Nghiên cứu công nghệ sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng nhằm phát triển một số cây trồng trọng yếu của tỉnh sơn la

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
QUỸ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ QUỐC GIA

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ ĐỔI MỚI CÔNG NGHỆ
DO DOANH NGHIỆP THỰC HIỆN THEO NGHỊ ĐỊNH SỐ 119/1999/NĐ-CP CỦA
CHÍNH PHỦ

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CƠNG NGHỆ ĐỀ TÀI
Tên đề tài:
Nghiên cứu cơng nghệ sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng nhằm phát
triển một số cây trồng trọng yếu của tỉnh Sơn La
(MÃ SỐ ĐỀ TÀI): 09/2009

Cơ quan chủ trì đề tài: Doanh nghiệp tư nhân Ngọc Trung
Chủ nhiệm đề tài: Phạm Văn Hùng
Thời gian thực hiện: 8/2009 - 8/2012

9772


BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
QUỸ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ QUỐC GIA
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ ĐỔI MỚI CÔNG NGHỆ
DO DOANH NGHIỆP THỰC HIỆN THEO NGHỊ ĐỊNH SỐ 119/1999/NĐ-CP CỦA CHÍNH
PHỦ

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI/DỰ ÁN
Tên đề tài:
Nghiên cứu công nghệ sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng nhằm phát

triển một số cây trồng trọng yếu của tỉnh Sơn La
(MÃ SỐ ĐỀ TÀI)
Chủ nhiệm đề tài:

Cơ quan chủ trì đề tài:

(ký tên)

(ký tên và đóng dấu)

KS. Phạm Văn Hùng

Dương Hồng Hương
Bộ Khoa học và Công nghệ

Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia
(ký tên và đóng dấu khi gửi lưu trữ)


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Số TT

Chữ viết tắt

Nghĩa của chữ viết tắt

1

VSV

Vi sinh vật

2

HTL

Hòa tan lân

3

KB

King B

4

ĐK

Đối kháng

5

LN1

Lần nhắc 1

6

LN2

Lần nhắc 2

7

Nts

Ni tơ tổng số

8

Pts

Lân tổng số

9

Kts

Kali tổng số

10

ĐC

Đối chứng

11

TN

Thí nghiệm

12

CT

Cơng thức

13

CTTN

Cơng thức thí nghiệm

14

HCVS

Hữu cơ vi sinh

15

HRGMT

Bệnh héo rũ gốc mốc trắng


DANH MỤC BẢNG
TT

Nội dung

Trang

Bảng 1
Bảng 2
Bảng 3
Bảng 4
Bảng 5

Các chủng vi sinh vật phân giải lân phân lập
Hoạt tính phân giải lân của các chủng vi khuẩn phân lập
Hoạt tính phân giải lân duy trì qua các lần cấy truyền
Khả năng hòa tan lân của các chủng VSV phân lập được
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng Azotobacter
mới phân lập
Khả năng cố định nitơ của các chủng Azotobacter
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV phân lập
được
Hàm lượng IAA thơ hình thành của các chủng vi sinh vật
phân lập
Nguồn gốc và đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn
đối kháng
Hoạt tính đối kháng nấm F. solani của các chủng vi
khuẩn đối kháng
Điểm sinh học của các chủng Azotobacter tuyển chọn
Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến hoạt tính sinh học
của VSV
Phân loại an tồn sinh học của các chủng vi khuẩn đối

kháng
Đánh giá an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật đến
cây trồng
Ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật đến khả năng sinh
trưởng phát triển của đậu tương, ngô và cà phê
Tình trạng sức khoẻ của chuột trong thời gian thí nghiệm
Trọng lượng của chuột trong thời gian thí nghiệm
Khả năng kìm hãm sinh trưởng của các chủng vi khuẩn
đối kháng
Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật lựa chọn để
sản xuất chế phẩm cho cây ngô

17
18
19
20
21

Bảng 6
Bảng 7
Bảng 8
Bảng 9
Bảng 10
Bảng 11
Bảng 12
Bảng 13
Bảng 14
Bảng 15
Bảng 16
Bảng 17

Bảng 18
Bảng 19
Bảng 20

i

22
23
25
27
29
31
32
32
33
35
35
37
37
38
39


Bảng 21

Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật lựa chọn để

39

sản xuất chế phẩm cho cây đậu tương

Bảng 22
Bảng 23
Bảng 24
Bảng 25
Bảng 26
Bảng 27
Bảng 28
Bảng 29
Bảng 30
Bảng 31
Bảng 32
Bảng 33
Bảng 34
Bảng 35
Bảng 36
Bảng 37

Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật lựa chọn để
sản xuất chế phẩm cho cây cà phê
Hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật lựa chọn để
sản xuất chế phẩm cho cây ngơ
Hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật lựa chọn để
sản xuất chế phẩm cho cây đậu tương
Hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật lựa chọn để
sản xuất chế phẩm cho cây cà phê
Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật* (CNP1, AT4,
KT2, ĐK14) trong điều kiện hỗn hợp chủng
Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật** (PTP1, AT7,
KT8, ĐK31) trong điều kiện hỗn hợp chủng
Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật*** (TGP2,

AT10, KT9, ĐK37) trong điều kiện hỗn hợp chủng
Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật (CNP1, AT4,
KT2, ĐK14) trong than bùn khử trùng
Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật PTP1, AT7,
KT8, ĐK31 trong than bùn khử trùng
Khả năng tồn tại của các chủng vi sinh vật TGP2, AT10,
KT9, ĐK37 trong than bùn khử trùng
Sự thay đổi hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật
trong quá trình bảo quản ở điều kiện hỗn hợp
Ảnh hưởng của các tổ hợp vi sinh vật đến năng suất và
khả năng phịng trừ bệnh thối rễ của cây ngơ
Ảnh hưởng của các tổ hợp vi sinh vật hữu ích đến sinh
trưởng của cây đậu tương
Ảnh hưởng của tổ hợp vi sinh vật hữu ích đến sự sinh
trưởng và phát triển của cây cà phê ở giai đoạn vườn ươm
Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của
chủng VSV
Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến hoạt tính sinh học
ii

40
40
40
40
41
41
42
42
43
43

43
44
45
46
47
48


Bảng 38
Bảng 39
Bảng 40
Bảng 41
Bảng 42
Bảng 43
Bảng 44
Bảng 45
Bảng 46
Bảng 47
Bảng 48
Bảng 49
Bảng 50
Bảng 51
Bảng 52
Bảng 53
Bảng 54
Bảng 55.

