0998 nghiên cứu chiết tách các chất có hoạt tính kháng u và điều biến miễn dịch từ hai loài nấm hầu thủ (hericium erinaceus) và nấm hư

BỘGIÁO DỤC VÀĐÀOTẠO

VIỆNHÀNLÂM
KHOAHỌCVÀ CÔNGNGHỆVIỆTNAM

HỌCVIỆNKHOAHỌCVÀCÔNG NGHỆ
----------------

TRẦNTHỊHỒNGHÀ

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CÁC CHẤT CĨ HOẠT
TÍNHKHÁNGUVÀĐIỀUBIẾNMIỄNDỊCHTỪHAILỒINẤMHẦU
THỦ(Hericiumerinaceus)VÀNẤMHƯƠNG(Lentinulaedodes)
NITRỒNGỞVIỆTNAM

Chun ngành: Hố học các hợp chất thiên
nhiênMãsố: 62.44.01.17
LUẬNÁNTIẾNSĨHĨAHỌC

HÀNỘI,2015

i


DANHMỤC CÁCKÍ HIỆUVÀCHỮVIẾTTẮT
Kíhiệu

Tiếnganh

Tiếngviệt

AST

Serumaspartattransaminase

ALT

Serumalanintransaminase

ATCC

American

Type

Culture

Ngânhàng chủnggiốngMỹ

Collection
BC

Bạchcầu

BSA

Bovineserumalbumin

13

Carbon-13

C-NMR

Nuclear

Albuminhuyếtthanhbị
Magnetic

ResonanceSpectroscopy
CC

Phổc ộ n g h ư ở n g t ừ h ạ t n h â
n
carbon13
Sắckícột

ColumnChromatography

CCT

Chuộtcốngtrắng

CNT

Chuộtnhắttrắng

COSY

CorrelationSpectroscopy

PhổCOSY

CS%

Cellsurvival%

%tếbàosốngsót

DEPT

Distortionless Enhancement by

PhổDEPT

PolarisationTransfer
DEAE-

celluloseD i e t h y l a m i n o e t h y l

cellulose
DMSO

Dimethylsulfoxid

Dimetylsulfoxit

EAC

EhrlichascitesCarcinoma

Ungthưcổtrướng

ECACC

TheE u r o p e a n C o l l e c t i o n o f
Cell

Ngânh à n g c h ủ n g g i ố n g c h â u
Âu

Cultures
ElectronS p r a y I o n i z a t i o n
M a s s

Phổkhốii o n h ó a p h u n m
ù

EtOAc

Spectra
Ethylacetate

điệntử
Etylaxetat

FBS

Foetalbovineserum

Huyếtthanhbàothaibò

Fl

Humancervicaluterinecarcinoma

TếbàoUng thưtửcung

ESI-MS

2


GC
γGTGT

GasChromatography
Serum
gamma

Sắckíkhí
glutanin

transaminase
Hb

Haemoglobin

HC

Hồngcầu

Hep-G2

Hepatocellularcarcinoma

HMBC

Heteronuclear

Tếbàoung thưganngười

Multiple

Bond

Connectivity
1

H-NMR

Proton

Phổtươngtácdịhạtnhânqua
nhiềuliên kết

Nuclear

Magnetic

ResonanceSpectroscopy

Phổc ộ n g h ư ở n g t ừ h ạ t n h â
n
proton

HPLC
HSQC
IC50

High

Performance

Sắck í l ỏ n g c a o á p h i ệ u n ă n g

liquidChromatography

cao

Heteronuclear

single-Quantum

Phổtươngtácdịhạtnhânqua

Conherence

mộtliênkết

Inhibitoryconcentration50%

Nồngđộứcchế50%

KLT

Khốilượngtạng

KN

Khángnguyên

LD50

lethaldose50%

Liềug â y c h ế t 5 0 % đ ộ n g v ậ
t
thựcnghiệm

Lu
MIC

Humanlungadenocarcinoma
minimuminhibitoryconcentration

NC

TếbàoUngthưbiểumơphổi
Nồngđộứcchếtốithiểu
Nghiêncứu

OD

OpticalDensity

Mậtđộquang

OVA

Ovalbumin

Albuminlịngtrắngtrứng

PBS

Phosphat buffersaline

Dungdịchđệmphosphat

RD

HumanRhabdomyosarcoma
%scavengingcapacity

Ungthư mơliênkết
%k h ả n ă n g t r u n g h ò a g ố c t ự

SC%

do

SGMD
SRB

Suygiảmmiễndịch
SulforhodamineB
3


TCA
TCCS
TCL

Trichloaceticacid

Axittricloaxetic

ThinLayerChromatography

Tiêuchuẩncơsở
Sắckílớpmỏng

TL(g)

Trọnglượng(gam)

