Luận văn thạc sĩ sinh học nghiên cứu tạo các dòng ngô mang gen isopentenyl transferase (ipt) bằng phương pháp biến nạp nhờ vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

NGHIÊN C U TẠO CÁC

NG NG

ISOPENTENYL TRANSFERASE (IPT
NẠP NH

MANG G N

NG PH

NG PHÁP I N

VI KHU N AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

Người hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng

H

vi n

: Tr n uy H ng

Hà Nội – 2015

Luận văn thạc sỹ Sinh học


L i cảm n
Để hoàn thành bản luận văn này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới
guy n ăn Đ ng

tận t nh, d u dắt, h ớng dẫn, truy n

qu b u c ng nh

t nh ng inh nghi

ng vi n và t o mọi i u ki n giúp ỡ tôi trong qu tr nh học

tập và nghi n cứu.
Tôi xin g i l i cả

ơn ến phòng ào t o

t o i u i n và tận t nh h ớng dẫn

ọi th t c ể tơi c thể hồn thành luận văn này
ơi xin g i l i cả ơn tới tập thể c n b

hịng thí nghi m Trọng iể Cơng ngh

tế bào hực vật - Vi n Di truy n ông nghi p

giúp ỡ nhi t t nh trong suốt th i

gian tôi thực hi n h a luận.
Cuối c ng nh ng hông
b n bè, nh ng ng
gian là

i

ph n quan trọng, tôi xin g i tới bố mẹ, anh chị c ng
luôn quan tâ , ng h và là chỗ dựa cho tôi trong suốt th i

h a luận này, c ng nh trong cu c sống.

ôi luôn ghi nhớ và hông bao gi qu n sự giúp ỡ vô c ng to lớn
ến tất cả qu th y cơ, gia

ơi xin g i

nh, b n bè lịng biết ơn vô tận
Hà Nội, ngày 24 tháng 12 năm 2015
Học viên

n

i

Luận văn thạc sỹ Sinh học

y H ng


M c

c

L i cảm n ......................................................................................................................................... i
M c

c .............................................................................................................................................. ii

nh m c h nh v ........................................................................................................................... iv
nh m c ảng................................................................................................................................. v
nh m c c c ch vi t t t .............................................................................................................. vi
M

Đ U ........................................................................................................................................... 1

Ch

ng –T NG QUAN ............................................................................................................... 3

1.1

Nguồn gốc cây ngô............................................................................................................ 3

1.2

T nh h nh nghiên cứu ngô trên th giới .......................................................................... 5

1.3

T nh h nh nghiên cứu ngô ở Việt Nam: .......................................................................... 9

1.4
C sở ho học v nghiên cứu nạp gen vào thực vật bằng ph ng ph p
Agrobacterium tumefaciens ........................................................................................................ 13
1.4.1

Ti-Plasmid ............................................................................................................... 14

1.4.2

Chức năng c

1.4.3

C ch chuy n gen ằng A. tumefaciens ............................................................... 16

1.4.4

Gen ch th - gen chọn ọc và c ch hoạt động chọn lọc c a hygromycin ........ 18

T-DNA .......................................................................................... 16

C ch ch u hạn hiện t

1.5

ng già h

và gen IPT ......................................................... 19

1.5.1

C ch ch u hạn c

1.5.2

Hiện t

1.5.3

Đi u hò sự già h

1.5.4

Gen ipt và promoter pSARK12 ............................................................................. 21
C c ph

1.6

Ph

1.6.2

Ki m tr

và v i trò c

ng ph p Southern

Cyto inin ...................................................... 20

ot .................................................................................. 21

hả năng ch u hạn ở t i

ng – VẬT LIỆU VÀ PH

2.1

và c c y u tố ảnh h ởng ....................................................... 20

ng ph p i m tra sự c mặt và i u hiện c a gen bi n nạp ....................... 21

1.6.1
Ch

ng già h

thực vật ................................................................................ 19

cây con ...................................................... 22

NG PHÁP ............................................................................ 24

Vật liệu ............................................................................................................................ 24

2.1.1

Vật liệu thực vật ..................................................................................................... 24

2.1.2

Ch ng vi khuẩn và vector dùng trong chuy n gen ............................................. 24

2.1.3

H

2.2

Ph

chất và thi t b sử d ng.................................................................................. 24

ng ph p nghiên cứu............................................................................................... 25

2.2.1
Quy tr nh chuy n gen vào phôi non thông qu vi huẩn Agrobacterium
tumefaciens .............................................................................................................................. 25

ii

Luận văn thạc sỹ Sinh học


2.2.2

Phân tích cây chuy n gen bằng ph

2.2.3

Đ nh gi

2.2.4

Đ nh gi sự h
Đ

2.3
Ch

hả năng ch u hạn c
già c

đi m, th i gi n và ph

ng ph p sinh học phân tử. ....................... 27

c c dịng ngơ chuy n gen ở th i

trong đi u iện

cây con 30

c t h i cành .............................. 31

ng ph p xử ý số liệu ....................................................... 31

ng - K T QUẢ .................................................................................................................... 32

3.1

K t quả c

3.2

Ki m tr

qu tr nh chuy n gen,chọn ọc và t i sinh c
ằng ph

giống ngô................. 32

ng ph p sinh học phân tử............................................................ 35

3.2.1

K t quả t ch chi t NA t ng số ............................................................................ 35

3.2.2

K t quả phân tích cây chuy n gen ằng ph

ng ph p PCR gen hpt ................ 36

3.2.3

K t quả phân tích cây chuy n gen ằng ph

ng ph p PCR gen ipt ................. 37

3.2.4

K t quả phân tích Southern

3.3 K t quả đ nh gi
3.4
Ch

ot c c dịng ngơ chuy n gen th hệ T .............. 38

hả năng ch u hạn c

K t quả đ nh gi qu tr nh h

c c dòng ngô chuy n gen ở th i

già c

hi

c t

cây con 40

............................................ 45

ng – THẢO LUẬN ............................................................................................................. 46

4.1

Chuy n gen thông qu vi huẩn ................................................................................... 46

4.2

Phân tích ằng ph

4.3

Đ nh gi s

Ch

ng ph p sinh học phân tử........................................................... 47

ộ i u hiện ch u hạn c

cây con ở đi u iện phịng thí nghiệm......... 49

ng – K T LUẬN VÀ KI N NGH .................................................................................. 52

5.1

K t uận ........................................................................................................................... 52

