BỘGIÁO DỤC VÀĐÀOTẠO
VIỆNHÀNLÂM
KHOAHỌCVÀ CÔNGNGHỆVIỆTNAM
HỌCVIỆNKHOAHỌCVÀCÔNG NGHỆ
----------------
TRẦNTHỊHỒNGHÀ
NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CÁC CHẤT CĨ HOẠT
TÍNHKHÁNGUVÀĐIỀUBIẾNMIỄNDỊCHTỪHAILỒINẤMHẦU
THỦ(Hericiumerinaceus)VÀNẤMHƯƠNG(Lentinulaedodes)
NITRỒNGỞVIỆTNAM
Chun ngành: Hố học các hợp chất thiên
nhiênMãsố: 62.44.01.17
LUẬNÁNTIẾNSĨHĨAHỌC
HÀNỘI,2015
i
DANHMỤC CÁCKÍ HIỆUVÀCHỮVIẾTTẮT
Kíhiệu
Tiếnganh
Tiếngviệt
AST
Serumaspartattransaminase
ALT
Serumalanintransaminase
ATCC
American
Type
Culture
Ngânhàng chủnggiốngMỹ
Collection
BC
Bạchcầu
BSA
Bovineserumalbumin
13
Carbon-13
C-NMR
Nuclear
Albuminhuyếtthanhbị
Magnetic
ResonanceSpectroscopy
CC
Phổc ộ n g h ư ở n g t ừ h ạ t n h â
n
carbon13
Sắckícột
ColumnChromatography
CCT
Chuộtcốngtrắng
CNT
Chuộtnhắttrắng
COSY
CorrelationSpectroscopy
PhổCOSY
CS%
Cellsurvival%
%tếbàosốngsót
DEPT
Distortionless Enhancement by
PhổDEPT
PolarisationTransfer
DEAE-
celluloseD i e t h y l a m i n o e t h y l
cellulose
DMSO
Dimethylsulfoxid
Dimetylsulfoxit
EAC
EhrlichascitesCarcinoma
Ungthưcổtrướng
ECACC
TheE u r o p e a n C o l l e c t i o n o f
Cell
Ngânh à n g c h ủ n g g i ố n g c h â u
Âu
Cultures
ElectronS p r a y I o n i z a t i o n
M a s s
Phổkhốii o n h ó a p h u n m
ù
EtOAc
Spectra
Ethylacetate
điệntử
Etylaxetat
FBS
Foetalbovineserum
Huyếtthanhbàothaibò
Fl
Humancervicaluterinecarcinoma
TếbàoUng thưtửcung
ESI-MS
2
GC
γGTGT
GasChromatography
Serum
gamma
Sắckíkhí
glutanin
transaminase
Hb
Haemoglobin
HC
Hồngcầu
Hep-G2
Hepatocellularcarcinoma
HMBC
Heteronuclear
Tếbàoung thưganngười
Multiple
Bond
Connectivity
1
H-NMR
Proton
Phổtươngtácdịhạtnhânqua
nhiềuliên kết
Nuclear
Magnetic
ResonanceSpectroscopy
Phổc ộ n g h ư ở n g t ừ h ạ t n h â
n
proton
HPLC
HSQC
IC50
High
Performance
Sắck í l ỏ n g c a o á p h i ệ u n ă n g
liquidChromatography
cao
Heteronuclear
single-Quantum
Phổtươngtácdịhạtnhânqua
Conherence
mộtliênkết
Inhibitoryconcentration50%
Nồngđộứcchế50%
KLT
Khốilượngtạng
KN
Khángnguyên
LD50
lethaldose50%
Liềug â y c h ế t 5 0 % đ ộ n g v ậ
t
thựcnghiệm
Lu
MIC
Humanlungadenocarcinoma
minimuminhibitoryconcentration
NC
TếbàoUngthưbiểumơphổi
Nồngđộứcchếtốithiểu
Nghiêncứu
OD
OpticalDensity
Mậtđộquang
OVA
Ovalbumin
Albuminlịngtrắngtrứng
PBS
Phosphat buffersaline
Dungdịchđệmphosphat
RD
HumanRhabdomyosarcoma
%scavengingcapacity
Ungthư mơliênkết
%k h ả n ă n g t r u n g h ò a g ố c t ự
SC%
do
SGMD
SRB
Suygiảmmiễndịch
SulforhodamineB
3
TCA
TCCS
TCL
Trichloaceticacid
Axittricloaxetic
ThinLayerChromatography
Tiêuchuẩncơsở
Sắckílớpmỏng
TL(g)
Trọnglượng(gam)
TLCT
Trọnglượngcơthể
TNFα
Yếutốhoại tửungthư
Tumornecrosisfactor
VSV
WHO
Visinhvật
WorldHealthOrganization
4
TổchứcYtếthếgiới
MỤCLỤC
DANHMỤCCÁC KÍHIỆUVÀ CHỮVIẾTTẮT.....................................................ii
DANHMỤCSƠ ĐỒ VÀHÌNH.............................................................................xiii
MỞĐẦU..................................................................................................................1
CHƯƠNGI.TỔNGQUANTÀILIỆU.......................................................................3
1.1. Nấmdược liệu và ứng dụngtrong yhọcdântộc...................................................3
1.1.1. Giớithiệuvềnấmdược liệu............................................................................3
1.1.2. Ứngdụngtrong yhọcdântộc..........................................................................4
1.2. Nhữngnghiêncứutrênthếgiớivềcácchất cóhoạttínhsinhhọccủanấmdư
ợcliệu........................................................................................................................6
1.2.1. Cáchợp chất cóphântửlượng nhỏ.................................................................6
1.2.1.2.Cácchất cóhoạttínhsinhhọckhác.................................................................11
1.2.2. Hoạttínhcủapolysaccharidetừnấmdược liệu................................................19
1.3. Tình hìnhnghiên cứu vềnấmhầuthủ vànấmhương..........................................30
1.3.1. Nấmhầu thủ (Hericiumerinaceus)..............................................................30
1.3.1.1. Trên thếgiới............................................................................................30
1.3.1.2. ỞViệtNam..............................................................................................34
1.3.2. Nấmhương (Lentinus edodes)....................................................................35
1.3.2.1. Trên thếgiới............................................................................................36