TLCT

Trọnglượngcơthể

TNFα

Yếutốhoại tửungthư

Tumornecrosisfactor

VSV
WHO

Visinhvật
WorldHealthOrganization

4

TổchứcYtếthếgiới


MỤCLỤC
DANHMỤCCÁC KÍHIỆUVÀ CHỮVIẾTTẮT.....................................................ii
DANHMỤCSƠ ĐỒ VÀHÌNH.............................................................................xiii
MỞĐẦU..................................................................................................................1
CHƯƠNGI.TỔNGQUANTÀILIỆU.......................................................................3
1.1. Nấmdược liệu và ứng dụngtrong yhọcdântộc...................................................3
1.1.1. Giớithiệuvềnấmdược liệu............................................................................3
1.1.2. Ứngdụngtrong yhọcdântộc..........................................................................4
1.2. Nhữngnghiêncứutrênthếgiớivềcácchất cóhoạttínhsinhhọccủanấmdư
ợcliệu........................................................................................................................6
1.2.1. Cáchợp chất cóphântửlượng nhỏ.................................................................6
1.2.1.2.Cácchất cóhoạttínhsinhhọckhác.................................................................11
1.2.2. Hoạttínhcủapolysaccharidetừnấmdược liệu................................................19
1.3. Tình hìnhnghiên cứu vềnấmhầuthủ vànấmhương..........................................30

1.3.1. Nấmhầu thủ (Hericiumerinaceus)..............................................................30
1.3.1.1. Trên thếgiới............................................................................................30
1.3.1.2. ỞViệtNam..............................................................................................34
1.3.2. Nấmhương (Lentinus edodes)....................................................................35
1.3.2.1. Trên thếgiới............................................................................................36
1.3.2.2. ỞV i ệ t Nam..........................................................................................40
1.4. Mơhìnhnicấytếbàoungthưbachiều(3D)trongnghiêncứuungthư...................41
CHƯƠNGII.NGUNLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU........................44
2.1. Đốitượngnghiêncứu.......................................................................................44
2.1.1. Nấmhương.................................................................................................44
2.1.2. Nấmhầuthủ................................................................................................44
2.2. Dụng cụ,hóa chấtvàmơitrường......................................................................44
2.2.1. Dụng cụvàthiết bị......................................................................................44
2.2.2. Mơi trường................................................................................................44
2.3. Cácphươngphápphân lập cáchợp chất...........................................................45


2.4. Phươngpháp tinh sạchβ-glucantừnấmhươngvànấmhầu thủ............................46
2.4.1. Phươngpháptinhsạchβ-1,3-glucantừnấmhương...........................................46
2.4.2. Phươngpháptinhsạchβ-1,3-glucantừnấmhầuthủ..........................................46
2.5. Cácphương pháp xácđịnhcấu trúchốhọc........................................................46
2.6. Phươngphápxácđịnhhàmlượngpolysaccharide................................................46
2.7. Phươngphápthủyphânkhơnghồntồnβ-1,3-glucantừnấmhầuthủbằng
-1,3-glucanase.....................................................................................................47
2.8. Nghiêncứubaocurcumin(Cur)bằng β-1,3/1,6-glucan........................................47
2.9. Phươngphápđánhgiáhoạttínhsinhhọc..............................................................48
2.9.1. Phươngphápthửkhảnănggâyđộctếbào(cytotoxicity)....................................48
2.9.2. Phươngphápứcchếhìnhthànhkhốiu3chiềutrênthạchmềm(antitumorpromotingassay)invitro.....................................................................................50
2.10. Cácphươngpháp thửdượclý..........................................................................51
2.10.1. Phươngphápđánhgiáđộctính cấp................................................................51

2.10.2. Phươngphápđánhgiáđ ộ c tínhbán trường diễn...........................................51
2.10.3. Phươngphápđánhgiámột sốtácdụngcủasảnphẩm........................................52
2.10.3.1. Nghiênc ứ u t á c d ụ n g b ả o v ệ g a n c ủ a H G 1 t r ê n m ô h ì n h g â y đ ộ c g a
n bằngcarbontetracholorid........................................................................................52
2.10.3.2. NghiêncứutácdụngcủaHG1đếnquátrìnhtổnghợpproteintrênđộngvậtkhi
dùng bán trườngdiễn...............................................................................................52
2.10.3.3. Nghiêncứutácdụngtrên hệmiễndịch củaHG1thựcnghiệm........................52
2.10.3.4. Phươngphápthửhiệulựckhánguthựcnghiệm............................................52
2.10.4. Xửlýsố liệu.................................................................................................52
CHƯƠNGIII.THỰCNGHIỆM..............................................................................53
3.1. Nghiên cứu hóahọc vàhoạttính sinhhọccủanấmhương....................................53
3.1.1. Phân lập cách ợ p c h ấ t từquảthểnấmhương.............................................53
3.1.2. Táchp o l y s a c c h a r i d e từdịch lên mennấmhương...............................55
3.1.3. Cách ằ n g s ố v ậ t l ý v à s ố l i ệ u p h ổ c ủ a c á c h ợ p c h ấ t đ ã p h â n l ậ p t ừ n ấ m
hương55


3.1.4. Tinhsạchβ-1,3/1,6 glucan (lentinan)từnấmhương (sơđồ3.3).........................56
3.2. Nghiêncứu hóahọcvàhoạttính sinhhọccủanấmhầu thủ....................................57
3.2.1. Phân lập cáchợp chấttừquảthểnấmhầu thủ(sơđồ3.4)....................................57
3.2.2. Táchp o l y s a c c h a r i d e từdịch lênmen nấmhầu thủ..............................60
3.2.3. Cáchằngsốvậtlývàsốliệuphổcủacáchợpchấtđãphânlậptừnấmhầuthủ