5.2

Ki n ngh ......................................................................................................................... 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................. 53
PH L C ........................................................................................................................................ 59

iii

Luận văn thạc sỹ Sinh học


nh m c h nh v
H nh 1: ấu trú Ti-plasmid ............................................................................................................ 14
H nh 2 : Hệ thống ve tor li n hợp .................................................................................................... 15
H nh 3 : Hệ thống vector nhị thể (kép) ............................................................................................ 15
H nh 4: ấu trú T-DNA ................................................................................................................. 16
H nh 5 : S
ấu trú ve tor pSI hyg-2 ....................................................................................... 24
H nh 6 : S
quy tr nh huyển gen ............................................................................................... 27
H nh 7: Kh n ng ph h i- ti p nh n- t i sinh
giống ng ................................................. 32
H nh 8: T n số huyển gen gi ịnh................................................................................................. 33
H nh 9: M t số h nh nh
gi i o n huyển gen ......................................................................... 33
H nh 10: K t qu iện i N t ng số ............................................................................................ 36
H nh 11: K t qu ph n t h P R gen hpt th hệ T0 ......................................................................... 37
H nh 12: K t qu ph n t h P R gen ipt th hệ T0 .......................................................................... 37
H nh 13: K t qu ph n t h P R gen ipt th hệ T1 .......................................................................... 38
H nh 14: K t qu Southern lot

ng huyển gen ở th hệ T1 .................................................. 39
H nh 15:
nh gi kh n ng hịu h n ở gi i o n y on ở nh lưới số 1 r
yx l
h n .................................................................................................................................................... 40
H nh 16: K t qu
nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o hi u o th n l v
hi u i r
i nhất t i nh lưới số 1............................................................................................... 41
H nh 17: K t qu
nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o tr ng lượng tư i t i nh
lưới số 1............................................................................................................................................ 41
H nh 18: K t qu
nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o tr ng lượng kh t i nh
lưới số 1............................................................................................................................................ 41
H nh 19:
nh gi kh n ng hịu h n ở gi i o n y on ở nh lưới số 2 r
yx l
h n .................................................................................................................................................... 43
H nh 20: K t qu
nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o hi u o th n l v
hi u i r
i nhất t i nh lưới số 2.............................................................................................. 43
H nh 21: K t qu
nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v tr ng lượng tư i t i nh
lưới số 2............................................................................................................................................ 44
H nh 22: K t qu
nh gi kh n ng hịu h n gi i o n y on n v o tr ng lượng kh t i nh
lưới số 2............................................................................................................................................ 44
H nh 23: nh gi qu tr nh h gi

l H9 ............................................................................. 45
H nh 24: nh gi qu tr nh h gi
l M8............................................................................. 45

iv

Luận văn thạc sỹ Sinh học


nh m c ảng
ng 1: Ph n lo i thực v t ................................................................................................................. 3
ng 2: T nh h nh s n xuất ng tr n th giới những n m g n y ................................................... 5
ng 3: T nh h nh s n xuất ng ở Việt Nam những n m g n y .................................................. 10
ng 4: Th nh ph n inh ư ng trong 100g h t ............................................................................. 11
ng 5: Tr nh tự m i ........................................................................................................................ 29
ng 6: K t qu t ng hợp th nghiệm huyển gen chịu h n ............................................................ 32
ng 7: Số opy gen huyển ............................................................................................................ 39

v

Luận văn thạc sỹ Sinh học


nh m c c c ch vi t t t

WW

i u kiện tưới nướ

WS

i u kiện x l h n

SH

hi u

o th n l

LRL

hi u

ir

y

i nhất

FWS

Tr ng lượng tư i th n l

FWR

Tr ng lượng tư i r

DWS

Tr ng lượng kh th n l

DWR

Tr ng lượng kh r

IM

M i trường l y nhi m

CCM

M i trường

REM

M i trường nu i ph

h i

ECM

M i trường h n l

m s o

SeM

M i trường ph t sinh h i

RM

M i trường r r

vi

Luận văn thạc sỹ Sinh học

ng nu i ấy


M
y ng l
n m

y lư ng thực quan tr ng cho n n kinh t to n

y lư ng thự

h nh

sống on người ũng như
ược phẩm .Ở
lư ng thự

Đ U

a th giới. S n phẩm từ ng ngo i l thực phẩm nu i
ng v t r

thể ược ng d ng trong nhi u ng nh như

nước Trung Mỹ, N m Á v

h u Phi, người ta s d ng ng l m

h nh ho người với phư ng th c rất

qu n mỗi n i. Ng l

u, l m t trong

ng theo vùng ị l v t p

y lư ng thự giúp nhi u n i gi i quy t n n

i trong

Việt N m. S n phẩm từ ng ngo i l thực phẩm nu i sống on người ũng như
ng v t r

thể ược ng d ng trong ng nh kh

ng ngo i việc s d ng l m hất ốt

như ược phẩm. G n

y th n

n l nguy n liệu ti m n ng ể ch t o x ng

sinh h c.
S n lượng ng h ng n m ị gi m sút

ng kể bởi rất nhi u nh n tố sinh v t

(biotic) ũng như phi sinh (abiotic). Trong

h n h n l nguy n nh n phi sinh

quan tr ng nhất khi n s n lượng ng mất m t l n
với lượng nướ mư ph n ố kh ng
gi m

n h n 70%.

ất kh

ằn c ng

n 1,3 tấn/ha

u dẫn tới k t qu thu ho ch chỉ

ng kể so với ti m n ng thu ượ h n 10 tấn/ ha [64]. Ch nh sự kh

t ng tố qu tr nh lão h

l , suy gi m kh n ng qu ng hợp dẫn

ằn ã l

n gi m sút

s n lượng [84].
ytokinin

v i tr thi t y u

n nhi u qu tr nh t ng trưởng v ph t triển

c a thực v t ặc biệt trong sự ph n hi t
o in vitro, ytokinin

t
h

o [68]. Trong

v i tr rõ r ng trong việ giúp m l t h rời ch m tho i

iệp l c tố. Ngay c trong thực ti n th việc x l

thư ng m i rất lớn v
ho h v kéo

Trong khi những phư ng ph p

nh t

nhất ịnh trong việc t o ra những giống

ã ướ

v o việc t o

nghĩ

a rau sau thu

y [45].

truy n thống ã

những th nh

ng

y hịu h n, th việc b sung v kỹ thu t

y huyển gen th h ng ược với h n h n ũng

u ch ng minh ược k t qu c

n p gen ipt- mã h

ytokinin ũng m ng

ytokinin giúp uy tr sự xanh tư i l u h n

i tu i th c a hoa sau khi cắt khỏi

ng nghệ sinh h

ng nghệ nu i ấy m

m nh.

ã

những nghi n

enzyme isopentenyl tr nsfer se li n qu n

1
Luận văn thạc sỹ Sinh học

u v bi n

n sinh t ng hợp


cytokinin isopentenyl adenine, ze tin v

ihy roze tin v o m t số

trường hợp như: lú - Oryza sativa [41], súp l - Brassica oleracea

qu cho thấy

[72] v x l h- Lactuca sativa L. cv Evola [65], thuố l [84],
v ng [85]

u

t những th nh

ng nhất ịnh. Nhằm ướ

kh n ng hịu h n, húng t i ti n h nh
mang gen isopentenyl transferase (ipt)
huẩn Agrobacterium tumefaciens” với m
 Bi n n p th nh
 Kiểm tra sự