của VSV
Ảnh hưởng của nhiệt độ tới mật độ tế bào các chủng vi
sinh vật hữu ích

Ảnh hưởng của pH tới mật độ tế bào của các chủng Vi
sinh vật hữu ích
Ảnh hưởng của lượng thổi khơng khí đến mật độ tế bào
của các chủng vi sinh vật hữu ích
Ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy đến mật độ tế bào của
các chủng vi sinh vật hữu ích
Mật độ tế bào của các chủng vi sinh vật hữu ích theo thời
gian ni cấy
Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp 1 đến mật độ tế bào củacác
chủng vi sinh vật hữu ích
Thành phần lý hoá học của than bùn
Khả năng tồn tại của các chủng VSV trong chế phẩm dạng
bột sau thời gian bảo quản ở 40C
Ảnh hưởng của chế phẩm đến một số chỉ số nông học của
ngô
Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đối kháng đến các yếu tố
cấu thành năng suất và năng suất ngô
Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đối kháng đến khả năng
phòng trừ bệnh thối rễ của cây ngô
Kết quả thử nghiệm chế phẩm vi sinh đến sinh trưởng,
phát triển, năng suất đậu tương
Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đối kháng đến khả năng
phòng trừ bệnh thối rễ của cây đậu tương
Mức độ khô cành và tốc độ phát triển đốt trên cành hữu
hiệu ở các cơng thức thí nghiệm
Ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đối kháng đến khả năng
phòng trừ bệnh thối rễ cây cà phê
Sự biến động nhiệt độ của khối ủ trong quá trình xử lý than bùn

Sự biến động quần thể vi sinh vật trong quá trình xử lý

than bùn
Thành phần hóa học than bùn trước và sau xử lý
iii

49
50
50
51
52
53
54
58
59
59
60
61
61
62
62
63
65
66


Bảng 56.
Bảng 57.
Bảng 58.
Bảng 59.
Bảng 60.
Bảng 61.

Bảng 62.

Bảng 63.

Bảng 64.
Bảng 65.
Bảng 66.
Bảng 67.
Bảng 68.
Bảng 69.
Bảng 70.
Bảng 71.
Bảng 72.
Bảng 73.

Tính chất cảm quan của cơ chất sau khi xử lý
Ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng phát triển của cây
cải ngọt
Ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng nảy mầm của ngô
CP888
Khả năng sinh trưởng, phát triển của các chủng vi sinh vật
hữu ích trong cơ chất sau khi phối trộn
Hoạt tính phân giải xenlulo của các chủng VSV phân lập
Tỷ lệ giảm trọng lượng rơm trong bình ủ bổ sung chế
phẩm vi sinh vật sau 14 ngày
Sự thay đổi nhiệt độ, pH và biến động VSV hiếu khí phân
giải xenlulo trong đống ủ đối chứng (không bổ sung chế
phẩm VSV) sau 30 ngày
Sự thay đổi nhiệt độ, pH và biến động VSV hiếu khí phân
giải xenlulo trong đống ủ bổ sung chế phẩm VSV sau 30

ngày
Kết quả phân tích một số chỉ tiêu hóa học của rơm rạ sau
ủ 30 ngày
Một số chỉ tiêu so sánh giữa việc ủ không bổ sung và bổ
sung chế phẩm vi sinh vật
Tỷ lệ nảy mầm của hạt cải trên nền các cơ chất
Đặc điểm hình thái, hoạt tính sinh học của các chủng VSV
lựa chọn.
Sự biến động về mật độ của các chủng VSV trong khối ủ
(CT1, CT2, CT3)
Sự biến động về mật độ của các chủng VSV trong khối ủ
(CT4, CT5, CT6)
Thành phần hóa học của cơ chất trước và sau khi ủ
Đặc điểm hình thái và hoạt tính sinh học của các chủng vi
sinh vật
Thành phần hóa học của các nguồn phế phụ phẩm trước
và sau xử lý
Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng đến sinh trưởng,
phát triển và năng suất của giống đậu tương ĐT84
iv

67
68
68
69
71
72
73

73

74
75
75
76
77
77

79
80
85


Bảng 74.
Bảng 75.
Bảng 76.
Bảng 77.
Bảng 78.
Bảng 79.
Bảng 80.
Bảng 81.
Bảng 82.
Bảng 83.
Bảng 84.
Bảng 85.
Bảng 86.

Bảng 87.
Bảng 88.

Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới bệnh hại đậu
tương ĐT84
Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới sinh trưởng,
phát triển và năng suất của ngô lai CP999
Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới bệnh hại giống
ngô C999
Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới sinh trưởng,
phát triển của giống cà phê Catimor tuổi 4
Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới các yếu tố cấu
thành năng suất của giống cà phê Catimor tuổi 4
Mức độ nhiễm bệnh trên cây cà phê chè Catimor tuổi 4
nghiên cứu
Kết quả thử nghiệm phân HCVS đối kháng trên giống đậu
tương ĐT84 tại Yên Châu
Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới bệnh hại trên
giống đậu tương ĐT84 tại Yên Châu
Đánh giá hiệu quả kinh tế của phân HCVS đối kháng trên
giống đậu tương ĐT84 tại Yên Châu
Kết quả thử nghiệm phân HCVS đối kháng trên giốngngô
lai CP999 tại Mộc Châu
Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới bệnh hại giống
ngô CP999 tại Mộc Châu
Đánh giá hiệu quả kinh tế của phân HCVS đối kháng trên
giống ngô lai C999 tại Mộc Châu
Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới các yếu tố cấu
thành năng suất của giống cà phê Catimor tuổi 4 tại Mai
Sơn
Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng tới bệnh hại cây cà
phê chè Catimor tuổi 4 tại Mai Sơn
Đánh giá hiệu quả kinh tế của phân HCVS đối kháng trên

giống cà phê chè Catimor tuổi 4

v

87
88
90
90
91
92
95
95
96
97
97
98
98

99
95


DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ
TT

Nội dung

Hình 1:
Hình 2:
Hình 3:

Khuẩn lạc một số chủng vi khuẩn phân giải lân phân lập
Hoạt tính phân giải lân của một số chủng vi khuẩn phân lập
Hình ảnh phản ứng màu của các chủng Azotobacter với
thuốc thử Nessler
Biểu đồ 1: Khả năng cố định nitơ của các chủng Azotobacter
Hình 4: Hình ảnh khuẩn lạc của một số chủng vi sinh vật phân lập
được
Hình 5: Khả năng sinh tổng hợp IAA thô của các chủng vi sinh vật
Hình 6: Hình thái khuẩn lạc và bào tử của chủng Fusarium solani
mới phân lập
Hình 7. Hoạt tính đối kháng của một số chủng vi khuẩn đối kháng
Hình 8: Hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn đối kháng
Hình 9. Một số hình ảnh thí nghiệm xác định đặc điểm sinh lý sinh
hóa các chủng VSV tuyển chọn
Hình 10: Minh họa đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật đến
cây ngơ
Hình 11. Đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật trên chuột
bạch
Hình 12. Nội tạng của chuột bạch sau khi đánh giá độc tính
Hình 13: Đồ thị biến động nhiệt độ trong q trình xử lý than bùn
Hình 14. Kết quả xử lý than bùn bằng chế phẩm vi sinh
Hình 15: Thí nghiệm trồng cải trên cơ chất than bùn
Hình 16. Ảnh hưởng của dịch chiết than bùn đến khả năng nảy mầm
của ngơ
Hình 17: Vịng phân giải xenlulo của các chủng VSV ( theo phương
pháp CMC-aza)
Hình 18. Ảnh minh họa phế thải rơm rạ xử lý sau 30 ngày
Biểu đồ 2. Sự biến thiên nhiệt độ của khối ủ
Hình 19.

Hình 20.

