Báo Cáo Thực Hành Vi Sinh Vật Học.docx

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM
−−−−−−−−−−

NHẬT KÝ THÍ NGHIỆM
MƠN : VI SINH VẬT HỌC

Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ QUAN SÁT
VI SINH VẬT
Lớp :
GVHD: NGUYỄN THỊ LAN HƯƠNG
SVTH:

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 12 năm 2020


NHẬT KÝ THÍ NGHIỆM
Tên vấn đề : Phân lập và quan sát hình thái vi thể, đại thể của các vi sinh
vật trong mẫu.
 Gồm :
 Nấm mốc
 Nấm men
 Trực khuẩn gram âm
 Trực khuẩn gram dương
 Cầu khuẩn
 Từ 2 mẫu :
 Mẫu có sẵn
 Mẫu tự chọn
+ Nước mía
+ Điện thoại
+ Khơng khí

+ Tay
+ Nước dưa
 Thành viên thực hiện

2


QUY TRÌNH THỰC HIỆN :

Pha chế và đổ
mơi trường ni
cấy vi sinh vật

Nuôi cấy vi sinh
vật

Quan sát vi sinh
vật dưới kính hiển
vi quang học

Thu nhận và báo
cáo kết quả

Phân lập vi sinh
vật, cấy vi sinh vật
vào ống thạch
nghiêng

Nhuộm mẫu vi sinh
vật

KẾ HOẠCH :
Tuần 1 ( 13/11/2020) : Tìm hiểu và nghiên cứu các công việc cần làm để
phân lập và quan sát các vi sinh vật.
Tuần 2 ( 20/11/2020) : Pha môi trường, đổ môi trường vào đĩa petri, cấy
mẫu nghiên cứu lên môi trường dinh dưỡng.
Tuần 3 (27/11/2020) : Quan sát vi sinh vật trên kính hiển vi, cấy truyền
tạo dịng thuần, đổ thêm mơi trường.
Tuần 4 (04/12/2020) : Tiếp tục cấy truyền, nhuộm màu và quan sát vi
sinh vật dưới kính hiển vi để xem hình dạng ,màu sắc.
Tuần 5 (11/12/2020) : Pha tiếp môi trường, đổ môi trường thạch nghiêng
và cấy trên ống nghiệm để lưu mẫu.
Tuần 6 (18/12/2020) : Nộp kết quả và thi vấn đáp.

3


Nhật ký thí nghiệm ngày 14 tháng 11 năm 2020
CƠNG VIỆC THỰC HIỆN :
+ Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất để đổ môi trường
+ Pha chế và đổ môi trường vào đĩa petri
NGƯỜI THỰC HIỆN : cả nhóm
+ Cân hóa chất :
+ Chuẩn bị đĩa :
+ Pha môi trường :
+ Đổ môi trường :
PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN :
Chuẩn bị đĩa petri để đổ môi trường
 Vật dụng cần chuẩn bị :
+ Đĩa petri : 15 cái

+ Giấy báo
 Thao tác thực hiện :
Bước 1 : Rừa sạch đĩa petri bằng nước sạch và lau khô đĩa bằng khăn cotton
100%.
Bước 2 : Chuẩn bị giấy báo để gói đĩa petri.
Bước 3 : Đặt đĩa petri vào giấy báo bằng cách xếp chồng khoảng 5 đĩa.
Bước 4 : Gói giấy báo chứa đĩa cẩn thận và chặt.
Bước 5 : Đưa đĩa petri đã gói giấy báo vào tủ sấy ở nhiệt độ khoảng 180độ C
trong vịng 30 phút.
Lưu ý : + Gói kĩ đĩa bằng giấy báo (không được cột dây cao su để tránh bị
chảy và tránh để giấy báo chạm vào thành tủ sấy gây cháy giấy báo) .
+ Đợi khi tủ sấy lên 180℃ mới bắt đầu tính thời gian sấy ( sấy 30’ ). mới bắt đầu tính thời gian sấy ( sấy 30’ ).
4


Hình ảnh đĩa petri được gói
Đĩa petri đã được gói
bằng giấy báo

đem đi sấy

Pha chế và đổ mơi trường
Mỗi nhóm pha một môi trường rồi chia cho tất cả các nhóm cịn lại trong lớp sử
dụng.
+ Nhóm 1 : Pha mơi trường Cao thịt – Peptone
+ Nhóm 2 : Pha mơi trường PGA
+ Nhóm 3 : Pha mơi trường Hansen
+ Nhóm 4 : Pha mơi trường Cao thịt - Peptone
Nhóm chúng em pha 100ml môi trường Cao thịt – Peptone
- Chuẩn bị :

+Dụng cụ :

+ Hóa chất :

1 cốc thủy tinh

Nước cất : 100ml

1 ống đong

Cao thịt : 0.3g

1 đũa thủy tinh

Peptone : 1g

1 ca nhựa

NaCl : 0.5g

1 cân kỹ thuật

Agar : 2g

5


a. Pha hóa chất
- Cân cao thịt (0.3g), peptone(1g), NaCl(0.5g), Agar(2g), nước cất (100ml)
bỏ

riêng lẻ từng chất.

