LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG NUÔI CẤY MÔ SẸO CÂY KIM NGÂN (Lonicera japonica Thunb.)

Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
MỤC LỤC
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1
1.1.Đặt vấn đề 1
1.2.Mục đích và nội dung nghiên cứu 1
1.2.1.Mục đích 1
1.2.2.Nội dung nghiên cứu 1
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
2.1.Khái niệm chung về các hợp chất tự nhiên 2
2.1.1.Khái niệm 2
2.1.2.Phân loại 2
2.2.Khái niệm chung về Thin layer chromatography (TLC) 14
2.2.1.Tổng quát về TLC 14
2.3.Nuôi cấy mô tế bào thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp 22
2.3.1.Khái niệm 22
2.3.2.Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật 23
2.3.3.Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh
học 27
Bảng 2.2 Các hợp chất thứ cấp đã được sản xuất từ nuôi cấy mô và tế bào thực vật
(Mulbagal and Tsay 2004) 30
2.4.Giới thiệu chung về Kim ngân hoa 33
2.4.1.Mô tả cây 33
2.4.2.Phân bố, thu hái và chế biến 34
2.4.3.Thành phần hóa học 34
2.4.4.Tác dụng dược lý 35
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 37
3.1.Thời gian và địa điểm thí nghiệm 37
3.2.Vật liệu 37
3.2.1.Đối tượng nghiên cứu 37
3.2.2.Trang thiết bị và dụng cụ 38
3.2.3.Các loại hóa chất sử dụng 38

3.3.Phương pháp thí nghiệm 38
i
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
3.3.1.Thí nghiệm 1:cảm ứng tạo mô sẹo 38
3.3.1.1.Khử trùng mẫu lá 38
3.3.1.2.Cảm ứng tạo mô sẹo 39
3.3.2.Chuẩn bị mẫu 39
3.3.3.Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và saponin triterpenoid
trong cây Kim ngân bằng phương pháp thử nghiệm sinh hóa 40
3.3.4.Thí nghiệm 3: khảo sát thành phần flavonoid và saponin triterpenoid
bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 40
3.3.5.Thí nghiệm 4: khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Kim
ngân 42
3.3.5.1.Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân bằng
phương pháp khuếch tán qua vòng giấy lọc 42
3.3.5.2.Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán qua
giếng thạch 43
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45
4.1.Thí nghiệm 1: cảm ứng mô sẹo 45
4.2. Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và sapoin triterpenoid
bằng phương pháp trắc nghiệm sinh hóa 48
4.2.1.Khảo sát sự hiện diện của flavonoid 48
4.2.1.1.Tác dụng với H2SO4 đậm đặc 48
4.2.1.2.Tác dụng với FeCl3 5% trong ethanol 49
4.2.1.3.Phản ứng Cyanidin của Wilstatter 50
4.2.1.4.Kết luận sơ bộ 52
4.2.2.Khảo sát sự hiện diện của triterpenoid saponin bằng phản ứng
Liebermann-Burchard 53
4.3.Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và saponin triterpenoid
bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 55

4.3.1.Khảo sát sự hiện diện flavonoid 55
4.3.2.Khảo sát sự hiện diện triterpenoid 58
4.4. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân 61
ii
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
4.4.1.Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân bằng
phương pháp khuếch tán qua vòng giấy lọc 61
4.4.2.Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán qua
giếng thạch 62
4.4.2.1.Đối với E.coli 63
4.4.2.2.Đối với Samonela 64
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66
5.1.Kết luận 66
5.2. Kiến nghị 67
CHƯƠNG 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 68
ii
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp đã tạo ra
một bước tiến xa trong khoa học thực vật. Việc phát triển và sử dụng các công cụ di
truyền cũng như sự hiểu biết ngày càng sâu sắc hơn về bản chất của tế bào và các
phương thức điều hòa quá trình chuyển hóa trao đổi chất là cơ sở cho việc sản xuất
chúng ở quy mô thương mại.
Do nhu cầu sử dụng các sản phẩm tự nhiên trong y dược ngày càng tăng
nhưng sản lượng của chúng ở cây trồng tự nhiên lại rất thấp đã thúc đẩy sự phát triển
không ngừng của công nghệ nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn. Tuy nhiên, các con đường
sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn trong thực vật cũng như trong nuôi
cấy tế bào ở quy mô lớn là rất phức tạp. Vì vậy, các thông tin ở mức độ tế bào và
phân tử của các quá trình chuyển hóa là rất cần thiết cho sự phát triển của sản xuất

công nghiệp. Nhiều nghiên cứu được đã thực hiện ở các điều kiện khác nhau để giải
thích các hiện tượng xuất hiện trong quá trình sản xuất các chất trao đổi thứ cấp từ
các tế bào thực vật nuôi cấy in vitro. Các kết quả này cũng cho thấy các hệ thống
nuôi cấy tế bào thực vật có tiềm năng rất lớn cho việc khai thác thương mại các chất
trao đổi thứ cấp.
1.2. Mục đích và nội dung nghiên cứu
1.2.1. Mục đích
Bước đầu khảo sát một vài hợp chất có hoạt tính sinh học có trong mẫu mô
sẹo, hoa, cành lá của Kim ngân hoa và thử hoạt tính của chúng lên hai chủng vi
khuẩn E.coli và Samonella. Từ đó tạo tiền đề cho những nghiên cứu tách chiết và
phân lập các chất có giá trị dược lý trong mô sẹo, hoa, cành lá Kim ngân làm nguyên
liệu phục vụ cho nghành công nghiệp dược.
1.2.2. Nội dung nghiên cứu
1
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
Bước đầu khảo sát hai hợp chất có hoạt tính sinh học được biết nhiều trong
Kim ngân hoa là saponin triterpenoid và flavonoid bằng hai phương pháp: trắc
nghiệm sinh hóa và sắc ký lớp mỏng (TLC).
Thử hoạt tính dịch chiết của mô sẹo, hoa đối với hai chủng vi khuẩn E.coli và
Samonella.
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái niệm chung về các hợp chất tự nhiên
2.1.1. Khái niệm
Hợp chất tự nhiên, là chất biến dưỡng thứ cấp, có trọng lượng phân tử nhỏ,
được tạo ra bởi cơ thể của một sinh vật. Chất biến dưỡng thứ cấp có thể cần thiết
hoặc nhiều khi không cần thiết cho sự sống của sinh vật, điều này khác với những
hợp chất đại phân tử như protein, acid nucleic, polysacchride là những hợp chất căn
bản cần thiết đối với sự sống của mỗi sinh vật. (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007,
Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh).
2.1.2. Phân loại