Hiệu quả của chế phẩm lên khối ủ
Đánh giá chất lượng cơ chất sau xử lý
i

Trang
18
19
21
22
24
24
26
29
30
31
34
36
37
64
67
67
68
71
74
78
78
79

Đồ thị 3:
Đồ thị 4:
Hình 21:
Hình 22:

Đồ thị biến động nhiệt độ trong quá trình xử lý thân lá lạc
Đồ thị biến động nhiệt độ trong quá trình xử lý thân lá đậu
tương
Thân lá lạc trước và sau xử lý
Thân lá đậu tương trước và sau xử lý

ii

80
80
82
82


MỤC LỤC
Mục

Nội dung

Trang

I
II
III

MỞ ĐẦU
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1
1
7

IV.
4.1.
4.2.
V.
5.1.
5.1.1.

5.1.2.

5.1.3.

5.1.4.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn bộ chủng giống vi sinh vật
sử dụng cho sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng
Nội dung 2: Xây dựng và hoàn thiện quy trình sản xuất phân
hữu cơ vi sinh đối kháng
Nội dung 3: Xây dựng quy trình sử dụng phân hữu cơ vi sinh
đối kháng
Nội dung 4: Xây dựng mơ hình sử dụng phân hữu cơ vi sinh
đối kháng

Nội dung 5: Đăng ký sản phẩm phân hữu cơ vi sinh đối
kháng
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Phương pháp nghiên cứu
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Phân lập, tuyển chọn bộ chủng giống vi sinh vật sử dụng cho
sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng
Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn phân giải lân từ đất
trồng cây cà phê, đậu tương, ngô tại huyện Mộc Châu, Yên
Châu, Mai Sơn, Sông Mã
Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do từ
đất trồng cây cà phê, đậu tương, ngô tại huyện Mộc Châu, Yên
Châu, Mai Sơn, Sông Mã
Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn kích thích sinh trưởng
từ đất trồng trồng cây cà phê, đậu tương, ngô tại huyện Mộc
Châu, Yên Châu, Mai Sơn, Sông Mã
Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn đối kháng vi sinh vật
gây bệnh thối rễ từ đất trồng cây cà phê, đậu tương, ngô tại
i

7
7
8
8
9
9
9
10
17

17
17

20

23

25


huyện Mộc Châu, Yên Châu, Mai Sơn, Sông Mã
5.1.5. Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa, sinh trưởng, phát triển và
hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật lựa chọn
5.1.6. Xác định an toàn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn để khẳng
định khả năng sử dụng cho nghiên cứu sản xuất phân bón
5.2. Xây dựng qui trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng
5.2.1. Nghiên cứu, sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng qui mơ phịng
thí nghiệm
SƠ ĐỒ 1 - QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VSV CHO CÂY

30
33
38
38
55

NGÔ
SƠ ĐỒ 2 - QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VSV CHO CÂY

56

ĐẬU TƯƠNG
SƠ ĐỒ 3 - QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VSV CHO CÂY CÀ

57

PHÊ

5.2.2. Xây dựng qui trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng từ
than bùn
QUI TRÌNH SẢN XUẤT PHÂN HỮU CƠ VI SINH ĐỐI
KHÁNG TỪ THAN BÙN
5.2.3. Xây dựng được qui trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng
từ các nguồn phụ phẩm nông nghiệp
QUI TRÌNH SẢN XUẤT PHÂN HỮU CƠ VI SINH ĐỐI
KHÁNG TỪ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP
5.3. Đánh giá hiệu quả của phân bón HCVSĐK đến sinh trưởng,
phát triển, năng suất và khả năng hạn chế một số bệnh cây đậu
tương, ngô và cà phê tại các huyện Mai Sơn, Mộc Châu, Yên
Châu của tỉnh Sơn La.
5.3.1. Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng đến sinh trưởng, phát
triển năng suất và khả năng hạn chế một số bệnh của giống đậu
tương ĐT84
5.3.2. Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng đến sinh trưởng, phát
triển và năng suất của giống ngô lai CP999
5.3.3. Ảnh hưởng của phân HCVS đối kháng đến sinh trưởng, phát
triển và năng suất của giống cà phê Catimor tuổi 4
5.4. Xây dựng quy trình sử dụng phân hữu cơ vi sinh đối kháng
ii

62
70
71
83
84

84

88
90
93


trên 03 loại cây trồng trọng yếu (cà phê, đậu tương và ngơ)
5.5.

Xây dựng mơ hình đánh giá khả năng thích ứng của phân
hữu cơ vi sinh đối kháng cho một số đối tượng cây trồng (cà
phê, đậu tương và ngơ)

94

5.5.1. Đánh giá hiệu quả của phân bón HCVS đối kháng tới giống đậu
tương ĐT84 tại huyện Yên Châu
5.5.2. Đánh giá hiệu quả của phân bón HCVS đối kháng tới giống ngô
lai C999 tại Mộc Châu
5.5.3. Đánh giá hiệu quả của phân bón HCVS đối kháng tới giống cà
phê Catimor tuổi 4 tại Mai Sơn
V.
KẾT LUẬN

VI.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
VII.
PHỤ LỤC

94

iii

96
98
100
101
103


I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, việc q lạm dụng phân bón hố học trong sản
xuất nơng nghiệp đã dẫn tới rất nhiều diện tích đất canh tác trở nên bạc màu, chai
cứng và mất dần khả năng canh tác, những diện tích này ngày càng lớn và rất cần
thiết phải trả lại sự mầu mỡ, phì nhiêu của đất bằng cách áp dụng các biện pháp
thâm canh liên hồn, trong đó phân bón hữu cơ vi sinh đóng một vai trị hết sức
quan trọng.
Theo các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước, cây trồng chỉ hấp thu được
35-40% tổng lượng Nitơ, 50-60 % tổng lượng Photpho và Kali bón trên đồng ruộng.
Lượng phân hố học cịn lại hoặc bị bốc hơi, rửa trơi hoặc ngấm vào trong đất. Theo
tính tốn, hàng năm, có khoảng 1,0-1,2 triệu tấn Nitơ bón vào trong đất khơng có tác
dụng dinh dưỡng đối với cây trồng (bị bốc hơi, rửa trôi hoặc ngấm vào trong đất).
Như vậy, hàng năm, có một lượng phân hố học rất lớn thất thốt, gây ơ nhiễm mơi

trường đất, nước, khơng khí và ảnh hưởng trực tiếp tới sức khoẻ con người và các
sinh vật khác. Mặt khác, việc sử dụng quá mức phân hố học cũng gây lãng phí rất
lớn cho người nơng dân.
Việc sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh bên cạnh chức năng trả lại sự mầu mỡ,
phì nhiêu cho đất, cung cấp dinh dưỡng thay thế một phần cho phân hố học, cịn có
tác dụng làm tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng của cây trồng lên 30-60% tổng
lượng phân hố học bón cho đất, từ đó làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường, tiết kiệm
được hàng triệu tấn phân hoá học thất thoát hàng năm.
Đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng nhằm
phát triển một số cây trồng trọng yếu của tỉnh Sơn La” được thực hiện nhằm sản xuất
phân hữu cơ vi sinh đối kháng từ các chủng vi sinh vật bản địa tuyển chọn có các
hoạt tính sinh học như cố định ni tơ, phân giải lân, kích thích sinh trưởng, đối kháng
bệnh cây; cung cấp nguồn phân bón hữu cơ cho một số cây trồng trọng yếu của tỉnh
Sơn La, góp phần để tăng năng suất, chất lượng cây trồng, giảm ô nhiễm môi trường.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
+ Hồn thiện được cơng nghệ sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng phục vụ
sản xuất nông nghiệp hữu cơ đặc thù cho tỉnh Sơn La;
+ Xây dựng dây chuyền sản xuất 5.000 tấn sản phẩm/năm.
II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát về phân hữu cơ vi sinh
Phân hữu cơ vi sinh là loại phân hỗn hợp của các nguyên liệu có nguồn gốc hữu
cơ và các vi sinh vật có lợi bao gồm vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn được sử dụng để làm
phân bón. Trong số đó quan trọng là các nhóm vi sinh vật cố định đạm, phân giải
1


