Lê trần bình xây dựng phương pháp định lượng bilastin trong huyết tương bằng lc ms khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ TRẦN BÌNH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG BILASTIN
TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG LC-MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2023


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ TRẦN BÌNH

Mã sinh viên: 1801073

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG BILASTIN
TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG LC-MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. ThS. Ngơ Quang Trung
2. PSG. TS. Lê Đình Chi
Nơi thực hiện
Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc Gia

HÀ NỘI – 2023

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin phép được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.
TS. Lê Đình Chi và ThS. Ngơ Quang Trung, những người đã tận tình hướng dẫn, chỉ
bảo cũng như giải đáp những thắc mắc giúp tơi trong suốt q trình thực hiện và hồn
thành khóa luận này.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới các anh chị nghiên cứu viên
tại Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi, cũng như
động viên, hỗ trợ em trong quá trình học tập, nghiên cứu tại Viện trong suốt thời gian
qua để có thể hồn thành được khóa luận này.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô đã luôn quan tâm, giúp đỡ tôi và các
bạn Ngô Quang Minh, Trần Ngọc Phan, cùng những người bạn khác đã đồng hành
cùng tôi trong suốt những năm tháng học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin dành sự biết ơn sâu sắc nhất tới bố mẹ và anh, những người thân
yêu trong gia đình đã ln ln ủng hộ, cổ vũ tơi cũng như chuẩn bị mọi hành trang tốt
nhất để giúp tơi hồn thành khóa luận này.
Một lần nữa, tơi xin cảm ơn và kính chúc các thầy cơ, anh chị nghiên cứu viên, bạn
bè và gia đình ln có một sức khỏe dồi dào, luôn thành công trong công việc và hạnh
phúc trong cuộc sống.

Hà Nội. ngày 31 tháng 05 năm 2023
Sinh viên

Lê Trần Bình


MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .........................................................................................2
1.1. Tổng quan về bilastin ............................................................................................... 2
1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất hóa lý ...................................................................2
1.1.2. Các đặc tính dược lý, dược động học của bilastin ................................................2
1.1.3. Các phương pháp định lượng bilastin ...................................................................4
1.2. Phân tích thuốc trong dịch sinh học .........................................................................6
1.2.1. Thành phần và đặc điểm của huyết tương người ..................................................6
1.2.2. Kỹ thuật xử lý huyết tương ....................................................................................6
1.2.3. Tổng quan về LC-MS/MS ......................................................................................8
1.3. Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học .........................................11
1.3.1. Độ chọn lọc ..........................................................................................................11
1.3.2. Đánh giá khả năng nhiễm chéo ...........................................................................11
1.3.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính .....................................................................12
1.3.4. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) ......................................................................12
1.3.5. Độ đúng, độ chính xác .........................................................................................12
1.3.6. Tỷ lệ thu hồi (hiệu suất chiết) ..............................................................................12
1.3.7. Độ ổn định ...........................................................................................................12
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU .............................................................................................................13
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị .........................................................................................13
2.1.1. Hóa chất - chất chuẩn .........................................................................................13
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ phân tích ..................................................................................13
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................................13
2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ...................................................................14
2.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích .......................................................................14
2.2.2. Chuẩn bị mẫu ......................................................................................................14

2.2.3. Thẩm định phương pháp phân tích......................................................................16
2.2.4. Phương pháp xử lý kết quả ..................................................................................21
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................22
3.1. Kết quả xây dựng phương pháp phân tích .............................................................. 22
3.1.1. Khảo sát, xác định điều kiện sắc kí và lựa chọn chuẩn nội ................................ 22
3.1.2. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng trong huyết tương bằng LC-MS/MS
được xây dựng như sau ..................................................................................................25
3.2. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích............................................................. 26
3.2.1. Độ phù hợp hệ thống phân tích ...........................................................................26
3.2.2. Độ đặc hiệu ..........................................................................................................27
3.2.3. Độ nhiễm chéo .....................................................................................................28
3.2.4. Đường chuẩn - khoảng tuyến tính .......................................................................29
3.2.5. Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ) .......................................................30
3.2.6. Độ đúng, độ chính xác của phương pháp ............................................................ 31
3.2.7. Xác định tỉ lệ thu hồi ...........................................................................................36
3.2.8. Độ ổn định ...........................................................................................................38
3.3. Bàn luận ..................................................................................................................40
3.3.1. Phương pháp định lượng bilastin ........................................................................40
3.3.2. Kỹ thuật xử lý mẫu ............................................................................................... 41
3.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích......................................................................41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tên

ACN

Acetonitril

BIL

Bilastin

CC

Đường chuẩn

Cmax

Nồng độ đỉnh (Maximum concentration)

CT

Chiết tách

CV

Hệ số biến thiên (Coefficient of variation)

EMA
ESI
HQC

Cơ quan quản lý thuốc Châu Âu (European medicines agency)
Kỹ thuật ion hóa phun điện tử (Electrospray ionization)

Mẫu kiểm tra nồng độ cao (High quality control samples)

HT

Huyết tương

IS

Chuẩn nội (Internal standard)

LC-MS
LC-MS/MS
LLE

Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid chromatography - mass spectrometry)
Sắc ký lỏng khối phổ hai lần
(Liquid chromatography with tandem mass spectrometry)
Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng (Liquid-liquid extraction)

LLOQ

Giới hạn định lượng dưới (Lower limit of quantification)

LQC

Mẫu kiểm tra nồng độ thấp (Low quality control samples)

m/z

Khối lượng/điện tích

MeOH

Methanol

MQC

Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình (Medium quality control samples)

MS

Khối phổ (Mass spectrometry)

NMR

Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance)

PPT

Kỹ thuật tủa protein (Protein precipitation)

PTHQ

Phương trình hồi quy

QC

Mẫu kiểm tra

RE

Sai số dư (Residual error)

RP

Pha đảo (Reverse phase)

Rt

Thời gian lưu (Retention time)

SKD

Sinh khả dụng

SPE

Kỹ thuật chiết pha rắn (Solid-phase extraction)

SQC

Mẫu kiểm tra bổ sung (Supplement quality control samples)


SST

Mẫu kiểm tra độ thích hợp hệ thống (System Suitability Testing)

STT

Số thứ tự

TB

Trung bình

TĐSH
TEA
TLTK
tmax
ULOQ
US-FDA

Tương đương sinh học
Triethanolamin
Tài liệu tham khảo
Thời gian đạt nồng độ cực đại
Giới hạn định lượng trên (Upper limit of quantification)
Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ
(The United States Food and Drug Administration)

tt

Thể tích

w

Khối lượng (Weighting)

∑RE%

Tổng phần dư độ đúng (relative error)


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo bilastin ...............................................................................2
Hình 1.2. Kỹ thuật tủa protein .........................................................................................7
Hình 1.3. Cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng khối phổ ...........................................................9
Hình 1.4. Sơ đồ mơ tả ngun lý ion hóa bằng kỹ thuật ESI ........................................10
Hình 3.1. Phổ Scan ........................................................................................................22
Hình 3.2. Sắc ký đồ bilastin của các hệ pha động .........................................................23
Hình 3.3. Sắc ký đồ bilastin và IS tại các tỷ lệ pha động ..............................................24
Hình 3.4. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu .............................................................................26