ướ

y tr ng. K t

u

ng [58], l c[78]
u t o ra giống ng

t i “Nghiên cứu tạo c c dịng ngơ
ằng ph

ng ph p

i n nạp nh

ti u:

ng gen ipt v o m t số

ng ng

h nl c

mặt c a gen ipt bằng kỹ thu t sinh h
nh gi kh n ng hịu h n ở

ph n t

y on th hệ T1

2
Luận văn thạc sỹ Sinh học

vi


Ch

ng

–T NG QUAN

1.1 Nguồn gốc cây ngô
Ng hay bắp

t n kho h

ngu n từ ti ng T y

l Zea mays L. Trong ti ng Anh từ “m ize” ắt

n Nh (m z) (“M ize”- Oxford English Dictionary online

edition). Từ “ orn” thường hay s d ng hiện n y l
orn”

nghĩ l “ y lư ng thực c

người

h g i rút g n c

“In i n

nh i ng” (“M ize”-Oxford English

Dictionary online edition.).
ảng 1: Phân oại thực vật
Giới (kingdom):

Plantae

(kh ng ph n h ng):

Angiosperms

(kh ng ph n h ng):

Monocots

(kh ng ph n h ng):

Commelinids

B (order):

Poales

H (family):

Poaceae

Chi (genus):

Zea

Lo i (species):

Z. mays

nhi u gi thuy t ượ
ịnh: 1.Sự thu n h
h

v

ư r v ngu n gốc c

ng trong

trực ti p từ cỏ teosinte 2.Ngu n gốc từ

y l i giữ ng thu n

ỏ teosinte 3.Tr i qua hai hay nhi u qu tr nh thu n h

d i v teosinte 4.Ti n h
102]. Những nghi n

uv

từ

y l i c a Z. diploperennis thu
i truy n h

g n

n i l n 4 nh n
a c ng ho ng

lo i Trips um [73,

y ho rằng qu tr nh thu n h

i n r v o kho ng n m 7000 T N t i mi n trung Mexi o v t ti n
ỏ teosinte ho ng
s ng
nghi n

i g n giống nhất với ng ng y n y vẫn

nm

ng

n l lo i
trong lưu vự

ls s [36]. George Beadle v o n m 1939 ã hi sẻ qu n iểm n y trong
uc

m nh v ngu n gố

y ng [27]. Trướ

v o n m 1926 Vavilop

ũng ã h ng minh mi n trung n m Mehi o l trung t m ph t sinh th nhất v

3
Luận văn thạc sỹ Sinh học


vùng núi Andet thu

Peru l trung t m ph t sinh th hai c

y ng [98].

ng

qu n iểm với ng l Galinat v K to l n lượt v o n m 1977 v

1988 [42, 55].

Theo những nghi n

th ch bắp ng

u v kh o c h

người t t m thấy những h

t i h ng Guil N quitz trong thung lũng O x
v

nhất l t i h ng
những nghi n

ho l

ng Tehu

n, Pue l

i kho ng n m 4250 T N,
n

i 3450 TCN [86].
những

ng

ng

ã l n r ng h t

T y N m Ho kỳ v

n

olum i v nhi u vùng thu
người h u Âu m khởi

vùng thu

ược

bằng

ũng như xuống ph

ul

huy n th m hiểm c

huy n th m hiểm th h i n m 1494, Ng

nh n bi t ượ gi trị c
những n m
Nh , It li

u

p, Th Nhĩ Kỳ, Ph p,

ư

Theo nh
Việt N m qu

n

nh

ng Ấn

h u Mỹ c a

olom us n m 1493 v

ã ượ

ư v o

ặc

u ti n t i T y

h u Âu [21]. Người t nh nh h ng

th kỷ XVI, ằng ường th y

i

ắc,

N m hile, E u or,

y ng v ph bi n húng ng y

y ng r h u h t

N m 1521, ng
ượ

nl ic

ã ư

xuất hiện ở

h u Mỹ. L n ph

r zin. Qu qu tr nh thự

n Nh v l n truy n khắp vùng

l

ị
,s u

v qu n

t u

ng r ng rãi. V o
o Nh , T y

n

th giới ũ. N m 1517, ng
l n m h u Âu v

ắ Phi.

o In onesi . V o kho ng n m 1575

n Trung Quố [37].
h

L Qu

n trong “V n

i lo i ngữ”, ng

huy n i s Trung Quố (thời Kh ng Hy)

ượ

ư v

ng Tr n Th Vinh

(người huyện Ti n Phong, S n T y) v o uối th kỷ XVII. Với ặ t nh qu
kh n ng th h ng r ng tr n nhi u ị h nh t i Việt N m , ng
u ti n t i S n T y v

vùng kh , ặ

n ng tưới nướ thường xuy n. Ng sớm ượ
thự

nh

ùng ể nghi n ng ở lớp tr m t h 8700 n m tu i [77, 80].

s ng ph

ng

ni n

u v o n m 2009 hỉ ra rằng ã

Từ ngu n gố

biệt l

ni n

iệt l những vùng
hấp nh n v

ng th h i hỉ s u lú nướ t i Việt N m.

4
Luận văn thạc sỹ Sinh học

ul

ã ượ nh n r ng
o kh ng

ã trở th nh

kh

y lư ng


1.2 T nh h nh nghiên cứu ngô trên th giới

y ng

ược tr ng r ng rãi khắp n i tr n th giới, v s n lượng ng h ng

n m nhi u h n ất c lo i ngũ ố n o. Theo số liệu n m 2009, t ng s n lượng ng
s n xuất ượ tr n th giới l 817 triệu tấn nhi u h n lú nước (678 triệu tấn) hay
lú m (682 triệu tấn). Trong

s n lượng c a Mỹ l

n l Trung Quốc, Brazil, Mexico, Indonesia, Ấn

o nhất chi m
, Ph p,

n 40%, ti p

rgentin , N m Phi,

Ukraine (theo FAOSTAT 2009). Trong n m 2009, h n 159 triệu h ng
khắp n i tr n th giới với s n lượng trung

ược tr ng

nh l 5 tấn/ha.

ảng 2: T nh h nh sản xuất ngô trên th giới nh ng năm g n đây
(FAOSTAT 04/08/2014)
Năm

Diện tích

Năng suất

(Triệu ha)

(Tấn/ha)

(Triệu tấn/ha)

2003

144,7

4,5

645,2

2004

147,5

4,9

728,9

2005

148

4,8

713,7

2006

146,7

4,8

706,8

2007

158,4

4,98

790,1

2008

162,7

5,1

830,6

2009

158,7

5,17

820,2

2010

164

5,19

851,3

2011

172,3

5,15

887,9

2012

178,6

4,89

872,8

2013

184,2

5,52

1016,7

Theo thống k

uối n m 2014

Sản

ng

u n m 2015 th t ng s n lượng ng s n xuất

ượ tr n th giới l n tới tr n 1 tỷ tấn (vượt tr i so với lú nước 740 triệu tấn v lú
mỳ 715 triệu tấn). H i nướ
Quốc (21%), ti p

nl

t h tr ng v n ng suất

r zil,

ng

u v s n lượng vẫn l Mỹ (35%) v Trung

rgentin , Ukr ine (theo F OST T 2015). Diện

u t ng so với n m 2012 trở v trước.