lân, phân giải chất hữu cơ, kích thích sinh trưởng cây trồng, v.v... Việc bổ sung các
loại vi sinh vật có khả năng phân huỷ xenlulo cao (Aspergillus, Trichoderma và
Penicillium), cố định nitơ tự do (Azotobacter), phân giải lân (Aspergillus,
Penicillium, Pseudomonas, Bacillus) và các chủng vi sinh vật đối kháng

(Pseudomonas, Bacillus) với mật độ 106-108 cfu/g cùng các nguyên tố dinh dưỡng
như đạm dạng hữu cơ, lân dạng quặng photphorit (liều lượng 5%) đã làm tăng chất
lượng của phân bón lên đáng kể.
Phân hữu cơ vi sinh có chứa các vi sinh vật là nấm đối kháng sẽ giúp phòng trừ
nấm bệnh cho cây trồng. Tiến bộ này đã được nghiên cứu, công nhận từ nhiều năm
qua ở nhiều nước trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Việc sử dụng phân bón vi
sinh vật có thể cung cấp cho đất từ 30-60 kg N (đạm)/năm, tăng hiệu lực phân lân,
làm tăng độ phì nhiêu của đất. Các chế phẩm có chứa vi sinh vật cịn làm tăng khả
năng trao đổi chất trong cây, nâng cao sức đề kháng và chống bệnh ở cây trồng, làm
tăng chất lượng nông sản, tăng thu nhập cho nông dân.
Xu hướng chung hiện nay trên thế giới là tạo ra các sản phẩm phân hữu cơ giàu
dinh dưỡng có bổ sung vi sinh vật hữu ích. Để góp phần phát triển nơng nghiệp bền
vững, nhiều quốc gia trên thế giới đã khuyến khích người dân sử dụng phân bón
sinh học bằng cách trợ giúp giá bán cho nông dân đồng thời phát triển mạng lưới
khuyến nơng, trong đó đặc biệt chú trọng cơng tác xây dựng các mơ hình trình diễn
trên đồng ruộng về việc sử dụng hiệu quả của phân hữu cơ vi sinh.
Mặt khác việc sử dụng phân hố học, thuốc hóa học bảo vệ thực vật quá nhiều dẫn
đến ô nhiễm mơi trường đất, tạo cho đất khơng cịn độ xốp, hấp thụ và giữ nước kém.
Các nhà khoa học đã kết luận: sử dụng phân hữu cơ vi sinh làm tăng năng suất cây
trồng, chất lượng sản phẩm tốt hơn, giảm ơ nhiễm của NO3. Điều này cũng có nghĩa
phân hữu cơ vi sinh góp phần quan trọng cho một nền nông nghiệp hữu cơ bền vững,
xanh sạch và an toàn.
Các chủng vi sinh vật bổ sung trong sản xuất phân hữu cơ vi sinh có tác dụng:
- Tạo thành phân hữu cơ có chất lượng cao: tăng độ mùn, tăng hợp chất hữu
cơ dễ tiêu, bổ sung các chất kích thích sinh trưởng thực vật.
- Phân huỷ các hợp chất kali, photpho khó tiêu thành dễ tiêu, tăng hàm lượng
Nitơ trong đất.
- Tăng quần thể vi sinh vật có ích trong đất và hạn chế vi sinh vật gây hại, từ
đó có thể làm giảm lượng sử dụng các loại phân bón, thuốc bảo vệ thực vật hố học
trong sản xuất nông nghiệp.

- Tăng năng suất và chất lượng nông sản, tạo ra các sản phẩm nông nghiệp
sạch, an tồn.
2.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân hữu cơ vi sinh
Trong những năm gần đây, ở nhiều nước trên thế giới, người ta đã tổ chức
sản xuất công nghiệp một số loại phân vi sinh vật và đem bán ở thị trường trong
nước. Một số loại phân vi sinh vật được bán rộng rãi trên thị trường thế giới. Tuy
2


nhiên, các loại phân vi sinh vật cịn rất ít và chỉ là bộ phận nhỏ so với phân hoá học
trên thị trường phân bón. Trong đó có nhiều loại phân vi sinh vật.
2.2.1. Phân vi sinh vật
* Phân vi sinh vật cố định đạm: gồm nhiều loài vi sinh vật có khả năng cố định
N từ khơng khí. Đáng chú ý có các lồi: tảo lam (Cyanobacterium), vi khuẩn
Azotobacter, Bradyrhizobium, Rhyzobium; xạ khuẩn Actinomyces, Klebsiella.
Phần lớn các loài vi khuẩn cố định đạm thường sống cộng sinh với các cây
họ đậu. Chúng xâm nhập vào rễ cây và sống cộng sinh trong đó, tạo thành các nốt
sần ở rễ cây. Chúng sử dụng chất hữu cơ của cây để sinh trưởng đồng thời hút đạm
từ khơng khí để cung cấp cho cây, một phần tích luỹ lại trong cơ thể chúng.
Tảo lam cộng sinh với bèo hoa dâu và hút đạm tích luỹ lại làm cho bèo hoa
dâu có hàm lượng đạm cao, trở thành cây phân xanh rất quý.
Thời gian gần đây, cùng với những tiến bộ của khoa học và công nghệ, các
nhà khoa học đã sử dụng công nghệ gen để tạo ra các chủng vi sinh vật cố định đạm
có nhiều đặc điểm tốt: khả năng cố định đạm cao, khả năng cộng sinh tốt. Công
nghệ sinh học cũng giúp tạo ra những chủng vi sinh vật có đặc tính cạnh tranh cao
với các lồi vi sinh vật trong đất. Mặt khác, công nghệ sinh học đã cho phép các nhà
khoa học tách được gen quy định đặc tính cố định đạm từ vi khuẩn và đem cấy vào
nhân tế bào cây trồng, làm cho một số loài cây trồng cũng tạo được khả năng cố
định đạm như vi khuẩn.
Hiện nay trên thị trường phân bón nước ta, phân vi sinh vật cố định đạm