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Bảng thông số dược động của bilastin trong một số nghiên cứu ....................3
Bảng 1.2. Tóm tắt một số phương pháp định lượng bilastin trong đối tượng mẫu khơng
phải là huyết tương ..........................................................................................................4
Bảng 1.3. Tóm tắt một số phương pháp định lượng bilastin trong huyết tương .............5
Bảng 2.1 Cách chuẩn bị đường chuẩn trong huyết tương .............................................15
Bảng 2.2 Cách chuẩn bị các mẫu kiểm tra trong huyết tương ......................................15
Bảng 2.3 Cách chuẩn bị mẫu SST .................................................................................16
Bảng 3.1. Bảng tóm tắt điều kiện ion hóa .....................................................................26
Bảng 3.2. Kết quả đánh giá độ thích hợp của hệ thống LC-MS/MS............................. 27
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của mẫu trắng (blank) tại thời điểm trùng Rt của bilastin và IS 27
Bảng 3.4. Kết quả đánh giá độ nhiễm chéo ...................................................................28
Bảng 3.5. Kết quả test F ................................................................................................ 29
Bảng 3.6. Kết quả xác định hệ số weighting .................................................................29
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát đường chuẩn theo mơ hình weighting 1/X2 ......................30

Bảng 3.8. Đáp ứng pic của mẫu LLOQ và mẫu trắng (blank) tại Rt của bilastin .........30
Bảng 3.9. Độ đúng, độ chính xác của mẫu LLOQ ........................................................31
Bảng 3.10. Kết quả phân tích độ đúng - độ chính xác trong ngày mẫu LLOQ.............31
Bảng 3.11. Kết quả phân tích độ đúng - độ chính xác trong ngày mẫu LQC ...............32
Bảng 3.12. Kết quả phân tích độ đúng - độ chính xác trong ngày mẫu SQC ...............32
Bảng 3.13. Kết quả phân tích độ đúng - độ chính xác trong ngày mẫu MQC ..............32
Bảng 3.14. Kết quả phân tích độ đúng - độ chính xác trong ngày mẫu HQC ...............33
Bảng 3.15. Kết quả phân tích độ đúng - độ chính xác khác ngày .................................34
Bảng 3.16. Độ đúng, độ chính xác khi pha loãng mẫu..................................................35
Bảng 3.17. Kết quả độ thu hồi ở nồng độ LQC ............................................................. 36
Bảng 3.18. Kết quả độ thu hồi ở nồng độ SQC ............................................................. 36
Bảng 3.19. Kết quả độ thu hồi ở nồng độ MQC............................................................ 37
Bảng 3.20. Kết quả độ thu hồi ở nồng độ HQC ............................................................ 37
Bảng 3.21. Kết quả độ ổn định mẫu HT ban đầu và sau thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng
.......................................................................................................................................38
Bảng 3.22. Độ ổn định mẫu dịch sinh học lúc bắt đầu và sau 5 chu kỳ đông - rã đông39
Bảng 3.23. Kết quả độ ổn định của mẫu ban đầu và sau xử lý trong auto-sampler 24 giờ
.......................................................................................................................................39


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, thực trạng các bệnh dị ứng đang gia tăng trên khắp thế
giới. Một số nghiên cứu đã chứng minh sự gia tăng tỷ lệ mắc bệnh hen suyễn, viêm mũi
dị ứng và viêm da dị ứng trong bốn thập kỷ qua, đặc biệt đối với trẻ em. Sự gia tăng này
đã được quan sát thấy ở cả các nước phát triển và các nước đang phát triển, đặt ra một
gánh nặng đáng kể cho bệnh nhân, gia đình họ và xã hội. Những rối loạn này ảnh hưởng
tiêu cực tới các hoạt động hàng ngày như hoạt động thể chất, công việc cũng như tới
tâm lý của bệnh nhân [28].
Histamin và các thụ thể của nó đóng vai trị quan trọng trong sự phát triển các bệnh
dị ứng khác nhau. Từ vai trò của histamin và đặc biệt đối với thụ thể H1 receptor trong

các bệnh dị ứng, các thuốc kháng histamin H1 đã xuất hiện [32]. Thuốc kháng Histamin
H1 thế hệ một có tác dụng kháng cholinergic rõ rệt, tác dụng an thần và tương tác với
rượu và nhiều loại thuốc. Ngược lại, thuốc kháng histamin H1 thế hệ thứ hai gây ra tác
dụng an thần tối thiểu hoặc không gây ra tác dụng kháng cholinergic và được khuyến
cáo là lựa chọn điều trị đầu tiên cho bệnh nhân viêm mũi dị ứng hay nổi mề đay. Bilastin
là thuốc kháng histamin thế hệ thứ hai chọn lọc. Nó lần đầu được phê duyệt tại Liên
minh Châu Âu vào năm 2010 để điều trị triệu chứng viêm mũi dị ứng và nổi mề đay ở
bệnh nhân từ 12 tuổi trở lên và hiện đã có mặt ở khoảng 100 quốc gia. Gần đây, nó đã
được phê duyệt ở Châu Âu để sử dụng cho trẻ em từ 6 đến < 12 tuổi [14].
Đối với các nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học, một trong
những nội dung quan trọng là phải xây dựng được một phương pháp định lượng đủ độ
nhạy và đủ độ tin cậy. Với bilastin, quá trình phân tích thuốc trong dịch sinh học thường
gặp nhiều khó khăn do nồng độ thuốc trong mẫu thấp. Nồng độ bilastin tối đa ở các bệnh
nhân dao động từ 99,1 ± 24,1 ng/ml đến 1277,9 ± 404,9 ng/ml tương ứng với liều 10 100 mg/ngày [21], ngoài ra do nền mẫu dịch sinh học tương đối phức tạp, các thiết bị
thông thường như máy quang phổ, sắc ký lỏng khơng đủ độ nhạy, thời gian phân tích
kéo dài và quy trình xử lý mẫu phức tạp.
Hiện nay, bằng việc phối hợp kỹ thuật sắc ký lỏng và phân tích khối phổ có thể giải
quyết được vấn đề về độ chọn lọc, độ đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp phân tích
định lượng bilastin trong dịch sinh học và nghiên cứu tương đương sinh học. Vì vậy,
khóa luận này tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng bilastin trong huyết
tương bằng LC-MS” với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng phương pháp định lượng bilastin trong huyết tương bằng LC-MS.
2. Thẩm định phương pháp định lượng bilastin trong huyết tương đã xây dựng.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về bilastin
1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất hóa lý

