng cách đổ thêm một ít nước
sôi từ từ khuấy đều, và ngâm củ trong thùng đậy kín trong 15 phút nữa.
- Bước 3: Sau khi xử lý xong, củ được rải đều và phơi khô trong 2 ngày sau
rồi đem trồng ra ruộng.
2.1.5.2. Chuẩn bị đất
Nên chọn nơi trảng nắng, luống trồng lên liếp rộng khoảng 1,2m và sâu 0,5m
để có thể giữ nước tốt. Luống đất nên bố trí dọc theo hướng mặt trời để cây nhận
ánh sáng tốt và đồng đều. Trước khi trồng nên bón phân lót và phun xịt các loại
thuốc diệt nấm và mầm bệnh.
2.1.5.3. Chăm sóc
Trong canh tác cây hoa huệ yêu cầu về nước là rất quan trọng, phải thường
xuyên tưới nước đồng thời phải xới đất và làm cỏ giúp cho bộ rễ phát triển tốt.

Phân bón thường sử dụng để bón cho cây là hỗn hợp (Urea, lân và Kali), sau khi
trồng được khoảng 2-3 năm cây huệ bắt đầu bị thoái hóa: sinh trưởng chậm, cho
hoa ít và kém chất lượng. Do đó phải nhổ lên phân loại củ và trồng lại trên một
diện tích khác.
Trong thời gian trồng và thu hoạch cần tiến hành trừ cỏ, xới đất, bón phân, tưới
nước, phun thuốc , thường xuyên để tránh lây lan nguồn sâu bệnh hại.
Khi trừ cỏ phải tiến hành theo nguyên tắc trừ sớm, trừ khi cỏ còn non và trừ
sạch, có thể trừ cỏ bằng tay hoặc bằng thuốc.
Trong quá trình trồng, nên bón phân với số lượng ít và chia thành nhiều đợt
như bón lót, bón thúc. Ngoài cách bón vào đất còn có thể phun lên lá để bổ sung
dinh dưỡng, hỗ trợ cho quá trình ra hoa và chống rụng nụ hoa. Trong thời kỳ phân
hóa mầm hoa cần bón thêm phân đạm, khi ra nụ và sau khi ra hoa cần bón thêm lân
và kali [9].
2.1.6. Vấn đề sâu bệnh trên cây huệ
Trên cây hoa huệ, sâu thường gặp là rệp sáp, nhện đỏ và nhất là tuyến trùng.
Bệnh gây hại trên cây huệ được chia thành hai nhóm:
8
- Nhóm bệnh không truyền nhiễm, do ngoại cảnh không phù hợp thường gặp
nhất là thối xám, thối gốc, đốm lá, gỉ sắt có thể phòng trị bằng các loại thuốc hóa học.
- Nhóm bệnh truyền nhiễm chủ yếu do vi sinh vật ký sinh gây ra bao gồm: vi
khuẩn, xạ khuẩn, nấm, mycoplasma, virus thường rất khó trị, nhất là bệnh do virus
gây ra do rất dễ lây lan và phát tán thành dịch, gây hại nghiêm trọng và truyền từ
đời này sang đời khác, đặc biệt là ở nhóm cây nhân giống vô tính (bằng củ) như cây
huệ [8]. Virus không thể phòng chống hay tiêu diệt bằng hóa chất như vi khuẩn,
nấm và sâu bệnh, cách duy nhất để loại bỏ virus là phải tách chúng ra khỏi cây bị
bệnh, trả lại cho cây cuộc sống bình thường khỏe mạnh. Vì vậy biện pháp làm sạch
virus phải luôn được kết hợp với biện pháp duy trì tính sạch bệnh [3].
Sau khi trồng khoảng 1 tháng, ở cây hoa huệ thường bị nhện đỏ phá hại nặng
trên lá, từ 3-4 tháng trở đi cây dễ bị rệp sáp phá hại nên có thể phòng trị bằng các
loại thuốc sau: Nissorun, Kelthan 20 EC, Comite, Basudin 10H. Khoảng tháng 9-