được bán dưới các tên thương phẩm sau đây:
Phân nitragin chứa vi khuẩn nốt sần cây đậu tương.
Phân rhidafo chứa vi khuẩn nốt sần cây lạc.
Azotobacterin chứa vi khuẩn cố định đạm tự do.
Azozin chứa vi khuẩn cố định đạm từ khơng khí sống trong ruộng lúa. Loại
phân này có thể trộn với hạt giống lúa.
* Phân vi sinh vật hoà tan lân: cây chỉ có thể hút được lân từ đất dưới dạng
hồ tan trong dung dịch đất. Vì vậy, cây chỉ có thể hút được lân ở dạng dễ tiêu trong
đất. Lân ở dạng khó tan trong đất cây khơng hút được. Vì vậy, có nhiều loại đất như
đất đỏ bazan, đất đen, v.v.. hàm lượng lân trong đất khá cao, nhưng cây khơng hút
được vì lân ở dưới dạng khó hồ tan.
Trong đất thường tồn tại một nhóm vi sinh vật có khả năng hồ tan lân.
Nhóm vi sinh vật này được các nhà khoa học đặt tên cho là nhóm HTL (hồ tan lân,
các nước nói tiếng Anh đặt tên cho nhóm này là PSM – phosphate solubilizing
microorganisms).
Nhóm hồ tan lân bao gồm: Aspergillus niger, một số lồi thuộc các chi vi
khuẩn Pseudomonas, Bacillus, Micrococens. Nhóm vi sinh vật này dễ dàng nuôi cấy
trên môi trường nhân tạo. Nhiều nơi người ta đã đưa trộn sinh khối hoặc bào tử các
loại vi sinh vật hoà tan lân sau khi ni cấy và nhân lên trong phịng thí nghiệm, với
3


bột phosphorit hoặc apatit rồi bón cho cây. Sử dụng các chế phẩm vi sinh vật HTL
đem lại hiệu quả cao ở những vùng đất cây bị thiếu lân.
Một số loài vi sinh vật sống cộng sinh trên rễ cây có khả năng hút lân để
cung cấp cho cây. Trong số này, đáng kể là loài VA mycorrhiza. Loài này có thể hồ
tan phosphat sắt trong đất để cung cấp lân cho cây. Ngồi ra lồi này cịn có khả
năng huy động các nguyên tố Cu, Zn, Fe… cho cây trồng. Nhiều nơi người ta sử
dụng VA mycorrhiza đã làm tăng năng suất cam, chanh, táo, cà phê… Nuôi cấy VA
mycorrhiza trên mơi trường nhân tạo rất khó. Vì vậy, hiện nay các chế phẩm có

chưa VA mycorrhiza chỉ có bán rất hạn chế trên thị trường phân bón Mỹ.
Những năm gần đây, trên thị trường phân bón ở một số nước có bán chế
phẩm Phospho – bacterin trong có chứa vi khuẩn giải phóng lân dễ tiêu từ các chất
hữu cơ.
* Phân vi sinh vật kích thích tăng trưởng cây. Gồm một nhóm nhiều lồi vi
sinh vật khác nhau, trong đó có vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, v.v.. Nhóm này được các
nhà khoa học phân lập ra từ tập đoàn vi sinh vật đất.
Người ta sử dụng những chế phẩm gồm tập đoàn vi sinh vật được chọn lọc
để phun lên cây hoặc bón vào đất làm cho cây sinh trưởng và phát triển tốt, ít sâu
bệnh, tăng năng suất. Chế phẩm này còn làm tăng khả năng nảy mầm của hạt, tăng
trọng lượng hạt, thúc đẩy bộ rễ cây phát triển mạnh. Như vậy, chế phẩm này có tác
động tương đối tổng hợp lên cây trồng.
Để sản xuất chế phẩm vi sinh vật kích thích tăng trưởng của cây, người ta sử
dụng công nghệ lên men vi sinh vật. Ở các nước phát triển người ta sử dụng các
thiết bị lên men tự động, công suất lớn. Ở nước ta, đã dùng kỹ thuật lên men trên
môi trường bán rắn để sản xuất chế phẩm này, bước đầu cho kết quả khá tốt.
Những năm gần đây ở nước ta đang tiến hành khảo nghiệm chế phẩm EM
của giáo sư người Nhật Teruo Higa. Chế phẩm này được đặt tên là vi sinh vật hữu
hiệu (Effective microorganisms – EM). Đây là chế phẩm trộn lẫn một nhóm các lồi
vi sinh vật có ích trong đó có vi khuẩn axit lactic, một số nấm men, một số xạ
khuẩn, vi khuẩn quang hợp, v.v.. Tại hội nghị đánh giá kết quả sử dụng EM tại Thái
Lan tháng 11/1989, các nhà khoa học đã đánh giá tác dụng tốt của EM như sau:
- Cải tạo lý hố tính và đặc tính sinh học của đất.
- Làm giảm mầm mống sâu bệnh trong đất.
- Tăng hiệu quả của phân bón hữu cơ.
- Cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt, cho năng suất cao, phẩm chất nông sản
tốt.
- Hạn chế sâu bệnh hại cây trồng.
- Góp phần làm sạch mơi trường.
2.2.2. Phân hữu cơ vi sinh

Phân hữu cơ vi sinh gồm phân vi sinh vật và hợp chất hữu cơ (ít nhất đạt
15%).
Ở nước ta, những quan điểm mới trong sản xuất nông nghiệp ngày càng
được nhận thức sâu sắc và đề cao trong giai đoạn hiện nay là hướng tới sản xuất
4


nông nghiệp bền vững, sinh thái, hữu cơ và an toàn, ... Những quan điểm này là
hoàn toàn đúng đắn và không hề mâu thuẫn với chủ trương phát triển công nghệ
sinh học phục vụ nông nghiệp. Theo ý kiến của một số nhà khoa học, con đường
đảm bảo an ninh lương thực là sản xuất theo hướng thâm canh, trong đó, việc sử
dụng những phân hữu cơ vi sinh đóng vai trị rất quan trọng.
Thời gian qua, các nhà khoa học trong cả nước đã nghiên cứu và sản xuất
thành công một số loại phân hữu cơ vi sinh bón cho cây trồng. Kết quả thử nghiệm
tại các vùng sản xuất cho thấy các sản phẩm phân bón hữu cơ vi sinh này có tác
dụng tích cực đến việc nâng cao năng suất, chất lượng nông sản, đồng thời có tác
dụng bảo vệ mơi trường sinh thái. Một số sản phẩm như Azogin, Rhizolec,
Vitaragin, Phosphobacterin, v..v... đều cho hiệu quả tốt trên cây trồng. Kết quả
nghiên cứu trong nước thời gian qua phải kể đến như:
- Đề tài khoa học cấp Nhà nước KC-08-02 (1991-1995): Nghiên cứu công
nghệ sản xuất và ứng dụng phân bón vi sinh vật cố định Nitơ nhằm nâng cao năng
suất lúa và cây trồng cạn.
- Đề tài khoa học cấp Nhà nước KHCN.02.06 (1996-1998): Nghiên cứu áp
dụng các giải pháp công nghệ mới nhằm mở rộng việc sản xuất và ứng dụng phân
bón vi sinh vật cố định Nitơ, phân giải lân trong nông lâm nghiệp.
- Đề tài khoa học cấp Nhà nước KHCN.02.06B (1999-2000): Nghiên cứu
công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm phân bón vi sinh vật hỗn hợp phát triển
nơng lâm nghiệp bền vững.
- Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước: Nghiên cứu cơng nghệ sản xuất
phân bón vi sinh vật chức năng phục vụ chăm sóc cây trồng cho một số vùng sinh