1.1.1.1. Cơng thức cấu tạo

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo bilastin
- Cơng thức phân tử: C28H37N3O3.
- Khối lượng phân tử: 463,6 g/mol.
- Tên khoa học: Acid 2-[4-[2-[4-[1-(2-ethoxyethyl)benzimidazol-2-yl]piperidin-1yl]ethyl]phenyl]-2-methylpropanoic [17].
1.1.1.2. Tính chất lý hóa
Bilastin ở dạng tinh thể trắng; khơng tan trong acetonitril, rất ít tan trong nước,
methanol và tan trong ethanol, chloroform, NaOH, HCl 1N [9]. Bilastin có nhiệt độ nóng
chảy khoảng 202oC; nhiệt độ sôi khoảng 639oC; logP=2,3, pKa = 4,06 [17].
1.1.2. Các đặc tính dược lý, dược động học của bilastin
1.1.2.1. Dược lực học
Nhóm dược lý: Thuốc kháng histamin sử dụng tồn thân [7].
Bilastin là chất đối kháng histamin không gây buồn ngủ, có tác dụng kéo dài, đối
kháng chọn lọc trên thụ thể H1 ngoại vi và khơng có ái lực với thụ thể muscarinic [7].
Dữ liệu từ các nghiên cứu tiền lâm sàng đã xác nhận ái lực và tính chọn lọc cao của
nó đối với thụ thể histamin H1 so với các thụ thể histamin khác. Bilastin liên kết với các
thụ thể H1 của tiểu não chuột lang và với các thụ thể H1 tái tổ hợp của con người với ái
lực tương đương với ái lực của astemizol và diphenhydramin, và vượt trội hơn cetirizin
gấp ba lần và fexofenadin gấp năm lần. Bilastin không ức chế các thụ thể muscarinic,
α1- và ꞵ2-adrenoceptors, bradykinin ꞵ1, leukotrien D4 hoặc thụ thể calci, trong một
nghiên cứu in vitro trên 30 vị trí thụ thể khác nhau; và cả bilastin, cetirizin hay
fexofenadin đều khơng có tác dụng đối với các thụ thể H2-, H3- hoặc H4- [15].
1.1.2.2. Dược động học
Hấp thu: Bilastin được hấp thu nhanh sau khi uống và đạt nồng độ tối đa trong huyết
tương sau khoảng 1,3 giờ. Thuốc không bị tích lũy. Giá trị sinh khả dụng đường uống
trung bình của bilastin là 61% [7].

2

Phân bố: Nghiên cứu in vitro và in vivo cho thấy bilastin là cơ chất của Pglycoprotein (P-gp) và cơ chất của polypeptid vận chuyển anion hữu cơ (OATP).
Bilastin không phải là cơ chất của các chất vận chuyển protein kháng ung thư vú (BRCP)
hoặc chất vận chuyển tại thận kênh vận chuyển cation hữu cơ 2 (OCT2), kênh vận
chuyển anion hữu cơ 1 (OAT1) và kênh vận chuyển anion hữu cơ 3 (OAT3). Theo các
nghiên cứu in vitro, bilastin khơng được dự đốn là ức chế các chất vận chuyển trong
tồn hệ thống, do chỉ có mức độ ức chế thấp được ghi nhận với P-gp, polypeptid vận
chuyển anion hữu cơ 2B1 (OATP2B1) và OCT1, với giá trị nồng độ ức chế tối đa một
nửa (IC50) ước tính > 300 μM, cao hơn rất nhiều so với nồng độ tối đa ước tính trong
huyết tương Cmax. Vì thế, các tương tác này khơng có nhiều ảnh hưởng trên lâm sàng.
Tuy nhiên, cũng theo các nghiên cứu này, không thể loại trừ tác dụng ức chế của bilastin
lên các chất vận chuyển trên niêm mạc ruột [7].
Ở liều điều trị, tỷ lệ gắn với protein huyết tương của thuốc là 84 - 90% [7].
Chuyển hóa: Kết quả các nghiên cứu in vitro cho thấy bilastin không cảm ứng hoặc
ức chế hoạt tính của Cytochrom P450 [7].
Thải trừ: Trong một nghiên cứu cân bằng khối được thực hiện trên người tình
nguyện khỏe mạnh, sau khi uống một liều đơn 20 mg 14C-bilastin, gần như 95% liều
dùng được tìm thấy trong nước tiểu (28,3%) và phân (66,5%) dưới dạng bilastin không
biến đổi. Điều này cho thấy bilastin khơng được chuyển hóa nhiều trong cơ thể người.
Thời gian bán thải trung bình tính trên người tình nguyện khỏe mạnh là 14,5 giờ [7].
Thơng số dược động học bilastin trong một số nghiên cứu thể hiện trong bảng 1.1. sau:
Bảng 1.1. Bảng thông số dược động của bilastin trong một số nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu Liều - Số mẫu Cmax (ng/ml) tmax (giờ)
t1/2 (giờ) TLTK
144,0 ±
1,5
9,26 ±
20 mg, N = 6
57,8
(1,0 - 3,0)

2,79
172,1 ±
1,5
15,08 ±
20 mg, N = 6
Liều đơn
45,0
(0,5 - 3,0)
7,66
24 người tình nguyện
[22]
271,1 ±
2,3
10,46
±
Nghiên cứu đói
20 mg, N = 6
30,4
(1,0 - 2,5)
2,34
228,8 ±
1,5
18,38 ±
20 mg, N = 6
81,8
(0,5 - 3,0)
11,39
Liều đơn
219,6 ±
9,05 ±

[29]
1,31 ± 0,72
12 người tình nguyện 20 mg, N = 12
62,0
5,55
Nghiên cứu đói
153,13 ±
13,86 ±
10 mg, N = 9
1,4 ± 0,5
52,5
9,48
274,9 ±
11,95 ±
Liều đơn
20 mg, N = 9
1,4 ± 0,6
109,9
9,05
36 người tình nguyện
[33]
756,01
±
12,9
±
Nghiên cứu đói
50 mg, N = 9
1,1 ± 0,4
280,06
8,24

Placebo, N = 9
3


1.1.3. Các phương pháp định lượng bilastin
Một số phương pháp định lượng bilastin trong đối tượng mẫu không phải là huyết tương
được liệt kê trong bảng 1.2.
Bảng 1.2. Tóm tắt một số phương pháp định lượng bilastin trong đối tượng mẫu khơng
phải là huyết tương
Đối tượng
Điều kiện đo
TLTK
phân tích
Định lượng
- Thiết bị: Máy quang phổ MicroNIRTM PAT-W.
bilastin trong
[13]
- Chế độ đo: phản xạ khuếch tán.
hỗn hợp bột

Định lượng
viên
nén
bilastin

Định lượng
viên
nén
bilastin và
định tính sản

phẩm thối
hóa
của
bilastin

Định lượng
viên
nén
bilastin và
định tính sản
phẩm thối
hóa
của
bilastin

Định lượng
viên
nén
bilastin

- Cột RP-18 (150 × 4,6 mm; 5 μm).
- Pha động: dung dịch TEA 0,3% chứa acid formic được điều
chỉnh tới pH 6,0 - ACN (55:45, tt/tt).
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
- Nhiệt độ cột: 25oC.
- Thời gian phân tích: 5 phút.
- Bước sóng phát hiện: 207 nm.
- Cột RP-18 (150 × 4,6 mm; 5 µm).
- Pha động: dung dịch TEA 0,3% chứa acid formic được điều
chỉnh tới pH 6,0 - ACN (52:48, tt/tt).

- Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút.
- Thời gian phân tích: 6 phút.
- Nhiệt độ cột: 30°C.
- Bước sóng phát hiện: 250 nm và 310 nm.
Máy quang phổ APPI-QTOF MS
- Nguồn ion hóa: ESI+, Nhiệt độ: 180oC.
- Phun trực tiếp mẫu.
- Tốc độ dòng: 3 μL/phút.
- m/z bilastin: 464,2899.
- Ct C18 (250 ì 4,6mm; 5àm).
- Tc độ dòng: 1,0 ml/phút.
- Pha động: ACN - đệm phosphat pH 5,5 (30:70, tt/tt).
- Bước sóng phát hiện: 275 nm.
- Thời gian chạy: 8,57 phút.
MicroTOF-Q II: Nguồn ion hóa: ESI+.
NMR: Phổ 1H và 13C NMR được ghi ở 300 K, dung mơi:
CDCl3, chất nội chuẩn: Tetramethylsilan.
- Cột C18 (100 × 4,6 mm; 5 µm).
- Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút.
- Pha động: ACN - 50 mM amoni acetat trong nước (điều
chỉnh bằng acid acetic băng tới pH 5,3) (90,5:9,5, tt/tt)
- Nhiệt độ cột: 30oC.
- Bước sóng phát hiện: 275 nm.
4

[16]

[25]

[27]

[31]


Một số phương pháp được sử dụng để định lượng bilastin trong huyết tương được
liệt kê trong bảng 1.3.
Bảng 1.3. Tóm tắt một số phương pháp định lượng bilastin trong huyết tương
Phương pháp
LLOQ
TLTK
Điều kiện sắc ký
(ng/ml)
xử lý mẫu
Tủa protein bằng
[26]
- Hệ thống LC-MS/MS
0,02
MeOH - ACN (1:1)
- Cột C18 (30 × 2,1 mm; 3,5 µm).
- Chuẩn nội: bilastin-d6.
- Nhiệt độ cột: 25oC.
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
Tủa protein bằng
[33]
- Pha động: nước - ACN chứa amoni
0,2
MeOH và ACN
format 1 mM và amoni hydroxid 0,1 %.
- m/z: 464 → 272 (bilastin),
470 → 278 (bilastin-d6).

- Nguồn ion hóa: ESI+.
- Cột C18 (30 × 2,1 mm; 3,5àm).
Chit pha rn bng - Nhit ct: 50oC.
ct Isoluteđ C8 EC; - Tốc độ dòng: 0,15 ml/phút.
[29]
0,2
Biotage
AB, - m/z: 464 → 272 (bilastin),
Uppsala, Sweden
431 → 234 (trandolapril).
- Thời gian lưu: 0,7 phút (bilastin).
- Cột RP18 (50 × 2,1 mm; 3,5 μm).
- Nhiệt độ cột: 50oC.
Chiết pha rắn bằng - Pha động: ACN - nước - acid formic
cột Isolute® C8 EC; (49,5:49,5:1, tt/tt/tt).
[20]
0,2
Biotage
AB, - Tốc độ dòng: 0,15 ml/phút.
Uppsala, Sweden
- Thời gian lưu: 0,7 phút (bilastin).
- m/z: 464 → 272 (bilastin),
431 → 234 (trandolapril).
- Cột C18 (100 × 4,6 mm; 2,6 μm).
- Chuẩn nội: Papaverin.
- Pha động:
0,1% acid formic trong ACN - nước
Chiết bằng dung dịch - Chế độ gradient.
đệm carbonat 0,5 M - Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.
[19]

10
(pH 9) và ethyl - Thời gian lưu: 7,17 phút (bilastin).
acetat.
- m/z mảnh mẹ: bilastin: 464,3,
papaverin: 340,2
- m/z mảnh con: bilastin: 272,2, 145,1,
191,1; papaverin: 202,0, 324,0
- Nguồn ion hóa: ESI+.

5


Hiện tại, trên thế giới các nghiên cứu về bilastin trong huyết tương cịn chưa nhiều
và Việt Nam chưa có nghiên cứu về định lượng bilastin trong huyết tương. Các nghiên
cứu đã có thường là LC-MS và sử dụng các cách xử lý mẫu như: chiết pha rắn, chiết
lỏng-lỏng, tủa protein.
Đối với kỹ thuật chiết pha rắn, kỹ thuật mang lại ưu điểm về nền mẫu sạch, độ chọn
lọc và khả năng thu hồi mẫu. Tuy nhiên, kỹ thuật này có chi phí thí nghiệm cao và quy
trình xử lý phức tạp nên chưa thực sự phù hợp khi triển khai tại Việt Nam và thực hiện
trên các phép phân tích tương đương sinh học.
Đối với kỹ thuật chiết lỏng-lỏng, kỹ thuật mang lại nền mẫu sạch, không cần thiết
bị đắt tiền và phù hợp với Việt Nam. Tuy nhiên, trong phương pháp [19] thì giới hạn
định lượng dưới cịn cao (10 ng/ml).
Đối với kỹ thuật tủa protein, ưu điểm của phương pháp là đơn giản, rẻ tiền, dễ thực
hiện. Tuy nhiên kỹ thuật cũng có nhược điểm là mẫu bị pha lỗng. Trong các phương
pháp nghiên cứu được tóm tắt ở trên, kỹ thuật tủa protein có ưu điểm khi giới hạn định
lượng thấp hơn như trong phương pháp [26] khi so với các phương pháp khác.
1.2. Phân tích thuốc trong dịch sinh học
1.2.1. Thành phần và đặc điểm của huyết tương người
Huyết tương là dịch ngoại bào nằm trong hệ thống các mạch máu. So với toàn bộ

cơ thể, thể tích huyết tương chiếm khoảng 5% trọng lượng cơ thể. Huyết tương có màu
vàng chanh, gồm các thành phần: khoảng 91,5% là nước, 1,5% chất hòa tan (các ion vô
cơ hoặc hữu cơ) và 7% là protein. Các protein huyết tương gồm: albumin, globulin,
fibrinogen [3].
1.2.2. Kỹ thuật xử lý huyết tương
Chuẩn bị mẫu là một phần quan trọng trong phân tích sinh học LC-MS, được sử
dụng nhiều trong việc xác định thuốc, chất chuyển hóa thuốc, dấu ấn sinh học và các
phân tử khác được quan tâm trong các nền sinh học khác nhau. Mặc dù các hệ thống
LC-MS cực kỳ tinh vi với độ nhạy tốt hơn trong phân tích sinh học, những thách thức
vẫn khơng thay đổi là việc chuẩn bị mẫu trước khi định lượng LC-MS.
Mục đích việc chuẩn bị mẫu vừa là làm cho chất cần phân tích có sẵn trong dịch
chiết mẫu ở nồng độ thích hợp để phát hiện MS mà cịn để loại bỏ các nguyên tố nền
gây nhiễu, nếu không được xử lý đúng cách, có thể thay đổi phản hồi của MS. Trong
phân tích sinh học LC-MS, dịch chiết mẫu sạch sẽ giúp sắc ký tốt hơn, giới hạn định
lượng thấp hơn, giảm độ biến thiên của kết quả, ít khả năng dương tính giả/ kết quả âm
tính, tuổi thọ của cột dài hơn, giảm thiểu chi phí v.v.