5
Luận văn thạc sỹ Sinh học


Như v y trong nhưng n m g n
nhưng kh ng th y

i

y, n ng suất v

ng kể kéo theo t ng s n lượng ng

o thực hiện n m 2003 c a viện nghi n

dự

iện t h tr ng ng

t ng

ũng hỉ t ng nh . Theo

u hư ng tr nh lư ng thực th giới

IPRI nhu c u v ng sẽ

n t ng cao h n nữa v o n m 2020 [76]. Tuy nhi n,

nhi u y u tố nh hưởng

n n ng suất ũng như s n lượng ng .

ngu n gốc từ sinh v t ( ioti ) như ỏ d i, s u ệnh… v
( ioti ) như nhiệt

v

ũng

y ng t i sinh từ m t t
,

quan tr ng h ng
lo i m kh

ược t n suất cao với m c

c l p v v t ch ph t triển b n vững l ưu ti n

ng nghệ sinh h c thực v t.

ể t m r quy tr nh

nh u l n lượt ược th nghiệm ể kiểm tra kh n ng t i sinh

ch i ỉnh, l , th n, tr tr n v

l p với những nỗ lực chuyển n p gen li n qu n. ho

h song song. Nỗ lực bi n n p
y ng [34]. G n

u ti n

n việc ng d ng ho
i n n p hư

2006

l-

nh kho h

u ti n v m s o to n n ng
e

ượ ph t triển m t

oe v S rk r v o n m 1966 l tr n

ã nh n r kiểu gen

ph i non th nh m s o, h y n i

k h ng th nh m s o l ti n
hai lo i m s o: m s o lo i I
qu n, m s o lo i II ở h n v
với t ng số thấp h n nhưng l i

ng

ng

Trung Quố [33].

Ph i non ược s d ng r ng rãi trong việ t i sinh v
o

c

y ngũ

y noãn ã th phấn ã ượ th nghiệm th nh

như l m t ối tượng i n n p ởi
o

ược thực hiện

n khi kỹ thu t bi n n p ược

y thuố l th người ta mới t nh

cố . V v y, qu tr nh ph t triển nu i ấy m v

phấn c

o g m:

ưới l m m, ph i non v h t [96].

Sự ph t triển nu i ấy m thực v t ặc biệt l ngũ ố
ph t triển tr n

ng

hướng rõ r ng h n. Quy tr nh ể

o i nn p ể

u ra, kiểu gen
u trong

u nhằm m c

t ược m t số th nh tựu kh quan.

huyển gen ũng ượ ưu ti n theo

ti u ặt ra: tố

y u tố phi sinh

n i hung h y huyển gen n i ri ng

h khắc ph c những vấn
ph t triển

y u tố

, nh s ng, ngu n nướ …

Những ti n b v khoa h
thời ng

og m

rất

i n n p ng từ khi

kh n ng t i sinh [47]. V o n m

ng v i tr qu n tr ng trong việ ph t triển
h kh

việ t m r

qu n tr ng trong việ
ng rắn ặ h n v

ng ng

kh n ng

huyển gen s u n y [17].
kh n ng ph t sinh

kh n ng ph t triển ph i. M s o lo i II xuất hiện
kh n ng t i sinh

6
Luận văn thạc sỹ Sinh học

o h n lo i I [22].

n

nh


, việ tối ưu h
ượ nghi n

th nh ph n m i trường ũng rất qu n tr ng,

u h nl

kỹ

th nh ph n ã

ng [28, 38, 106]. Tuy nhi n, những h

iệt hỉ th h hợp với m t v i ối tượng

thể [46]. V v y việ h nh th nh hệ

thống m i trường th h hợp ho m t v t liệu mới rất ấp thi t, ặ

iệt trong huyển

gen [75]. Việ tối ưu h

i u kiện ể h nh th nh m s o to n n ng

sinh từ ph i non ti p t

ượ nghi n

ng sự

ã t i sinh th nh

hất ặ

uv

ã

kh n ng t i

t ượ k t qu . J ku ekov v

ng từ ph i non h i

ng ng

18 v

19 ể r

ượ

y ho n hỉnh [54].
n n m 2014, Lee v Zh ng ã
v o ng

từ v t liệu

n

ng ố quy tr nh ho n thiện v

huyển gen

u l ph i non th ng qu vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens [60].
Những th nh

ng

u ti n v ng

huyển gen thu

v ng

huyển gen

kh ng s u v thuố trừ ỏ. Tuy nhi n, m t mối nguy hiểm ặt r l t n t i sự trao
y huyển gen v

i v t chất di truy n giữ

m t gi i ph p ược Tilney-

d ng.

l p. DNA l c l p sẽ di truy n theo
ặc biệt g n

y

y ng

ssett ư r l

huyển gen kh ng v o l c

ng m v kh ng l n truy n qua h t phấn [97].

gen chịu h n rất ượ qu n t m. Tuy nhi n, kh n ng

chịu h n l m t t nh tr ng ph c t p,
ch n t o

ỏ d i khi n thuốc diệt cỏ mất t

hịu h n bi n

nghi n

u ã hỉ ra rằng m t chi n lược

i gen hiệu qu l

hi n lược s d ng ùng m t lú

nhi u gen chịu h n hiệu qu hoặc s d ng hỉ m t gen i u khiển
khiển nhi u gen th m gi qu tr nh hịu h n.
mã h

ho protein h

trong huỗi
nướ

n

t

nh gen i u khiển

n

gen

n ng th m gi v o những ph n ng uối ( ownstre m)

p ng, giúp k h ho t những ph n ng ặ

iệt

p l i sự thi u h t

o h n h n.
Theo nghi n

uc

Nelson v

YB2 giúp t ng n ng suất giống ng
ch ng.

y huyển gen

ng sự v o n m 2007 th gen ZmNFi n

i gen l n h n gấp hai l n so với

ịnh từ b gen c

y ối

iểu hiện chịu h n tốt với kh n ng uy tr qu ng

hợp, h m lượng diệp l c tố n ịnh, gi m héo rũ. Gen ZmNF-YB2 l
x

ng i u

y m h nh Arabidopsis v

7
Luận văn thạc sỹ Sinh học

ngu n gốc từ

gen ược
lo i h


h ng

y ng

ượ

ng ty Mons nto

u tư v thư ng m i h

s n phẩm ng

chuyển gen chịu h n [71].
N m 2009,

ssem

Kin se) v o giống ng
qu n

ã nghi n c u chuyển gen NPK1 (Nicotiana Protein
i

p th ng qu vi khuẩn A. tumefaciens. Gen NPK1 li n

n kh n ng hịu p suất thẩm thấu giúp ng

thi u nướ

ũng như sống trong m i trường

hống chịu ượ t nh tr ng

n ng

muối cao.

ssem

nk t

hợp chuyển gen bar- gen kh ng thuốc trừ cỏ như l m t nh n tố ch n l c thực v t.
K t qu chuyển gen th nh

ng với hai lo i ng

ng ng Mỹ A188 với sự trợ giúp

i

p (Gz 639 v Gz 649) v

a promoter 35S C4 PPDK [23].