10, khi trời mưa kéo dài huệ dễ bị úng thối lá, thối củ thì có thể khắc phục hiện
tượng này bằng các loại thuốc như: Anuil, Topsin, Ridomol [52].
2.1.7. Giá trị kinh tế và sử dụng của cây huệ
Với đặc điểm sinh thái dễ thích nghi với vùng khí hậu nhiệt đới như ở nước ta
đồng thời yêu cầu trồng và chăm sóc không quá khắt khe nên huệ được trồng khá
phổ biến và đem lại thu nhập rất cao cho người dân.
Trong những năm gần đây, cây hoa huệ đem lại thu nhập cao cho người dân
các tỉnh phía Nam như Tiền Giang, Đồng Tháp Đặc biệt, tại các tỉnh Nam Trung
Bộ như Bình Định, Khánh Hòa, từ khi người dân mở rộng diện tích và nâng cao kỹ
thuật canh tác, cây hoa huệ đã trở thành cây trồng chính, đem lại thu nhập cao và trở
thành cây xóa đói giảm nghèo. Hiện nay, thu nhập từ cây hoa huệ ở đồng bằng sông
Cửu Long bình quân từ 150-200 triệu/ha và ở Nam Trung bộ là 80-150 triệu/ha.
Ngoài giá trị sử dụng thông thường như trên, gần đây người ta còn sử dụng
một số bộ phận của cây này làm thuốc chữa bệnh và chế ra các loại dầu thơm [54].
Hiện nay, một số nghiên cứu về loài hoa này đã tìm ra một số thành phần hoá
học có liên quan đến việc sản xuất ra các loại dầu thơm, nước hoa quý, được chiết
xuất từ các bộ phận như hoa và sáp hoa trong đó loại tinh dầu tuyệt đối thu được
9
khi chiết xuất từ hoa như alcol benzil chiếm 0,7%, benzoat metil (4,5%), antranilat
metil (8,0%), metilisoeugenol (10%), benzoat benzil (24%). Ngoài ra, n-alkan
chiếm tỷ lệ không nhỏ tới 42% trong sáp hoa cũng là một thành phần hoá học quan
trọng trong việc chế xuất các loại nước hoa, dầu thơm [54].
Bên cạnh đó, cây hoa huệ còn có công dụng trong y học, bộ phận được sử
dụng là củ huệ. Trong tinh dầu củ huệ có chứa thành phần sapogenin, sapogenin
bao gồm hecogenin và tigogenin là loại hợp chất được chiết xuất để bào chế ra một
số loại thuốc quý. Từ lâu trong dân gian người dân đã biết sử dụng cây hoa huệ để
làm thuốc chữa một số bệnh đơn giản. Ở Ấn Độ người ta đã dùng củ phơi khô, tán
thành bột để làm thuốc trị liệu, hoặc ở Vũng Tàu người dân nơi đây đã dùng củ huệ
để chữa bệnh sốt rét.
Ở một số nơi, dân gian còn dùng củ huệ để chữa bệnh hóc xương bằng cách

đem giã nát củ, vắt lấy nước rồi nhỏ vào họng của người bị hóc xương sau 1-2
phút sẽ khỏi [54].
2.2. Tình hình sản xuất hoa huệ trong nước
Du nhập vào nước ta từ lâu và được trồng rộng rãi trong cả nước, nhưng cây
huệ được trồng phổ biến hơn cả ở Miền Nam và Nam Trung Bộ. Trong những năm
gần đây, diện tích canh tác cây hoa huệ ngày càng được mở rộng và đem lại thu
nhập cao cho người trồng.
Theo thống kê hiện nay, trên địa bàn các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long có
diện tích trồng huệ lớn hơn cả. Trung bình các tỉnh có khoảng 500-1000 ha canh tác
cây hoa huệ, khi thu hoạch có thể cho thu nhập từ 150-200 triệu đồng/ha [55].
Do cây này dễ trồng, chi phí đầu tư thấp, ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố thời
tiết và đặc biệt hơn là hoa huệ cho thu hoạch tới 14 tháng/vụ nên trong điều kiện
thuận lợi thường cho thu nhập cao.
Trong những năm gần đây, trên địa bàn các tỉnh vùng Nam Trung bộ bắt đầu đẩy
mạnh canh tác cây hoa huệ, đặc biệt là ở Bình Định và Khánh Hòa. Ở Bình Định, cây
hoa huệ dần trở thành cây trồng chính. Theo đánh giá của người dân nơi đây, trong
điều kiện thuận lợi mỗi ha bình quân cho thu nhập trên 80-120 triệu đồng [53].
Mặc dù vậy, hiện nay việc canh tác cây huệ đang gặp nhiều khó khăn, do bị
sâu bệnh hại phá hoại nhiều, trong đó có một bệnh rất khó trị là bệnh chai bông.
10
Hiện nay, bệnh phá hoại rất mạnh, có thể làm giảm đến 60% năng suất cây trồng.
Chính vì vậy, năng suất huệ trên nhiều vùng có xu hướng không ổn định và chất
lượng hoa thì giảm đáng kể.
Hiện nay, bệnh chai bông đang là nguyên nhân chính làm giảm năng suất và
phẩm chất hoa trên các vùng chuyên canh, đặc biệt ở Nam Trung Bộ và Nam Bộ.
Triệu chứng bệnh thể hiện:
- Trên lá: trước khi ra hoa, trên lá của cây con bị nhiễm bệnh thường xuất hiện
các đường gân sọc màu nâu đỏ kéo dài từ bẹ lá đến chóp lá, lá có thể bị xoắn.
- Trên bông: nếu bị nhiễm nặng, bông sẽ bị chai không trỗ được hoặc bông bị
đen thui và khô, bẹ lá hầu như bị thâm màu nâu đỏ.