-

Pha

lỗng từng hóa chất rồi phối trộn các thành phần theo trình tự nhất định tránh sự
tương tác trực tiếp của các thành phần có thể phản ứng tạo kết tủa với nhau.Phối
6


trộn theo nguyên tắc thể tích tăng dần, khuấy đều, sau đó thêm nước cất đến cho
đủ 100ml, tiếp tục khuấy, rồi đổ sang ca nhựa.

- Đem vào lò vi sóng nấu sơi nhẹ để agar tan hết tồn (cách 1 phút lấy ra kiểm
tra 1 lần, thấy sắp sôi thì set 30s tránh để bị sơi tràn ra ngồi ).

b. Phân phối môi trường vào dụng cụ chứa
- Lấy mơi trường ra khỏi lị vi sóng, nhanh tay đổ mơi trường vào bình thủy
tinh.
- Dùng bơng gịn khơng thấm đậy kín nắp bình và lấy giấy báo bọc ngồi, cột
dây su lại cho chắc chắn.
- Hấp tiệt trùng môi trường bằng nồi hấp cao áp trong vòng 30 phút, nhiệt độ
121 độ C, 1 atm.

7


Hình ảnh mơi trường sau khi đổ vào bình chứa

Sử dụng nồi hấp cao áp
Bước 1: Kiểm tra nồi hấp, khóa các van thơng giữa 2 nồi và van xả khí. Kiểm
tra mực nước, mực nước phải đạt từ 1/2 đến 2/3 ống nước .
Bước 2: Bật cầu giao.
Bước 3: Đợi đồng hồ dưới lên 1 atm cho dụng cụ mơi trường cần hấp vào nồi.
Khóa nắp theo ngun tắc đối xứng 2 bên, mở van thông giữa 2 nồi ( cho khí ở
nồi bên ngồi tràn vào nồi bên trong ).
Bước 4 : Chờ đồng hồ trên lên 1 atm, mở van xả khí ( 3-5 phút ) sau đó đóng
van xả khí chờ đồng hồ lên 1atm rồi mới bắt đầu tính giờ. Hấp trong vịng 30
phút ( thời gian hấp phụ thuộc vào thể tích mơi trường ni cấy) .
Bước 5: Sau 30 phút đóng van thơng giữa 2 nồi , tắt cầu giao, xả khí để đồng hồ
trên xuống 0 atm, mở nắp lấy môi trường ra khỏi nồi hấp.

8


Hình ảnh nồi hấp cao áp
c. Đổ mơi trường vào đĩa petri
Tắt quạt. Chọn bề mặt thích hợp trống trãi, khơng có các vật dễ cháy xung
quanh để tránh cháy, nổ
Bước 1 : Khử trùng tay và xung quanh mặt bàn bằng cồn 70 độ
Bước 2 : Chuẩn bị
sấy tiệt trùng và
hấp tiệt trùng, đèn

đĩa petri đã được
bình mơi trường đã
cồn

Bước 3 : Tay phải

trường, tháo nút
ngắn vào trong
tránh bị nhiễm vi
miệng bình xung

cầm
bình
mơi
bơng ( đặt ngay
miệng giấy báo để
sinh vật khác) , hơ
quanh đèn cồn

Bước 4 : Tay trái
xung quanh ngọn
10cm

cầm đĩa petri hơ đĩa
lửa trong bán kính

Bước 5 : Mở hé nắp đĩa, đổ từ từ môi trường vào đĩa cho đến khi lớp thạch
được trải đều (thể tích mơi trường khoảng 12-15ml mỗi đĩa và độ dày khoảng
2mm). Cầm đĩa petri song song với mặt bàn khéo léo đặt nhẹ xuống bàn tránh
đụng vào những đĩa đã đổ môi trường.
Lưu ý : thực hiện các thao tác phải trong vịng vơ trùng của ngọn lửa đèn cồn,
bán kính khoảng 10cm

9

Hình ảnh đổ mơi trường vào đĩa petri
- Đợi mơi trường trong đĩa đông lại , ta tiến hành viết nhãn trên đĩa gồm : tên
môi trường, người đổ, ngày đổ

KẾT QUẢ :
- Thu được 15 đĩa môi trường ( 6 Cao thịt, 5 Hansen, 4 PGA ). Có 5 đĩa ( 2 cao
thịt, 2 Hansen, 1PGA) môi trường bị dính nắp.
- Thảo luận với giảng viên : số đĩa cịn lại vẫn đủ để tiến hành ni vi sinh vật.