thái (Mã số KC.04.04) do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam chủ trì
(2001-2004)
2.2.3. Phân hữu cơ vi sinh đối kháng
Phân hữu cơ vi sinh đối kháng về thành phần cơ bản như phân hữu cơ vi sinh,
trong đó có bổ sung thêm một số loại vi sinh vật (Bacillus, Pseudomonas,
Metarhizium, Beauveria...) có khả năng đối kháng cao với một số bệnh hại cây trồng
như: bệnh héo xanh, bệnh héo vàng, bệnh thối quả, thối thân, thối rễ, ..... Nhờ vậy,
loại phân này có phổ tác dụng rất rộng trên nhiều loại cây trồng, khơng những góp
phần làm tăng năng suất cây trồng mà cịn tăng chất lượng nơng sản, đảm bảo cho
sự phát triển một nền nông nghiệp hữu cơ bền vững.
Đây chính là sản phẩm cần được hồn thiện, phát triển mạnh mẽ trong xu thế hội
nhập hiện nay.
2.3. Nhu cầu sản xuất và tiêu thụ phân hữu cơ vi sinh tại Sơn La
Theo thống kê, với nhu cầu sản xuất và tiêu thụ phân hữu cơ vi sinh tại tỉnh
Sơn La từ 2009 đến hiện nay là rất lớn
5


Theo từng loại cây
TT

Loại cây

Nhu cầu (tấn)

1

Cây chè

7.502

2

Cây cà phê

3

Cây dâu tằm

2.594

4

Cây mía

6.548

5

Cây ăn quả

27.272

6

Cây lương thực

12.186

12.139

Tổng
(Nguồn: Sở Nơng nghiệp & PTNT tỉnh Sơn La, 2009)

68.262

Theo địa bàn
TT
Huyện
Nhu cầu (tấn)
1
Huyện Mộc châu
9.931
2
Huyện Phù Yên
4.317
3
Huyện Yên Châu
8.248
4
Huyện Mai Sơn
16.411
5
Huyện Bắc Yên
2.178
6
Huyện Sông Mã
5.464
7
Thị xã Sơn La

9.494
8
Huyện Thuận Châu
8.152
9
Huyện Quỳnh Nhai
599
10
Huyện Mường La
3.468
Tổng
68.262
(Nguồn: Sở Nông nghiệp & PTNT tỉnh Sơn La, 2009)
2.4. Trữ lượng than bùn tại Sơn La
Tại Sơn La có nhiều mỏ than bùn với trữ lượng lớn, độ ngập nước cao nhưng
khi phơi khơ thì rất nhẹ, thành phần chủ yếu là mùn cây, xác thực vật đã phân hủy
cao hoàn toàn đồng nhất, chất lượng tương đương loại tốt nhất ở Việt Nam.
6


Trữ lượng than bùn ở một số mỏ đại diện tại Sơn La
Trữ lượng
TT
Điểm mỏ
Đơn vị
tính
Tổng số
Cấp I
1 Tân Lập - Mộc
Tấn

107.060
64.660
Châu
2 Chiềng Ve – Mộc
Tấn
105.503
49.790
Châu
3 Mường Chanh Tấn
35.979
4.100
Mai Sơn
4 Mường Lựm -Yên
Tấn
1.463
Châu
5 Bản Ban - Huy
Tấn
18.220
Thượng
Tổng
268.225
118.550
(Nguồn: Sở Nông nghiệp & PTNT tỉnh Sơn La, 2009)

Cấp II
42.400
55.713
31.879
1.463

18.220
149.675

Theo khảo sát những mỏ than bùn này có hàm lượng chất hữu cơ cao, đạt trên
20%, đảm bảo đủ nguyên liệu và chất lượng cho sản xuất với công suất 5.000 tấn
phân hữu cơ vi sinh/năm.
III. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn bộ chủng giống vi sinh vật sử dụng cho sản
xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng
- Khảo sát và thu thập mẫu đất tại 3 vùng đặc thù chuyên canh cây cà phê, đậu
tương và ngô ở Sơn La.
- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật thuộc 3 nhóm: phân giải lân, cố
định Nitơ, đối kháng bệnh chết héo cây do vi khuẩn Ralstonia solanacearum
và thối thân cây do vi khuẩn Erwinia carotovora.
- Đánh giá hoạt tính sinh học các chủng vi sinh vật tuyển chọn.
- Định tên và xác định độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật tuyển
chọn.
Nội dung 2: Xây dựng và hồn thiện quy trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối
kháng
2.1. Nghiên cứu, sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng qui mơ phịng thí nghiệm
- Nghiên cứu khả năng tổ hợp của các chủng VSV đối kháng.
7


- Đánh giá ảnh hưởng của tổ hợp VSV tuyển chọn đến sinh trưởng phát triển
cây trồng (cà phê, đậu tương, ngô).
- Nghiên cứu nhân sinh khối VSV đối kháng.
- Nghiên cứu hồn thiện quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng.
- Đánh gía hiệu quả của chế phẩm vi sinh đối kháng trên 03 loại cây trồng
2.2. Nghiên cứu hồn thiện quy trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng qui

mô bán công nghiệp từ than bùn.
- Nghiên cứu xử lý nguyên liệu hữu cơ bằng các chế phẩm vi sinh đối kháng
- Nghiên cứu hồn thiện quy trình sản xuất 03 loại phân hữu cơ vi sinh đối
kháng
- Đánh giá hiệu quả của 03 loại phân hữu cơ vi sinh đối kháng trên cây trồng
(cà phê, đậu tương và ngô) trong điều kiện nhà lưới.
2.3. Nghiên cứu hồn thiện quy trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng từ
các nguồn phế phụ phẩm khác nhau.
- Nghiên cứu xử lý sơ bộ phế phụ phẩm nơng nghiệp phù hợp, sẵn có ở Sơn
La.
- Nghiên cứu hồn thiện quy trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh đối kháng từ
các nguồn nguyên liệu phế phụ phẩm.
- Đánh giá hiệu quả của phân hữu cơ vi sinh đối kháng (sản xuất từ các nguồn
phế phụ phẩm nông nghiệp) trên cây trồng (cà phê, đậu tương và ngơ).
Nội dung 3: Xây dựng quy trình sử dụng phân hữu cơ vi sinh đối kháng
- Xây dựng, áp dụng quy trình sử dụng phân hữu cơ vi sinh đối kháng trên
03 loại cây trồng trọng yếu (cà phê, đậu tương và ngơ).
- Hiệu chỉnh, đề xuất quy trình sử dụng phân hữu cơ vi sinh đối kháng trên
03 loại cây trồng trọng yếu (cà phê, đậu tương và ngơ).
Nội dung 4: Xây dựng mơ hình sử dụng phân hữu cơ vi sinh đối kháng
- Xây dựng 03 mô hình đánh giá khả năng thích ứng của phân hữu cơ vi sinh
đối kháng cho một số đối tượng cây trồng (cà phê, đậu tương và ngô).
- Tổ chức hội nghị đầu bờ tổng kết mơ hình: tổ chức hội nghị và giới thiệu kết
quả sử dụng phân hữu cơ vi sinh đối kháng tới các hộ nông dân.
8


- Quảng cáo sản phẩm trên các phương tiện thông tin đại chúng.
Nội dung 5: Đăng ký sản phẩm phân hữu cơ vi sinh đối kháng
- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở.