60

3.2.4. Tinhsạchβ-1,3/1,6 glucan từnấmhầu thủ.......................................................61
3.2.5. Thủyphânkhơnghồntồnβ-1,3-glucantừnấmhầuthủbằngenzyme-1,3glucanase.....................................................................................................................62
3.2.6. Sửdụng β-1,3/1,6-glucantừnấmhầu thủlàmchất mangcurcumin...................64
3.3. Tạochếphẩmthửnghiệm..................................................................................66
3.4. Thửdượclý chếphẩm.......................................................................................66

3.4.1. Nghiên cứuđộctính cấp................................................................................66
3.4.3. NghiêncứumộtsốtácdụngcủasảnphẩmHG1trênđộngvậtthựcnghiệm
……………………………………………………………………………………68
3.4.4. NghiêncứuthửhiệulựckhánguthựcnghiệmtrênđộngvậtcủasảnphẩmHG2
70
CHƯƠNGIV.KẾTQUẢVÀ THẢOLUẬN...........................................................73
4.1. Nghiên cứu hóahọc vàhoạttính sinhhọccủanấmhương....................................73
4.1.1. Tách cácphânđoạnvà đánh giáhoạt tínhsinhhọc..........................................73
4.1.2. Xácđịnh cấutrúc cáchợpchấtNH1,NH2vàNH3..........................................76
4.1.2.1. HợpchấtNH1:galactiol...........................................................................76
4.1.2.2. HợpchấtNH-2:Ergosterol.......................................................................80
4.1.2.3. HợpchấtNH3:Ergosterolperoxide...........................................................84
4.1.2.4. HợpchấtNH-GL:β-1,3/1,6glucan(lentinan)............................................88
4.1.3. Đánhgiáhoạt tính sinhhọccủa cáchợp chấtphânlập từnấmhương...............89
4.2. Nghiêncứu hóahọcvàhoạttính sinhhọccủanấmhầu thủ....................................92
4.2.1. Táchphân đoạn vàđánhgiáhoạttínhchốngungthư.........................................92
4.2.2. Xácđịnh cấutrúccáchợp chấtphânlậptừnấmhầu thủ......................................94
4.2.2.1. HợpchấtHT1:axitstearic............................................................................94


4.2.2.2. HợpchấtHT2:Ergosterolperoxide..............................................................97
4.2.2.3. HợpchấtHT3-CerebrosideB......................................................................99
4.2.2.4. Hợpchất HT4 -HericenoneD...................................................................104
4.2.2.5. HợpchấtH T 5 -Ergosterol.......................................................................110
4.2.2.6. HợpchấtHT6-β-Adenosine......................................................................112
4.2.3. Đánh giáhoạt tính sinhhọccủacáchợp chấtphânlậptừnấmhầu thủ...............118
4.3. Nghiêncứubiếnđổiβ-1,3glucantừnấmhầuthủthànhhoạtchấtdễtanhơnvàđánh giáhoạttínhcủachúng........121
4.3.1. Thủyphânbằng enzyme-1,3-glucanase.....................................................122
4.3.2. Dùngβ-1,3/1,6-glucantừnấmhầuthủlàmchấtmang curcumin.......................124
4.4. ThửnghiệmtácdụngdượclýchếphẩmHG1trênđộngvậtthựcnghiệm.................128

4.4.1. Kếtquảnghiêncứu độctínhcấpcủasản phẩmtheođườnguống củachế
phẩmHG1...............................................................................................................128
4.4.2. Độctínhbántrườngdi ễncủasản phẩmHG1khichouốngtrênđộngvật
thựcnghiệm............................................................................................................129
4.4.2.1. ẢnhhưởngcủaHG1,choCNTuốngtrườngdiễnđốivớikhốilượnggan,lách,thậ
nđộngvật..............................................................................................................130
4.4.2.2. KếtquảnghiêncứutrọnglượngcơthểCNT,khốilượnggan,lách,thậnvà
tỷsốgiữakhốilượng mỗitạng so vớitrọng lượngcơthể............................................131
4.4.2.3. Ảnh hưởng của sản phẩm cho uống bán trường diễn đến các chỉ tiêu
huyếthọctrên độngvật thựcnghiệm........................................................................132
4.4.2.4. Ảnhh ư ở n g c ủ a s ả n p h ẩ m đ ế n c á c t h ô n g s ố h ó a s i n h đ ộ n g v ậ t k h i c h
o uốngbántrường diễn............................................................................................133
4.4.2.5. Ảnhhưởngcủasảnphẩmdùnguống6tuầnđếnchứcnăngtimthỏđượcđođi
ệntim

134

4.4.2.6. Ảnhhưởngcủasảnphẩmđếncácthôngsốmôbệnhhọckhidùngtrườngdiễn 135
4.4.3. Kết quảnghiêncứu một số tácdụngcủasảnphẩmHG1..................................136
4.4.3.1. Tácd ụ n g b ả o v ệ g a n c ủ a s ả n p h ẩ m t r ê n c h u ộ t n h ắ t đ ư ợ c g â y đ ộ c g
a n bằngcarbontetraclorid........................................................................................136