- Trên thân: khi bị nhiễm bệnh, thân bị lùn, vỏ thân có những gai sần dày đặc.
Tác nhân gây bệnh hiện nay vẫn chưa được làm rõ, tuy nhiên các triệu chứng
bệnh thể hiện giống với những mô tả các triệu chứng bệnh do virus của Horner và
Person (1988), Chen và Chang (1998) [28], [32].
Theo phương pháp nhân giống truyền thống, đối với huệ, nguồn vật liệu
ban đầu để sản xuất hoa thương phẩm là củ giống, chất lượng củ giống đóng
vai trò quan trọng, nó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và chất lượng
của hoa sau này.
Củ huệ tái sinh theo phương pháp thông thường dựa trên nguyên lý chung là ở
phía trong các nách lá có một chồi ngủ (chồi nách), các chồi này khi gặp điều kiện
thuận lợi sẽ phát triển thành chồi bên.
Nhìn chung, phương pháp này đơn giản, dễ làm và chi phí đầu tư không cao
nhưng có rất nhiều nhược điểm như: hệ số nhân thấp, thường làm thoái hóa giống,
gây nhiễm bệnh hàng loạt ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng hoa.
2.3. Nhân giống cây trồng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào.
Là phương pháp nuôi cấy mô, tế bào trong môi trường dinh dưỡng nhân
tạo trong điều kiện vô trùng và tái sinh chúng thành cây con.
Nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào là phương pháp mới bổ sung
cho các kỹ thuật nhân giống truyền thống nhiều kỹ thuật tiến bộ, có thể khắc phục
được những hạn chế của các phương pháp nhân giống truyền thống.
11
2.3.1. Lịch sử nuôi cấy mô, tế bào thực vật
Năm 1838, trên cơ sở những nghiên cứu độc lập, hai nhà bác học
người Đức là Schleiden và Schwamn cùng khởi xướng học thuyết tế bào.
Học thuyết này cho rằng tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của sinh vật,
vì vậy có khả năng tồn tại độc lập.
Gottlibe Haberlandt là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy tế
bào thực vật vào năm 1902 để chứng minh học thuyết về tính toàn năng của
tế bào. Theo ông mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể nào đều mang toàn bộ hệ
thống di truyền cần thiết và đầy đủ thông tin của sinh vật đó, khi gặp điều

kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh.
Ông tiến hành thí nghiệm với tế bào khí khổng và các tế bào đã được biệt
hoá về chức năng khác nhưng không thành công. Điều đó đã giảm sự tin t-
ưởng của các nhà khoa học đối với phương pháp nuôi cấy mô, tế bào trong
thời gian dài.
Đến năm 1922 học trò của Gottlibe Haberlandt là Kotte và Robbinss
đã làm lại thí nghiệm của ông. Họ đã lấy đỉnh sinh trưởng của rễ cây hòa
thảo nuôi cấy trong môi trường có khoáng, đường, đầu rễ đã sinh trưởng
mạnh và tạo ra hệ rễ nhỏ và cả rễ phụ. Tuy nhiên sự sinh tr ưởng chỉ tồn tại
trong một thời gian mặc dù chuyển sang môi trường mới.
Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ 2 trong lịch sử nuôi cấy mô, tế bào
thực vật khi White đã nuôi cấy thành công đầu tiên rễ cà chua trên môi
trường lỏng có chứa đường, muối khoáng, dịch chiết nấm men. Các thí
nghiệm tiếp theo ông thay thế dịch chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 vitamin
nhóm B: thiamin (B
1
), nicotinic acid (B
3
), pyridioxin (B
6
). Sau đó ít lâu
Went và Thimann tìm ra chất kích thích sinh trưởng đầu tiên là IAA.
Năm năm sau Gautheret đã thông báo về sự tái sinh của cà rốt, đây
cũng là lần đầu tiên sự phát triển của mô sẹo không bị giới hạn. Bằng cách
thêm IAA vào môi trường nuôi cấy, ông có thể kích thích sự phát triển của
mô đã biệt hoá trên vết cắt của bề mặt mẫu cấy vô trùng. Sau này người ta
mới thấy rằng callus có thể trực tiếp nuôi cấy vô thời hạn. Đến năm 1948,
12
Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt. Trong thời gian
này nhiều chất sinh trưởng thuộc nhóm auxin được tổng hợp như

