nghiên cứu bổ sung chitosan oligomer trong nuôi cấy mô khoai lang cao sản nhật bản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN









NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN


TÊN ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU BỔ SUNG CHITOSAN
OLIGOMER TRONG NUÔI CẤY MÔ KHOAI
LANG CAO SẢN NHẬT BẢN
(IPOMOEA BATATAS L.)





LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Buôn Ma Thuột, năm 2009
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
……………………….






NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN


TÊN ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU BỔ SUNG CHITOSAN
OLIGOMER TRONG NUÔI CẤY MÔ KHOAI
LANG CAO SẢN NHẬT BẢN
(IPOMOEA BATATAS L.)




Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC




NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN ANH DŨNG




Buôn Ma Thuột, năm 2009
i
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam ñoan: ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các
số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, ñược các
ñồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng ñược công bố trong bất kỳ
một công trình nào khác.

HỌC VIÊN


NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN

NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

ii
LỜI CẢM ƠN!

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn:

Người thầy hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Anh Dũng ñã tận tình hướng
dẫn chỉ bảo và giúp ñỡ cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận
văn.
TS. Phan Văn Tân ñã tạo ñiều kiện thuận lợi và chỉ bảo cho tôi trong
thời gian học tập và thực hiện luận văn tại bộ môn sinh học thực vật.
ThS. Nguyễn Đình Sỹ ñã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi trong
suốt thời gian thực hiện luận văn.
Tất cả các thầy cô giáo Khoa Sau ñại học, Khoa KHKT&CN Trường
Đại học Tây Nguyên.
Ban Giám Hiệu, toàn thể các anh chị và các bạn ñồng nghiệp Trường
THCS Đoàn Kết ñã luôn tạo ñiều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp ñỡ cho tôi
trong suốt thời gian công tác và học tập.
Tất cả các anh, chị và các bạn trong lớp cao học Sinh học thực nghiệm
khóa 1 ñã luôn ñộng viên và giúp ñỡ cho tôi trong suốt thời gian học tập và
thực hiện luận văn.
Chị Tuyến, em Ngọc, em Bình ở Bộ môn Sinh học thực vật ñã tạo ñiều

kiện thuận lợi, ñộng viên và nhiệt tình giúp ñỡ cho tôi trong suốt thời gian
thực hiện ñề tài này.
Cuối cùng xin gửi lòng biết ơn ñến tất cả những người thân trong gia
ñình ñã luôn ở bên cạnh ñộng viên và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi nhất ñể tôi
học tập và làm việc trong suốt thời gian qua
Xin chân thành cảm ơn!
NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN
iii
MỤC LỤC
Trang
Các chữ viết tắt i
Danh mục ảnh ii
Danh mục bảng iv
Danh mục hình v

MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tổng quan về cây khoai lang 3
1.1.1 Đặc ñiểm sinh học
3
1.1.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất cây khoai lang 7
1.1.3. Nghiên cứu ngoài nước về cây khoai lang 8
1.1.4Nghiên cứu trong nước về cây khoai lang 9
1.2. Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật 12
1.2.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 12

1.2.2 Ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô 14
1.2.3 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 15
1.2.4 Các bước nhân giống invitro 15
1.2.5. Khử trùng mẫu nuôi cấy 15

1.2.6. Mẫu cấy 17
1.2.7. Môi trường nuôi cấy tế bào thực vật 18
1.2.8. Các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật 19
1.3. Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 25
1.4 Sự phát sinh hình thái 26

1.5. Tổng quan tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam 28

iv
1.6. Tổng quan về Chitosan 29

1.6.1. Công thức cấu tạo 29
1.6.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chitosan 31
CHƯƠNG 2 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40
2.1. Nội dung nghiên cứu 40
2.2. Phương pháp nghiên cứu 40

2.2.1. Vật liệu, hóa chất 40
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu 41
2.2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các hóa chất khử trùng ñến
sức sống của mô nuôi cấy 41
2.2.2.2. Nghiên cứu thành phần môi trường ñến sự hình thành
protocorm 44
2.2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ và loại chất ñiều hòa
sinh trưởng thực vật lên sự bật chồi và tăng trưởng chồi từ ñốt
thân khoai lang in vitro 46
2.2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ và loại chất ñiều hòa
sinh trưởng thực vật lên sự tạo rễ và tăng trưởng chồi cây khoai
lang in vitro 48
2.2.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer

ñến sinh trưởng và khả năng kháng bệnh của khoai lang nuôi cấy
mô 50
2.2.2.6 Xử lý số liệu thống kê 52
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53
3.1. Ảnh hưởng của các hóa chất khử trùng ñến sức sống của chồi mầm
từ củ khoai lang
53
3.1.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl
2
ñến sức sống của
chồi mầm từ củ khoai lang
53
v
3.1.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các
nồng ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm từ củ
khoai lang 57
3.1.3 Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng
ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm từ củ
khoai lang 69
3.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường ñến hình thành protocorm
62
3.3. Ảnh hưởng của nồng ñộ, tỷ lệ chất kích thích sinh trưởng ñến hình
thành chồi và rễ cây con trong in vitro 65
3.3.1. Ảnh hưởng của N
6
- benzyladenine (BA) và Kinetin ở các
nồng ñộ và tỷ lệ khác nhau ñến sự hình thành chồi và tăng trưởng
chồi cây khoai lang 65
3.3.2. Ảnh hưởng của NAA và IBA ở các nồng ñộ và tỷ lệ khác
nhau ñến sự hình thành rễ cây khoai lang 69

3.4. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến sinh trưởng và khả
năng kháng bệnh của khoai lang nuôi cấy mô 75
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 81
KẾT LUẬN 81
ĐỀ NGHỊ 81
TÀI LIỆU THAM KHẢO 82
PHỤ LỤC





vi
CÁC CHỮ VIẾT TẮT


ABA Acid abscisic
BA N
6
– benzyladenine
cs cộng sự
CV Coefficient of Variation
GA
3
Gibberellin
MS Murashige và Skoog
NAA Napthalen acetic acid
IAA Idol – 3 – acetic acid
IBA Indol – 3 – btyric acid
TDZ Thidiazuron

JA Jasmonic acid














vii

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl
2
ở các nồng ñộ và thời gian
khác nhau ñến sức sống của chồi mầm thu nhận từ củ khoai lang sau 3
tuần nuôi cấy 55
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các nồng ñộ và
thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm thu nhận từ củ khoai
lang sau 3 tuần nuôi cấy 59
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng ñộ và

thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm thu nhận từ củ khoai
lang sau 3 tuần nuôi cấy 61
Bảng 3.4 . Ảnh hưởng của thành phần môi trường ñến hình thành protocorm
sau 40 ngày nuôi cấy 64
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của BA và Kinetin lên sự bật chồi và tăng trưởng chồi từ
ñốt thân cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy 67
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của IBA và NAA lên sự hình thành rễ từ chồi cây khoai
lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy 72
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến sinh trưởng của
khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày nuôi cấy 77







viii


DANH MỤC HÌNH
Trang

Hình 1.1 Cơ chế di chuyển hữu cực của auxin 19
Hình 1.2. Cấu trúc của auxin tự nhiên và auxin tổng hợp 19
Hình1. 3. Cấu trúc của một số dạng cytokinin 20
Hình 1.4. Cấu trúc của khung gibbane và sự chuyển ñổi GA
4
thành các GA
khác 21

Hình 1.5. Cấu trúc của ABA 22
Hình 1.6. Cấu trúc của ethylen 22
Hình 1.7. Cấu trúc của TDZ 23
Hình 1.8. Chitin (có 4-10 nghìn gốc N-acetyl-glucosamine) 31
Hình 1.9. Chitosan (có 1-4 nghìn gốc glucosamine) 31
Hình 1.10. Olygoglucosamine (có 2- vài chục gốc glucosamine) 31
Hình 1.11. Cơ chế hoạt ñộng của Chitosan 39
Hình 3.1. Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl
2
ñến sức sống của chồi mầm
từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy ở các nồng ñộ 0.1% (A), 0.3% (B),
0.5% (C) 56
Hình 3.2. Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các nồng ñộ và
thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang sau 3
tuần nuôi cấy 60
Hình 3.3. Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng ñộ và
thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang sau 3
tuần nuôi cấy 62
Hình 3.4. Số lá của cây khoai lang khi BA và Kinetin thay ñổi ở các nồng ñộ
và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy 68
ix
Hình 3.5. Chiều cao chồi của cây khoai lang khi BA và Kinetin thay ñổi ở các
nồng ñộ và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy 68
Hình 3.6. Chiều cao chồi của cây khoai lang khi IBA và NAA thay ñổi ở các
nồng ñộ và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy 72
Hình 3.7. Số rễ của cây khoai lang khi IBA và NAA thay ñổi ở các nồng ñộ
và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy 73
Hình 3.8. Ảnh hưởng của IBA và NAA lên chiều cao chồi, số rễ và chiều dài
rễ từ chồi cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy 73
Hình 3.9. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến chiều cao chồi của

khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày 78
Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến khối lượng chồi
tươi và khối lượng chồi khô của khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày.
78
1
MỞ ĐẦU
Khoai lang (Ipomoea batatas L. (Lam) là cây lương thực quan trọng ñược
trồng ở nhiều nước Châu Á, Châu Phi và Châu Mỹ la tinh. Khoai lang không
những chỉ có công dụng làm lương thực cho người, thức ăn cho gia súc mà
còn là sản phẩm của các mặt hàng công nghiệp thực phẩm. Người ta có thể
chế biến rượu, cồn, xiro từ khoai lang. Tinh bột khoai lang còn dùng trong
công nghiệp giấy và hồ sợi. Một số nước trên thế giới dùng khoai lang chế
biến axit xitoric, dextrin, lấy tinh bột dùng trong y học. Khoai lang chứa nhiều
men amilaza biến tinh bột thành ñường mạch nha nên là nguồn nguyên liệu
tốt cho công nghiệp sản xuất loại men này.
Theo thống kê 2006 của Sở Nông Nghiệp – PTNT Đăk Nông và Đăk
Lăk, khoai lang cao sản xuất khẩu ñang phát triển mạnh với diện tích ở tỉnh
Đăk Nông là 4500 ha, Đăk Lăk là trên 3000 ha. Trong thời kỳ ñầu, năng suất
khoai lang ñạt từ 20-25 tấn/ha, giá bán cho suất khẩu là 5 triệu ñồng /tấn, ñem
lại thu nhập cao cho nông dân. Tuy nhiên, sau 5 năm phát triển năng suất
khoai lang suy giảm gần 40-50%, chỉ còn 12-15 tấn/ha, làm giảm thu nhập
của người nông dân và sản suất không bền vững cả về kinh tế và môi trường.

Chitosan và chitosan oligomer là các chất hoạt hóa một số gen thực vật,
bằng cách tác ñộng trên promoter của trên 20 gen hệ thống ñề kháng của thực
vật ñể tăng cường tổng hợp enzyme chitanase, β- 1,3-glucanase, RNAse,
proteinase inhibitor, tăng cường tổng hợp lignin và kháng sinh thực vật
phytoalexin. Chính vì vậy, Chitosan và chitosan oligomer làm tăng sức ñề
kháng của cây với các tác nhân gây bệnh như nấm, vi khuẩn và virus [41].

Chitosan và chitosan oligomer làm tăng khả năng kháng bệnh rỉ sắt
(Phakopspora foiae) của ñậu tương (N.A. Dung, 2002) [30]. Suwalee (2002)
công bố phun chitosan cho ngô với nồng ñộ 100 ppm có khả năng hạn chế
70% bệnh bạc lá[64]. Ngoài ra còn nhiều công bố khẳng ñịnh khả năng kháng
2
nấm bệnh của chitosan ñối với thực vật, như kháng nấm pythium, Sclerotium,
Fusarium (Hirano, 1996 ; N.A. Dung, 2004, R.D. Park, 2002).

Chitosan oligomer còn ñược coi là nhóm ñiều hòa sinh trưởng thực vật thế
hệ mới [68]. Chitosan oligomer có tác dụng kích thích tăng trưởng, tăng hàm
lượng diệp lục, tăng số lượng nốt sần cố ñịnh ñạm và tăng năng suất của lạc
[33]. Chitosan oligomer làm tăng cường ñộ quang hợp của lúa, lạc trong thủy
canh [42]. Chitosan oligomer làm tăng chiều dài rễ, kích thước cây con trong
nuôi cấy mô [50].
Với mục ñích ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phát triển nông
nghiệp bền vững, vừa tăng năng suất cây trồng, giống không bị thoái hoá,
không sâu bệnh, giảm tỷ lệ nhiễm trong nuôi cấy mô. Chúng tôi ñề suất
nghiên cứu ñề tài: ‘‘Nghiên cứu bổ sung Chitosan oligomer trong nuôi cấy
mô khoai lang cao sản Nhật Bản (Ipomoea batatas L.).’’
Mục tiêu của ñề tài :
•
Xây dựng quy trình nhân giống khoai lang cao sản bằng công nghệ
nuôi cấy mô tế bào trong invitro.
•
Đánh giá hoạt tính kích thích tăng trưởng khi bổ sung chitosan
oligomer trong nuôi cấy mô khoai lang.

3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cây khoai lang
1.1.1 Đặc ñiểm sinh học

Vị trí phân loại:

Giới (regnum): Plantae

Ngành (division): Magnoliophyta

Lớp (class): Magnoliopsida

Bộ (ordo): Solonales
Họ(familia): Convolvulaceae
Chi (genu): Ipomoea
Loài (species): Ipomoea batatas L.