4.4.3.2. Ảnhhưởngcủasảnphẩmuốngbántrườngdiễnđếnquát r ì n h tổnghợp
proteintrênđộngvậtthựcnghiệm................................................................................137
4.4.3.3. Tácdụngtrênhệmiễndịch củasản phẩm....................................................138
4.4.3.4. Kếtquảđánhgiátỷlệsống/chếtcủaCNTsauchiếuxạdướitácdụngcủasảnphẩm
139
4.4.3.5. Kếtquảnghiêncứutácdụngtêncácdịngtếbàocóchứcnăngmiễndịch
.............................................................................................................................140

4.4.3.6. Kếtquảnghiêncứ uvề phảnứngqm ẫn m uộ n vớikhángngunđặc
hiệudướitácdụng của sản phẩm...............................................................................141
4.4.4. Thửnghiệmtácdụng của sản phẩmHG1 lêntếbàoungthư............................144
4.4.4.1. TácdụngcủasảnphẩmHG1lênhồngcầuvàtếbàoungthưbiểumôcổtrướngE
hrlich(EAC)invitro...............................................................................................144
4.4.4.2. TácdụngcủahỗnhợpHG1lêntếbàoungthưbiểumôcổtrướngEhrlich(EAC)inv
ivo

144

4.4.4.1.Tácdụng củachếphẩmHG1lên khối tếbào ungthưEhrlichinvivo..............144
KẾTLUẬN..........................................................................................................147
KIẾNNGHỊ.........................................................................................................149
CÁCCƠNGTRÌNHĐÃCƠNGBỐLIÊN QUANĐẾNLUẬNÁN.........................150
TÀILIỆUTHAMKHẢO......................................................................................152
DANHMỤCCÁCPHỤLỤC..................................Error! Bookmarknot defined.


DANHMỤCBẢNG
Bảng1.1.Danh sáchnấmdượcliệutiêu biểuvàđặctính chữabệnh................................5
Bảng1.2.Cácchấtphân tửlượng nhỏ cóhoạttínhkhángu.............................................9
Bảng13.Nguồn gốc,kiểuvàhoạttính polysaccharidetừmộtsốnấm dượcliệu19
Bảng1.4.Cácthụthểnhậnbiếtkhnmẫuvớimộtsốpolysaccharide............................28
Bảng 1.5.Giátrị yhọcvà một số chất hoạttínhtừnấmhương.....................................37
Bảng3.1.Kếtquảthủyphânkhơnghồntồnβ-1,3glucantừnấmhầuthủbằngenzym-1,3-glucanase...................................................63
Bảng4.1.Polysaccharidetrongcácphân đoạntáchchiếtnấmhương............................73
Bảng 4.2.Hoạttính gâyđộctếbàocáccặnchiết củanấmhương..................................74
Bảng 4.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các
phânđoạnpolysaccharide..........................................................................................74
Bảng4.4.Hoạttính gâyđộctếbàocácphân đoạn........................................................75

Bảng 4.5. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các
phânđoạn.................................................................................................................76
Bảng4.6.Kết quảphổ13C-NMRcủaNH2..................................................................83
Bảng4.7.SốliệuphổNMRcủahợp chấtNH3 vàhợp chất thamkhảo..........................86
Bảng4.8.Sosánhphổ13C-NMRcủalentinanvàβ-1,3/1,6tinhsạch...............................89
Bảng4.9.Hoạt tínhgâyđộctế bào củacáchợpchấtphân lậptừnấmhương...................90
Bảng4.10.Kếtquả thửnghiệmhoạttínhứcchế tạoutếbàoungthưganHep-G2trênthạch
mềmcủacáchợp chất................................................................................................91
Bảng4. 11 . Hàm lượngpolysaccharide t r ong cá c phân đo ạn t á ch ch i ế t n ấ m
hầuthủvà nấmhương...............................................................................................92
Bảng 4.12.Hoạttínhgâyđộctếbàocácphân đoạn chiếttáchtừnấmhầuthủ..................93
Bảng4.13.Hoạttínhkháng utrên thạch củacáccặn chiếtnấmhầuthủ.........................94
Bảng4.14.Kếtquảphổ NMRcủaHT3....................................................................103
Bảng4.15.Kếtquảphổ NMRcủaHT4....................................................................107
Bảng4.16.KếtquảphổNMRcủaHT6.....................................................................113
Bảng4.17.g i á trịtínhiệuphổ13C-NMRcủa-1,3/1,6glucan hầuthủ.......................118


Bảng 4.18. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ nấm Hầu
thủ119Bảng 4.19. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u tế bào ung thư gan HepG2trên thạch
mềmcủacáchợp chất............................................................................................120
Bảng 4.20. Hoạt tính gây độc tế bào của các β-1,3/1,6-glucan với trọng
lượngphântửkhácnhau.........................................................................................123
Bảng 4.21. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của β1,3/1,6-glucancótrọnglượngphântửkhácnhau......................................................124
Bảng 4.22. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính ức chế tạo
utrênthạch mềmcủacácsảnphẩmtrên dịng tếbào HepG2......................................128
Bảng4.23.Độctínhcấp củasảnphẩmtheo đường uốngtrên CNT.............................129
Bảng 4.24. Chỉ số tăng trọng lượng ở các nhóm trắng, nhóm chứng, sản
phẩmnghiên cứu khi cho uống mức liều 3,0 g/kg bán trường diễn sản phẩm trên
chuộtnhắttrắng.....................................................................................................131