naphthylacetic acid (NAA), 2,4 – Diclophenoxyacetic acid (2,4D). Nhiều tác
giả nhận thấy cùng với nước dừa, NAA và 2,4D đã giúp tạo mô sẹo gây phân
chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật trước đó khó nuôi cấy.
Năm 1955, Miller và Skoog đã xác định vai trò của chất kích thích sinh trưởng là
6 – Furfuryl aminopurin (kinein). Việc phát hiện ra chất kích thích sinh trưởng, vitamin
và nước dừa là những bước tiến quan trọng trong giai đoạn thứ hai.
Năm 1957, Miller và Skoog công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng
của tỷ lệ auxin/kinetin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ
quan, tỷ lệ auxin/kinetin thấp, mô sẹo có khuynh hướng tạo chồi, ngược lại tỷ
lệ auxin/kinetin tăng, mô sẹo có khuynh hướng tạo rễ. Hiện nay, những kết quả
này cũng được quan sát thấy trên nhiều loại cây khác nhau và đóng góp nhiều
vào việc điều khiển quá trình sinh trưởng, phát triển và phát sinh các cơ quan
của mô, tế bào trong nuôi cấy. Thành công của Miller và Skoog đã mở đầu cho
giai đoạn thứ 3 của lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật.
Những thành công trên là cơ sở bùng nổ ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy
mô, tế bào thực vật trong sản xuất. Morel và Martin đã phát triển kỷ thuật
nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo giống sạch bệnh ở khoai tây và hoa lan.
Chính hai nhà khoa học này đã mở đầu cho một hướng mới của nuôi cấy tế
bào thực vật, đó là vi nhân giống.
Từ những năm 1960, ngoài các hướng trên, nuôi cấy bao phấn và hạt
phấn, nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần được phát triển mạnh. Các kỷ thuật
lai soma bằng dung hợp tế bào trần và kỷ thuật chuyển gen được phát triển
và thu được những thành tựu đáng kể.
Chúng ta đang bước vào giai đoạn thứ 4 của nuôi cấy mô, tế bào thực
vật. Đó là giai đoạn nuôi cấy mô, tế bào được ứng dụng mạnh mẽ vào thực
tiễn chọn giống, nhân giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học
và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao.
13
2.3.2. Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô, tế bào thực vật.
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào in vitro là học

thuyết về tính toàn năng (totipotence) của tế bào. Theo Haberlandt G. (1902),
nhà thực vật người Đức, tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng thông tin
di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng tái
sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh [24]. Thực tế đã chứng minh được khả
năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài
cây trồng đã được nhân giống trên qui mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi
trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô
cùng lớn (Murashige, 1980) [41].
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất
là kết quả của các quá trình phân hóa và phản phân hóa. Tất cả các tế bào trong các
cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật trưởng thành đều bắt nguồn từ tế bào phôi
sinh. Sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hóa để đảm nhiệm các
chức năng khác nhau được gọi là sự phân hóa tế bào. Còn quá trình phản phân hóa
thì ngược lại với quá trình phân hóa, có nghĩa là tế bào đã phân hóa thành mô chức
năng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp chúng
có thể trở về dạng phôi sinh và tái phân chia.
Các quá trình trên có thể tóm tắt như sau:
Ví dụ như khi nuôi cấy mảnh lá hay đốt thân cây thuốc lá, ở điều kiện
môi trường thích hợp, các tế bào đã phân hóa của lá, đốt thân sẽ phản phân
hóa, phân chia trở lại thành mô sẹo, không còn là tế bào có chức năng như tế
bào lá, đốt thân nữa. Nếu chuyển sang môi trường khác thì tùy theo thành
Tế bào dãn
Phân hóa tế bào
Phản phân hóa
tế bào
Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hóa
14
phần môi trường mà các tế bào mô sẹo có thể phân hóa theo các hướng khác
nhau (hình thành rễ, chồi hay cây hoàn chỉnh ).
Bản chất của quá trình này là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen.