1.3.2.2. ỞV i ệ t Nam..........................................................................................40
1.4. Mơhìnhnicấytếbàoungthưbachiều(3D)trongnghiêncứuungthư...................41
CHƯƠNGII.NGUNLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU........................44
2.1. Đốitượngnghiêncứu.......................................................................................44
2.1.1. Nấmhương.................................................................................................44
2.1.2. Nấmhầuthủ................................................................................................44
2.2. Dụng cụ,hóa chấtvàmơitrường......................................................................44
2.2.1. Dụng cụvàthiết bị......................................................................................44
2.2.2. Mơi trường................................................................................................44
2.3. Cácphươngphápphân lập cáchợp chất...........................................................45
2.4. Phươngpháp tinh sạchβ-glucantừnấmhươngvànấmhầu thủ............................46
2.4.1. Phươngpháptinhsạchβ-1,3-glucantừnấmhương...........................................46
2.4.2. Phươngpháptinhsạchβ-1,3-glucantừnấmhầuthủ..........................................46
2.5. Cácphương pháp xácđịnhcấu trúchốhọc........................................................46
2.6. Phươngphápxácđịnhhàmlượngpolysaccharide................................................46
2.7. Phươngphápthủyphânkhơnghồntồnβ-1,3-glucantừnấmhầuthủbằng
-1,3-glucanase.....................................................................................................47
2.8. Nghiêncứubaocurcumin(Cur)bằng β-1,3/1,6-glucan........................................47
2.9. Phươngphápđánhgiáhoạttínhsinhhọc..............................................................48
2.9.1. Phươngphápthửkhảnănggâyđộctếbào(cytotoxicity)....................................48
2.9.2. Phươngphápứcchếhìnhthànhkhốiu3chiềutrênthạchmềm(antitumorpromotingassay)invitro.....................................................................................50
2.10. Cácphươngpháp thửdượclý..........................................................................51
2.10.1. Phươngphápđánhgiáđộctính cấp................................................................51
2.10.2. Phươngphápđánhgiáđ ộ c tínhbán trường diễn...........................................51
2.10.3. Phươngphápđánhgiámột sốtácdụngcủasảnphẩm........................................52
2.10.3.1. Nghiênc ứ u t á c d ụ n g b ả o v ệ g a n c ủ a H G 1 t r ê n m ô h ì n h g â y đ ộ c g a
n bằngcarbontetracholorid........................................................................................52
2.10.3.2. NghiêncứutácdụngcủaHG1đếnquátrìnhtổnghợpproteintrênđộngvậtkhi
dùng bán trườngdiễn...............................................................................................52
2.10.3.3. Nghiêncứutácdụngtrên hệmiễndịch củaHG1thựcnghiệm........................52
2.10.3.4. Phươngphápthửhiệulựckhánguthựcnghiệm............................................52
2.10.4. Xửlýsố liệu.................................................................................................52
CHƯƠNGIII.THỰCNGHIỆM..............................................................................53
3.1. Nghiên cứu hóahọc vàhoạttính sinhhọccủanấmhương....................................53
3.1.1. Phân lập cách ợ p c h ấ t từquảthểnấmhương.............................................53
3.1.2. Táchp o l y s a c c h a r i d e từdịch lên mennấmhương...............................55
3.1.3. Cách ằ n g s ố v ậ t l ý v à s ố l i ệ u p h ổ c ủ a c á c h ợ p c h ấ t đ ã p h â n l ậ p t ừ n ấ m
hương55
3.1.4. Tinhsạchβ-1,3/1,6 glucan (lentinan)từnấmhương (sơđồ3.3).........................56
3.2. Nghiêncứu hóahọcvàhoạttính sinhhọccủanấmhầu thủ....................................57
3.2.1. Phân lập cáchợp chấttừquảthểnấmhầu thủ(sơđồ3.4)....................................57
3.2.2. Táchp o l y s a c c h a r i d e từdịch lênmen nấmhầu thủ..............................60
3.2.3. Cáchằngsốvậtlývàsốliệuphổcủacáchợpchấtđãphânlậptừnấmhầuthủ
60
3.2.4. Tinhsạchβ-1,3/1,6 glucan từnấmhầu thủ.......................................................61
3.2.5. Thủyphânkhơnghồntồnβ-1,3-glucantừnấmhầuthủbằngenzyme-1,3glucanase.....................................................................................................................62
3.2.6. Sửdụng β-1,3/1,6-glucantừnấmhầu thủlàmchất mangcurcumin...................64