Bảng 4.25. Kết quả nghiên cứu về trọng lượng cơ thể và khối lượng các tạng
ởmứcliềusảnphẩmlà3,0g/kg/24h trong 42 ngày...................................................132
Bảng 4.26. Các thông số huyết học khi dùng sản phẩm cho dùng uống bán
trườngdiễnvớimứcliều3,0g/kg/24h.........................................................................133
Bảng 4.27. Các chỉ tiêu hóa sinh về chức năng gan, thận khi dùng sản phẩm
bántrườngdiễnliều3,0g/kg/24giờ.........................................................................133
Bảng 4.28. Kết quả nghiên cứu điện tim thỏ dưới tác dụng của sản phẩm liều
3,0g/kg TLCTtại cácthời điểm(n=12)..................................................................134
Bảng 4.29. Kết quả nghiên cứu về mô bệnh học của gan, lách, thận khi uống
sảnphẩmbán trườngdiễnliều 3,0g/kg/TLCT.........................................................135
Bảng 4.30. Kết quả định lượng hoạt độ các enzym AST, ALT và γGTGT ở các
nhómchuộtnhắtnghiêncứu dướitácdụngcủasảnphẩm.............................................136
Bảng4.31.Kết quảđịnh lượng khốilượnggan ởcácnhómchuột nhắt nghiên cứu137
Bảng4.32.Kếtquảnghiêncứuảnhhưởngcủasảnphẩmuốngliều1 , 0 g/kg/TLCT
lượng

protein

tồn

phần

(tính

bằng

g/L)

ở

huyết

tương

đến
động

vậtthựcnghiệm(n=12)..........................................................................................138


Bảng 4.33. Tác dụng của sản phẩm về tác dụng trên hệ miễn dịch ở động vật
thựcnghiệm dùng uống liều 1,0 g/kg TLCT/24h và 3,0 g/kg TLCT/24h trên các
chỉtiêukhốilượngcáccơquanmiễndịch....................................................................138
Bảng 4.34. Tỷ lệ chuột nhắt sống sót sau chiếu xạ liều 7.0 Gy dưới tác dụng
củasảnphẩmliều1,0 g/kg TLCT-CNT..................................................................139
Bảng 4.35. Ảnh hưởng của sản phẩm đến kết quả định lượng các tế bào tủy,
bạchcầuvàquần thểcoloni lách ởCNT..................................................................140
Bảng 4.36.Ảnhhưởng củasản phẩmđếntỷsố thựcbàovàchỉsố thực bào1 4 1
Bảng 4.37. Kết quả đo phản ứng quá mẫn muộn với kháng nguyên đặc hiệu
trênCNT dưới tác dụng của HG1 liều 1,0 g/kg TLCT (chiếu xạ 7.0 Gy, sau đó
uốngsảnphẩm).....................................................................................................141
Bảng 4.38. Kết quả đo phản ứng quá mẫn muộn trên chuột nhắt dưới tác dụng
củasảnphẩm; uốngsảnphẩmliều 1,0g/kg TLCT,sauđóđượcchiếu xạ7,0Gy 142
Bảng 4.39. Kết quả đo phản ứng quá mẫn muộn trên CNT chiếu xạ 7,0 Gy
khôngdùngsản phẩm............................................................................................143
Bảng 4.40. Ảnh hưởng của HG1 (10 mg/kg) lên sự ức chế phát triển khối tế
bàoungthưEhrlich ởchuột (sốtrungbình±s.e; n=10;p<0.05)..................................145
Bảng 4.41. Ảnh hưởng của HG1 lên chỉ số tăng tuổi thọ của chuột có khối tế
bàoung thư Ehrlich. Ước tính tuổi thọ trung bình được xác định sau 30 ngày kể
từ khibắtđầu thínghiệm(số trungbình ±s.e;n=10;p<0,05)......................................145