Khoai lang trên thế giới chủ yếu ñược phân bố ở các vùng nhiệt ñới,
á nhiệt ñới châu Á, châu Phi và châu Mỹ la tinh. Có nguồn gốc từ khu vực

nhiệt ñới Châu Mỹ, ñược con người trồng cách ñây khoảng 5000 năm. Nó
ñược phổ biến rất sớm trong khu vực này, bao gồm cả khu vực Cariber, ñã
ñược biết tới trước khi có sự thám hiểm của người phương tây tới Polinesia.
Ngày nay khoai lang ñược trồng khắp trong các khu vực nhiệt ñới và ôn ñới
ẩm với lượng nước ñủ ñể hỗ trợ sự phát triển của cây. Nước ta nằm trong khu
vực nhiệt ñới gió mùa, nóng, ẩm, nhiệt ñộ cao, mưa nhiều, lượng mưa phân
bố tương ñối ñều nên rất thuận lợi cho cây khoai lang sinh trưởng và phát
triển, do ñó có thể trồng quanh năm.
Khoai lang (Ipomoea batatas) là một loài cây nông nghiệp với rễ củ
lớn, chứa nhiều tinh bột, có vị ngọt, ñược gọi là củ khoai lang và nó là một
nguồn cung cấp rau củ quan trọng, ñược sử dụng trong vai trò của cả rau lẫn
lương thực. Các lá non và thân non ñược sử dụng như cũng ñược sử dụng như
4
một loại rau. Khoai lang có họ hàng xa với khoai tây (Solanum tuberosum) có
nguồn gốc Nam Mỹ.
Là cây thân thảo dạng dây leo sống lâu năm, có các lá mọc so le hình
trái tim hay lá xẻ thùy hình chân vịt, các hoa có tràng hợp và kích thước trung
bình. Rễ củ ăn ñược, hình dạng thuôn dài và thon, lớp vỏ nhẵn nhụi có màu
ñỏ, tía, nâu hay trắng, bên trong củ có màu vàng, trắng, cam, hay tím.

Khoai lang có khối lượng ñường bột (cacbonhydrat), vitamin A và năng
lượng cao hơn so với lúa mì, lúa nước, sắn. Khoai lang ñược sử dụng củ và lá
ñể làm thức ăn gia súc, chế biến bột, rượu cồn, bánh kẹo và gần ñây ñang
ñược nghiên cứu ñể làm màng phủ sinh học ( bioplastic).
Do ñặc ñiểm tính ña dạng của giống khoai lang, hơn nữa trong quá
trình trồng trọt do chọn lọc tự nhiên, chọn lọc nhân tạo nên ñã hình thành
nhiều loại hình, nhiều giống khác nhau.
Khoai lang không chịu ñược sương giá, phát triển tốt nhất ở nhiệt ñộ
trung bình khoảng 24 °C (75 °F). Khoai lang ít khi ra hoa nếu khoảng thời
gian ban ngày vượt quá 11 giờ. Chúng ñược nhân giống chủ yếu bằng các

ñoạn thân (dây khoai lang) hay rễ hoặc bằng các rễ bất ñịnh mọc ra từ các rễ
củ trong khi lưu giữ bảo quản. Trong các ñiều kiện tối ưu với 85-90 % ñộ ẩm
tương ñối ở 13-16 °C (55-61 °F), củ khoai lang có thể giữ ñược trong vòng 6
tháng. Nhiệt ñộ thấp hoặc cao hơn ñều nhanh chóng làm hỏng củ.
Khoai lang phát triển tốt trong nhiều ñiều kiện về ñất, nước và phân bón.
Nó cũng có rất ít kẻ thù tự nhiên nên thuốc trừ dịch hại là ít khi phải dùng tới.
Do nó ñược nhân giống bằng các ñoạn thân nên khoai lang là tương ñối dễ
trồng. Do thân phát triển nhanh che lấp và kìm hãm sự phát triển của cỏ dại
nên việc diệt trừ cỏ cũng tiêu tốn ít thời gian hơn. Trong khu vực nhiệt ñới,
khoai lang có thể ñể ở ngoài ñồng và thu hoạch khi cần thiết còn tại khu vực
ôn ñới thì nó thường ñược thu hoạch trước khi sương giá bắt ñầu. Khoai lang
5
có khả năng thích ứng với nhiều loại ñất khác nhau, nhưng sinh trưởng tốt
nhất trên các loại ñất thoáng khí như ñất thịt nhẹ và ñất pha cát. Thời gian
sinh trưởng của cây khoai lang ngắn ngày nhưng lại cho năng suất cao, do ñó
cần phải bón nhiều phân và ñủ dạng cần thiết. Vì vậy, nói chung ñiều kiện
khí hậu, thời tiết ở nước ta cho phép trồng khoai lang quanh năm, nhưng cũng
cần lưu ý tới những ñặc ñiểm riêng của từng vùng khí hậu khác nhau ñể bố trí
thời vụ cho thích hợp.