2
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
Các chất biến dưỡng thứ cấp bao gồm nhiều loại hợp chất và được sắp xếp
thành những nhóm khác nhau. Việc phân loại các hợp chất thành một nhóm thường
không phải bởi một định nghĩa duy nhất, cũng như ranh giới của một nhóm thường
không rõ ràng.
2.1.2.1. Alkaloid
Alkaloid là những hợp chất có tính base yếu, do sự có mặt của nguyên tử nitơ.
Tính base của các alkaloid cũng khác nhau tùy theo sự hiện diện của các nhóm thế R
(mang các nhóm chức khác nhau) gắn trên nguyên tử nito.
Các alkaloid chia thành ba loại:
 Alkaloid thật: là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính base,
thường được sinh tổng hợp từ amino acid, phân bố giới hạn trong thực vật và
hiện diện trong cây dưới dạng muối của một acid hữu cơ.
 Protoalkaloid được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cả mescalin
và N, N–dimetyltryptamin. Chúng là những amin đơn giản, được tổng hợp từ
các amino acid, trong đó nguyên tử nitơ không ở trong vòng dị hoàn.
 Giả alkaloid là những hợp chất không bắt nguồn từ những amino acid, bao
gồm hai nhóm hợp chất lớn là alkaloid steroid và alkaloid terpenoid.
2.1.2.2. Flavonoid
 Khái niệm
Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật. Hơn một nữa
rau quả thường dùng có chứa flavonoid. Flavonoid cũng là thành phần hay gặp trong
dược liệu có nguồn gốc từ thực vật. Cho đến nay có khoảng 4.000 chất đã được xác
định cấu trúc. Chỉ riêng 2 nhóm flavon và flavonol và với nhóm thế là -OH và / hoặc
-OCH
3
thì theo lý thuyết có thể gặp 38.627 chất. Phần lớn các chất flavonoid có màu
vàng (flavonoid do từ flavus có nghĩa là màu vàng). Tuy nhiên một số có màu xanh,
tím, đỏ, một số khác lại không có màu cũng thuộc nhóm flavonoid. Trong thực vật

cũng có một số nhóm hợp chất khác không thuộc flavonoid nhưng lại có màu vàng
như carotenoid, anthranoid, xanthon.
 Cấu trúc hóa học
Người ta xếp vào nhóm flavonoid những chất có cấu tạo khung theo kiểu C
6
–
C
3
–C
6
hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau
qua một mạch 3 carbon.
3
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
Hình 2.1: khung cơ bản của flavonoid
Người ta xem cấu trúc này gồm hai phần (được theo dõi bằng chất đồng vị):
+ C
6
– C
3
(tức là vòng B + 3C) phần này xuất phát từ acid shikimic dẫn
đến các dẫn chất phenylpropanoid
Hình 2.2: sơ đồ hình thành phenylpropanoid
+ C
6
hay là (vòng A) xuất phát từ 3 đơn vị acetat dẫn đến acid triacetic.
Sau đó 2 phần được ghép lại tạo thành chalcone
4
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
Hình 2.3: cấu tạo cơ bản của chalcone

Phần lớn các flavonoid có thể xem là các dẫn chất có gốc phenyl của các nhân
trên. Đánh số thứ tự bắt đầu từ dị vòng, số 1 từ dị tố oxy rồi tiếp đến vòng A, vòng B
đánh số phụ. Trường hợp không có vòng C (nghĩa là mạch 3C hở) ví dụ trường hợp
chalcon thì đánh số bắt đầu từ vòng B, vòng A đánh số phụ.
Hình 2.4: cấu tạo cơ bản của flavan
 Phân loại flavonoid
Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ
oxy hóa của mạch 3C. Người ta chia ra: Euflavonoid là các flavonoid có gốc aryl ở
vị trí C – 2, isoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C – 3, neoflavonoid có gốc ary ở vị trí C
– 4. Người ta còn phân biệt biflavanoid là những flavonoid dimer, triflavonoid cấu
tạo bởi 3 monomer flavonoid, flavolignan là những flavonoid mà phân tử có một
phần cấu trúc ligan.
 Euflavonoid: bao gồm các nhóm: anthocyanidin, flavan, flavan 3–ol flavan 4–
ol, 3,4–diol, flavanon, 3–hydroxy flavanon, flavon, flavonol, dihydrochalcon,
chalcon, auron.
 Isoflavonoid: bao gồm nhiều nhóm khác nhau: isoflavan, isoflav-3–ene,
isoflavan – 4 –ol, isoflavanon, isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3–
arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon, dihyroisochalcon,
homoisoflavon. Isoflavonoid thường gặp trong họ Đậu – Fabaceac.
5
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
 Neoflavonoid chỉ có giới hạn trong một số loài thực vật, bao gồm: 4–
arylchrroman, 4–arylcoumarin, dalbergion.
 Biflavonoid và triflavonoid: những flavonoid dimer và trimer. Những hợp
chất này được gọi là proanthocyanidin. Ở đây những biflavonoid tạo thành từ
flavon, flavanon, dihydroflavonol–chalcon, dihydro chalcon, auron, isoflavon.
 Sự phân bố flavnoid trong thực vật
Trong thực vật bậc thấp flavonoid ít được gặp. Trong ngành rêu chỉ phát hiện
được rất ít chất. Trong dương xỉ số lượng flavonoid ít nhưng đều có mặt các nhóm
anthocyanin, flavanon, flavon, flavonol, chalcon, dihydrochalcon.