- Khảo nghiệm và đăng ký “Phân hữu cơ vi sinh đối kháng Ngọc Trung”.
IV. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
4.1.1. Vật liệu
- Mẫu đất thu ở các huyện Mộc Châu, Yên Châu, Mai Sơn, Sông Mã, thành
phố Sơn La.
- Giống đậu tương ĐT84
- Giống ngô lai CP999
- Giống cà phê: Catimor 4 năm tuổi
- Phân hữu cơ vi sinh vật đối kháng
- Các thiết bị, hóa chất thuộc Bộ môn Vi sinh vật – Viện Thổ nhưỡng Nơng
hóa.
+ Mơi trường AT để phân lập và nhân sinh khối vi khuẩn kích thích sinh
trưởng thực vật: CaCO3 20g; Gluco 20g; K2HPO4 0,8g; MgSO4.7H2O 0,5g; KH2PO4
0,2g; FeCl3.6H2O 0,1g; Na2MoO4.2H2O 0,05g; nước cất 1000 ml.
+ Môi trường King B: Để phân lập và nhân sinh khối vi sinh vật kích thích
sinh trưởng nhóm Bacillus: Yeast extract 5g; pepton 20g; glyxerin 5 ml; K2HPO4
(12,5%) 12 ml; MgS04.7H20 (6,25%) 25 ml; nước cất 1000 ml.
+ Môi trường SPA. Để phân lập và nhân sinh khối vi sinh vật kích thích sinh
trưởng nhóm Pseudomonas: Saccharoza 20g, peptone 5g, K2HPO4 0,5g,
MgS04.7H20 0,25g, nước cất 1000 ml.
+ Môi trường SX1 để nhân sinh khối các chủng VSV: đậu trắng 100 g;
K2HPO4 0,5g; MgSO4.7H2O 0,5g; KH2PO4 0,5g; (NH4)2SO4 1,0g; CaCO3 1,0g;
Glucoza 5,0g; nước cất 1000 ml.
+ Môi trường SX2 để nhân sinh khối các chủng VSV: Rỉ đường 10g; đậu 50g;
CaCO3 1,0g; Bột nấm men 5,0g; nước cất 1000 ml.
+ Môi trường TTC: Để nghiên cứu hình thái khuẩn lạc R.solanacearum
(Kelman, 1954): pepton 10 g; cazein hydrolyzat 1g; glucoza 5g; thạch 20g; nước cất
1 lần 1000 ml. Khử trùng ở 0,5 at, 121°C, 20 phút, làm lạnh đến 60 °C và thêm 5 ml
2-3-5 Triphenyl Tetrazolium Chloride 1 %.
+ Môi trường 523: Để nuôi cấy R.solanacearum: MgSO4.7H2O (6,25%) 5 ml;

K2HPO4 12,5%) 16,3 ml; yeast extract 4g; casein hydrolyzat 8g; sucaroza 10g; agar
18g; nước cất 1000 ml.

9


+ Môi trường King B (KB): Để phân lập và thu sinh khối vi khuẩn đối kháng:
Yeast extract 5g; pepton 20g; glyxerin 5 ml; K2HPO4 (12,5%) 12 ml; MgS04.7H20
(6,25%) 25ml; nước cất 1000ml.
+ Môi trường LB: Để nuôi cấy vi khuẩn đối kháng (Luria Broth: Difco
Bacto): tryptone 10g; difco bacto yeast extract 5g; NaCl 5g; nước cất 1000 ml.
+ Môi trường PDA: Glucoza 20.0 g; Khoai tây 200.0 g; Thạch 15 g nước cất
1000 ml.
+ Môi trường Czapek- Dox: Sucrose 30.0g; NaNO3 3.0g; MgSO4.7 H2O 0.5g;
KCl 0.5g; FeSO4 x 7 H2O 0.01g; K2HPO4 1.0g; Thạch 15g; Nước cất 1000 ml.
+ Môi trường mước chiết Malt: Glucoza 20.0g; Malt extract 20.0g Pepton
1.0g; Thạch 20.0g; Nước cất 1.000 ml ; pH=5.6
+ Môi trường Pikowskia (để phân lập và tuyển chọn vi sinh vật phân giải lân):
Ca3(PO4)2: 0,5g; Sacarose 10g; (NH4)2SO4: 0,5; NaCl: 0,2g; MgSO4.7H2O: 0,1g;
KCl: 0,2g; Cao nấm men: 0,5g; MnSO4: vết; FeSO4: vết; nước cất: 1.000 ml;
pH=7.
4.1.2. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn Azotobacter theo Erogov (1983)
- Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật (theo phương pháp Koch)
- Phương pháp so màu với thuốc thử Nessler theo Lê Văn Khoa (1996)
- Phương pháp nghiên cứu đặc điểm ni cấy và hình thái theo Nguyễn Lân
Dũng (1998).
- Phương pháp xác định khả năng cố định nitơ của vi sinh vật: Khả năng cố
định nitơ của các chủng vi sinh vật được xác định bằng phương pháp đo hoạt tính
khử axetylen trên máy sắc ký khí. Azotobacter được ni cấy trên mơi trường dịch

bán lỏng (4 ml môi trường trong lọ 10 ml) hoặc cắt tồn bộ phần rễ cây lạc cho và
bình tam giác 250 ml (đối với Rhizobium). Đậy kín lọ/bình bằng nút cao su, dùng
bơm tiêm thay thế 10% thể tích khí trong lọ/bình bằng khí axetylen. Ủ mẫu qua 24 h
rồi tiến hành phân tích mẫu trên máy sắc kí khí.
Kết quả tính tốn được thực hiện theo cơng thức:
V1.V2.V3.L1.10-6
M=
V4.V5.L2.22,4

Trong đó:
M : Hoạt tính cố định nitơ được thể hiện bằng lượng Etylen tạo thành
V1: Lượng axetylen dùng để hoà vào bình hồ lỗng khí chuẩn
V2: Thể tích bình đựng mẫu
V3: Thể tích khí Etylen chuẩn đã hồ lỗng được bơm vào máy
V4: Thể tích lọ dùng để hồ lỗng khí chuẩn
V5: Thể tích mẫu bơm vào máy
L1: Chiều cao píc của vạch mẫu trên băng tự ghi của máy sắc kí khí
10


L2: Chiều cao píc của vạch mẫu trên vạch Etylen chuẩn trên băng tự ghi của
máy sắc kí khí
t: Thời gian ủ mẫu
22,4. 106: Hệ số chuyển số ml khí Etylen sang số nmol khí Etylen
- Phương pháp phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng R.
solanacearum và F.oxysporum.
+ Thu mẫu: mẫu là các đoạn thân sát cổ rễ và bộ rễ của những cây lạc và
vừng khoẻ, đang thời kỳ ra hoa kết quả. Mẫu đất được thu ở độ sâu 15 cm ÷ 20 cm,
mỗi điểm thu 100g đất, mẫu được đựng trong từng túi polyetilen riêng biệt, ghi ngày
tháng năm và địa điểm thu mẫu.