6

Ảnh 1.1. Cánh ñồng trồng khoai lang
Ảnh 1.2. Củ khoai lang cao sản Nhật Bản (Benniazuma)
7
1.1.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất cây khoai lang
+ Kỹ thuật nhân giống thông thường:
Khoai lang ñược nhân giống vô tính bằng chồi củ giống và hom giống
của dây sau khi thu hoạch củ từ vụ trước. Ngoài các yếu tố về ñất ñai, thời vụ,
phân bón, kỹ thuật canh tác, ñặc ñiểm giống thì ñộ dài và chất lượng hom
giống và cách trồng ảnh hưởng rất lớn ñến năng suất củ.
Ở Malaysia, người ta trồng hom 6 mắt với ñộ sâu 2 mắt.
Ở Georgia thường trồng hom khoai lang dài 30 – 40cm với 2 – 3 mắt
dưới ñất cho năng suất cao hơn hom giống ngắn 20 – 25cm.
Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau Châu Á (AVRDC) khuyến cáo
trồng hom giống dài 30cm với 3 mắt dưới ñất.
Ở Trung Quốc, hom giống 7 mắt ñược sử dụng phổ biến trong sản
xuất.
Ở Việt Nam, phần lớn các qui trình hướng dẫn ñều cho rằng: hom
giống cắt dài 25 – 30cm ở ñoạn 1 và ñoạn 2 của những dây mập mạnh không
sâu bệnh. Trồng nông nối liền theo chiều dọc luống, mỗi mét dài trồng 5 hom
với khoảng cách từ 18 – 22cm, lấp ñất sâu 5 – 6cm.

Công ty thực phẩm Đà Lạt – Nhật Bản (DJF), ñơn vị trực tiếp nhập
giống và thu mua khoai lang nhật ñã hướng dẫn cách trồng khoai lang nhật
như sau: trồng cây cách cây 25cm, hàng cách hàng 1m, mật ñộ 25000 cây/ha.
Hom ñược cắt xong ñem về rãi nơi thoáng mát từ 1 ñến 2 ngày trước khi
trồng sẽ giúp hom nhanh ra rễ, nảy chồi hơn.
Theo kinh nghiệm trồng khoai lang giống Nhật Bản ở xã Đăc Bup So,

huyện Tuy Đức, tỉnh ĐăkNông thì trước hết là cách ñặt giống, bao giờ cũng
lấp ñất phủ hết, chỉ ñể ngọn nhô lên 3 -5cm, nếu ñể ngọn nhô lên quá cao thì
hom dễ bị táp nắng và dễ bị sâu ñục thân dẫn ñến suy dinh dưỡng.
8
Tuy nhiên, phương pháp này tốn công, vườn ươm lớn và phụ thuộc vào
ñiều kiện bảo quản, cây thiếu sức ñề kháng với virus gây bệnh. Vì vậy ñể sản
xuất ra khối lượng lớn cây giống sạch bệnh có thể mong chờ ở nuôi cấy mô.
Trên thế giới và trong nước ñã có những báo cáo về nghiên cứu tái sinh cây
khoai lang in vitro qua con ñường phát sinh phôi soma và con ñường phát
sinh cơ quan.
1.1.3. Nghiên cứu ngoài nước về cây khoai lang
Để tạo giống cho năng suất cao, phẩm chất tốt, sạch bệnh, trên thế giới
ñã nghiên cứu nhân giống khoai lang bằng kỹ thuật nuôi cấy mô. Tuy nhiên
những nghiên cứu về nuôi cấy mô khoai lang trên thế giới còn r
ất hạn chế.
Hwang, Robert (1983) nghiên cứu nuôi cấy mô khoai lang bằng kỹ
thuật nuôi cấy mô rễ sử dụng môi trường MS với nồng ñộ khoáng và inositol
cao. Sử dụng chóp ngọn, chồi nách, mẩu lá hoặc mẩu cuống lá non. Được
ñem khử trùng bề mặt bằng Clorox 10% (0,52% NaOCl), rửa nhẹ 2 lần với
nước cất [49].