3.3. Tạochếphẩmthửnghiệm..................................................................................66
3.4. Thửdượclý chếphẩm.......................................................................................66
3.4.1. Nghiên cứuđộctính cấp................................................................................66
3.4.3. NghiêncứumộtsốtácdụngcủasảnphẩmHG1trênđộngvậtthựcnghiệm
……………………………………………………………………………………68
3.4.4. NghiêncứuthửhiệulựckhánguthựcnghiệmtrênđộngvậtcủasảnphẩmHG2
70
CHƯƠNGIV.KẾTQUẢVÀ THẢOLUẬN...........................................................73
4.1. Nghiên cứu hóahọc vàhoạttính sinhhọccủanấmhương....................................73
4.1.1. Tách cácphânđoạnvà đánh giáhoạt tínhsinhhọc..........................................73
4.1.2. Xácđịnh cấutrúc cáchợpchấtNH1,NH2vàNH3..........................................76
4.1.2.1. HợpchấtNH1:galactiol...........................................................................76
4.1.2.2. HợpchấtNH-2:Ergosterol.......................................................................80
4.1.2.3. HợpchấtNH3:Ergosterolperoxide...........................................................84
4.1.2.4. HợpchấtNH-GL:β-1,3/1,6glucan(lentinan)............................................88
4.1.3. Đánhgiáhoạt tính sinhhọccủa cáchợp chấtphânlập từnấmhương...............89
4.2. Nghiêncứu hóahọcvàhoạttính sinhhọccủanấmhầu thủ....................................92
4.2.1. Táchphân đoạn vàđánhgiáhoạttínhchốngungthư.........................................92
4.2.2. Xácđịnh cấutrúccáchợp chấtphânlậptừnấmhầu thủ......................................94
4.2.2.1. HợpchấtHT1:axitstearic............................................................................94
4.2.2.2. HợpchấtHT2:Ergosterolperoxide..............................................................97
4.2.2.3. HợpchấtHT3-CerebrosideB......................................................................99
4.2.2.4. Hợpchất HT4 -HericenoneD...................................................................104
4.2.2.5. HợpchấtH T 5 -Ergosterol.......................................................................110
4.2.2.6. HợpchấtHT6-β-Adenosine......................................................................112
4.2.3. Đánh giáhoạt tính sinhhọccủacáchợp chấtphânlậptừnấmhầu thủ...............118
4.3. Nghiêncứubiếnđổiβ-1,3glucantừnấmhầuthủthànhhoạtchấtdễtanhơnvàđánh giáhoạttínhcủachúng........121
4.3.1. Thủyphânbằng enzyme-1,3-glucanase.....................................................122
4.3.2. Dùngβ-1,3/1,6-glucantừnấmhầuthủlàmchấtmang curcumin.......................124
4.4. ThửnghiệmtácdụngdượclýchếphẩmHG1trênđộngvậtthựcnghiệm.................128
4.4.1. Kếtquảnghiêncứu độctínhcấpcủasản phẩmtheođườnguống củachế
phẩmHG1...............................................................................................................128
4.4.2. Độctínhbántrườngdi ễncủasản phẩmHG1khichouốngtrênđộngvật
thựcnghiệm............................................................................................................129
4.4.2.1. ẢnhhưởngcủaHG1,choCNTuốngtrườngdiễnđốivớikhốilượnggan,lách,thậ
nđộngvật..............................................................................................................130
4.4.2.2. KếtquảnghiêncứutrọnglượngcơthểCNT,khốilượnggan,lách,thậnvà
tỷsốgiữakhốilượng mỗitạng so vớitrọng lượngcơthể............................................131
4.4.2.3. Ảnh hưởng của sản phẩm cho uống bán trường diễn đến các chỉ tiêu
huyếthọctrên độngvật thựcnghiệm........................................................................132
4.4.2.4. Ảnhh ư ở n g c ủ a s ả n p h ẩ m đ ế n c á c t h ô n g s ố h ó a s i n h đ ộ n g v ậ t k h i c h
o uốngbántrường diễn............................................................................................133
4.4.2.5. Ảnhhưởngcủasảnphẩmdùnguống6tuầnđếnchứcnăngtimthỏđượcđođi
ệntim
134
4.4.2.6. Ảnhhưởngcủasảnphẩmđếncácthôngsốmôbệnhhọckhidùngtrườngdiễn 135
4.4.3. Kết quảnghiêncứu một số tácdụngcủasảnphẩmHG1..................................136
4.4.3.1. Tácd ụ n g b ả o v ệ g a n c ủ a s ả n p h ẩ m t r ê n c h u ộ t n h ắ t đ ư ợ c g â y đ ộ c g
a n bằngcarbontetraclorid........................................................................................136
4.4.3.2. Ảnhhưởngcủasảnphẩmuốngbántrườngdiễnđếnquát r ì n h tổnghợp
proteintrênđộngvậtthựcnghiệm................................................................................137
4.4.3.3. Tácdụngtrênhệmiễndịch củasản phẩm....................................................138