Ngành hạt trần có khoảng 700 loài, 20 họ, số lượng flavnoid cũng không
nhiều nhưng cũng đủ các nhóm anthocyanidin, leucoanthocyanidin, flavanon, flavon,
flavonol, isoflavon. Nét đặc trưng của nghành hạt trần có khác thực vật bậc thấp và
ngành hạt kín ở chỗ sự hiện diện của nhiều dẫn chất biflavonoid.
Flavonoid tập trung chủ yếu vào ngành hạt kín ở lớp 2 lá mầm. Có rất nhiều
họ chứa flavonoid và đủ các loại flavonoid. Tuy nhiên cũng có một vài nét đặc trưng
cho một số họ ví dụ họ Asteraceae là một họ lớn với 15.000 loài, 1000 chi, có rất
nhiều dẫn xuất thuộc các nhóm khác nhau. Tuy nhiên, một số chi có nét đặc trưng
riêng của nó, ví dụ trong các chi Carthamus, Coreopsis, Cosmos, Dahlia thì hay gặp
các dẫn chất chalcon và auron. Chi Gymnosperma, Ageratum thì gặp các dẫn chất
flavon và flavonol có nhiều nhóm thế có oxy (có thể đến 8 nhóm). Họ Fabaceae thì
hay gặp các chất thuộc nhóm isoflavonoid. Họ Rutaceae thường gặp các flavon và
flavonol có nhiều nhóm methoxy. Họ Theaceae hay gặp các flavan–3–ol. Họ
Ranunculaceae và Paeoniaceae hay gặp dẫn chất flavonol 3,7 diglycosid. Họ
Rosaceae chi Rubrus và Prunus ở trong quả hay gặp anthocyanin có mạch đường
phân nhánh. Họ Polygonaceae ở chi Hydropiper hay gặp các flavon và flavonol
sulfat.
Lớp một lá mầm có 53 họ nhưng cho đến nay chỉ khoảng trên 10 họ tìm thấy
có flavonoid: Amaryllidaceae, Araceae, Cannaceae, Commelinaceae, Iridaceae,
Lemnaceae, Liliaceae, Musaceae, Oridaceae, Poaceae.
6
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
Hàm lượng và cả thành phần flavonoid trong cây phụ thuộc vào nơi mọc. Cây
mọc ở vùng nhiệt đới và núi cao thì hàm lượng cao hơn ở nơi cây thiếu ánh sáng.
Hình 2.5: sơ đồ sinh tổng hợp flavonoid
 Tính chất
Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt có khi không có màu (trường hợp
các nhóm OH đã methyl hóa), flavonol vàng nhạt đến vàng, chalcon và auron vàng
đậm, đến đỏ cam. Các chất thuộc nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanon, flavanonol,
leuco–anthocyanidin, flavan–3–ol do không có nối đôi liên hiệp giữa vòng B với

nhóm carbonyl nên không màu.
Các dẫn chất anthocyanidin thì màu thay đổi tùy theo pH của môi trường. Tuy
nhiên khi các flavonoid ở trong các bộ phận của cây thì còn phụ thuộc vào hỗn hợp
với các sắc tố khác.
Độ tan không giống nhau, thường flavonoid glycosid và flavonoid sulfat là
những hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan được
trong nước tốt nhất là cồn. Các aglycon flavonoid thì tan được trong dung môi hữu
7
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
cơ, không tan trong nước. Các dẫn chất flavnoid có nhóm 7–hydroxy thường đễ tan
trong dung dịch kiềm loãng.
 Tác dụng sinh học của flavonoid
Các dẫn chất flavonoid có khả năng loại bỏ các gốc tự do như -HO, -ROO.
Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh DNA thì
sẽ gây ra những ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư,
tăng nhanh sự lão hóa. Thí nghiệm cho thấy khả năng ức chế của một số flavonoid
theo thứ tự: myriceum > quercetin > rhammetin > morin > diosmetin > naringenin >
apigenis > catechin > 5,7 dihydroxy–3’, 4’, 5’ trimethoxy flavon > robinin >
kaempferol > flavon.
Flavonoid tạo được phức với các ion kim loại mà chính các ion kim loại này
là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hóa. Các flavonoid có 3, 5, 3’, 4’ hydroxyl có khả
năng liên kết tốt với các ion kim loại đó theo phức oxychromon, oxycarbonxyl hoặc
3’, 4’ orthodioxyphenol.
Thành phần của màng tế bào có các hoạt chất lipid dễ bị peroxyde hóa, tạo ra
những sản phẩm làm rối loạn sự trao đổi chất cũng như đến sự hủy hoải tế bào. Đua
các chất chống oxy hóa như flavonoid vào cơ thể để bảo vệ tế bào thì có ngăn ngừa
các nguy cơ như xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, tổn thương do bức xạ,
thoái hóa gan…
Flavonoid cùng với acid ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động của
enzyme oxy hóa – khử. Flavonoid còn ức chế tác động của hyaluronidase. Enzyme

này làm tăng tính thấm của mao mạch. Khi enzyme này thừa thì gây hiện tượng xuất
huyết dưới da mà y học gọi là bệnh thiếu vitamin P. Các chế phẩm chứa flavonoid
chiết từ các loài Citrus như “Cemaflavone”, “Circularine”,… flavonoid từ lá bạc hà
(diosmin) như “Daflon”, “Diosmil”, flavonoid từ hoa hòe (rutin) với nhiều biệt dược
khác nhau đã chứng minh tác dụng làm bền thành mạch, làm giảm tính “dòn” và tính
thấm của mao mạch. Tác dụng này được hợp lực cùng với acid ascorbic. Flavonoid
được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch, tĩnh mạch bị suy yếu,
giãn tĩnh mạch, trĩ, chảy máu do đặt vòng trong phụ khoa, các bệnh trong nhãn khoa
như sung huyết kết mạc, rối loạn tuần hòa võng mạc. Các dẫn chất anthocyanosid có
8
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
tác dụng tái tạo tế bào võng mạc và đã được chứng minh có tác dụng tăng thị lực vào
ban đêm.
Tác dụng chống độc của flavonoid thể hiện làm giảm thương tổn gan, bảo vệ
được chức năng gan khi một số chất độc được đua vào cơ thể sinh vật thí nghiệm
(CCl
4
, benzene, ethanol, CHCl
3
, quinine, novarsenol, ) Dưới tác dụng của flavonoid
ngưỡng ascorbic được ổn định đồng thời lượng glycogen trong gan tăng. Sự tích lũy
glycogen có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao chức năng giải độc gan.
Việc sử dụng một số dược liệu trong điều trị viêm gan, xơ gan, bảo vệ tế bào
gan rất hiệu quả như: cây actiso, có biệt dược là Chophytol. Cây Silibummarianum
Gaertn có biệt dược “Legalon”; cây bụt dấm – Hibiscus sabdariffa.
Tác dụng kích thích tiết mật thể hiện ở các chất thuộc nhóm flavanon, flavon,
flavonol, và flavan–3–ol.
Flavonoid thể hiện tác dụng chống co thắt những tổ chức cơ nhẵn (túi mật,
ống dẫn mật, phế quản và một số tổ chức khác). Ví dụ apigemin có tác dụng làm
giảm co thắt phế quản gây ra bởi histamin, acetylcholine, serotonin.