6


Các phương pháp chuẩn bị mẫu được sử dụng phổ biến nhất trong phân tích sinh
học LC-MS là: kỹ thuật tủa protein, kỹ thuật chiết lỏng - lỏng và kỹ thuật chiết pha rắn.
Ngồi ra có thể kể đến một số phương pháp như kỹ thuật vi chiết pha rắn, chiết hấp thụ
trên thanh khuấy v.v.
1.2.2.1. Kỹ thuật tủa protein (Protein Precipitation – PPT)
Các chất nền sinh học phổ biến, chẳng hạn như máu, huyết tương hoặc huyết thanh
chứa khoảng 8% (w/w) lượng protein. Do các protein trong các mẫu này dễ dàng kết tủa
do tiếp xúc với dung môi hữu cơ hoặc chất đệm trong pha động, do đó việc tiêm trực
tiếp các mẫu này vào hệ thống LC-MS thường không phải một lựa chọn tốt.
Trong kỹ thuật tủa protein, dung dịch mẫu được trộn với một lượng nhất định chất

gây kết tủa protein. Khi protein trong nền mẫu/dung dịch tiếp xúc với chất gây kết tủa,
cấu trúc của protein bị thay đổi do tương tác. Điều này dẫn đến sự kết tủa của các protein.
Do sự thay đổi về cấu hình của protein, các chất cần phân tích liên kết với protein được
giải phóng và ở lại trong dung dịch. Sau khi ly tâm và/hoặc lọc, các protein kết tủa được
tách ra khỏi các chất phân tích chứa trong phần dịch nổi phía trên [24].

Hình 1.2. Kỹ thuật tủa protein [12]
Các chất gây kết tủa protein phổ biến bao gồm: dung môi hữu cơ, acid, ion kim loại
hoặc muối. Trong số các chất gây kết tủa này, dung môi hữu cơ và acid là những chất
phổ biến nhất và có thể kể đến như: acetonitril, aceton, ethanol, methanol, acid
trichloroacetic, acid perchloric…
Kỹ thuật tủa protein có ưu điểm là một kỹ thuật chuẩn bị mẫu đơn giản, rẻ tiền,
nhanh chóng và thuận tiện trong phân tích sinh học bằng LC-MS. Độ lặp lại và độ thu
hồi của phương pháp cao cũng như có thể dễ dàng áp dụng với đa dạng các loại mẫu và
khả năng tự động hóa giúp cho kỹ thuật trở nên phổ biến hơn.
Tuy nhiên, nhược điểm hiện tại của kỹ thuật đó là mẫu thử bị pha lỗng, mẫu sau
khi xử lý cịn chưa tinh khiết cũng như có thể gây ra ức chế ion và từ đó ảnh hưởng đến
độ chọn lọc và độ lặp lại [10].

7


1.2.2.2. Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng (Liquid-Liquid Extraction – LLE)
Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng là một trong các kỹ thuật chuẩn bị mẫu phổ biến khác
trong phân tích LC-MS. Cơ chế của kỹ thuật có thể hiểu như sau: Khi có hai dung mơi
khơng thể trộn lẫn trong một hệ thống, chất tan hiện đang được hòa tan trong dung mơi
có độ hịa tan kém hơn sẽ khuếch tán qua mặt phẳng lỏng - lỏng của hai dung mơi để đi
vào phần chất lỏng trong đó độ hịa tan của chất tan cao hơn [24].
Yếu tố ảnh hưởng đến q trình chiết có thể kể đến như giá trị pH trong mẫu. Việc
điều chỉnh pH của mẫu trước khi chiết là quan trọng đối với các chất có tính acid/base

và cần điều chỉnh giá trị pH của mẫu ít nhất hai đơn vị so với giá trị pKa của chất cần
phân tích. Tuy nhiên, trong điều kiện acid/kiềm mạnh, một số chất phân tích nhất định
có thể bị phân hủy hoặc gây ra kết tủa thành phần nền mẫu. Ngoài ra, độ phân cực và
khả năng trộn lẫn của dung môi cũng là yếu tố quan trọng cần xem xét trong LLE [24].
Ưu điểm phương pháp LLE là mẫu tương đối sạch, không cần thiết bị đắt tiền. Tuy
nhiên, kỹ thuật có thể gây tốn kém khi phải sử dụng một lượng lớn dung môi do phụ
thuộc khả năng phân bố của chất phân tích trong hai pha dung môi, đồng thời khi tốc độ
chiết xuất chậm sẽ gây tốn thời gian hơn để đạt được cân bằng pha [36]. Đối với phép
phân tích sinh học cho nhiều hơn một chất phân tích, việc tinh chỉnh các điều kiện LLE
có thể khó đạt được độ thu hồi chấp nhận được do sự khác nhau về độ phân cực.
1.2.2.3. Kỹ thuật chiết pha rắn (Solid-phase Extraction – SPE)
SPE là một kỹ thuật chuẩn bị mẫu đã được sử dụng trong nhiều thập kỷ để chiết
xuất có chọn lọc và làm giàu các chất phân tích quan tâm trong các mẫu sinh học khác
nhau. Kỹ thuật gồm bốn bước chính: hoạt hóa cột nhằm ổn định chất hấp phụ, chuẩn bị
cho tương tác với chất phân tích; nạp mẫu, hấp phụ chất phân tích vào chất hấp phụ; rửa
giải tạp nhằm loại bỏ các chất không mong muốn; rửa giải nhằm thu chọn lọc chất phân
tích quan tâm [23]. Các cơ chế lưu giữ phổ biến trong kỹ thuật dựa trên lực van der
Waals, liên kết hydro, tương tác phân cực và tương tác tĩnh điện [37].
SPE có ưu điểm là cho độ chọn lọc khi chiết cao do sự đa dạng của các loại pha rắn
thương mại sẵn có cho phép tìm được điều kiện thích hợp cho đối tượng phân tích cụ
thể. Tuy nhiên, kỹ thuật chiết pha rắn cần trải qua nhiều giai đoạn, chưa thể tự động hóa
hồn tồn [8]. Cùng với đó, với chi phí còn cao nên hiện nay tại Việt Nam kỹ thuật này
chưa được áp dụng nhiều.
1.2.3. Tổng quan về LC-MS/MS
1.2.3.1. Nguyên tắc
Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được
tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Tỷ số này được biểu thị
bằng đơn vị khối lượng nguyên tử và bằng khối lượng của nguyên tử hydro [1].
8