4.4.3.4. Kếtquảđánhgiátỷlệsống/chếtcủaCNTsauchiếuxạdướitácdụngcủasảnphẩm
139
4.4.3.5. Kếtquảnghiêncứutácdụngtêncácdịngtếbàocóchứcnăngmiễndịch
.............................................................................................................................140
4.4.3.6. Kếtquảnghiêncứ uvề phảnứngqm ẫn m uộ n vớikhángngunđặc
hiệudướitácdụng của sản phẩm...............................................................................141
4.4.4. Thửnghiệmtácdụng của sản phẩmHG1 lêntếbàoungthư............................144
4.4.4.1. TácdụngcủasảnphẩmHG1lênhồngcầuvàtếbàoungthưbiểumôcổtrướngE
hrlich(EAC)invitro...............................................................................................144
4.4.4.2. TácdụngcủahỗnhợpHG1lêntếbàoungthưbiểumôcổtrướngEhrlich(EAC)inv
ivo
144
4.4.4.1.Tácdụng củachếphẩmHG1lên khối tếbào ungthưEhrlichinvivo..............144
KẾTLUẬN..........................................................................................................147
KIẾNNGHỊ.........................................................................................................149
CÁCCƠNGTRÌNHĐÃCƠNGBỐLIÊN QUANĐẾNLUẬNÁN.........................150
TÀILIỆUTHAMKHẢO......................................................................................152
DANHMỤCCÁCPHỤLỤC..................................Error! Bookmarknot defined.
DANHMỤCBẢNG
Bảng1.1.Danh sáchnấmdượcliệutiêu biểuvàđặctính chữabệnh................................5
Bảng1.2.Cácchấtphân tửlượng nhỏ cóhoạttínhkhángu.............................................9
Bảng13.Nguồn gốc,kiểuvàhoạttính polysaccharidetừmộtsốnấm dượcliệu19
Bảng1.4.Cácthụthểnhậnbiếtkhnmẫuvớimộtsốpolysaccharide............................28
Bảng 1.5.Giátrị yhọcvà một số chất hoạttínhtừnấmhương.....................................37
Bảng3.1.Kếtquảthủyphânkhơnghồntồnβ-1,3glucantừnấmhầuthủbằngenzym-1,3-glucanase...................................................63
Bảng4.1.Polysaccharidetrongcácphân đoạntáchchiếtnấmhương............................73
Bảng 4.2.Hoạttính gâyđộctếbàocáccặnchiết củanấmhương..................................74
Bảng 4.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các
phânđoạnpolysaccharide..........................................................................................74
Bảng4.4.Hoạttính gâyđộctếbàocácphân đoạn........................................................75
Bảng 4.5. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các
phânđoạn.................................................................................................................76
Bảng4.6.Kết quảphổ13C-NMRcủaNH2..................................................................83
Bảng4.7.SốliệuphổNMRcủahợp chấtNH3 vàhợp chất thamkhảo..........................86
Bảng4.8.Sosánhphổ13C-NMRcủalentinanvàβ-1,3/1,6tinhsạch...............................89
Bảng4.9.Hoạt tínhgâyđộctế bào củacáchợpchấtphân lậptừnấmhương...................90
Bảng4.10.Kếtquả thửnghiệmhoạttínhứcchế tạoutếbàoungthưganHep-G2trênthạch
mềmcủacáchợp chất................................................................................................91
Bảng4. 11 . Hàm lượngpolysaccharide t r ong cá c phân đo ạn t á ch ch i ế t n ấ m
hầuthủvà nấmhương...............................................................................................92
Bảng 4.12.Hoạttínhgâyđộctếbàocácphân đoạn chiếttáchtừnấmhầuthủ..................93
Bảng4.13.Hoạttínhkháng utrên thạch củacáccặn chiếtnấmhầuthủ.........................94
Bảng4.14.Kếtquảphổ NMRcủaHT3....................................................................103
Bảng4.15.Kếtquảphổ NMRcủaHT4....................................................................107
Bảng4.16.KếtquảphổNMRcủaHT6.....................................................................113
Bảng4.17.g i á trịtínhiệuphổ13C-NMRcủa-1,3/1,6glucan hầuthủ.......................118
Bảng 4.18. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ nấm Hầu
thủ119Bảng 4.19. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u tế bào ung thư gan HepG2trên thạch
mềmcủacáchợp chất............................................................................................120
Bảng 4.20. Hoạt tính gây độc tế bào của các β-1,3/1,6-glucan với trọng
lượngphântửkhácnhau.........................................................................................123
Bảng 4.21. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của β1,3/1,6-glucancótrọnglượngphântửkhácnhau......................................................124
Bảng 4.22. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính ức chế tạo