Gen DREB ( ehy r tion-responsive element- in ing) l nh n tố phi n mã
th m gi t h ự v o qu tr nh hống hịu với
ằng

h k h ho t sự ho t

ng

i u kiện ất lợi

m i trường

gen th m gi trự ti p hống l i

kiện ất lợi

m i trường như h n h n, mặn, l nh. Gen DREB ã ượ

v o ng g m

DREB1A/CBF3 t h từ

từ h nh

gen

giống ng

Gen ipt mã h
n ng

73 [62].

enzyme isopentenyl tr nsfer se, enzyme n y
gi

l

ng sự ã nghi n

d ng promoter PSEE1 từ ng

n

nh

ể l m h m qu tr nh lão suy ở l .
ng ng

ã

ấp

ng ng

biểu hiện kh

nh u

những biểu hiện rõ r ng. Nghi n

u

kh n ng l m h m qu tr nh lão h

y m t l m m n i hung h y ng n i ri ng [85]
n

hướng nghi n

lợi cho thực v t như huyển gen t o
gen th y

h -

u chuyển gen ipt từ vi khuẩn Argrobacterium s

n y ã h ng minh ược việc chuyển gen
thực hiện ượ tr n

ytokinin trong

i lớn v kiểu h nh. V o n m 2004,

biểu hiện gen chuyển ã ượ ph n t h hi ti t ở
tr n kiểu h nh. M t trong

ng t ng

. Qu tr nh n y l m t ng n ng

hệ thống nhưng l i kh ng l m th y

Ro son v

t

ti n hất trong qu tr nh t ng hợp.

ượ nh n i t ởi promoter, n ng

m sẽ ượ t ng l n giúp tr hoãn qu tr nh
m n

i nn p

r i opsis [16] hay ZmDREB ượ t h

ytokinin th ng qu việ t ng hợp

Khi qu tr nh h

i u

i h m lượng v

u nhằm t ng

y s n xuất protein

hất lượng

ng v t [88, 89]. Chuyển

hất inh ư ng c

8
Luận văn thạc sỹ Sinh học

o những ặ t nh
y [59].


Giống ng
o

huyển gen

ng ty Syngent

u ti n ượ

ng k v o n m 1995.

thuố trừ ỏ glufosin te v kh ng s u
n m 2013 giống ng

nn y

t i Mỹ, trong

y l giống ng

roughtG r

4 sự kiện ng

01 sự kiện

huyển gen hống

nh v y Lepi opter . V s u g n 20 n m,

huyển gen hịu h n

ũng t i Ho kỳ. ho
m ih

hấp nh n l SYN-EV176-9 t i Ho Kỳ

TM

l n

u ti n ượ tr ng

huyển gen chịu h n ã ượ thư ng

n t nh tr ng l MON87460 m ng gen cspB (gen

ph n l p từ Bacillus subtilis)-t n thư ng m i: Genuity® roughtG r ™ v 03 sự kiện
t nh tr ng

ượ

l i t o từ sự kiện tr n: (1). MON87460 x MON89034 x

MON88017: kh ng thuốc trừ cỏ Glyphosate (cp4 epsps), kh ng s u
(cry3Bb1),

ng

nh v y (cry1A.105, cry2Ab2), chịu h n (cspB); (2). MON87460 x

MON89034 x NK603:

kh ng s u
NK603:

nh

t nh tr ng: kh ng thuốc trừ cỏ Glyphosate (cp4 epsps),

nh v y (cry1A.105, cry2Ab2), chịu h n (cspB); (3). MON87460 x
t nh tr ng: kh ng thuốc trừ cỏ Glyphosate (cp4 epsps), chịu h n (cspB)

(ISAAA,2015).
1.3 T nh h nh nghiên cứu ngô ở Việt Nam:
Ở Việt N m, ng l

y lư ng thự

r ng khắp c nước ở h u h t

vùng sinh th i với 8 vùng h nh: vùng ng

bằng Bắc b , vùng ng Việt Bắ v
Bắc Trung b , vùng ng
ng N m

ng ắc b , vùng ng T y ắc b , Vùng ng

ng bằng s ng

u Long. Diện t h gieo tr ng v n ng

ũng t ng m nh, từ h n 200 ng n h với n ng suất 1 tấn/ha

(n m 1960) nhờ mở r ng
t ,

giống ng lai s n xuất v

i thiện

iện ph p

nh

n n m 2009 ã vượt ngư ng 1 triệu ha với n ng suất 4,3 tấn/ha. So với

nước tr n th giới th n ng suất ng ở ta vẫn thu c lo i kh thấp, ưới m
suất trung

nh t i thời iểm

l 5tấn/ha (theo FAOSTAT, 2009).

số ị phư ng mi n núi vùng s u, vùng x
H , Qu ng N m, L m

ng… m t số

tỉnh L i
ng

ngu n lư ng thực, thực phẩm h nh, s d ng
nh t

ng

uy n h i Nam Trung b , vùng ng T y Nguy n, vùng ng

v vùng ng

suất, s n lượng ng

ng h ng th h i s u lú nước. Ph n ố

l c h u n n n ng suất ng ở

y hỉ

o

nt

giống ng

n ng

ặc biệt t i m t

h u, S n L , Th nh

t người s d ng ng l

ị phư ng v t p qu n

t tr n ưới 1 tấn/ha. Theo số liệu

9
Luận văn thạc sỹ Sinh học


thống k mới nhất từ FAOSTAT-2015, s n lư ng ng

a Việt Nam n m 2013 l

5,2 triệu tấn với diện t h gieo tr ng t ng nh so với n m 2010
t n ng suất 4,44 tấn/h t ng h n 3% so với n m 2012. M
kh ng thể

p ng nhu

u trong nước, h ng n m húng t

nhi u ng h t (trị gi tr n 500 triệu US ) ể s n xuất th

n 1170 ngh n h
t ng trưởng n y

n ph i nh p khẩu kh
n gi sú .

ảng 3: T nh h nh sản xuất ngô ở Việt Nam nh ng năm g n đây
(FAOSTAT 04/08/2014)

Năm

Diện tích

Năng suất

(Ngh n h

(Triệu tấn/ha)

2003

912,7

3,44

3,1363

2004

991,1

3,46

3,4309

2005

1.052,6

3,60

3,7871

2006

1.033,1

3,73

3,8545

2007

1.096,1

3,93

4,3032

2008

1.440,2

3,18

4,5731

2009

1.089,2

4,01

4,3717

2010

1.126,3

4,09

4,6068

2011

1.121,2

4,31

4,8357

2012

1.118,2

4,30

4,8032

2013

1.170,3

4,44

5,1909

ở nước ta. Gi trị inh ư ng c
xit linolei , 31% l

gluxit (ch y u l tinh
nghèo

ng

(Tấn/ha)

Hiện n y v trong những n m tới, ng vẫn l
(50% l

Sản

t v m t số ường

ph n c

xit p nmiti v 3% l Ste ri ), 69%
n v kép), hất kho ng (gi u photpho,

rotene- ti n vitamin A). Ng
y ng từ h t,

l m lư ng thực, thực phẩm ho người, th

v i tr qu n tr ng

o với 10,6% protein (zein), 4-5% lipit

xit olei , 13% l

nxi) v vit min ( 1,

d ng, tất c

ng kh

y ngũ ố

n th n, l

u

rất nhi u
thể s d ng ượ

ng
ể

n ho gi sú , l m nguy n liệu cho

ng nghiệp như rượu ng , s n xuất eth nol ể ch bi n x ng sinh h c, th m h
n

n h bi n t o ra m t số v t d ng
ph n c

ng

ùng,

h a m t số chất

trang s c c a ph nữ . H u h t

v i tr như m t lo i thuốc chữa bệnh

10
Luận văn thạc sỹ Sinh học


h m lượng kali cao. H t ng v m m ng giúp t ng ường kh n ng hấp

nhờ ch

inh ư ng, trị i ngo i ph n sống, l ng r u ng ru t bấ th n ng

th
uống

t

ng lợi tiểu, lõi ng

[1]. Ngo i r

ph n bỏ i

un nướ l vị thuốc chữa ch ng bệnh ra m h i
thể l m hất ốt.