DANHMỤCCÁCPHỤLỤC


DANHMỤC SƠĐỒVÀHÌNH
Hình1.1: Kết nối cácpolymertrong thànhtếbàonấm...............................................21
Hình1.2.cấutrúchóahọcđiển hìnhcủaβ1,3/1,6glucan.............................................22
Hình1.3.Cácdạngcấu trúccủaβglucanvàsựchuyển đổigiữachúng.........................24
Hình1.4.Cấutrúccủalentinan..................................................................................25
Hình1.5.Cấutrúcβ1,3/1,6glucancủaschizophyllan.................................................26
Bảng1.4.Cácthụthểnhậnbiếtkhnmẫuvớimộtsốpolysaccharide...........................28
Hình1.6.Mơhìnhglucanhoạthóatếbàomiễndịchgâypháhủytácnhâng â y b
ệnh(Leung,2006)[81]..............................................................................................29
Hình1.7.T á c dụng yhọccủanấmhương (Bisten etal.2010).....................................37
Sơđồ3.1:Sơđồ chiếtphân đoạnmẫu nấmhương.......................................................54
Sơđồ 3.2: Sơđồ phân lậpcáchợp chất NH2vàNH3..................................................55
Sơđồ 3.3.Sơđồtinhsạch β-1,3/1,6glucantừnấmHương............................................57
Sơđồ3.4:Sơđồchiết phânđoạn mẫunấmHầuthủ......................................................59
Sơđồ 3.5: Sơđồphân lập cáchợp chấtHT1 vàH T 2 ...............................................60
Sơđồ 3.6.Sơ đồ tinhsạchβ-1,3/1,6glucantừnấmhầuthủ..........................................62
Sơđồ 3.7.SơđồThủyphân β-1,3/1,6glucan từnấmhầu thủbằng emzyme..................64
Sơđồ 3.8 Sơđồ tạohỗnhợpβ-1,3/1,6glucan từnấmhầu thủvàcurcumin....................65
Hình4.1.Phổ1H-NMRcủaNH1...............................................................................77
Hình4.2.Phổ13C-NMRvàcácphổDEPTcủaNH1.....................................................78
Hình4.3.Phổ COSYcủaNH1..................................................................................78
Hình4.4.Phổ HMBCcủaNH1.................................................................................79
Hình4.5.PhổESI-MScủaNH1.................................................................................79
Hình4.6.Cấutrúchóahọchợpchất NH1....................................................................80
Hình4.7.Phổ13C-NMRcủahợpchấtNH2.................................................................80
Hình4.8.Phổ13C-NMRvàcácphổDEPTcủaNH2.....................................................81
Hình4.9.Phổ1H-NMRcủaNH2...............................................................................82

Hình4.10.Cấu trúchóahọccủaNH2.........................................................................84
Hình4.11.Phổ ESI-MScủaNH3..............................................................................84


Hình 4.12.Phổ1H-NMR của NH3..........................................................................85
Hình 4.13.Phổ13C-NMR của NH3.........................................................................86
Hình 4.14.Cấutrúchóa học của NH3......................................................................87
Hình4.15.Phổ13C-NMR của NH-GL.....................................................................88
Hình4.16.Ức chếpháttriển khốiu tếbàoHep-G2bởicácchấtphânlập.......................91
Hình 4.17.Phổ1H-NMR của HT1..........................................................................95
Hình 4.18.Phổ13C-NMR của HT1.........................................................................95
Hình4.19.PhổESI-MS của HT1.............................................................................96
Hình 4.20.Cấutrúchóa họccủahợpchấtHT1...........................................................97
Hình4.21.PhổESI-MS của HT2.............................................................................97
Hình 4.22.Phổ13C-NMR của HT2.........................................................................98
Hình 4.23.Phổ1H-NMR của HT2..........................................................................99
Hình4.24.Cấutrúchóa học của HT2.......................................................................99
Hình 4.25.PhổESI-MS của HT3.........................................................................100
Hình 4.26.Phổ1H-NMR của HT3........................................................................100
Hình4.27.Phổ13C-NMRvà các phổ DEPTcủa HT3..............................................101
Hình 4.28.PhổHMBC của HT3...........................................................................102
Hình 4.29.Phổ HSQC củaHT3............................................................................102
Hình4.30.Cấutrúchóa học củaHT3......................................................................104
Hình 4.31.PhổESI-MS của HT4.........................................................................105
Hình4.32.Phổ1H-NMR của HT4.........................................................................105
Hình4.33.Phổ13C-NMRvà các phổDEPTcủa HT4...............................................106
Hình4.34.PhổHSQC của HT4.............................................................................107
Hình4.35.PhổHMBC của HT4............................................................................109
Hình4.36.Cấutrúchóa học củaHT4......................................................................109
Hình 4.37.Phổ1H-NMR của HT5........................................................................110

Hình4.38.Phổ13C-NMR của HT5........................................................................111
Hình4.39.Phổ13C-NMR và cácphổDEPTcủa HT5..............................................111
Hình4.40.Cấutrúchóa học củaHT5......................................................................112


Hình4.41.Phổ ESI-MScủaHT6............................................................................112
Hình 4.42.Phổ1H-NMRc ủ a HT6........................................................................113
Hình4.43.Phổ13C-NMRvàcácphổDEPTcủaHT6..................................................114
Hình4.44.PhổHSQCcủa HT6...............................................................................114
Hình4.45.Phổ HMBCcủaHT6.............................................................................115
Hình4.46.Cấu trúchóahọccủaHT6.......................................................................115
Hình4.47.Phổ13C-NMRcủaHT-GL......................................................................117
Hình4.48.Ứcchếphát triển khốiutếbàoHepG2bởicácchấtphânlập........................121
Hình4.49.DùngcộtsephadexG-100kiểmtraMwphânđoạnHT-GL1,HT-GL2và HTGL3 sau khi ủ với enzyme và tách phân đoạn bằng EtOH 25, 40 và 70%.122Hình
4.50.PhổhấpthụđiệntửcủaCurvàCur-Glu................................................................126
Hình4.51.PhổhuỳnhquangcủaCurvàCur-Glu.......................................................126
Hình4.52.Ảnh FESEMcủaGlu (a),Cur(b)vàCur-Glu (c,d)...................................127
Hình4 . 5 3 . H ì n h ả n h m i n h h ọ a đ ộ h ò a t a n c ủ a h ỗ n h ợ p G l u C u r s o s á n h v ớ i Curcumin(độtancủaGlu-Cur(a)vàCur(b)).........................................127
Hình4.54.ẢnhhuỳnhquangcủahạtCur(a)vàCur-Glu(b).........................................127