utrênthạch mềmcủacácsảnphẩmtrên dịng tếbào HepG2......................................128
Bảng4.23.Độctínhcấp củasảnphẩmtheo đường uốngtrên CNT.............................129
Bảng 4.24. Chỉ số tăng trọng lượng ở các nhóm trắng, nhóm chứng, sản
phẩmnghiên cứu khi cho uống mức liều 3,0 g/kg bán trường diễn sản phẩm trên
chuộtnhắttrắng.....................................................................................................131
Bảng 4.25. Kết quả nghiên cứu về trọng lượng cơ thể và khối lượng các tạng
ởmứcliềusảnphẩmlà3,0g/kg/24h trong 42 ngày...................................................132
Bảng 4.26. Các thông số huyết học khi dùng sản phẩm cho dùng uống bán
trườngdiễnvớimứcliều3,0g/kg/24h.........................................................................133
Bảng 4.27. Các chỉ tiêu hóa sinh về chức năng gan, thận khi dùng sản phẩm
bántrườngdiễnliều3,0g/kg/24giờ.........................................................................133
Bảng 4.28. Kết quả nghiên cứu điện tim thỏ dưới tác dụng của sản phẩm liều
3,0g/kg TLCTtại cácthời điểm(n=12)..................................................................134
Bảng 4.29. Kết quả nghiên cứu về mô bệnh học của gan, lách, thận khi uống
sảnphẩmbán trườngdiễnliều 3,0g/kg/TLCT.........................................................135
Bảng 4.30. Kết quả định lượng hoạt độ các enzym AST, ALT và γGTGT ở các
nhómchuộtnhắtnghiêncứu dướitácdụngcủasảnphẩm.............................................136
Bảng4.31.Kết quảđịnh lượng khốilượnggan ởcácnhómchuột nhắt nghiên cứu137
Bảng4.32.Kếtquảnghiêncứuảnhhưởngcủasảnphẩmuốngliều1 , 0 g/kg/TLCT
lượng
protein
tồn
phần
(tính
bằng
g/L)
ở
huyết
tương
đến
động
vậtthựcnghiệm(n=12)..........................................................................................138
Bảng 4.33. Tác dụng của sản phẩm về tác dụng trên hệ miễn dịch ở động vật
thựcnghiệm dùng uống liều 1,0 g/kg TLCT/24h và 3,0 g/kg TLCT/24h trên các
chỉtiêukhốilượngcáccơquanmiễndịch....................................................................138
Bảng 4.34. Tỷ lệ chuột nhắt sống sót sau chiếu xạ liều 7.0 Gy dưới tác dụng
củasảnphẩmliều1,0 g/kg TLCT-CNT..................................................................139
Bảng 4.35. Ảnh hưởng của sản phẩm đến kết quả định lượng các tế bào tủy,
bạchcầuvàquần thểcoloni lách ởCNT..................................................................140
Bảng 4.36.Ảnhhưởng củasản phẩmđếntỷsố thựcbàovàchỉsố thực bào1 4 1
Bảng 4.37. Kết quả đo phản ứng quá mẫn muộn với kháng nguyên đặc hiệu
trênCNT dưới tác dụng của HG1 liều 1,0 g/kg TLCT (chiếu xạ 7.0 Gy, sau đó
uốngsảnphẩm).....................................................................................................141
Bảng 4.38. Kết quả đo phản ứng quá mẫn muộn trên chuột nhắt dưới tác dụng
củasảnphẩm; uốngsảnphẩmliều 1,0g/kg TLCT,sauđóđượcchiếu xạ7,0Gy 142
Bảng 4.39. Kết quả đo phản ứng quá mẫn muộn trên CNT chiếu xạ 7,0 Gy
khôngdùngsản phẩm............................................................................................143
Bảng 4.40. Ảnh hưởng của HG1 (10 mg/kg) lên sự ức chế phát triển khối tế
bàoungthưEhrlich ởchuột (sốtrungbình±s.e; n=10;p<0.05)..................................145
Bảng 4.41. Ảnh hưởng của HG1 lên chỉ số tăng tuổi thọ của chuột có khối tế
bàoung thư Ehrlich. Ước tính tuổi thọ trung bình được xác định sau 30 ngày kể
từ khibắtđầu thínghiệm(số trungbình ±s.e;n=10;p<0,05)......................................145
DANHMỤCCÁCPHỤLỤC
DANHMỤC SƠĐỒVÀHÌNH
Hình1.1: Kết nối cácpolymertrong thànhtếbàonấm...............................................21
Hình1.2.cấutrúchóahọcđiển hìnhcủaβ1,3/1,6glucan.............................................22
Hình1.3.Cácdạngcấu trúccủaβglucanvàsựchuyển đổigiữachúng.........................24
Hình1.4.Cấutrúccủalentinan..................................................................................25
Hình1.5.Cấutrúcβ1,3/1,6glucancủaschizophyllan.................................................26
Bảng1.4.Cácthụthểnhậnbiếtkhnmẫuvớimộtsốpolysaccharide...........................28
Hình1.6.Mơhìnhglucanhoạthóatếbàomiễndịchgâypháhủytácnhâng â y b
ệnh(Leung,2006)[81]..............................................................................................29
Hình1.7.T á c dụng yhọccủanấmhương (Bisten etal.2010).....................................37
Sơđồ3.1:Sơđồ chiếtphân đoạnmẫu nấmhương.......................................................54
Sơđồ 3.2: Sơđồ phân lậpcáchợp chất NH2vàNH3..................................................55