10


Nhật ký thí nghiệm ngày 15 tháng 11 năm 2020
CƠNG VIỆC : cấy vi sinh vật lên đĩa môi trường
NGƯỜI THỰC HIỆN : cả nhóm
PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN :
11


Cấy vi sinh vật từ :
+ Mẫu có sẵn
+ Mẫu khơng khí ( Ban đầu nhóm dự định làm mẫu nước mía , nhưng cuối cùng
nhóm quyết định làm mẫu khơng khí )
Các bước tiến hành đối với mẫu có sẵn
Bước 1 : Chuẩn bị đĩa petri đã đổ môi trường ( đã đông lại ).
Bước 2 : Khử trùng tay và xung quanh mặt bàn bằng cồn 70 độ.
Bước 3 : Hơ lửa xung quanh đĩa petri, mở hé nắp đĩa. Dùng micropipette và đầu
tuýp vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chữa giống vi sinh
vật lên bề mặt môi trường trong đĩa petri.
Bước 4 : Nhúng đầu que trải thủy tinh vào cồn 96°, hơ qua ngọn lửa (3 lần) để

tiệt trùng que trải. Sau đó, để đầu que trải nguội trong khơng gian vơ
trùng của ngọn lửa.
Bước 5 : Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng que trải lên bề mặt thạch đĩa petri. Dùng
đầu que trải xoay, trải đều dịch lên bề mặt thạch cho đến khi bề mặt
thạch khơ hồn tồn.
Bước 6 : Rút que trải ra khỏi đĩa , đậy đĩa và hơ lửa xung quanh đĩa petri .
Lưu ý : các thao tác phải được thực hiện trong vịng vơ trùng của ngọn lửa đèn
cồn ( bán kính khoảng 10 cm) .

12


Các bước tiến hành đối với mẫu tự chọn ( khơng khí )
Bước 1 : Chuẩn bị đĩa petri đã đổ môi trường ( đã đông lại ).
Bước 2 : Mở đĩa petri để ngồi khơng khí trong khoảng 20’.
Bước 3 : Đậy nắp đĩa petri lại, đem đi gói giấy báo.

KẾT QUẢ :
13


NHẬN XÉT :

Có vi sinh vật phát triển trên các mẫu , mật độ vi sinh vật khá nhiều. Có thể tiến
hành phân lập vi sinh vật.

Nhật ký thí nghiệm ngày17 tháng 11 năm 2020
CÔNG VIỆC : Quan sát và cấy truyền vi sinh vật
14

NGƯỜI THỰC HIỆN : cả nhóm
+ Làm tiêu bản , quan sát vi sinh vật :
+ Cấy truyền vi sinh vật :
PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN :
Làm tiêu bản giọt ép
Tạo không gian vô trùng.
Bước 1 : Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý lên lam kính đã được làm sạch.
Bước 2 : Dùng que cấy đã được tiệt trùng chuyển giống vi sinh vật từ đĩa
petri lên phiến kính.
Bước 3 : Hòa sinh khối vi sinh vật vào giọt nước muối sinh lý.
Bước 4 : Đặt lamelle lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh khơng tạo bọt
khí giữa 2 tấm ( Để 1 mép lamelle tiếp xúc với phiến kính nghiêng
khoảng 45 độ rồi từ từ hạ lamelle xuống ).
Bước 5 : Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi ở vật kính x10, rồi chuyển
sang x40.
Lưu ý : Dùng que cấy móc đối với tiêu bản nấm mốc, que cấy tròn đối với tiêu
bản nấm men và vi khuẩn.

Ảnh hiển vi của nấm men
Ảnh hiển vi của nấm mốc
- Môi trường Cao thịt- Peptone : phân
lập và nuôi cấy vi khuẩn.
- Môi trường Hansen : phân lập và nuôi cấy nấm men.
- Môi trường PGA : phân lập và nuôi cấy nấm mốc.
15