MỞĐẦU
Hàng nghìn năm nay, nấm lớn (mushroom) đã được con người sử
dụnglàmt h ự c p h ẩ m v à t h u ố c c h ữ a b ệ n h . T h e o ư ớ c t í n h , t r ê n t h ế g i ớ i c
ókhoảng
140.0

lồi nấm lớn, trong đó có 14.000 lồi đã được biết vàm ô t ả v ớ i

5 0 % có thể dùng làm thựcphẩm. Hơn2.000 loàinấm là an toàn chon g ư ờ i

v à khoảng 700 lồi có hoạt tính sinh học có thể dùng cho ngành y dược. Vì
vậy,nấm lớn là nguồn tài nguyên phong phú phục vụ cho phát triển các sản
phẩm
cógiátrịchongànhyvàdượchọc.Mộtsốlồiđangđượcsửdụngrộngrãiphảikể
đến nấm linh chi (Ganoderma lucidum), hầu thủ (Hericium erinaceus), nấmhương
(Lentinula edodes), nấm vân chi (Trametes versicolor), nấm chân
chim(Schizophyllumcommune)…
Khoa học đã chứng minh rằng nấm dược liệu hỗ trợ điều trị các bệnh
ungthư,timmạch,tiểuđường,mỡmáu,béophì,suygiảmmiễndịchdovirus,chống viêm nhiễm, bệnh tổn
thương

thần

kinh

...

(Wasser,

2002;

Chang

và

cs.,2004)

[167,29].Cáchoạtchấttrongnấmcóthểlàcácphântửnhỏnhưtriterpenoids(hơn130loại)ởnấmlinh
chiG. lucidum(Huie và cs., 2004) [60],các hericinone (8 loại) và erinacine của
nấm hầu thủH. erinaceus(Arnone vàcs., 1994) [17], và hoạt tính chữa bệnh

chính là nhờ các chất phân tử lượng lớnnhư polysaccharide và glycoprotein.
Phầnlớncácpolysaccharideở n ấ m c ó hoạt tính điều hòa đáp ứng sinh học
(biological response modifiers, BRM) vớivai trò ngăn chặn và tiêu diệt tế bào
lạ (ung thư, vi sinh vật …) mà khơng hâyhạicơthểchủ.
ỞViệtNam,nấmlớnđãđượcchúýtừlâu.Nấmcóthểđượcthuháitừtựn h i ê
n h o ặ c c h ủ đ ộ n g n u ô i t r ồ n g . C ù n g v ớ i s ự p h á t t r i ể n c ủ a k h o a h ọ c k ĩ thuật
,trongkhoảngvàithậpkỷtrởlạiđây,nấmdượcliệuđượcsửdụngnhằmbổ sung nguồndinh dưỡng, tăng
cường sứckhoẻ vàhệm i ễ n d ị c h , đ i ề u t r ị h ỗ trợphòngvà chốngcác
bệnhhiểmnghèo.
1


Với mục đích làm rõ hơn các hoạt chất có giá trị y học trong hỗ trợ
điềutrị ung thư của một số nấm dược liệu nuôi trồng tại Việt Nam, chúng tôi
tiếnhành thực hiện đề tài“ N g h i ê n c ứ u c h i ế t t á c h c á c c h ấ t
c ó h o ạ t t í n h k h á n g u và điều biến miễn dịch từ hai loài nấm hầu
thủ (Hericium erinaceus) và nấmhương (Lentinula edodes) nuôi trồng ở Việt Nam”. Trong
khuôn khổ luận án,chúng tôi tậptrungnghiênnhữngnội dungchủ yếu sau:
1. Tách chiết một số hợp chất trao đổi thứ cấp, các polysaccharide
giàuglucan từquả thể nấm.
2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, khả năng ức chế sự hình thành khối
utrên thạchmềmcủacácchấtđã phânlập.
3. Tạo chếphẩmthửnghiệmtrênđộng vậtthựcnghiệm.
4. Đánh giá độ an toàn và hiệu lực của chế phẩm trên động vật thực
nghiệm(hoạt tính kháng u và điều biến miễn dịch, khả năng bảo vệ, phục
hồichứcnănggancủasảnphẩm)