Sơđồ 3.3.Sơđồtinhsạch β-1,3/1,6glucantừnấmHương............................................57
Sơđồ3.4:Sơđồchiết phânđoạn mẫunấmHầuthủ......................................................59
Sơđồ 3.5: Sơđồphân lập cáchợp chấtHT1 vàH T 2 ...............................................60
Sơđồ 3.6.Sơ đồ tinhsạchβ-1,3/1,6glucantừnấmhầuthủ..........................................62
Sơđồ 3.7.SơđồThủyphân β-1,3/1,6glucan từnấmhầu thủbằng emzyme..................64
Sơđồ 3.8 Sơđồ tạohỗnhợpβ-1,3/1,6glucan từnấmhầu thủvàcurcumin....................65
Hình4.1.Phổ1H-NMRcủaNH1...............................................................................77
Hình4.2.Phổ13C-NMRvàcácphổDEPTcủaNH1.....................................................78
Hình4.3.Phổ COSYcủaNH1..................................................................................78
Hình4.4.Phổ HMBCcủaNH1.................................................................................79
Hình4.5.PhổESI-MScủaNH1.................................................................................79
Hình4.6.Cấutrúchóahọchợpchất NH1....................................................................80
Hình4.7.Phổ13C-NMRcủahợpchấtNH2.................................................................80
Hình4.8.Phổ13C-NMRvàcácphổDEPTcủaNH2.....................................................81
Hình4.9.Phổ1H-NMRcủaNH2...............................................................................82
Hình4.10.Cấu trúchóahọccủaNH2.........................................................................84
Hình4.11.Phổ ESI-MScủaNH3..............................................................................84
Hình 4.12.Phổ1H-NMR của NH3..........................................................................85
Hình 4.13.Phổ13C-NMR của NH3.........................................................................86
Hình 4.14.Cấutrúchóa học của NH3......................................................................87
Hình4.15.Phổ13C-NMR của NH-GL.....................................................................88
Hình4.16.Ức chếpháttriển khốiu tếbàoHep-G2bởicácchấtphânlập.......................91
Hình 4.17.Phổ1H-NMR của HT1..........................................................................95
Hình 4.18.Phổ13C-NMR của HT1.........................................................................95
Hình4.19.PhổESI-MS của HT1.............................................................................96
Hình 4.20.Cấutrúchóa họccủahợpchấtHT1...........................................................97
Hình4.21.PhổESI-MS của HT2.............................................................................97
Hình 4.22.Phổ13C-NMR của HT2.........................................................................98
Hình 4.23.Phổ1H-NMR của HT2..........................................................................99
Hình4.24.Cấutrúchóa học của HT2.......................................................................99
Hình 4.25.PhổESI-MS của HT3.........................................................................100
Hình 4.26.Phổ1H-NMR của HT3........................................................................100
Hình4.27.Phổ13C-NMRvà các phổ DEPTcủa HT3..............................................101
Hình 4.28.PhổHMBC của HT3...........................................................................102
Hình 4.29.Phổ HSQC củaHT3............................................................................102
Hình4.30.Cấutrúchóa học củaHT3......................................................................104
Hình 4.31.PhổESI-MS của HT4.........................................................................105
Hình4.32.Phổ1H-NMR của HT4.........................................................................105
Hình4.33.Phổ13C-NMRvà các phổDEPTcủa HT4...............................................106
Hình4.34.PhổHSQC của HT4.............................................................................107
Hình4.35.PhổHMBC của HT4............................................................................109
Hình4.36.Cấutrúchóa học củaHT4......................................................................109
Hình 4.37.Phổ1H-NMR của HT5........................................................................110
Hình4.38.Phổ13C-NMR của HT5........................................................................111
Hình4.39.Phổ13C-NMR và cácphổDEPTcủa HT5..............................................111
Hình4.40.Cấutrúchóa học củaHT5......................................................................112