Trên bộ máy tiết niệu, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, flavonon, flavonol
thể hiện tác dụng thông tiểu rõ rệt. Scoparosid trong Sarothammus scoparius,
lespecapitosid trong Lespedeza capiata, quercitrin trong lá diếp cá, flavonoid của cây
râu mèo đều có tác dụng thông tiểu.
Tác dụng chống loét của flavanon và chalcon glycoside của rễ cam thảo đã
được ứng dụng để chữa đau dạ dày. Một số dẫn chất khác như catechin, 3–O– methyl
catechin, naringennin cũng đã được thử thấy có tác dụng chống loét.
Tác dụng chống viêm của nhiều flavonoid thuộc các nhóm flavon, flavonon,
dihydroflavonol, anthocyanin, flavan–3–ol , chalcon, isoflavon, biflavon, 4–aryl
coumarin, 4–aryl chroman đều được chứng minh bằng thực nghiệm do các chất
flavonoid này ức chế con đường sinh tổng hợp prostaglandin.
Người ta đã sử dụng rutin, citrin, leucodephinidin, quercetin, catechin để điều trị ban
đỏ, viêm da, tổn thương da và màng nhầy trong trường hợp xạ trị.
Trên hệ tim mạch, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavonol, flavan–3– ol,
anthocyanin như quercetin, rutin, myricetin, pelarrgonin, hỗn hợp catechin của trà có
9
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
tác dụng làm tăng biên độ co bóp và tăng thể tích của tim, thí nghiệm làm hồi phục
tim khi bị ngộ độc bởi CHCl
3
, quinin, methanol, bình thường lại sự rối loạn nhịp.
Cao chiết từ lá cây bạch quả (Ginko biloba) chứa các dẫn xuất 3–rutinosid của
kaempferol, quercetin và isorhammetin (trong lá già đã vàng thì chứa ginkgetin và
isoginkgetin) đã được một số hãng của Pháp bào chế thành biệt dược ví dụ
“Ginkogink”, “Tanakan” có tác dụng tăng tuần hoàn máu trong động mạch, tĩnh
mạch và mao mạch. Thuốc dùng cho những người có biểu hiện lão suy: rối loạn trí
nhớ, khả năng làm việc trí óc sút kém, mất tập trung tư tưởng, hay cáu gắt.
Trên hệ thần kinh, một số C– lavon glycoside của hạt táo – Ziziphus vulgaris
var. spinosus (chứa spinosin, swertisin và các dẫn chất acyl của spinosin) có tác dụng
an thần rõ rệt.

Một số tài liệu gần đây có nói đến tác dụng chống ung thư của một số chất
như leucocyanidin, leucopelargonidin, leucodelphinidin và tác dụng kháng HIV của
một số dẫn xuất thuộc nhóm flavon như chrysin, acacetin 7–O–β–D–
galactopyranosid.
Các dẫn xuất thuộc nhóm isoflavonoid có tác dụng tương tự estrogen ví dụ
như genistein daizein. Tác dụng này được giải thích do sự gần nhau về cấu trúc với
diethylstiboestrol.
Một số flavonoid khác thuộc nhóm rotenoid như chất rotenon có trong dây
mật – Deris ellptica Benth thì tác dụng diệt côn trùng đã được biết và đã được ứng
dụng từ lâu.
2.1.2.3. Saponin
 Định nghĩa
Saponin còn gọi là saponosid do chữ latin sapo = xà phòng, là một nhóm
glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Người ta cũng phân lập được saponin trong
động vật như hải sâm, cá sao.
Saponin có một số tính chất đặc biệt:
- Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ
hóa và tẩy sạch.
- Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng.
- Độc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm
mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm
như giun, sán, ốc sên.
10
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu cao
gây nôn mửa, đi lỏng.
- Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3– β–hydroxysteroid khác.
Tuy vậy một vài tính chất trên không thể hiện ở một vài saponin. Ví dụ:
sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức với cholesterol.
Saponin đa số có vị đắng trừ một số như glycyrrhizin có trong cam thảo bắc,

abrusosid trong cam thảo dây, oslandin trong cây Polypodium vulgare có vị ngọt.
Saponin tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan do đó người
ta dùng ba dung môi này để tủa saponin. Saponin có thể bị tủa bởi chì acetate,
barihydroxyd, ammoni sulfate. Saponin khó bị thẩm tích, người ta dựa vào tính chất
này để tinh chế saponin trong quá trình chiết xuất. Phần genin tức là sapogenin và
dẫn xuất acetyl sapogenin thường dễ kết tinh hơn saponin.
Saponin triterpenoid thì có loại trung tính và loại acid, saponin steroid thì có
loại trung tính và loại kiềm. Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hóa học có thể chia
ra: saponin triterpenoid và saponin steroid.
 Cấu trúc hóa học
 Saponin triterpenoid
Phần genin của loại này có 30 carbon cấu tạo bởi 6 nhóm hemiterpen. Người
ta chia àm 2 loại:
+ Saponin triterpenoid pentacyclic: chia ra làm các nhóm: olean, ursan, lupan.
Hình 2.6: (1) olean, (2) ursan
+ Saponin triterpenoid tetracyclic: có 3 nhóm chính: dammaran, lanostan,
cucurbitan.
11
(1) (2)
(3)
(4)
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
Hình 2.7: (3) dammaran, (4) lanostan
 Saponin steroid
+ Nhóm spirostan
Hình 2.8: spirostan
+ Nhóm furostan
Hình 2.9: furostan
+ Nhóm spirosolan
Hình 2.10: spirosolan