+ Phân lập và tuyển chọn: (theo Geels và Schippers -1983).
10 g đất được khuấy đều trong 90 ml nước cất khử trùng, lắc 30 phút, để lắng
tự nhiên, lấy phần dịch trong để phân lập vi khuẩn đối kháng. Mẫu thu từ các cây
được nghiền trong cối sứ có chứa 1 ml nước cất khử trùng, bỏ cặn, sử dụng phần
dịch để phân lập vi khuẩn đối kháng.
Bước 1: Mỗi mẫu dịch trên được pha loãng đến nồng độ nhất định, sao cho
khi dùng 0,1 ml trải đều trên bề mặt môi trường KB hoặc PDA, ủ ở nhiệt độ 280C ÷
300C trong 24 ÷ 48 giờ có thể nhìn rõ các khuẩn lạc riêng biệt.
Bước 2: Những khuẩn lạc có sắc tố vàng, nâu hoặc xanh nhạt được hồ lỗng
trong các ống eppendorf riêng biệt, dùng 100µl dung dịch trải đều trên bề mặt đĩa
môi trường KB hoặc PDA (mật độ tế bào trong dung dịch sao cho sau khi ủ ở 280C
÷ 300C trong 24 ÷ 48 giờ có thể nhìn rõ các khuẩn lạc riêng biệt).
Bước 3: Phun dịch vi khuẩn gây bệnh héo xanh phủ lên bề mặt môi trường, ủ
ở nhiệt độ 280C ÷ 300C trong 24 ÷ 48 giờ.
Bước 4: Quan sát các đĩa môi trường, nếu xuất hiện những vùng ức chế (vịng
vơ khuẩn), nghĩa là có vi khuẩn đối kháng tại điểm đó.
Bước 5: Những tế bào vi khuẩn đối kháng được làm sạch và giữ trong nước
cất khử trùng hoặc glyxerol 30% ở - 800C để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
+ Đánh giá hoạt lực của vi khuẩn đối kháng
++ Chủng vi khuẩn đối kháng cần kiểm tra được cấy bằng tăm vô trùng lên
điểm giữa của bề mặt môi trường KB (môi trường đặc), để vi khuẩn phát triển ở
280C ÷ 300C trong 24 ÷ 48 giờ, các tế bào phát triển thành cụm khuẩn lạc hình trịn.
++ Dùng bơng vơ trùng loại bỏ các tế bào trong cụm khuẩn lạc.
++ Xử lý những tế bào cịn sống sót bằng cách xơng hơi chloroform từ 45 đến
60 phút.
++ Phun dung dịch vi khuẩn gây bệnh héo xanh đạt mật độ 107÷108 tế bào/ml
kín bề mặt mơi trường.
++ Ủ ở nhiệt độ 280C ÷ 300C, sau 48 giờ quan sát khả năng đối kháng của vi
khuẩn được thể hiện qua hiện tượng có hay khơng có vịng ức chế.
++ Dựa vào kích thước vịng ức chế để đánh giá hiệu lực đối kháng của chúng.

11


- Phương pháp Salkowsky cải tiến (Misra và cs, 1989): sử dụng để xác định
khả năng sinh tổng hợp IAA thô: Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong mơi
trường có bổ sung 0,1% Triptophan. Sau thời gian ni cấy, ly tâm, thu được dịch
trong. Cho 2 ml dịch trong vào ống nghiệm chứa 8 ml thuốc thử Salkowsky cải tiến.
Lắc đều, để yên trong 20 phút, sau đó so màu trên máy với bước sóng 530nm. Hàm
lượng IAA tạo ra trong mơi trường được tính tốn trên cơ sở đồ thị IAA chuẩn.
Thuốc thử Salkowsky cải tiến: FeCl3 0,5M 15ml; H2SO4 98% 300 ml; Nước
cất 500 ml.
- Phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch đĩa để xác định khả năng
phân giải kitin.
- Phương pháp phân lập vi sinh vật phân giải lân: Lấy 10 g mẫu cho vào cối
sứ nghiền nhỏ và đưa vào bình tam giác có chứa 90 ml nước cất vơ trùng (độ pha
lỗng 10-1) lắc bằng máy lắc ở tốc độ 100 vòng/phút trong 15 phút. Hút 0,5 ml dịch
cho vào ống nghiệm có chứa 4,5 ml nước cất vơ trùng ta được nồng độ pha loãng
10-2. Tiếp tục làm như vậy cho tới khi thu được độ pha lỗng thích hợp. Lấy pipet vô
trùng hút 0,1 ml dịch huyền phù từ các ống nghiệm có độ pha lỗng thích hợp cho
vào đĩa Petri có chứa mơi trường Pikowskia. Gạt đều và ủ ở 30 0C trong vài ngày
cho tới khi xuất hiện khuẩn lạc. Với mỗi độ pha loãng cấy ra 3 đĩa. Sau khi xuất
hiện khuẩn lạc trên các đĩa, đếm số khuẩn lạc vi sinh vật có vịng bao quanh. Đây
chính là các vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất phốt pho vơ cơ khó tan.
Đồng thời đếm tổng số VSV có trên các mơi trường tổng số để tính tần số bắt gặp vi
sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất phốt pho vơ cơ khó tan.Các khuẩn lạc
này chưa đảm bảo thuần khiết về mặt di truyền và giữ mức độ ổn định hoạt tính cho
nên cần phải giữ chúng trong các ống nghiệm giữ giống để làm sạch.Để làm sạch
dùng que cấy vơ trùng lấy một vịng que cấy sinh khối của giống cần làm sạch cho
vào ống nghiệm chưa 4,5 ml nước cất vơ trùng. Trộn đều và pha lỗng tiếp cho đến
khi đạt được độ pha lỗng thích hợp. Hút 0,1 ml dịch huyền phù từ các độ pha lỗng

thích hợp nhỏ vào đĩa pettri có chứa mơi trường Pikowskia gạt đều và ủ cho đến khi
xuất hiện khuẩn lạc. Giữ các khuẩn lạc riêng rẽ có vịng trong bao quanh trong ống
nghiệm giữ giống và tiếp tục làm sạch cho đến khi thu được giống thuần khiết. Cấy
truyền những khuẩn lạc có vịng phân hủy sang ống nghiệm thạch nghiêng để giữ
giống.
Mơi trường giữ giống thạch nghiêng có thành phần như sau (g/l): Glucose:
10g; Cao nấm men; 6,5g; Ca3(PO4)2: 5g; (NH4)2SO4:
0,5g; Kl:
0,2g;
MgSO4.7H2O: 0,1g; MnSO4: 0,01g; FeSO4: 0,01g; Agar: 20g; H2O: 1000ml
- Xác định định tính khả năng phân hủy phốtpho vô cơ: lựa chọn sơ bộ dựa
trên độ lớn và độ trong của vòng phân hủy. Cấy các chủng đã phân lập được trên
mơi trường dịch thể có thành phần giống như thành phần môi trường phân lập khơng
có thạch. Mỗi chủng cấy vào 1 ống nghiệm chứa 5ml môi trường với một lượng cấy
tương đối bằng nhau (1 vịng que cấy), ni cấy trên máy lắc 24h. Dùng micropipet
cấy dịch vi sinh vật trên môi trường thạch bằng có thành phần giống như mơi trường
12