Mẫu phân tích được hịa tan trong dung mơi và cho qua cột bằng một dòng chất lỏng
liên tục (pha động). Các chất tan là thành phần của mẫu di chuyển qua cột theo pha động
với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số phân bố giữa chất tan với pha tĩnh và pha động.
Nhờ tốc độ di chuyển qua cột khác nhau, các thành phần của mẫu sẽ tách biệt riêng
thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng [5].
Mẫu phân tích ở thể lỏng từ bộ phận sắc ký lỏng đi tới bộ phận khối phổ được loại
dung môi thành các phân tử trung hịa điện tích ở thể khí bay hơi, sau đó được nạp vào
buồng ion hóa của thiết bị bằng các thiết bị chuyển mẫu phù hợp để hình thành các ion
hoặc các tiểu phân mang điện tích ở pha khí. Các ion được tạo thành trong buồng ion
hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối phổ trước khi đến bộ phận
phát hiện (detector). Quá trình phân tích khối và phát hiện được thực hiện trong môi
trường chân không (p ≈ 10-5 - 10-8 Torr) [2].
Phép đo khối phổ có khả năng cung cấp thơng tin về cấu trúc và khối lượng phân tử
từ lượng picogram của vật liệu và tính chọn lọc bằng cách theo dõi các ion hoặc quá
trình phân mảnh ion đặc trưng của một chất phân tích quan tâm [11].
1.2.3.2. Cấu tạo
Cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng gồm các phần chính: (1) hệ thống cấp pha động, (2)
bơm sắc ký lỏng, (3) bộ phận tiêm mẫu, (4) cột sắc ký.
Cấu tạo hệ thống khối phổ gồm các phần chính: (1) bộ phận nạp mẫu, (2) bộ nguồn
ion, (3) bộ phân tích khối, (4) detector và (5) bộ phận xử lý dữ liệu. Mẫu được đưa vào
qua bộ phận nạp mẫu, các ion tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng
nhờ bộ phận phân tích khối để tách các ion theo trị số m/z trước khi đến detector [1].

Hình 1.3. Cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng khối phổ
1.2.3.3. Nguyên lý vận hành của hệ thống khối phổ
- Bộ phận nạp mẫu
Nạp mẫu trực tiếp: Với mẫu lỏng, mẫu được đưa vào buồng trung gian (áp suất
giảm) trước khi vào buồng chân khơng của máy. Có thể tách phần hơi của mẫu trắng
bằng một màng bán thấm đưa thẳng vào buồng ion hóa [1].

9


Nạp mẫu gián tiếp: ở đây bộ phận nạp mẫu là đầu của một thiết bị phân tích khác
được kết nối với khối phổ, đó là GC-MS, LC-MS… [1].
- Bộ nguồn ion (ion source)
Một số kỹ thuật ion hóa được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như ion hóa phun
điện tử (ESI), ion hóa học ở áp suất khí quyển (APCI).
o Ion hóa phun điện tử (ESI): được thực hiện ngồi vùng chân khơng. Tại đầu ống
mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và khí mang, mẫu được phun thành hạt
sương nhỏ tích điện tại bề mặt. Khí ở xung quanh các hạt này tạo nhiệt năng và làm bay
hơi dung môi ra khỏi sương làm mật độ điện tích tại bề mặt sương gia tăng. Mật độ điện
tích này đạt tới điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh), khi đó hạt sương phân chia
thành các hạt nhỏ hơn do lực đẩy lớn hơn sức căng bề mặt. Quá trình này được lặp lại
nhiều lần và tạo những hạt rất nhỏ mang điện tích cao. Các ion chuyển thành thể khí và
đi vào bộ phận phân tích khối do lực đẩy tĩnh điện [2]. Sơ đồ mơ tả ngun lý ion hóa
bằng kỹ thuật ESI được trình bày ở Hình 1.4.

Hình 1.4. Sơ đồ mơ tả nguyên lý ion hóa bằng kỹ thuật ESI [30]
o Ion hóa học ở áp suất khí quyển (APCI): pha động được chuyển thành hạt sương
nhờ dòng nito tốc độ cao và nhiệt (khoảng 500oC). Một điện thế cao sẽ ion hóa chất
phân tích trong hạt sương [1].
- Bộ phận phân tích khối
Bộ phân tích khối có nhiệm vụ tách các ion có tỷ lệ m/z khác nhau thành từng loại
riêng biệt nhờ tác dụng của từ trường, điện trường trước khi đến bộ phận phát hiện và
xử lý số liệu. Một số phân tích khối thường dùng như bộ phân tích bẫy ion tứ cực, bộ
phân tích thời gian bay, bộ phân tích từ [2].
Trong nghiên cứu này sử dụng bộ phân tích tứ cực chập ba gồm ba tứ cực xếp nối
tiếp nhau Q1, Q2, Q3. Tứ cực Q1 sẽ tách các ion và lựa chọn một hoặc một số ion ban
đầu (ion mẹ) từ đây đưa vào tứ cực Q2. Trong buồng Q2 với áp suất cao, các ion mẹ bị

phân mảnh do va chạm với khí trơ có mặt như nito, argon, heli… Nhờ va chạm này năng
10


lượng động học của các ion chuyển thành nội năng nên chúng bị phân mảnh tiếp tạo ra
các ion nhỏ hơn (ion con). Các ion tạo thành được dẫn tới Q3 để tách riêng và đến
detector. Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này gọi là khối phổ hai lần (MS/MS) [2].
1.2.3.4. Một số chế độ thu phổ
- Thu tín hiệu toàn phổ (Full Scan)
Khi thao tác với chế độ SCAN, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho khối
phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt q trình phân tích. Thường dùng để nhận
danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ
cực, chế độ SCAN thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ [2].
- Thu tín hiệu chọn lọc hai lần
Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS/MS), 2 kỹ thuật
ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM [2].
SRM (Selected Reaction Monitoring): cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion
cơ lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào
đầu dò để phát hiện [2].
MRM (Multiple Reaction Monitoring): cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ
nhất, phân mảnh ion cơ lập đó tại tứ cực thứ hai (thực chất là buồng va chạm) thu được
các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều hơn 2) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào
đầu dò để phát hiện [2].
1.3. Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học
Thẩm định phương pháp là một nội dung bắt buộc đối với các phương pháp phân
tích nói chung và phương pháp định lượng chất trong dịch sinh học nói riêng. Theo
hướng dẫn của EMA [18] và US-FDA [35], thẩm định phương pháp phân tích thuốc
trong dịch sinh học gồm những chỉ tiêu sau:
1.3.1. Độ chọn lọc
Độ chọn lọc thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể phân biệt và định lượng

chất phân tích, khơng bị nhầm lẫn bởi các thành phần khác có trong mẫu. Độ chọn lọc
được tiến hành phân tích trên 06 mẫu huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau và 06
mẫu tự tạo có chứa chất chuẩn nội và chất phân tích ở nồng độ thấp của đường chuẩn
(nồng độ LLOQ dự kiến) trong từng nền huyết tương trắng tương ứng.
1.3.2. Đánh giá khả năng nhiễm chéo
Độ nhiễm chéo là sự thay đổi nồng độ đo được do chất phân tích cịn lại từ mẫu
trước đó vẫn cịn trong thiết bị phân tích. Độ nhiễm chéo cần được đánh giá để giảm
thiểu sai số trong quá trình phát triển phương pháp.