 Công dụng
- Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho. Saponin là hoạt chất chính trong các
dược liệu chữa ho như viễn chí, cát cánh, cam thảo, thiên môn, mạch môn,…
- Một số dược liệu chưa saponin có tác dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải,
thiên môn, mạch môn,…
- Saponin có mặt trong một số vị thuốc bổ như nhân sâm, tam thất và một số
cây thuộc họ nhân sâm khác.
- Saponin làm tăng sự thấm của tế bào: sự có mặt của saponin sẽ làm cho các
hoạt chất khác dễ hòa tan và hấp thu.
- Một số saponin có tác dụng chống viêm. Một số có tác dụng kháng khuẩn,
kháng nấm, ức chế virus.
- Một số có tác dụng chống ung thư.
- Nhiều saponin có tác dụng diệt các loài thân mềm (nhuyễn thể).
 Sự phân bố trong thực vật
12
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
Saponin steroid thường gặp trong những cây một lá mầm. Các họ thường gặp
là: Amaryllidaceae, Dioscoreaceae, Liliaceae, Smilacaceae.
Saponin triterpenoid thường gặp trong những cây 2 lá mầm thuộc các họ như:
Acanthaceae, Amaranthaceae, Araliaceae, Campnulaceae, Caryophyllaceae,
Fabaceae, Polygalaceae, Rubiaceae, Sapindaceae, Sapotaceae,…
Trong cây saponin thường tích lũy ở những bộ phận khác nhau: tích lũy ở quả
bồ kết, bồ hòn; rễ cam thảo, viễn chí, cát cánh; lá như dứa Mỹ.
2.1.2.4. Hợp chất glycoside
Các glycoside hiện diện trong rất nhiều họ thực vật và ở tất cả các bộ phận
cây: lá, vỏ, hạt, …Các glycoside thường là chất kết tinh và có vị đắng.
Glycoside là hợp chất mà cấu trúc hóa học gồm có hai phần: phần đuờng và
phần không đường thường được gọi là aglycon. Dưới tác dụng của enzyme thực vật
hoặc dung dịch acid hoặc kiềm, glycosid bị thủy phân thành aglycon và phần đường:
+ Phần đường của glycosid: phần đường phổ biến là D–glucose, D–galactose,

L–arabinose, L–rhamnose, D–xylose, acid glucuronic, acid galacturonic và
một số đường khác.
+ Phần aglycon của glycosid: phần aglycon rất đa dạng và gồm tất cả các loại
hợp chất tự nhiên như: monoterpen, sesquiterpen, diterpen, triterpen, steroid,
iridoid, flavonoid, alkaloid, quinonoid, polyphenol,
2.1.2.5. Hợp chất phenol
Các hợp chất phenol dùng để chỉ chung các hợp chất mà trong cấu trúc có
vòng benzen mang một hoặc nhiều nhóm chức hydroxy – OH. Trong thiên nhiên, các
hợp chất phenol là: flavonoid, xanthon, courmarin, quinon, các phenol đơn vòng, các
polyphenol (ligin, tanin, ).
Các hợp chất phenol dễ tan trong nước vì chúng thường hiện diện trong cây ở
dạng glycosid. Nhiều hợp chất phenol có màu sắc tự nhiên, nên có thể đựa vào đặc
điểm này để theo dõi chúng trong quá trình chiết tách, cô lập chúng ra khỏi cây cỏ.
Các hợp chất phenol thường bị hủy hoại do tác dụng của enzmye phenolase vốn luôn
có trong cây vì thế nên sử dụng alcol nóng để chiết tách do alcol giúp hạn chế tác
dụng của enzyme này.
Sinh tổng hợp các hợp chất đã được biết từ rất sớm, đi từ ba amino acid là
phenylamin, tyrosin, tryptophan. Quá trình này xảy ra ngang một chuỗi các phản ứng
phức tạp để cho phenylalanin, tyrosin, tryptophan và từ đó dẫn đến những hợp chất
phenol.
13
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
2.2. Khái niệm chung về Thin layer chromatography (TLC)
2.2.1. Tổng quát về TLC
Kỹ thuật sắc ký đã được sử dụng từ nhiều thế kỷ trước để tách các phẩm
nhuộm từ cây cỏ. Đến thập kỷ 1930 – 1940, phương pháp này được phát triển nhanh
chóng với nhiều kỹ thuật khác nhau. Có các loại sắc ký: sắc ký giấy (kỹ thuật sớm
nhất, hiện nay ít được sử dụng vì hiệu quả tách kém thua kỹ thuật sắc ký lớp mỏng),
sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực, sắc ký lỏng hiệu
năng cao, điện di.

Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng, dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu
trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang
qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ, mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm
kiến, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng
nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng.
 Bình sắc ký: một chậu, hũ, lọ,… bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp
đậy.
 Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0.25 mm của một loại chất hấp thu, thí dụ như
silica gel, alumin,… được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền
phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Chất hấp thu trên tấm giá
đỡ nhờ sulfat calci khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polymer hữu cơ.
Hình 2.11: bình sắc ký lớp mỏng
 Mẫu cần phân tích: mẫu chất cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp
chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1µl dung dịch mẫu với nồng
14
Nắp đậy bình sắc ký
Pha động (dung môi)
Tấm lớp mỏng bằng
plastic hoặc nhôm
Pha tĩnh (chất hấp thu)
Mẫu cần phân tích
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
độ loãng 2 – 5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha
tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang
chứa trong bình.
 Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi, di chuyển chầm chậm dọc
theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển đi lên
cao nhờ vào tính mao quản. Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với
vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển này tùy
thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất

ở lại pha tĩnh (hiện tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy vào độ hòa tan của mẫu
chất trong dung môi.
Với chất hấp thu là silica gel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ di
chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực di chuyển chậm.
2.2.1.1. So sánh TLC với kỹ thuật sắc ký khác
Sắc ký lớp mỏng có ưu điểm: sử dụng ít chất hấp thu, cần rất ít mẫu phân tích
(vi lượng), quá trình triển khai sắc ký nhanh nên trong một thời gian ngắn có thể biết
ngay kết quả mẫu cần phân tích có chứa bao nhiêu chất khác nhau.
So với phương pháp sắc ký lớp mỏng, phương pháp sắc ký cột cổ điển cho kết
quả kém hơn do phải sử dụng một lượng lớn chất hấp thu, chất mẫu và dung môi nên
quá trình thực hiện phải kéo dài, dẫn theo kết quả không tốt. Tiếp theo, kỹ thuật sắc
ký lớp mỏng mới là sắc ký cột chớp nhoáng (flash column chromatography) do có sử
dụng thêm áp suất nên rút ngắn được thời gian thao tác và khả năng tách riêng các
chất ra khỏi hỗn hợp ban đầu, đã cho kết quả gần đạt được so với sắc ký lớp mỏng,
tuy vật vẫn mất thời gian. Những năm gần đây kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp cho kết
quả nhanh, tốt, cả về mặt định tính lẫn định lượng nhưng máy rất đắt tiền, không phải
phòng thí nghiệm nào cũng có khả năng trang bị.
Bảng 2.1: so sánh các đặc trưng của các kỹ thuật sắc ký
Sắc ký lớp
mỏng
Sắc ký cột
cổ điển
Sắc ký cột
chớp
nhoáng
Sắc ký khí Sắc ký
HPLC
Cơ chế sắc
ký
Hấp thu /

phân chia
Hấp thu Hấp thu Phân chia Phân chia
Tính chất
hợp chất
Dung dịch
mẫu có tính
Dung dịch
mẫu có tính
Dung dịch
mẫu có tính
Khí hoặc
hơi của các
Mẫu có
tính bay
15
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
đem đi
phân tích
kém bay hơi kém bay
hơn
kém bay hơi hợp chất có
tính bay hơi
hơi nhiều
hay ít đều
phù hợp
Khả năng
tách chất
Đạt Trung bình Tốt Rất tốt Rất tốt
Thời gian
tách chất