Hình4.41.Phổ ESI-MScủaHT6............................................................................112
Hình 4.42.Phổ1H-NMRc ủ a HT6........................................................................113
Hình4.43.Phổ13C-NMRvàcácphổDEPTcủaHT6..................................................114
Hình4.44.PhổHSQCcủa HT6...............................................................................114
Hình4.45.Phổ HMBCcủaHT6.............................................................................115
Hình4.46.Cấu trúchóahọccủaHT6.......................................................................115
Hình4.47.Phổ13C-NMRcủaHT-GL......................................................................117
Hình4.48.Ứcchếphát triển khốiutếbàoHepG2bởicácchấtphânlập........................121
Hình4.49.DùngcộtsephadexG-100kiểmtraMwphânđoạnHT-GL1,HT-GL2và HTGL3 sau khi ủ với enzyme và tách phân đoạn bằng EtOH 25, 40 và 70%.122Hình
4.50.PhổhấpthụđiệntửcủaCurvàCur-Glu................................................................126
Hình4.51.PhổhuỳnhquangcủaCurvàCur-Glu.......................................................126
Hình4.52.Ảnh FESEMcủaGlu (a),Cur(b)vàCur-Glu (c,d)...................................127
Hình4 . 5 3 . H ì n h ả n h m i n h h ọ a đ ộ h ò a t a n c ủ a h ỗ n h ợ p G l u C u r s o s á n h v ớ i Curcumin(độtancủaGlu-Cur(a)vàCur(b)).........................................127
Hình4.54.ẢnhhuỳnhquangcủahạtCur(a)vàCur-Glu(b).........................................127
MỞĐẦU
Hàng nghìn năm nay, nấm lớn (mushroom) đã được con người sử
dụnglàmt h ự c p h ẩ m v à t h u ố c c h ữ a b ệ n h . T h e o ư ớ c t í n h , t r ê n t h ế g i ớ i c
ókhoảng
140.0
lồi nấm lớn, trong đó có 14.000 lồi đã được biết vàm ô t ả v ớ i
5 0 % có thể dùng làm thựcphẩm. Hơn2.000 loàinấm là an toàn chon g ư ờ i
v à khoảng 700 lồi có hoạt tính sinh học có thể dùng cho ngành y dược. Vì
vậy,nấm lớn là nguồn tài nguyên phong phú phục vụ cho phát triển các sản
phẩm
cógiátrịchongànhyvàdượchọc.Mộtsốlồiđangđượcsửdụngrộngrãiphảikể
đến nấm linh chi (Ganoderma lucidum), hầu thủ (Hericium erinaceus), nấmhương
(Lentinula edodes), nấm vân chi (Trametes versicolor), nấm chân
chim(Schizophyllumcommune)…
Khoa học đã chứng minh rằng nấm dược liệu hỗ trợ điều trị các bệnh
ungthư,timmạch,tiểuđường,mỡmáu,béophì,suygiảmmiễndịchdovirus,chống viêm nhiễm, bệnh tổn
thương
thần
kinh
...
(Wasser,
2002;
Chang
và
cs.,2004)
[167,29].Cáchoạtchấttrongnấmcóthểlàcácphântửnhỏnhưtriterpenoids(hơn130loại)ởnấmlinh
chiG. lucidum(Huie và cs., 2004) [60],các hericinone (8 loại) và erinacine của
nấm hầu thủH. erinaceus(Arnone vàcs., 1994) [17], và hoạt tính chữa bệnh
chính là nhờ các chất phân tử lượng lớnnhư polysaccharide và glycoprotein.
Phầnlớncácpolysaccharideở n ấ m c ó hoạt tính điều hòa đáp ứng sinh học
(biological response modifiers, BRM) vớivai trò ngăn chặn và tiêu diệt tế bào
lạ (ung thư, vi sinh vật …) mà khơng hâyhạicơthểchủ.
ỞViệtNam,nấmlớnđãđượcchúýtừlâu.Nấmcóthểđượcthuháitừtựn h i ê
n h o ặ c c h ủ đ ộ n g n u ô i t r ồ n g . C ù n g v ớ i s ự p h á t t r i ể n c ủ a k h o a h ọ c k ĩ thuật
,trongkhoảngvàithậpkỷtrởlạiđây,nấmdượcliệuđượcsửdụngnhằmbổ sung nguồndinh dưỡng, tăng
cường sứckhoẻ vàhệm i ễ n d ị c h , đ i ề u t r ị h ỗ trợphòngvà chốngcác
bệnhhiểmnghèo.
1
Với mục đích làm rõ hơn các hoạt chất có giá trị y học trong hỗ trợ
điềutrị ung thư của một số nấm dược liệu nuôi trồng tại Việt Nam, chúng tôi
tiếnhành thực hiện đề tài“ N g h i ê n c ứ u c h i ế t t á c h c á c c h ấ t
c ó h o ạ t t í n h k h á n g u và điều biến miễn dịch từ hai loài nấm hầu
thủ (Hericium erinaceus) và nấmhương (Lentinula edodes) nuôi trồng ở Việt Nam”. Trong
khuôn khổ luận án,chúng tôi tậptrungnghiênnhữngnội dungchủ yếu sau:
1. Tách chiết một số hợp chất trao đổi thứ cấp, các polysaccharide
giàuglucan từquả thể nấm.
2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, khả năng ức chế sự hình thành khối
utrên thạchmềmcủacácchấtđã phânlập.
3. Tạo chếphẩmthửnghiệmtrênđộng vậtthựcnghiệm.
4. Đánh giá độ an toàn và hiệu lực của chế phẩm trên động vật thực
nghiệm(hoạt tính kháng u và điều biến miễn dịch, khả năng bảo vệ, phục
hồichứcnănggancủasảnphẩm)
CHƯƠNGI. TỔNGQUANTÀILIỆU
1.1. Nấmdượcliệuvà ứng dụng trongy họcdântộc
1.1.1. Giớithiệuvềnấmdượcliệu
Trong nhiều thế kỷ, nấm lớn đã được con người sử dụng làm nguồn
thứcăn và dược liệu chữa bệnh. Nấm lớn được hiểu làcó quả thể rõ ràng xuất
hiệntrên cây, trên hoặc dưới mặt đất và có thể nhìn thấy bằng mắt thường, hái
bằngtay(Chang và Miles, 1992) [28]. Nấm lớn được sử dụng trong y dược gọi
lànấmdược liệu.