11


1.3.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Đường chuẩn là đường biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng pic của thiết bị và nồng
độ chất phân tích trong mẫu. Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ của chất phân tích
có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích với tỷ lệ đáp ứng chất phân
tích/IS.
Đường chuẩn phải có tối thiểu 05 nồng độ, bao phủ tồn bộ khoảng tuyến tính, các
dung dịch chuẩn được chuẩn bị trên cùng nền mẫu.
1.3.4. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)
Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong
một mẫu cho kết quả định lượng đảng tin cậy, có độ đúng và độ chính xác phù hợp.
1.3.5. Độ đúng, độ chính xác
Độ đúng là giá trị phản ánh mức độ gần sát của kết quả nồng độ chất phân tích thu
được từ phương pháp phân tích so với nồng độ lý thuyết. Độ chính xác của phương pháp
phản ánh mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân tích
nhiều lần trên cùng mẫu thử đồng nhất. Độ chính xác biểu diễn bằng giá trị CV%.
1.3.6. Tỷ lệ thu hồi (hiệu suất chiết)
Tỷ lệ thu hồi là giá trị phản ánh khả năng tìm lại của chất phân tích và chuẩn nội sau
quá trình chiết tách xử lý mẫu. Tỷ lệ thu hồi được xác định bằng cách so sánh kết quả

đáp ứng của các mẫu QC có qua chiết tách với đáp ứng của các mẫu chuẩn có cùng nồng
độ không xử lý qua chiết tách. Tỷ lệ thu hồi của chất phân tích và chuẩn nội phải ổn
định.
1.3.7. Độ ổn định
Các mẫu phân tích trong dịch sinh học trải qua quá trình lấy mẫu, xử lý, bảo quản
mẫu (ngắn hạn, dài ngày), qua chu kỳ đông lạnh - rã đơng và q trình phân tích mẫu
nên cần đánh giá độ ổn định của chất phân tích. Độ ổn định của mẫu phân tích trong
dịch sinh học cần được đánh giá trong quá trình xử lý và bảo quản mẫu. Mẫu phân tích
phải đảm bảo ổn định trong thời gian dự kiến cho phân tích hết mẫu thử. Độ ổn định
được đánh giá bằng cách so sánh kết quả phân tích các mẫu sau bảo quản với các mẫu
mới chuẩn bị ở mỗi mức nồng độ khác nhau (LQC và HQC).
Độ ổn định của mẫu huyết tương bao gồm: độ ổn định sau thời gian ngắn ở nhiệt độ
phòng, độ ổn định sau thời gian dài ở nhiệt độ bảo quản, độ ổn định sau 5 chu kì đông rã đông, độ ổn định của mẫu sau xử lý.

12


CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Hóa chất - chất chuẩn
- Chất chuẩn và chuẩn nội (IS)
o Bilastin - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, SKS: C0122388, hàm lượng
98,8% (nguyên trạng).
o Carbamazepin - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, SKS: WS.0115318.01,
hàm lượng 99,78% (nguyên trạng).
o Một số chất chuẩn nội khác: papaverin, glicazid, được lựa chọn để khảo sát chất
chuẩn nội.
- Dung mơi hóa chất:
o Dung mơi tinh khiết dùng cho LC-MS: acetonitril, methanol (VWR

International), nước (Thermo Fisher Scientific).
o Hóa chất tinh khiết phân tích: Acid formic (Merck), amoni format (Merck).
- Huyết tương trắng của người được mua tại Viện Huyết học và Truyền máu TW.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ phân tích
- Hệ thống LC-MS ACQUITY UPLC I-Class / Xevo TQ-XS Triple Quadrupole
Model VBA 1465 (Waters, Mỹ), sử dụng phần mềm Masslynx.
- Cân phân tích Metler Toledo XPE105 (d = 0,01mg) (Metler Toledo, Mỹ).
- Máy ly tâm lạnh Hettich Mikro 220R (Hettich, Đức).
- Tủ lạnh bảo quản Haier HYC-940 (Haier, Trung Quốc).
- Máy lắc xoáy Vortex mixer VM-300 (Gemmy, Đài Loan).
- Tủ lạnh sâu Sanyo MDF-U333 (Sanyo Electric, Nhật Bản).
- Micropipet Eppendorf (Eppendorf, Đức), Nichipet EXH (Nichiryo, Nhật Bản).
- Bình định mức (Isolab, Đức).
- Vial đựng dung dịch tiêm sắc ký loại 2 ml (Waters, Mỹ).
- Ống Eppendorf (Eppendorf, Đức).
- Cột sắc ký Waters Acquity UPLC® BEH C18 (50 ì 2,1mm; 1,7àm) (Waters, M).
- Mng lc 0,2 PTFE (Whatman, Anh).
- Bộ thiết bị lọc chân không (Sartorius, Đức).
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu huyết tương tự tạo: các mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn bilastin.

13


2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích
2.2.1.1. Khảo sát điều kiện khối phổ xác định bilastin và chuẩn nội
Sử dụng hệ thống LC-MS/MS, Xevo TQ-XS Triple Quadrupole với nguồn ion hóa
kiểu ESI, tiến hành quá trình thực nghiệm như sau:
Bơm trực tiếp dung dịch chuẩn chứa bilastin có nồng độ 10 ng/ml vào trong hệ thống