Kuo, Shen (1985) nghiên cứu nhân giống khoai lang sạch virus sử
dụng mô lá và ñỉnh sinh trưởng. Mẫu mô nuôi cấy ñược kiểm tra virus bằng
kỹ thuật ELISA[24].
Daniel (1993) ñã xây dựng hệ thống nhân giống cho những loài có sinh
khối lớn như cây khoai lang bằng phương pháp tạo phôi soma từ ñỉnh ngọn 1-
2 lá mầm trên môi trường có bổ sung 2,4D cho thấy sự hình thành phôi khi
cấy chuyền phôi calli hoặc khối tế bào sang môi trường có 2,4 D mới và phôi
có lá mầm có khả năng hình thành cây mới [28].
Makoto (1993) ñã nghiên cứu sự hình thành củ khoai lang in vitro từ

mô rễ cây khoai lang in vitro. Sau 6-7 nuôi cấy ñường kính của rễ lớn nhất
lớn hơn 2mm dưới tác dụng của chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật JA trong
9
môi trường ñặc và BA trong môi trường lỏng, phần rễ phình to ra có màu ñỏ,
màu tự nhiên của cây trồng này[53].
Podobo (1995) nghiên cứu nhân giống khoai lang từ lá theo quy trình
gồm 2 bước: nuôi cấy mô lá trên môi trường MS và sau ñó chuyển sang môi
trường MS bổ sung zeatin riboside. Kết quả cho thấy rằng mô lá của các
giống khoai lang ñược cấy trên môi trường MS có bổ sung 0,2mg/l
-1
2,4 D thì
có 19/27 giống có biểu hiện sự tái sinh chồi, 8 giống không có phản ứng.
Trong ñó, giống có tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất là PI 318846-3 (78,6%) và khi
chuyển sang môi trường MS bổ sung 0.2mg/l
-1
zeatin riboside thì giống này
cũng có tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất (33,3%).[20]
Isabirye (2007) nghiên cứu sự thoái hóa của ñất trồng sắn và khoai lang
ở những khu vực nghèo, ñầu tư thấp ở Uganda. Các tác giả ước tính lượng
dinh dưỡng mất ñi cho 1 ha khoai lang là 45 kg N/ha/năm, 8 kg P/ha/năm và
55 kg K/ha/năm[51]. Ankumah (2003) nghiên cứu hiệu quả của bón N ñến
năng suất và hiệu quả sử dụng N của 4 giống khoai lang [37]. Ở Việt Nam,
Viện cây lương thực ñưa ra qui trình thâm canh các giống khoai lang cao sản
là 20 tấn phân hữu cơ, 120 kg N, 900 kg super lân, 450 kg Kali[58].
1.1.4 Nghiên cứu trong nước về cây khoai lang
Khoai lang là cây lương thực ngắn ngày quan trọng của Việt Nam,
là cây trồng lấy củ có thời gian sinh trưởng ngắn khoảng 90 – 110 ngày, chịu
hạn, chịu ñất xấu, ñầu tư thấp, ít chăm sóc, ít sâu bệnh, nên ñược nông dân ưa
trồng. Với các giống cao sản, thâm canh chăm sóc tốt, khoai lang có thể cho
năng suất cao 20 – 25 tấn/ha và tiềm năng năng suất của khoai lang có thể ñạt

40 – 50 tấn/ha. Vì vậy cây khoai lang là cây xóa ñói giảm nghèo cho nhiều
nông dân ở nhiều ñịa phương, trong ñó có Tây Nguyên trong những năm gần
ñây.
10
Theo thống kê của FAO (2007) của Việt Nam năm 2005 là 205.000 ha
với năng suất là 7,56 tấn/ha và sản lượng ñạt trên 1,5 tấn. Theo ñánh giá của
FAO, năng suất trung bình khoai lang của nước ta khá thấp bởi nhiều nguyên
nhân [39]:
- Do chưa có cơ cấu giống khoai lang tốt, có năng suất cao, chịu thâm canh và
phù hợp với từng vùng.

- Giống sau nhiều năm trồng bị thoái hóa.
- Nông dân có tâm lý trồng khoai không ñầu t
ư thâm canh.
Đăk Nông là tỉnh ñi ñầu trong trồng và xuất khẩu khoai lang cao sản
Nhật Bản. Từ năm 2004, Sau khi giống khoai lang nhật bản (Benniazuma)
ñược du nhập vào ñịa bàn tỉnh Đăk Nông ñến nay, diện tích gieo trồng khoai
lang của tỉnh Đăk Nông ngày càng ñược mở rộng. Tổng diện tích khoai lang
năm 2004 là 1,917 ha, sản lượng 9,251 tấn, năm 2005 là 2,333 ha, sản lượng
21,668 tấn (khoai lang Nhật Bản Benniazuma chiếm 80% diện tích và sản
lượng).