Vài phút
đến vài giờ
Nhiều giờ Vài mươi
phút
Vài phút Vài phút
Hiệu quả
tách chất
định tính
Rất tốt Cần sắc ký
vài lần
Cần sắc ký
vài lần
Rất tốt Rất tốt
Hiệu quả
tách chất
định lượng
Có thể Cần sắc ký
vài lần
Cần sắc ký
vài lần
Rất tốt Rất tốt
Khả năng
tách lượng
lớn mẫu
Có thể Rất tốt Rất tốt Có thể,
nhưng rất
khó
Rất tốt
2.2.1.2. Ưu điểm của TLC
Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích.

Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng, trong cùng điều
kiện phân tích.
Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký
lớp mỏng; trong khi so với HPLC: những hợp chất có tính phân cực mạnh sẽ có sắc
ký đồ ở dạng một mũi (để chỉ sự hiện diện của một chất) hay chỉ là tạp bẩn.
2.2.2. Các bước chuẩn bị trước khi TLC
2.2.2.1. Chấm mẫu lên tấm bản mỏng
 Chuẩn bị tấm bản mỏng: từ tấm bản mỏng thương mại 20 x 20 cm,
dùng kéo cắt các bản với kích thước cần thiết. Lưu ý sao cho tấm bản
mỏng phải lọt được vào bình giải ly.
Dùng bút chì để vạch nhẹ các nét mức xuất phát và mức kết thúc.
 Chuẩn bị dung dịch mẫu: Với mẫu là chất lỏng, có thể chấm trực tiếp
mẫu lên bản mỏng; trường hợp đây là dung dịch quá sệt, có thể pha
loãng mẫu. Với mẫu là chất rắn, phải hòa tan hoàn toàn mẫu trong
dung môi hữu cơ phù hợp, với nồng độ 2 – 5%; dung môi hòa tan mẫu
không nhất thiết phải là dung môi giải ly.
16
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
Nhờ một vi quản, đặt dung dịch mẫu lên bề mặt của tấm sắc ký lớp mỏng một
cách thận trọng, tránh không làm lũng bề mặt của lớp mỏng. Thao tác: cầm vi quản
(hoặc một ống nhỏ có khắc độ bằng thủy tinh để rút dung dịch) nhúng vào dung dịch
mẫu, lực mao dẫn sẽ tự hút dung dịch lên vi quản, rồi đặt đầu vi quản chạm nhẹ lên
bề mặt của tấm lớp mỏng, dung dịch trong ống sẽ chảy ra và thấm lên tấm lớp mỏng.
Phải nhanh chóng nhấc vi quản rời khỏi tấm lớp mỏng, để vết chấm chỉ lan rộng ra
thành vết tròn có đường kính từ 2 – 5 mm.
TLC (sắc ký lớp mỏng) là phương pháp định tính vì thế mỗi vết chấm trên bản
không nên chứa nhiều hơn 12 microgam (10 microgram là tối ưu) mẫu chất. Với một
mẫu, có thể chấm nhiều lần, nhưng giữ cho vết chấm đừng lan rộng ra trên bản, vết
phải có đường kính từ 2 – 5 mm; muốn thế, sau mỗi lần chấm, dùng miệng thổi hơi
nhẹ hoặc dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm, rồi mới chấm tiếp

theo vài lần nữa cho đến khi đủ lượng cần cho một vết chấm.
Sau khi chấm hoàn tất, dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm,
rồi nhúng bản vào dung dịch giải ly; điều này đặc biệt cần thiết nếu dung dịch pha
mẫu là nước hoặc loại dung môi có độ bay hơi kém.
Nếu cần khảo sát một lượt nhiều mẫu khác nhau, chuẩn bị các dung dịch mẫu
này, mỗi dung dịch mẫu chấm lên cùng một bản, vết này cách vết kia 1cm. Hai vết ở
ngoài bìa phải các bờ cạnh 1.5 cm (đối với có kích thước 20 x 20cm).
Với bản sắc ký lớp mỏng điều chế, dung dịch mẫu sẽ được chấm lên bản
thành một đường dài, đều, dọc theo mức xuất phát. Có thể áp dụng khoảng 10 mg
cho một bản có kích thước 20 x 20 cm và chiều dầy bản 5mm. Trên mức kết thúc
dung môi (cách bờ cạnh trên 0.5 – 1 cm), nên dùng một đầu viết chì vót nhọt vạch
một đường hằn xuống lớp hấp thu. Làm như thế, khi dung môi giải ly đi lên đến đầu
trên sẽ bị buộc phải ngừng lại, giúp cho mỗi bản sẽ có kết thúc giống như nhau.
Khi dung môi lên đến đầu trên của bản, không nên để bản ở lâu trong bình,
nên lấy bản ra khỏi bình giải ly, vì sự khuyếch tán và sự bay hơi dung môi có thể làm
các vết vừa tách được sẽ bị trải dài ra.
Ngoài ra, các nhà xản xuất có bán sẵn các thiết bị tự động để chấm mẫu lên
lớp mỏng. Các loại thiết bị này giúp chấm dung dịch mẫu lên lớp mỏng với lượng thể
tích xác định chính xác.
2.2.2.2. Giải ly bản mỏng
17
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
Chuẩn bị bình có kích thước lớn hơn một chút so với kích thước của bản
mỏng. Kích thước của bình và lượng thể tích dung môi giải ly sẽ ảnh hưởng lên giá
trị Rf của mẫu. Cần sử dụng bình nhỏ nhất nếu có thể vì như thế bầu khí quyển sẽ
nhỏ nhất.
Cho dung môi hoặc hỗn hợp dung môi vào bình. Với sắc ký lớp mỏng định
tính, chỉ cần một thể tích koảng 10 ml dung môi. Quan sát chiều dầy của lớp dung
môi trong bình giải ly: không được cao quá 1 cm, bởi vì các vết chấm mẫu trên bản
mỏng cách bìa là 1cm.