ảng 4: Thành ph n dinh d ng trong
nguồn: en.wikipedia.org

ũng như
kiện bất lợi

nướ kh

un nước

g hạt -

tr n th giới Việt N m ũng ối mặt với những i u

n s n lượng ng như ỏ d i, s u bệnh bao g m những lo i s u ệnh

h nh s u. S u h i ng : s u x m, s u x nh, s u
ng , h u hấu h i ng , m t h i ng g y r

th n, s u ắn l , s u g i, rệp h i
lo i bệnh ho ng . M t số lo i bệnh

thường thấy ở ng như ệnh h i h t, bệnh thối th n o nấm hay vi khuẩn, bệnh kh
vằn, bệnh b ch t ng, bệnh phấn en, ệnh sợi en, ệnh ốm l v

ệnh rỉ sắt.

Nhưng tr n h t h n h n mới l nguy n nh n qu n tr ng nhất nh hưởng
tr nh sinh trưởng

n qu

ng l m gi m n ng suất [40].

Hệ thống tưới ti u th s n n việc tr ng ng ở Việt Nam ph thu c ch y u từ
“nước trời” chi m tr n 70%, diện t h h
cung cấp ho ng

ượ

hi r l m h i ngu n h nh g m nướ mư v từ ao h

s ng suối. Tuy lượng mư trung

nh h ng n m nướ t v o kho ng 1700-2000 mm

cho nhu c u sinh trưởng v ph t triển c
theo mù n n v o mù kh
i n

i kh h u g n

ng tưới chỉ kho ng 30%. Ngu n nước

y ng nhưng lượng mư l i t p trung

y ng thường bị thi u nước. Với những hiện tượng

y, h n h n

nguy

x y thường xuy n h n [87]. M g n

11
Luận văn thạc sỹ Sinh học


y nhất l
Trung

ợt h n h n từ uối n m 2014
ặ

n t n giữ n m 2015 ở

i t l Ninh Thu n khi n t nh h nh s n xuất

t m ngừng s n xuất. Nhu

hịu h n n i ri ng l

u t o r giống

ấp thi t h n

h n 6.100 h

o giờ h t.

u tr n th giới bởi v n ph thu

n gen.

k ross (l i ngượ ) ể l i t o
ng

ở Việt N m.

ng sinh h
ng hú

m t

d ng phư ng ph p truy n thống

ph n t v o h n giống ể t n
yl “

ng ng

ốm

t i nghi n
ng ượ

Nghi n

u Ng

u Ng l

ũng ã th ng

h nhiệm

giống s n

u huyển gen n ng

p

ng trong s n xuất”,

t i. V o

o ã huyển th nh

ng ng thư ng
ng

t i cấp nh nướ , mang mã số KC.04.02/11-15 do TS

Viện ph Viện nghi n

huy n gia

nh u h kh ng ph i

t nh tr ng chịu h n v o m t số

nhất g n

cao t nh hịu h n v o m t số

ối với

v o nhi u gen kh

nh kho h c Việt N m ã s

m i. Hay

ất ph i

y tr ng hịu h n n i hung h y ng

Ng chuyển gen chịu h n l th h th c lớn ngay c
h ng

tỉnh N m

ùi M nh

ường-

u n m 2014 Viện

ng 3 gen hịu h n

DREB2A, HVA1 v CspB v o 3 ngu n v t liệu ng

og m

Việt N m ằng phư ng

ph p huyển gen th ng qu vi khuẩn A. tumefaciens.
ùng với phư ng ph p h n t o giống truy n thống ng y
th việc ng d ng

ng nghệ sinh h

ểt or

n ng chống chịu với i u kiện bất thu n sinh h

giống ng

phư ng ph p n y tr n

Viện ã t o ượ

ng ng

i gen

ng ng

kh

u ti n ở Việt N m,

u x y ựng hệ thống t i sinh ở ng ph

huyển gen ằng Agrobacterium v súng ắn gen t o
bằng

i n

v phi sinh h c ũng ã ược triển

khai t i Viện Di Truy n N ng Nghiệp. Từ n m 2003, l n
Ph m Thị L Thu ã nghi n

ng hiệu qu h n

v

ho

y huyển gen b n vững

ngu n gố

huyển gen b n vững m ng

n ới như

188, H99.

gen: kh ng thuốc

diệt cỏ, gen GFP, gen kh ng kh ng sinh, gen t ng ường hấp th nit v gen hịu
l nh [8-10]. V v o n m 2007 ã ti n h nh i n n p gen gus/p t v o

ng ng

m h nh (HR8 HR9) [7] .
N m 2009, Nguy n V n
trong nghi n

ng v

ng sự ã

u kh n ng ph t sinh m s o ph i h

chỉnh từ ph i non

a m t số

những th nh
v m

ng ng Việt Nam [3]. Nghi n

12
Luận văn thạc sỹ Sinh học

ng ướ

t i sinh

u

y ho n

u n y ũng l

ước


ệm c

hư ng tr nh

th nh

ng Nghệ Sinh H

ng s u n y. Ph i kể

nl

N ng Nghiệp t o i u kiện cho những

i n n p th nh

ng m h nh HR8 v HR9 [4]. H n th nữa l n
s u Cry 1Ac ã ược bi n n p th nh
ng ướ

ng

u ti n t i Việt N m, gen kh ng

ng v o

c u v bi n n p gen kh ng h n v o m t số
tumefaciens ũng

ng gen Cry 1Ac v o 2
ng ng

ng ng

h n l c [5]. Nghi n

h nl

u ược triển kh i nghi n

th ng qu vi khuẩn A.
uv

t ược m t số k t

qu nhất ịnh [6]. Ph n l p v thi t k ve tor m ng gen i u khiển t nh hịu h n
ng t

ph c v

t o giống

y tr ng chuyển gen ũng

ng thực hiện ở Viện Di

ước ti p c n với vấn

chuyển gen chịu h n v o

Truy n N ng Nghiệp [13].
ng ng ở Việt N m ũng
iểm

ng Nghệ T

ng thời ược triển khai t i ph ng th nghiệm tr ng

o Thực V t – Viện Di Truy n N ng Nghiệp.