Năm 2006 ước thực hiện ñược 4.138 ha, sản lượng 42,795 tấn. Trong
ñó tập trung chủ yếu ở các huyện (huyện Đăk Song diện tích: 2,933 ha, sản
lượng: 30,994 tấn; huyện Đăk R’Lấp diện tích: 706 ha, sản lượng: 7,296 tấn;
huyệnKrông Nô diện tích: 127 ha, sản lượng: 1,365 tấn) khoai lang nhật bản
Benniazuma chiếm 95% diện tích và sản lượng.

Khác với cây khoai lang truyền thống, sản phẩm chỉ phục vụ nhu cầu
nội ñịa và làm thức ăn gia súc. Cây khoai lang Nhật Bản (Benniazuma) là cây

hàng hóa ñem lại hiệu quả kinh tế cao. Nếu ñầu tư thâm canh trên một ñơn vị
diện tích có thể ñạt ñược (vụ hè thu: 32.000.000ñ/ha; vụ thu ñông:
30.000.000ñ/ha và vụ ñông xuân có tưới nước: 45.000.000ñ/ha).


11
Định hướng phát triển diện tích, sản lượng cây khoai lang của Đak Nông
Hạng mục Năm 2007 Năm 2008 Năm 2009 Năm 2010
Diện tích (ha) 4.300 4.600 4.800 5.000
Sản lượng (tấn) 43.000 46.000 48.000 50.000

Trong những năm gần ñây, Viện Cây lương thực, Viện Khoa học Nông
nghiệp Việt Nam lai tạo một số giống khoai lang có năng suất cao như KB1,
KB4 và TV1, năng suất có thể ñạt từ 20 – 25 tấn/ha. Tuy nhiên nông dân
thường tự ñể giống bằng dây hoặc củ trong nhiều năm liền, giống bị thoái hóa
và tích lũy nhiều bệnh cho vụ sau. Do ñó, giống tốt, sạch bệnh là yếu tố quyết
ñịnh ñể cho năng suất cao, phẩm chất tốt và hiệu quả canh tác khoai lang.

Nguyễn Du Sanh, Nguyễn Thanh Dũng(2004) ñã nghiên cứu các thay ñổi
về cấu trúc và sinh lý trong quá trình tạo củ ở cây khoai lang từ các ñoạn thân
dài 30 – 40cm trên hai giống trồng Hưng Lộc (HL4) và giống ñịa phương
(Gạo) làm cơ sở cho việc tăng năng suất của các cây trồng lấy củ [13].

Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Nguyễn Quang Thạch
(2004) ñã xây dựng ñược qui trình tái sinh in vitro một số giống khoai lang
Việt Nam ( giống Chiêm Dâu, Nông nghiệp 31 và Lim)[2].

Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2005) ñã nghiên cứu tái sinh in
vitro các giống khoai lang Keganesengan, Kokei 14 và Satsuma Hikari từ
mô lá qua kiểu tái sinh chồi bất ñịnh và tái sinh theo con ñường sinh phôi

soma qua nuôi cấy tạo mô sẹo từ ñỉnh sinh trưởng. Khoảng 1 tuần ñến 1 tháng
thấy một số chồi tái sinh từ mô sẹo, xuất hiện thường ở vùng gân chính vị trí
gốc lá. Ngoài ra, tác giả còn nhận thấy hệ rễ trên môi trường MS không chất
sinh trưởng sau 3 ñến 4 tuần nuôi cấy ñã tái sinh chồi trên một số rễ to, ñôi
khi hình thành từ rễ nhỏ [5].

12
1.2. Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật


Tế bào thực vật có tính toàn thế (totipotency), tế bào ñơn hoặc protoplast
thực vật ñều có khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh. Đây là ñiều kiện quan trọng
ñể ứng dụng trong nuôi cấy mô thực vật. Sự phát sinh hình thái
(morphogenesis) hoặc khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh từ một tế bào, một
cụm tế bào (mô sẹo), một mảnh lá, ñã ñược thực hiện trên hàng trăm loài thực
vật, hầu hết tập trung vào các cây trồng quan trọng.

Ý tưởng nuôi cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể, trong ống nghiệm (in
vitro) ñã ñược Haberlandt thử nghiệm từ năm 1902 nhưng do ông ñã sử dụng
các tế bào của cây một lá mầm nên ñã thất bại. Năm 1919, A. Carrel nuôi cấy
thành công mô ñộng vật, nhưng cho ñến năm 1934 mô thực vật mới ñược
nuôi cấy.
Năm 1934, White ñã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn
của các tế bào rễ cà chua ñược nuôi cấy mô.


Năm 1941, Van Overbeck ñã chứng minh tác dụng tốt của nước dừa trong
nuôi cấy phôi cây họ cà. Sau ñó Steward và Milles (1952) cũng xác nhận tầm

quan trọng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo và phát sinh phôi ở cà rốt.