Hiện nay việc nuôi trồng nấm lớn phục vụ thương mại chủ yếu là
nấmđảm (Basidiomycetes), vì nấm túi (Ascomycetes) thường khó ni trồng.
Nấmđược con người sử dụng bởi giá trị dinh dưỡng và giá trị dược học của
chúng.Nấm cung cấp ít calor và chất béo nhưng rất giầu protein, chất xơ,
vitamin vàchất khống(Crisanvà Sands,1978)[40].
Các nấm có thểăn được dùng làm thực phẩm và thực phẩm chức
năngnhư
các
loài
thuộc
chiLentinula,Hericium,Grifola,Flammulina,Pleurotus,Tremella… Một số nấm
như
linh
chi
(Ganoderrma
lucidum),
nấm
vân
chi(Trametesversicolor)chỉsửdụng làmthuốcbởi chúng có vịđắngvàrất cứng.
Hiện nay, khoảng hơn 200 loài nấm đã được thu hái và dùng cho
chữabệnh;35 lồi nấm được ni trồng cho mục đích thương mại, trong đó 20
lồiđược sản xuất ở qui mơ cơng nghiệpl à m t h ự c p h ẩ m v à d ư ợ c
l i ệ u ( C h a n g , 1999) [27]. Sản lượng nấm nuôi trồng trên thế giới năm
1994 là 4909103tấnvà tăng 6158103tấn năm 1997 với giá trị ước tính 14 tỉ
đơ la Mỹ. Sáu trong số10 lồi nấm được trồng nhiều nhất(chiếm tới 92% tổng sản lượng
nấm)
gồm:Agaricusbisporus(nấmmỡ,chiếm31.8%),Lentinusedodes(nấmhương,25,4%),
Pleurotus
spp.
(thuộc
nấm
sò,
14,2%),Auricularia
auricular(7,9%),Flammulina
velutipes(kim
volvaceae(nấm rơm,7,9%)(Chang,1999)[27].
châm,
4,6%)
vàVolvariella
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về nấm dược liệu chủ yếu tập trung vào
kỹthuật ni trồng (Nguyễn Thị Chính, 2005 và 2011; Lê Minh Tuấn, 2009)
[2,3,11]. Nguyễn Thị Chínhcũng là một trong những nhà khoa học đầu tiên
ởViệt Nam thí điểm ni trồng nấm sị và nấm linh chi bằng phương pháp
lênmen dịch thể để sản xuất thực phẩm chức năng, nhưng không tách chiết
lấypolysaccharide hay các thành phần có hoạt tính mà dùng sản phẩm hỗn
hợp(Chính, 2005 và 2011) [2,3]. Hoạt tính chống ung thư, tăng cường sức
khỏe chobệnh nhân mắc AIDS của polysaccharide từ nấm linh chi cũng được tác giảNguyễn Thị Chính
(2005) thử nghiệm [2]. Tác giả Nguyễn Cửu Khoa cũng đãbước đầu nghiên
cứu tách chiết polysaccharide từ nấm linh chi, nấm hầu thủnuôi trồng ở Việt
Nam và xác định hoạt tính chống oxy hố của chúng [5].Nhóm nghiên cứu của
chúng tơi (đứng đầu làP G S . T S . L ê M a i H ư ơ n g ) l à những người
đi tiên phong trong nghiên cứu tách chiết các hoạt chất từ một sốnấm dược liệu
nuôi trồng tại Việt Nam và đã đạt được những thành tựu đáng kểnhưtáchchiếtvàsản
xuấtthựcphẩmchứcnăngchứaβ-glucanvàmộtsốhoạtchấttừnấmdược liệu.
1.1.2. Ứngdụng trong yhọcdântộc
Các nước châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc đã sử dụng
nấmđểp h ò n g v à c h ữ a m ộ t s ố b ệ n h , k é o d à i t u ổ i t h ọ . N h ữ n g n ă m g ầ
n đ â y , t h ị trường Mỹ đãmởcửađể đón nhận nhữngsản phẩm thuốc từ nấm
dượcl i ệ u , đặcbiệtnấmlinhchivà nấmmaitake.Năm1994thếgi ới tiêut h
ụ nấmdượcliệuvàcácsảnphẩmtừnấmvớiướctínhtới3,8tỉUSDvàtănglêntới6tỉnăm1999vớithịtrườngchính
(chiếm
tới
99%)l à
châu
Á
và
châu
Âu.
Các
s ả n phẩmquantrọngtừnấmdượcliệuthườngcónguồngốctừcácn ấ m Ganoderma
sp.,L.edodes,S.commune,Tremellafusiformis,Trametesversicolor,Grifola
frondosa,
và
gần
đây
là
từPhellinussp.
(thượng
vàHericiumerinaceus(hầu thủ)(bảng 1.1-WasservàWeis,1999)[166].
hoàng)