CHƯƠNGI. TỔNGQUANTÀILIỆU
1.1. Nấmdượcliệuvà ứng dụng trongy họcdântộc

1.1.1. Giớithiệuvềnấmdượcliệu
Trong nhiều thế kỷ, nấm lớn đã được con người sử dụng làm nguồn
thứcăn và dược liệu chữa bệnh. Nấm lớn được hiểu làcó quả thể rõ ràng xuất
hiệntrên cây, trên hoặc dưới mặt đất và có thể nhìn thấy bằng mắt thường, hái
bằngtay(Chang và Miles, 1992) [28]. Nấm lớn được sử dụng trong y dược gọi
lànấmdược liệu.
Hiện nay việc nuôi trồng nấm lớn phục vụ thương mại chủ yếu là
nấmđảm (Basidiomycetes), vì nấm túi (Ascomycetes) thường khó ni trồng.
Nấmđược con người sử dụng bởi giá trị dinh dưỡng và giá trị dược học của
chúng.Nấm cung cấp ít calor và chất béo nhưng rất giầu protein, chất xơ,
vitamin vàchất khống(Crisanvà Sands,1978)[40].
Các nấm có thểăn được dùng làm thực phẩm và thực phẩm chức
năngnhư

các

loài

thuộc

chiLentinula,Hericium,Grifola,Flammulina,Pleurotus,Tremella… Một số nấm
như

linh

chi

(Ganoderrma

lucidum),

nấm

vân

chi(Trametesversicolor)chỉsửdụng làmthuốcbởi chúng có vịđắngvàrất cứng.
Hiện nay, khoảng hơn 200 loài nấm đã được thu hái và dùng cho
chữabệnh;35 lồi nấm được ni trồng cho mục đích thương mại, trong đó 20
lồiđược sản xuất ở qui mơ cơng nghiệpl à m t h ự c p h ẩ m v à d ư ợ c
l i ệ u ( C h a n g , 1999) [27]. Sản lượng nấm nuôi trồng trên thế giới năm
1994 là 4909103tấnvà tăng 6158103tấn năm 1997 với giá trị ước tính 14 tỉ
đơ la Mỹ. Sáu trong số10 lồi nấm được trồng nhiều nhất(chiếm tới 92% tổng sản lượng
nấm)
gồm:Agaricusbisporus(nấmmỡ,chiếm31.8%),Lentinusedodes(nấmhương,25,4%),
Pleurotus

spp.

(thuộc

nấm

sò,

14,2%),Auricularia


auricular(7,9%),Flammulina

velutipes(kim

volvaceae(nấm rơm,7,9%)(Chang,1999)[27].

châm,

4,6%)

vàVolvariella


Ở Việt Nam, các nghiên cứu về nấm dược liệu chủ yếu tập trung vào
kỹthuật ni trồng (Nguyễn Thị Chính, 2005 và 2011; Lê Minh Tuấn, 2009)
[2,3,11]. Nguyễn Thị Chínhcũng là một trong những nhà khoa học đầu tiên
ởViệt Nam thí điểm ni trồng nấm sị và nấm linh chi bằng phương pháp
lênmen dịch thể để sản xuất thực phẩm chức năng, nhưng không tách chiết
lấypolysaccharide hay các thành phần có hoạt tính mà dùng sản phẩm hỗn
hợp(Chính, 2005 và 2011) [2,3]. Hoạt tính chống ung thư, tăng cường sức
khỏe chobệnh nhân mắc AIDS của polysaccharide từ nấm linh chi cũng được tác giảNguyễn Thị Chính
(2005) thử nghiệm [2]. Tác giả Nguyễn Cửu Khoa cũng đãbước đầu nghiên
cứu tách chiết polysaccharide từ nấm linh chi, nấm hầu thủnuôi trồng ở Việt
Nam và xác định hoạt tính chống oxy hố của chúng [5].Nhóm nghiên cứu của
chúng tơi (đứng đầu làP G S . T S . L ê M a i H ư ơ n g ) l à những người
đi tiên phong trong nghiên cứu tách chiết các hoạt chất từ một sốnấm dược liệu
nuôi trồng tại Việt Nam và đã đạt được những thành tựu đáng kểnhưtáchchiếtvàsản
xuấtthựcphẩmchứcnăngchứaβ-glucanvàmộtsốhoạtchấttừnấmdược liệu.
1.1.2. Ứngdụng trong yhọcdântộc
Các nước châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc đã sử dụng
nấmđểp h ò n g v à c h ữ a m ộ t s ố b ệ n h , k é o d à i t u ổ i t h ọ . N h ữ n g n ă m g ầ
n đ â y , t h ị trường Mỹ đãmởcửađể đón nhận nhữngsản phẩm thuốc từ nấm
dượcl i ệ u , đặcbiệtnấmlinhchivà nấmmaitake.Năm1994thếgi ới tiêut h

ụ nấmdượcliệuvàcácsảnphẩmtừnấmvớiướctínhtới3,8tỉUSDvàtănglêntới6tỉnăm1999vớithịtrườngchính
(chiếm

tới

99%)l à

châu

Á

và

châu

Âu.

Các

s ả n phẩmquantrọngtừnấmdượcliệuthườngcónguồngốctừcácn ấ m Ganoderma
sp.,L.edodes,S.commune,Tremellafusiformis,Trametesversicolor,Grifola
frondosa,

và

gần

đây

là

từPhellinussp.

(thượng

vàHericiumerinaceus(hầu thủ)(bảng 1.1-WasservàWeis,1999)[166].

hoàng)