Năm 1951, Skoog và Miler phát hiện ra các hợp chất có khả năng ñiều
khiển sự nhân chồi.


Năm 1954, Skoog phát hiện chế phẩm thủy phân của tinh dịch cá bẹ có tác
dụng kích thích sinh trưởng rất rõ rệt trong nuôi cấy các mảnh mô thân cây
thuốc lá.
Năm 1957, Skoog và Miller ñã chứng minh sự biệt hóa của rễ, chồi trong
nghiên cứu nuôi cấy mô tủy thuốc lá phụ thuộc vào nồng ñộ tương ñối của
auxin/cytokinin và từ ñó ñưa ra quan niệm ñiều khiển hoocmon trong quá
trình hình thành cơ quan ở thực vật.


13
Năm 1962, Murashige và Skoog ñã thành công trong việc cải tiến môi
trường nuôi cấy, ñánh dấu một bước tiến quan trọng trong kĩ thuật nuôi cấy
mô. Môi trường của họ ñã ñược dùng làm môi trường cơ bản cho việc nuôi
cấy nhiều loại cây và cho ñến nay vẫn còn ñược sử dụng rộng rãi.

Năm 1960-1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi
cấy ñỉnh sinh trưởng và lan là cây nuôi cấy mô ñầu tiên ñược thương mại hóa.
Từ ñó ñến nay nhiều loại cây khác nhau ñã ñược nuôi cấy thành công và
ñưa vào thương mại hóa.

Năm 1964, Ball là người ñầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi
ngọn. Ông ñã thành công trong việc chuyển mô nuôi cấy thành cây con ở cây
sen cạn và cây White lupin từ môi trường nuôi cấy tối thiểu.

Năm 1966, Guha và cộng sự ñã tạo ñược cây ñơn bội từ nuôi cấy túi phấn
của cây cà ñộc dược (Datura inoxia).


Năm 1978, Melchers và cộng sự ñã lai tạo thành công protoplast của cà
chua với protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai xa ở
thực vật. Tuy nhiên, việc nhân giống cây in vitro vẫn chưa hoàn thiện. Sau ñó,
nhiều nhà nghiên cứu ñã khám phá ra những thành phần quan trọng, cần thiết
cho sự phát triển của tế bào ñược nuôi cấy [19].


Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong
nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học, nông
nghiệp và y dược học
Ngày nay phương pháp nuôi cấy mô thực vật ñã hướng về những ứng
dụng thực tiễn, vì nó liên hệ mật thiết với cây trồng. Nhờ tiến bộ của khoa học
kỹ thuật ở những ngành có liên quan, ngành nuôi cấy mô thực vật ñã ñược
trang bị hiện ñại và trở nên quan trọng trong nghiên cứu khoa học và thực tiễn
sản suất. Các nhà thực vật học ñã áp dụng phương pháp này với mục ñích sau:
14
- Đối với lĩnh vực cải tiến cây trồng: Vi nhân giống; lập thư viện DNA;
bảo tồn in vitro; tạo các biến dị soma; lai tế bào soma; chọn giống
chống chịu sâu bệnh; lai xa…
- Đối với nghiên cứu di truyền học:
• Tạo ra một quần thể lớn và ñồng nhất trong một thời gian ngắn, vẫn
giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ.
• Tạo các giống mới có năng suất và phẩm chất cao bằng phương
pháp chuyển gen.
• Tạo ñược nhiều cây con từ mô và cơ quan của cây (thân, phiến lá,
hoa, hạt phấn,…) mà ngoài thiên nhiên không thực hiện ñược.

• Làm sạch nguồn virus cho cây bằng cách lấy mô phân sinh ngọn.

1.2.2 Ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô

Phương pháp nuôi cấy mô thực vật ñã ñược ứng dụng vào các mục ñích
sau:

•
Tạo quần thể lớn và ñồng nhất về di truyền trong khoảng thời gian
ngắn, với diện tích và không gian nhỏ trong phòng thí nghiệm, có thể
kiểm soát ñược các ñiều kiện lý hóa ảnh hưởng ñến sinh trưởng của
cây.
•
Tạo ñược nhiều cây con từ các mô và cơ quan của cây (lóng, thân,
phiến lá, hoa, hạt phấn, noãn, chồi, phát hoa) mà ngoài tự nhiên không
thực hiên ñược.
•
Làm sạch nguồn virus gây bệnh cho cây bằng cách nuôi cấy ñỉnh sinh
trưởng.
•
Cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh học và nhân nhanh
các giống chọn ñược.