Việ tr ng th nghiệm
nhưng từ n m 2011,
nghiệm

nh gi

y tr ng i n

nh hưởng

n m i trường v

huyển gen ã ượ thư ng m i h

ng

huyển gen G 21 kh ng s u

ng sinh h

T 1507 kh ng s u
k t thú v mới

như: (1)

ng ty Syngent kh o nghiệm

th n v ng

t11 kh ng thuố trừ ỏ. (2)

n r ng rãi ng

triển kh i

ướ kh o nghiệm

ã ấp h ng nh n ho h i
i n

nh v y v ng

ng ty Pioneer Hi- re kh o nghiệm ng EVENT

nh phấn.
y

ng tr nh ãi,
m t số giống

eK l kh o nghiệm ng MON89034 kh ng s u

NK603 kh ng thuố trừ ỏ. (3)

ượ

ù vẫn

N ng nghiệp v Ph t triển n ng th n ã ấp phép kh o

ng

ng ty

i gen mặ

n n y (n m 2015) ã

ng ty

eK l v Syngent

i gen tr n thị trường Việt N m. H i

m h nh iểm tr ng th nghiệm

giống ng

i n

ng ty n y

ng

i gen n y t i tất

vùng tr ng ng tr ng iểm tr n to n quố .
1.4 C sở ho học v nghiên cứu nạp gen vào thực vật bằng ph

ng ph p

Agrobacterium tumefaciens
Hiện n y

rất nhi u kỹ thu t chuyển gen kh

nh u v o t

o song kỹ thu t

chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens vẫn ược ng d ng r ng rãi l nhờ những
ưu iểm sau:
 Kh ng

i hỏi d ng c

ặc biệt

 Số lượng b n copy thấp v

n ịnh ở th hệ on h u

13
Luận văn thạc sỹ Sinh học


 D th o t


invitro,

y l kỹ thu t

l m

n gi n, hi ph thấp

1.4.1 Ti-Plasmid
Ti-pl smi l m t plasmid lớn với k h thước kho ng 200k . Tr n Ti-plasmid
o n T- N

(tumor

N ) ược giới h n bằng bờ ph i (right or er) v

(left or er). Tr nh tự nucleotid c a bờ ph i v
m t o n

k h thước 25kb ch

chuyển v o t

o thực v t gắn v o

ờ tr i

ờ tr i tư ng tự nhau. T- N

gen t ng hợp opine v
nhi m sắc thể c a t

l

o n n y sẽ ược
o

y h v g yr

bệnh u.

H nh 1: Cấu trúc Ti-plasmid
Ngu n: L Thị Thu Hi n (2003), “T o ch ng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens m ng gen kh ng
n trùng ể chuyển v o y tr ng”, Luận văn iến sĩ sinh học, Viện ng nghệ sinh h , H N i
[14]

Ngo i T- N , tr n Ti-pl smi
ho t

n

vùng vir (vir region) chịu tr h nhiệm

ng l y nhi m, chuyển n p ( onjug tive tr nsfer) v ti u h

opine (opine

catabolism).
Dự v o

h n y on người lợi d ng vi khuẩn ất ể chuyển

muốn ho m nh tr n
m b o ược ch
Người t

gen mong

sở thi t k l i hệ thống Ti-plasmid c a vi khuẩn sao cho vẫn
n ng chuyển gen nhưng kh ng m ng

ãt or

gen g y

ho

y.

ng vector mới ể chuyển gen l những ve tor li n hợp (co-

intergr te ve tor) v ve tor nhị thể (Binary vector).
a. H thống vector

ng li n hợp

Hệ thống ve tor li n hợp (co-integr te ve tor) l k t qu c a sự li n hợp hai
lo i plasmid: Ti-pl smi

ã lo i trừ vùng gen g y khối u v gen t o

hợp chất

opine nhưng vẫn giữ l i vùng vir v vùng ờ tr i, ờ ph i. Th y v o những gen bị
cắt bỏ l

o n tư ng

ng với m t o n tr n pl smi th hai (plasmid trung gian)

ể ph c v cho việ li n hợp hai lo i pl smi . Pl smi trung gi n l m t plasmid

14
Luận văn thạc sỹ Sinh học


t h

ng từ vi khuẩn E.coli v
h

thể t i sinh ược ở Agrobacterium. Pl smi n y

vùng gắn gen c n chuyển n p,

mặt o n tư ng

ng. Khi ho tư ng t

li n hợp qua sự tr o

gen hỉ thị ph c v việc ch n l

v

h i lo i pl smi n y với nh u húng sẽ

i héo giữ h i o n tư ng

ng v h nh th nh n n ve tor

li n hợp. Ve tor li n hợp n y nằm trong vi khuẩn A. tumefaciens v ho t

ng theo

h chuyển gen th ng thường c a vi khuẩn ất. Do t n số ư pl smi trung gi n
từ E.coli sang Agrobacterium rất thấp (10-7-10-5) n n ve tor n y t ược s d ng.

H nh 2 : Hệ thống vector iên h p
Ngu n: L Thị Thu Hi n (2003),“T o ch ng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens m ng gen kh ng
n trùng ể chuyển v o y tr ng”, Luận văn iến sĩ sinh học, Viện ng nghệ sinh h , H N i
[14]

b. H thống vector

p

Hệ thống vector nhị thể kh
(pl smi ) ùng

từ E.coli trong

mặt v ho t

với ve tor li n hợp l

húng

h i ve tor

ng trong Agrobacterium. M t pl smi t h

thi t k vùng ờ tr i v

ờ ph i, nằm giữ

húng l

ng

gen hỉ

thị v vùng gắn gen c n chuyển. Plasmid th h i l Ti-plasmid c i ti n: to n
vùng T- N

v vùng ờ tr i v

ờ ph i bị cắt bỏ chỉ giữ l i vùng vir, pl smi n y

ược g i l pl smi hỗ trợ. Hệ thống ve tor n y ũng ho t

gen c a vi khuẩn ất A. tumefaciens m t

ng theo

h chuyển

h rất hữu hiệu.

H nh 3 : Hệ thống vector nh th ( ép
Ngu n: L Thị Thu Hi n (2003), “T o ch ng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen
kh ng n trùng ể chuyển v o y tr ng”, Luận văn iến sĩ sinh học, Viện ng nghệ sinh
h , H N i [14]

15
Luận văn thạc sỹ Sinh học


Thực t cho thấy, plasmid với h i
trong E.coli khi c h i vùng n y ho t

n vị s o hép

thể kh ng

ng. Tuy nhi n, ve t nhị thể

n vững
m t số ưu

iểm sau:

+ Kh ng x y r qu tr nh t i t hợp giữ

pl smi .