Nếu sắc ký lớp mỏng với các tấm bản lớn, sử dụng bình lớn, phải tính toán thể
tích dung môi trong bình không cao hơn khoảng cách của vết chấm trên bản mỏng
(vết chấm trên bản mỏng không được ngập vào trong dung môi khi vừa mới thả bản
vào bình).
Trước khi cho tấm bản mỏng vào bình, bình cần phải được bão hòa dung môi
để có một bầu khí quyển đồng nhất, thực hiện bằng cách phủ bề mặt trong của bình
bằng một tờ giấy lọc, nghiêng đảo nhẹ bình giải ly để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc.
Một hậu quả dễ thấy là nếu bình không được bão hòa dung môi, khi dung môi giải ly
là hệ hỗn hợp, mức tiền tuyến dung môi sẽ có hình lõm (hình lòng chảo) do dung
môi di ở hai bênh cạnh nhanh hơn đi ở giữa bản.
Đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, cạnh đáy của bản ngập vào dung dịch
giải ly khoảng 0.5 – 1 cm. Hệ dung môi phù hợp là sau khi giải ly, hệ sẽ cho các vết
chính có Rf khoảng từ 0.3 đến 0.6.
2.2.2.3. Hiện hình các vết sau giải ly
Sau khi giải ly xong, các hợp chất có màu sẽ được nhìn bằng mắt thường,
nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vết,
cần sử dụng phương pháp hóa học hoặc vật lý.
 Phương pháp vật lý
Có nhiều phương pháp khác nhau nhưng phương pháp thông dụng nhất là
phát hiện bằng tia tử ngoại (UV). Các nhà sản xuất có bán sẵn dụng cụ để khảo sát
bản mỏng bằng tia UV. Dụng cụ đơn giản gồm một thùng rỗng, được bao phủ chung
quanh bằng vật liệu màu đen để tạo phòng tối; trên nắp thùng có gắn hai bóng đèn
UV với hai loại bước sóng là μ = 254 nm và 366 nm. Thùng có cửa mở ở bên hông.
Muốn nhìn bản bằng đèn UV: mở cửa, đặt tấm bản mỏng vào bên trong, ở đáy thùng,
18
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
đóng cửa lại, bật công tắc cho đèn sáng và quan sát tấm bản mỏng từ bên ngoài, từ
trên cao nhìn xuống ngang qua một cửa sổ bằng kiếng.
Đèn chiếu tia UV 254 nm: ánh sáng này để nhận ra các hợp chất có thể hấp
thu tia UV. Các hợp chất sẽ tạo thành vết có màu tối sẫm.

Nếu sử dụng bản mỏng thương mại ví dụ silica gel 60 F254, bản mỏng này là
silica gel có trộn thêm chất chỉ thị phát huỳnh quang (silicat kẽm có Mn hoạt hóa)
hấp thu ánh sáng ở bước sóng 254 nm, như vậy dưới ánh sáng 254 nm, tấm bản sẽ có
màu xanh lục chói. Nếu trên tấm bản có một vết của hợp chất mà hợp chất này cũng
hấp thu ánh sáng ở bước sóng 254 nm, vết này sẽ che mất huỳnh quang, xuất hiện là
một vệt tối trên nền sáng.
Đèn chiếu tia UV 366 nm: ánh sáng này dùng để phát hiện những hợp chất
phát huỳnh quang. Các vết của chất mẫu có màu sáng trên nền bản mỏng sẫm màu.
 Một số điểm cần lưu ý:
Có thể thay thế dụng cụ nêu trên bằng máy kiểm tra tiền, nhưng khi sử dụng
cẩn thận vì máy này không có thùng che chắn tia UV giống như dụng cụ nói trên,
nhưng biết rằng tia UV có thể gây đột biến gen.
Bản mỏng với chất hấp thu có trộn thêm chất chỉ thị phát huỳnh quang có thể
gây nên sự thay đổi vị trí của các vết trên bản: vết ở đúng vị trí này nhưng lại nhìn
thấy vết ở ví trí khác, điều này gây nên nhưng nhầm lẫn tai hại.
 Phương pháp hóa học
Phương pháp hóa học là phát hiện các vết bằng thuốc thử, bằng cách hòa
thuốc thử vào một dung môi thích hợp rồi phun xịt dung dịch thuốc thử này lên bản
mỏng. Thuốc thử sẽ kết hợp với các hợp chất để tạo ra các dẫn xuất có màu. Các
thuốc thử được xếp thành 2 loại: đặc trưng và không đặc trưng.
Thuốc thử không đặc trưng khi nó tạo vết có màu hầu hết với các loại hợp
chất hữu cơ, thí dụ như: iod, acid sulfuric, rhodamin B, chất chỉ thị phát huỳnh
quang.
Thuốc thử đặc trưng khi nó chỉ tác dụng với những hợp chất có chứa những
nhóm chức hóa học đặc biệt, tạo vết có màu đặc trưng. Thí dụ: thuốc thử
dinitrophenylhydrazin tác dụng với những hợp chất có chứa nhóm carbonyl để tạo
màu đỏ đậm.
 Phun xịt dung dịch thuốc thử lên bản mỏng
Muốn khảo sát các hợp chất trên bản mỏng bằng các thuốc thử đặc trưng, phải
thấm bản mỏng với dung dịch thuốc thử, có thể thực hiện theo hai cách.