khối phổ, thông qua phần mềm Masslynx được tích hợp sẵn trên thiết bị để xác định
được:
- Ion mẹ cho bilastin.
- Tối ưu các điều kiện để lượng ion mẹ đi vào bộ phận phân tích khối là nhiều nhất
và ổn định nhất.
- Mảnh ion con của bilastin có cường độ tín hiệu cao nhất và ổn định nhất.
- Tối ưu năng lượng phân mảnh ion mẹ tạo thành các ion con đã xác định từ đó tối
ưu năng lượng ion con tạo thành cũng như tăng độ ổn định.
Tiến hành tối ưu hóa điều kiện khối phổ của chuẩn nội (IS) tương tự với chất chuẩn
bilastin để thu được cường độ tín hiệu cao và ổn định.
2.2.1.2. Khảo sát lựa chọn chuẩn nội
Việc lựa chọn chuẩn nội cho phương pháp phân tích cần phải dựa trên cấu trúc phân
tử và đặc tính hóa lý của chất để tiến hành chọn lựa phù hợp. Chuẩn nội phải đảm bảo
được các tiêu chí như: bền vững, khơng hoặc ít tương tác với các thành phần có trong
mẫu, có thể tham gia q trình chiết tách và phân tích sắc ký cùng chất phân tích, đáp
ứng tín hiệu tốt, độ đúng và độ chính xác tốt [4], [6]. Dự kiến chuẩn nội lựa chọn gồm
có: carbamazepin, gliclazid, papaverin.
2.2.1.3. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký
Sử dụng cột sắc ký Acquity UPLCđ BEH C18 (50 ì 2,1mm; 1,7àm), tin hnh
kho sát với các hệ pha động khác nhau: MeOH - dung dịch acid formic, ACN - dung
dịch acid formic, ACN - nước chứa dung dịch amoni format và acid formic với các tỷ
lệ và nồng độ khác nhau.
2.2.2. Chuẩn bị mẫu
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc
Cân chính xác khoảng 30 mg chất chuẩn bilastin vào trong bình định mức 50 ml,
hịa tan trong dung mơi là methanol vừa đủ để thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng
độ khoảng 600 µg/ml.
Từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha loãng trong dung môi MeOH - nước (1:1,
tt/tt) thu được dung dịch chuẩn làm việc 1 có nồng độ 12 μg/ml.

14


Từ dung dịch chuẩn làm việc 1, tiến hành pha lỗng trong dung mơi nước thu được
dung dịch chuẩn làm việc 2 có nồng độ 600 ng/ml.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn nội gốc
Cân chính xác khoảng 25 mg chuẩn nội carbamazepin vào trong bình định mức 50
ml, hồ tan trong dung môi là methanol vừa đủ để thu được dung dịch chuẩn nội gốc có
nồng độ carbamazepin khoảng 500 µg/ml.
Từ dung dịch chuẩn nội gốc, tiến hành pha loãng trong dung môi MeOH - nước
(1:1, tt/tt) thu được dung dịch chuẩn nội làm việc có nồng độ 2 μg/ml.
Chuẩn bị đường chuẩn trong huyết tương
Từ các dung dịch chuẩn làm việc, tiến hành pha loãng trong huyết tương để thu được
dung dịch WSS-CC1 và WSS-CC2 có nồng độ lần lượt là 600 ng/ml và 30 ng/ml. Từ
hai dung dịch WSS-CC1 và WSS-CC2, ta chuẩn bị một dãy đường chuẩn trong huyết
tương có nồng độ khoảng 3 - 600 ng/ml (S1 - S8). Các điểm đường chuẩn trong huyết
tương được tiến hành như trong bảng 2.1.
Bảng 2.1 Cách chuẩn bị đường chuẩn trong huyết tương
Blank

Mẫu

Zero

Nồng độ (ng/ml)

S1

S2

S3

S4

S5

S6

S7

S8

3

6

12

30

60

180

360

600

VHT trắng (L)

500

500

450

400

300

0

450

350

200

0

VWSS-CC1 (L)

-

-

-

-

-

-

50

150

300

500

VWSS-CC2 (L)

-

-

50

100

200

500

-

-

-

-

Chuẩn bị mẫu kiểm tra
Mẫu kiểm tra (QC) được chuẩn bị từ dung dịch chuẩn gốc và độc lập với đường
chuẩn. Chuẩn bị 2 mẫu WSS-QC1 và WSS-QC2 lần lượt tương tự WSS-CC1, WSSCC2, và có nồng độ lần lượt 600 ng/ml và 30 ng/ml.
Từ dung dịch WSS-QC1 và WSS-QC2, pha vào huyết tương để thành mẫu kiểm tra
LQC, SQC, MQC, HQC có nồng độ dự kiến như sau:
Bảng 2.2 Cách chuẩn bị các mẫu kiểm tra trong huyết tương
Mẫu

LQC

SQC

MQC

HQC

Nồng độ (ng/ml)

9

72

300

480

VWSS-QC2(µl)

150

-

-

-

VWSS-QC1(µl)

-

60

250

400

VHT trắng (l)

350

440

250

100

15


Chuẩn bị mẫu kiểm tra độ thích hợp hệ thống (SST)
Bảng 2.3 Cách chuẩn bị mẫu SST
Mẫu

Nồng độ (ng/ml)

VWSS-QC1(µl)

VHT trắng (l)

SST

240

200

300

2.2.3. Thẩm định phương pháp phân tích
Tiến hành thẩm định phương pháp định lượng bilastin trong huyết tương bằng kỹ
thuật LC-MS/MS theo quy định của US-FDA và EMA về thẩm định phương pháp phân
tích trong dịch sinh học.
2.2.3.1. Độ thích hợp hệ thống
Để đánh giá độ thích hợp hệ thống, chuẩn bị một mẫu trong huyết tương trắng gồm
chất phân tích tại nồng độ 240 ng/ml và chuẩn nội (IS). Tiến hành phân tích mẫu đã
chuẩn bị tối thiểu 06 lần liên tiếp. Ghi lại sắc ký đồ.
Yêu cầu: Độ thích hợp hệ thống đạt khi đáp ứng các yêu cầu sau:

- Pic cân đối.
- Có sự lặp lại về thời gian lưu của chất phân tích và chuẩn nội (IS): CV% ≤ 2,0%.
- Có sự lặp lại về đáp ứng của chất phân tích và chuẩn nội (IS): CV% ≤ 5,0%.
2.2.3.2. Độ đặc hiệu
Chuẩn bị ít nhất 06 mẫu huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau và 06 mẫu tự
tạo trong các nguồn mẫu huyết tương trên có chứa chất phân tích ở nồng độ LLOQ dự
kiến và chuẩn nội (IS). Tiến hành phân tích mẫu đã chuẩn bị. Ghi lại sắc ký đồ.
Yêu cầu: Độ chọn lọc đạt khi đáp ứng các yêu cầu sau:
- Pic của chất cần phân tích phải đảm bảo nhận biết rõ ràng.
- Tại thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng của mẫu trắng phải không được vượt
quá 20% đáp ứng của từng mẫu LLOQ tương ứng.
- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng của mẫu trắng phải không
được vượt quá 5% đáp ứng của IS.
2.2.3.3. Đánh giá khả năng nhiễm chéo
Chuẩn bị 06 mẫu huyết tương trắng, 06 mẫu tự tạo có nồng độ ULOQ và 06 mẫu tự
tạo có nồng độ LLOQ. Xử lý các mẫu theo quy trình đã xây dựng. Tiêm sắc ký mẫu
LLOQ trước rồi tiêm sắc ký xen kẽ huyết tương trắng sau mỗi mẫu ULOQ. So sánh đáp
ứng pic tại thời gian lưu bilastin và IS của huyết tương trắng và của LLOQ.
Yêu cầu: Mẫu được coi là khơng bị nhiễm chéo trong q trình phân tích khi:
- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng của mẫu trắng
khơng được lớn hơn 20% so với đáp ứng chất phân tích của mẫu LLOQ.
- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng IS của từng mẫu trắng không
được lớn hơn 5% so với đáp ứng IS.
16