+ K h thướ ve t kh nhỏ.
Nhờ v y, hiệu qu chuyển gen giữa E.coli với Agrobacterrium t ng l n. Hiện
nay, ve t nhị thể ược s d ng r ng rãi với rất nhi u lo i ược thi t k phù hợp
với y u

qu tr nh huyển gen

uc

1.4.2 Chức năng c

H nh 4: Cấu trúc T-DNA
y nhi m A. tumefaciens, o T- N n p v o trong hệ gen

Khi
ắt

T-DNA

u ho t

ng v s n sinh r

y ị rối lo n,
khuẩn s

t

uxin, ytokinin v opine, to n

o ph n hi v t

h

v t or

húng t hiểu ược ch
sự li n hợp nhất. T- N

opine tr n Ti-plasmid.

ng d ng kỹ thu t l p b n

n ng
ượ

li n k t gen ho phép

vùng m ng T- N , vùng n y ược thể hiện theo
ư v o

N

thực v t trong nh n t

v o thường l ngẫu nhi n, tuy nhi n thường l những vùng

Sự t ng hợp opine ượ
những vùng

o. Vị tr gắn

kh n ng s o hép.

i u khiển bởi T-DNA. Những enzime như: o topine

synth se, nop line synth se ượ mã h
theo th tự,

sinh trưởng

khối u. Opine ượ vi

ng như m t lo i “thức ăn”. Nhờ gen huyển h

Ph n t h i truy n v

y h

tr n T-DNA t i những loci: ocs v nos

a T- N kh quen thu c với c hai plasmid: octopine

v nop line.
1.4.3
t
khuẩn như:

C ch chuy n gen ằng A. tumefaciens
o thực v t bị t n thư ng sẽ ti t r

hợp chất h

etosyringone, hy roxyl- etosyringone…

chất n y, A. tumefaciens nh n bi t r i

m v o th nh t

16
Luận văn thạc sỹ Sinh học

ưới t

h c dẫn d vi

d ng c

o h v

hợp

huyển T-DNA


v ot

o thực v t. Qu tr nh n y ược sự trợ giúp ặc biệt c

L . ũng h nh
ho t

hợp chất n y, với v i tr

gen Vir v R ,

m ng, giúp ho

gen vùng vir

ng v t ng ường biểu hiện.
Ho t

gen vir sinh ra sợi

ng c

n ưới c a T-DNA. Chỉ o n sợi
T-DNA mới ược chuyển v o t
l y u tố ho t
ng v i tr l

l m xuất hiện b n copy sợi

n N giữ h i tr nh tự i n (L v R )
o thực v t, v

ược gắn v o genome c a t

a
o.

ng cis c a hệ thống v n chuyển T-DNA. Protein vir D1, D2

h kh

n ưới t i mỗi

sợi

n T- N

trong ướ n y, húng nh n r tr nh tự i n T- N v
n.

iểm cắt l

n gắn k t với

protein vir D2 vẫn

iểm

u v k t thú

u cuối 5‟

ắt

a sợi t i sinh. S u

a sợi T- N

v t

,

o thực v t.

N ug y

t bi n hay lo i bỏ o n R th h u như mất ho n to n kh n ng huyển

T- N ,

nn u

t bi n LB sẽ l m gi m hiệu qu chuyển T- N .
u 5‟

tỏ t ng hợp sợi T-DNA từ

n 3‟, ược bắt

Phư ng tiện ể chuyển o n T- N
v sợi T- N . Theo

số

n sự tấn

ng

h ng

u từ o n R v k t thú ở LB.

v o nh n t

o thực v t l ph c protein

nh kho h c cho rằng, ph c hợp sợi

2 ược bao b c bởi protein vir E2
ng n

i u

n T-DNA-vir

tr ng lượng 96 kDa. Sự phối hợp n y giúp

nu le se, h n nữa sợi

n T-DNA duỗi thẳng l m gi m

k h thước c a ph c xuống xấp xỉ 2 nm, t o i u kiện thu n lợi ho qu tr nh i

chuyển qu

k nh ẫn truy n tr n m ng t

hiệu ịnh vị trong nh n t
protein n y
t

o. Protein vir E2 ch

ựng h i t n

o thực v t v m t protein vir D2. Thực t cho thấy 2

v i tr qu n tr ng trong việ

n x p sự hấp th ph

v o trong nh n

o thực v t. N u lo i bỏ t n hiệu ịnh vị trong nh n th m t trong

bị gi m, nhưng kh ng
T-DNA với genome t

c ch ho n to n qu tr nh huyển T- N v tư ng t
o thực v t, ch ng tỏ

nh n m t ph n tối thiểu v i tr
qu tr nh

n ng

m t th nh vi n kh

thể

giữa
m

a protein bị thi u. Protein vir E c n thi t ối với

i xuất protein vir E2 sang t

Protein vir

protein n y

o thực v t.

4 kh ng thể thi u ối với sự v n chuyển ph c ss-T-DNA. Ch c

protein vir

4 l li n k t với

TP

c l p với ph c protein c n thi t ối

với qu tr nh huyển T-DNA.

17
Luận văn thạc sỹ Sinh học


nghi n

u

ng ố trướ

y ã mi u t v i tr

thướ 9,5 k trong qu tr nh s n sinh cấu trú
l protein

kh . Ph n lớn protein vir
Tuy nhi n, ũng

ã ượ ph t hiện giống như k nh protein xuy n m ng.

thể v i protein vir

l trong

kh

ượ ph n phối l i trong qu tr nh

n ng

k nh k t hợp qua t

protein vir 2, vir 11 l th nh ph n
o vi khuẩn sang t

chuyển T-DNA từ t

o ối với sự v n

t nh kị nướ tư ng tự protein k t hợp tr n m ng

ph t sinh sinh v t v thực hiện ch
ng hú

mặt c a t

o v n chuyển.
nc ab m yv n

o thực v t. Sau khi T- N

o, húng i thẳng v o nh n v k t hợp với hệ gen thực v t, bắt

t

v s n sinh r

uxin,

ol n

lo t t

nh nghi n

rãi v

u

n v sinh h

h ng

h ng A. tumefaciens mẫn c m với

ã nh n ượ

y huyển gen hữu th

ph n t . A. tumefaciens ược s d ng r ng

phư ng ph p huyển gen trực ti p kh

b n s o ược chuyển v o t
vững v hiệu qu chuyển gen

o thực v t thấp o

thể l : số

t ng kh n ng huyển gen b

o. Ngo i r phư ng ph p n y tr nh ược sự h nh

y huyển gen thể kh m [39].

Hiệu qu bi n n p th ng qu A. tumefaciens
kh

ng

ng v i tr qu n tr ng trong kĩ thu t di truy n thực v t ũng

ưu iểm h n hẳn

th nh

u ãtmr

ng , lú ...v

[53]. A. tumefaciens
nghi n

u ho t

n sự h nh th nh khối u.

y 1 l m m trong

như

qu m ng

ytokinin v opine g y n n sự ph t triển th i qu

n dẫn

Hiện n y

k h

o thực v t.

chuyển ph c từ vi khuẩn sang t
Protein vir

protein vir

n ph thu

v o m t số y u tố

như: h ng lo i A. tumefaciens, cấu trú ve tor chuyển gen, kiểu gen thực v t,
h x l m thực v t, ngu n v t liệu g y nhiểm, m t

nu i ấy, th nh ph n c

m i trường nu i ấy, nhiệt

vi khuẩn,thời gi n

ng

... ặc biệt l kh n ng t i

sinh c a thực v t sau khi bi n n p
1.4.4 Gen ch th - gen chọn ọc và c ch hoạt động chọn lọc c a
hygromycin
ể ch ng minh gen m
t h những m h y t
nh nghi n

ti u

mặt trong m thực v t hay lo i bỏ ũng như

o huyển gen ra khỏi

m kh ng ược chuyển gen,

u thường s d ng gen chỉ thị v gen ch n l c. Những gen n y ược

18
Luận văn thạc sỹ Sinh học