19
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
+ Phun xịt bản mỏng bằng bình phun xịt: Thuốc thử pha theo quy định và cho
vào bình, thể tích thuốc thử chỉ được chiếm tối đa hai phần ba thể tích chứa
của bình. Sử dụng khí nén hoặc dùng một bóp cao su để tạo sức nén, giúp
dung dịch đi ra khỏi bình ở dạng giọt sương mịn. Phải bóp vài cái trước để tạo
ra các giọt sương đều, rồi mới hướng đầu ra của bình vào tấm bản mỏng, sao
cho hơi sương phủ đều lên bề mặt bản mỏng. Phương pháp có ưu điểm là
dung dịch thuốc thử được sử dụng với lượng vừa đủ để tạo phản ứng màu với
hợp chất trên bản mỏng, nhược điểm là cần có thao tác khéo léo chuyên
nghiệp nếu không dung dịch thuốc thử được phủ lên bản không đều, chỗ
nhiều gây loang lỗ, chỗ ít không đủ để làm xuất hiện vết.
+ Nhúng bản mỏng vào một lọ có chứa dung dịch thuốc thử. Ưu điểm của
phương pháp này là dung dịch thuốc thử có thể phủ đều lên mặt bản: nhược
điểm là các chất mẫu nằm trên bản khi gặp một lượng lớn thuốc thử sẽ hòa
tan luôn thuốc thử, có thể biến mất khỏi bản. Sau mỗi lần nhúng bản vào dung
dịch, một lượng nhỏ chất hấp thu silica gel sẽ rơi vào dung dịch, sau một thời
gian, đáy bình chứa đầy silica gel, do đó phải thay dung dịch mới.
Thường sau khi phun xịt dung dịch thuốc thử lên bản vào dung dịch thuốc
thử, cần phải xúc tiến phản ứng bằng cách sấy nóng bản mỏng cho đến khi các vết
xuất hiện.
2.2.2.4. Lưu giữ vết để làm tài liệu
Sau khi giải ly bản, cần ghi lại những thông tin cần thiết. Các chi tiết có thể
ghi lên mặt trước của bản bằng bút chì, hoặc ghi lên mặt sau bằng bút benzen. Các
chi tiết như: dung môi giải ly, giá trị Rf của mẫu chất, hình dạng, màu sắc của vết,
thuốc thử dùng để hiện hình các vết.
Tờ bản mỏng cần được lưu giữ bằng cách bảo quản trong một bao plastic.
Nhưng nếu để lâu, bản cũng sẽ bị phai màu hoặc hư hỏng. Tốt nhất là đối với các bản
quan trọng cần phải lưu tài liệu, có thể làm các cách như sau:
+

Đặt tấm bản mỏng dưới một tờ giấy trong, dùng bút chì tô lại các vết đậm,
nhạt, vị trí vết.
+
Photocopy lại tấm bản mỏng.
20
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
+
Tốt nhất là chụp hình màu để lưu lại hình ảnh nguyên tấm bản với đầy đủ màu
sắc của các vết.
2.2.2.5. Ứng dụng của TLC
 Để công bố các đặc điểm của một hợp chất
Một hợp chất tinh khiết có một vết với sắc ký lớp mỏng, với giá trị Rf không
đổi, trong một hệ dung môi giải ly xác định, bởi bản sắc ký của một lô sản xuất nhất
định.
Muốn đo Rf sử dụng thước để đo khoảng đường di chuyển của hợp chất và
của dung môi. Rf là tỉ số giữa đoạn đường di chuyển của hợp chất và đoạn đường di
chuyển của dung môi, là con số không có đơn vị, luôn luôn nhỏ hơn một (Rf< 1).
Quy ước viết Rf với hai con số lẻ sau dấu phẩy.
Hình 2.12 hình minh họa bản sắc ký
Nếu vết mẫu hiện trên bản mỏng là một vết tròn, nhỏ, đo khoảng cách từ mức
xuất phát đến tâm của vết đo. Nếu vết mẫu quá to, phải thực hiện sắc ký bản mỏng
lại, giảm lượng mẫu chấm, sao cho vết hiện nhỏ, gọn.
Giá trị Rf của hợp chất thay đổi tùy theo nhiều yếu tố:
+
Loại bản mỏng silica gel hoặc alumina của hãng Merk hay Prolabo (bản mỏng
tráng sẵn dù của cùng một hãn sản xuất cũng khác nhau tùy theo lô sản xuất).
+
Hoạt độ của bản lúc sử dụng khác nhau tùy theo thời gian tồn trữ lâu, mau.
+
Độ dầy của bản.

21
b
a
Tiền tuyến dung môi
Mức xuất phát
Đồ án tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo
+
Thành phần của dung môi giải ly, chỉ cần thay đổi một ít cũng làm ảnh hưởng
kết quả. Độ bão hòa dung môi trong bình giải ly của hai lần giải ly khác nhau
cũng khác nhau.
+
Kỹ thuật giải ly: dung môi đi lên hay đi xuống cũng cho kết quả khác nhau.
Lượng mẫu chấm lên bản nhiều hay ít cũng làm vị trí của vết trên bản thay đổi.
 Để tìm hiểu sơ bộ về tính chất của mẫu chất khảo sát
Biết được số các hợp chất có trong hỗn hợp mẫu ban đầu: Chuẩn bị nhiều bản,
chấm mẫu chất lên mỗi bản; mỗi bản giải ly với một hệ dung môi giải ly khác nhau,
cần phải dò tìm mới có thể chọn ra được một hệ dung môi phù hợp làm rải các hợp
chất ra trên cùng một bản mỏng.
Nhìn số lượng các vết hiện trên bản để đoán biết mẫu ban đầu có chứa bao
nhiêu hợp chất. Lưu ý: do bản mỏng có độ phân giải thấp cho nên nhìn thấy một vết
trên bản mỏng không có nghĩa đó là một chất, mà đó có thể là hai hoặc ba chất tụ lại
với nhau.
Để kiểm tra độ tinh khiết của một hợp chất: phân tích cộng hưởng từ hạt nhân
(NMR) để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất, mẫu này phải đạt độ tinh khiết ≥
95%. Kiểm tra độ tinh khiết của một hợp chất hiệu quả nhất là HPLC, máy sẽ cho
biết luôn hàm lượng phần trăm của mẫu chất. Tuy nhiên, thực hiện như thế sẽ khá
tốn kém vì HPLC cần có các loại dung môi tinh khiết tiêu chuẩn của HPLC. Có thể
tự mình kiểm tra độ tinh khiết của một hợp chất bằng sắc ký lớp mỏng.
Chuẩn bị ba bản giống nhau, có vết mẫu. Thực hiện sự giải ly, mỗi bản với
một hệ dung môi giải ly khác hẳn nhau. Ba hệ dung môi phải lựa chọn như thế nào

để có: một hệ dung môi đẩy các vết di chuyển gần với mức xuất phát; một hệ dung
môi đẩy vết di chuyển đến khoảng giữa bản và một hệ dung môi đẩy vết di chuyển
xa với mức xuất phát.
Nếu cả ba bản lúc nào cũng cho thấy vết tròn, gọn là mẫu tinh khiết, còn chỉ cần
một bản có thêm các vết khác, là mẫu có lẫn bẩn, cần tinh chế thêm.
2.3. Nuôi cấy mô tế bào thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp
2.3.1. Khái niệm
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện các hợp
chất có giá trị trong y dược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không thể sản xuất
chúng từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hóa học. Những năm
gần đây, sự phát triển của các hợp chất thứ cấp quan trọng trong thương mại là kết
22