Trong quá trình phát triển cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều có một số
gen nhất định được hoạt hóa cho ta tính trạng mới, một số gen khác lại bị
đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa
trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát
triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác, khi nằm trong khối
mô bình thường, tế bào luôn bị chi phối bởi các tế bào xung quanh. Khi tế
bào được tách riêng rẽ, tác dụng ức chế của các tế bào xung quanh không
còn nữa thì các gen được hoạt hóa và quá trình phân hóa sẽ xảy ra theo một
chương trình định sẵn [16].
2.3.3. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro
Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở
ngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp. Sau đây là những
ưu điểm chính:
- Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng,
phát triển và năng suất cao.
- Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng
đã chọn lọc.
- Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao.
- Tạo được cây có genotip mới (đa bội, đơn bội).
- Bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen.
- Có khả năng sản xuất quanh năm.
- Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện
sinh thái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém.
- Hệ số nhân giống cực kỳ cao (thường đạt được ở loài cây khác nhau
trong phạm vi từ 3
6
-10
12
/năm), rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản
xuất đại trà [3].

Trong công tác giống cây trồng, vấn đề được quan tâm hàng đầu là chất
15
lượng và số lượng giống. Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng,
người ta đã tạo ra được những giống cây hoàn toàn sạch virus. Limasset và
Cornel (1945) [36] đã chứng minh được rằng, nồng độ virus trong thực vật
giảm dần ở bộ phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn
toàn sạch virus (Morel và Martin, 1952) [37]. Nguyên nhân của hiện tượng
này là:
- Đỉnh sinh trưởng không có hệ mô dẫn, làm cho virus và vi sinh vật
không có khả năng thâm nhập.
- Đỉnh sinh trưởng là nơi sinh tổng hợp của auxin nên hàm lượng auxin
khá cao, auxin có tác dụng ức chế sinh sản của virus.
- Quá trình phân chia của tế bào phôi sinh (ở đỉnh sinh trưởng) không
kéo theo sự phân chia của virus.
Về phương diện hệ số nhân, nhân giống in vitro là phương pháp không
gì có thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt. Chỉ tính riêng
lĩnh vực true-to-type, nuôi cấy in vitro có thể coi là một cuộc đại cách mạng
về hệ số nhân. Thí dụ: sử dụng chồi nách để nhân có thể tạo ra hàng chục
vạn cây D.fLoribunda trong vòng một năm (Chaturvedi, Sinha, 1979) [27],
(Phạm Văn Hiển và cs, 1988) [7] hay 26 vạn cây cam thảo trong 5 tháng
(Shah, Dalal, 1980) [43] từ một lát cắt ban đầu. Thông thường một cây
D.foLoribunda chỉ tạo ra 8-10 cây trong một năm, và cam thảo chỉ cho 5-7
cây nếu nhân giống bằng cành. Ở Việt Nam, Mai Thị Tân và cộng sự đã đạt
được hệ số nhân 5
32
trong vòng một năm đối với cây khoai tây bằng phương
pháp này [13]. Đặc biệt, cây cọ dầu thường phải mất 10-15 năm mới cho thu
hoạch, việc chọn, tạo và nhân nhanh được một giống mới rất khó khăn [23].
Bằng phương pháp nhân nhanh in vitro, người ta có thể cung cấp được
500000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm (Staricky, 1970) [49].

Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang
thiết bị đắt tiền và kỹ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá
trị cao hoặc khó nhân giống bằng phương pháp khác (Nickell, 1973) [44].
Ngoài ra, phương pháp này còn có những bất lợi sau:
16
- Mặc dù số lượng cây giống thu được có thể rất cao nhưng cây con có kích
thước nhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm.
- Cây có thể có những đặc tính không mong muốn.
- Khả năng tạo đột biến tăng.
- Khả năng tái sinh có thể bị mất đi do cấy truyền callus hay huyền phù
tế bào nhiều lần.
- Cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt.
Tuy vậy phương pháp nhân giống in vitro ngày càng được sử dụng rộng
rãi để phục vụ những mục đích sau:
- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công
tác chọn giống.
- Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống
các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, cây rau, cây hoa, cây
cảnh và cây dược liệu thuộc nhóm cây thân thảo.
- Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quí hiếm của giống cây lâm nghiệp và
gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm thân gỗ.
- Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm
sạch virus.
- Bảo quản và lưu giữ các tập đoàn giống nhân giống vô tính và các
loài giao phấn trong ngân hàng gen.
2.3.4. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro
Kỹ thuật nuôi cấy in vitro có thể chia thành các bước sau:
+ Lựa chọn đối tượng (cây trồng, giống, bộ phận cây) thích hợp
Nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy mô, tế bào thực vật có thể là bất cứ
bộ phận nào của cây: các đoạn của rễ, thân, các phần của lá (cuống lá, phiến

lá ), các cấu trúc của phôi như lá mầm, trụ trên, trụ dưới lá mầm, hạt phấn,
noãn thậm chí cả mẩu thân ngầm hay cơ quan dự trữ dưới mặt đất (củ, căn
hành ) cũng được dùng cho nuôi cấy [23].
+ Khử trùng mẫu và tiến hành nuôi cấy
Nguyên liệu để nuôi cấy in vitro được lựa chọn từ những cá thể ưu tú
17
của loài, khỏe và sạch bệnh, nhưng ít nhiều đều có nhiễm vi sinh vật và nấm
tùy thuộc vào sự tiếp xúc của chúng với môi trường xung quanh. Có một số
bộ phận như phôi trong hạt, mô trong quả, dòng lúa non ít bị nhiễm vi sinh
vật hơn các bộ phận khác, ngược lại các bộ phận nằm dưới mặt đất như rễ,
củ, thân ngầm, có lượng vi khuẩn và nấm rất cao. Phương pháp thông dụng
nhất hiện nay để loại bỏ hệ vi sinh vật khỏi vật liệu nuôi cấy là sử dụng các
hóa chất có hoạt tính diệt khuẩn và nấm [24].
Khả năng tiêu diệt nấm và vi sinh vật của hóa chất khử trùng phụ thuộc
vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ
ngách trên bề mặt của mô cấy. Để làm tăng hiệu quả, người ta thường nhúng
mẫu vào ethanol 70-80% trong 30 giây, sau đó mới xử lý bằng dụng dịch
diệt khuẩn. Đối với những mẫu có bề mặt được bao phủ lớp sáp, muốn đạt
được kết quả tốt nhất cần cho thêm vào dung dịch khử trùng một vài giọt
Tween 20, Tween 80 hay teapol vì các chất này làm tăng tính bám dính
của hóa chất khử trùng. Với các mẫu quá bẩn phải rửa kỹ bằng nước xà
phòng và để dưới vòi nước chảy từ 20 đến 30 phút sẽ có tác dụng làm giảm
đáng kể hệ vi khuẩn khỏi mẫu cấy (Narayanswamy S., 1997) [42].
Tác nhân khử trùng, ngoài tác dụng diệt vi sinh vật còn ảnh hưởng đến
mô cấy vì vậy việc lựa chọn loại hóa chất phải căn cứ vào mức độ nhiễm
khuẩn và độ mẫn cảm của từng mẫu. Trong số các hóa chất hay được sử
dụng để khử trùng thì canxi hypoclorit và natri hypoclorit là hay được sử
dụng hơn cả vì có độc tính thấp đối với mô được xử lý, không gây ức chế
sinh trưởng và hiệu quả diệt khuẩn tốt. Nồng độ của canxi hypoclorit và
natri hypoclorit tương ứng thường là 5-15% và 0,5-2% trong thời gian 15-30

phút. Tuy nhiên, những chất này không bền nên trong thực tế HgCl
2
cũng
hay được dùng để thay thế.
+ Xác định điều kiện nuôi cấy (môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh
sáng) để điều khiển quá trình phát triển mô nuôi cấy theo định hướng.
Thành công của phương pháp nuôi cấy in vitro phụ thuộc rất nhiều vào
điều kiện nuôi cấy. Nhu cầu dinh dưỡng cho sự sinh trưởng và phát triển tối
18