Cấy truyền vi sinh vật bằng phương pháp cấy ria, cấy điểm, cấy gõ
- Đối với nấm men và vi khuẩn: cấy truyền bằng phương pháp cấy ria (ria zích

zắc, ria chữ T, ria 3 góc, ria 4 góc) bằng que cấy đầu tròn.
Bước 1 : Khử trùng tay và mặt bàn bằng cồn 70 độ.
Bước 2 : Dùng que cấy đầu tròn đốt trên ngọn lửa đèn cồn để tiệt trùng que cấy
đến khi đỏ que.
Bước 3 : Tay trái cầm đĩa chứa mẫu vi sinh vật hơ xung quanh đĩa, sau đó mở
hé đĩa.
Bước 4 : Tay phải cầm que cấy tròn cho vào trong đĩa, để que cấy đụng nắp đĩa,
dùng tay trái sờ bên ngoài để kiểm tra xem que cấy đã nguội hay chưa.
Bước 5 : Khi que cấy đã nguội thì tiến hành lấy một ít sinh khối vi sinh vật, đậy
nắp đĩa và hơ xung quanh qua ngọn lửa đèn cồn. Úp ngược đĩa lại rồi đặt đĩa
xuống bàn.
Bước 6 : Que cấy sau khi đã lấy sinh khối vi sinh vật tiến hành cấy vào đĩa petri
có chứa mơi trường.
Bước 7 : Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo phương pháp cấy ria.
Bước 8 : Khi cấy xong , đậy nắp đĩa petri và hơ xung quanh đĩa , rồi tiệt trùng
lại que cấy.

Hình : cấy ria trên đĩa thạch
- Đối với nấm mốc: cấy truyền bằng phương pháp cấy điểm hoặc cấy gõ, cấy
truyền bằng que cấy móc.
Bước 1 : Khử trùng tay và mặt bàn bằng cồn 70 độ.
16


Bước 2 : Dùng que cấy móc đốt trên ngọn lửa đèn cồn để tiệt trùng que cấy đến
khi đỏ que.
Bước 3 : Tay trái cầm đĩa chứa mẫu vi sinh vật hơ xung quanh đĩa, sau đó mở
hé đĩa.
Bước 4 : Tay phải cầm que cấy móc cho vào trong đĩa, để que cấy đụng nắp
đĩa , dùng tay trái sờ bên ngoài để kiểm tra xem que cấy đã nguội hay chưa.

Bước 5 : Khi que cấy đã nguội thì tiến hành móc một ít bào tử hoặc sợi nấm ,
đậy nắp đĩa và hơ xung quanh qua ngọn lửa đèn cồn rồi nhẹ nhàng đặt đĩa
xuống bàn.
Bước 6 : Dùng que cấy tiến hành cấy vào đĩa petri có chứa mơi trường PGA
bằng phương pháp cấy điểm (cấy 3 điểm hoặc một điểm).

Hình : cấy 3 điểm

trên đĩa thạch

KẾT QUẢ :

NHẬN XÉT :
17


- Đã quan sát được tế bào nấm mốc và nấm men, biết được hình dạng của từng
tế bào, cấy truyền chưa được đẹp và mật độ vi sinh chưa giảm sau mỗi đường
cấy ( chưa thấy được các khuẩn lạc đơn lẻ).
- Nguyên nhân do trong quá trình cấy truyền chưa đốt que cấy sau mỗi lần ria và
đường ria sau bị chồng lên quá dày so với đường ria trước.
- Cách khắc phục: Xem lại video hướng dẫn của cô đã quay lại và tập cấy ria lại
nhiều lần.

Nhật ký thí nghiệm ngày 21 tháng 11 năm 2020
CƠNG VIỆC :
+ Hấp bỏ môi trường bị hư hỏng
+ Đổ môi trường và tiếp tục cấy truyền làm thuần
NGƯỜI THỰC HIỆN : cả nhóm
+ Hấp bỏ và đổ mơi trường :

+ Cấy truyền và làm thuần :
PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN :
Pha chế và đổ môi trường :
+ Dụng cụ : cốc thủy tinh , ống đong , đũa thủy tinh, ca nhựa, cân kỹ thuật...
+ Hóa chất : Cao thịt, Peptone, NaCl, Agar, Glucose, K2PO4, MgSO4.7H2O ,..
- Pha 150 ml môi trường Cao thịt- Peptone
- Pha 100 ml môi trường PGA
- Pha 150 ml môi trường Hansen

18


Cấy truyền vi sinh vật
- Đối với nấm mốc: cấy truyền bằng phương pháp cấy điểm hoặc cấy gõ, cấy
truyền bằng que cấy móc.
- Đối với nấm men và vi khuẩn: cấy truyền bằng phương pháp cấy ria bằng que
cấy đầu tròn.

KẾT QUẢ :

19


Đĩa Hansen cấy nấm Đĩa
menPGA
bị cấy nấm mốc thuần
nhiễm vi khuẩn và nấm mốc
chủng

Đĩa CT-PT cấy vi khuẩn bị

nhiễm vsv khác

Đĩa CT-PT cấy vi khuẩn bị
nhiễm vsv khác

Đĩa CT-PT cấy cầu khuẩn bị
nhiễm vsv khac

20