Định tính samonella tiểu luận phân tích vi sinh thực phẩm

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HỒ CHÍ MINH
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM
-----o0o----

BÀI TẬP LỚN/ BÀI TẬP DỰ ÁN HỌC PHẦN:
PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM
TÊN ĐỀ TÀI: ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

NHĨM: 02

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2022


BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HỒ CHÍ MINH
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM
-----o0o----

TÊN ĐỀ TÀI: ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2022


LỜI CAM ĐOAN
Chúng em xin cam đoan đề tài: “Định tính Salmonella” do nhóm 02 nghiên cứu
và thực hiện.
Chúng em đã kiểm tra dữ liệu theo quy định hiện hành.
Kết quả bài làm của đề tài: “Định tính Salmonella” là trung thực và không sao
chép từ bất kỳ bài tập của nhóm khác.
Các tài liệu được sử dụng trong tiểu luận có ng̀n gớc, xuất xứ rõ ràng.

(Ký và ghi rõ họ tên)
Nhóm 02


LỜI CẢM ƠN
Nhóm 02 xin chân thành cảm ơn khoa Cơng nghệ thực phẩm và nhà trường đã
giúp nhóm tiếp cận và tìm hiểu về mơn Phân tích vi sinh thực phẩm. Nhóm 02 cũng
xin cảm ơn cơ

Đinh Thị Hải Thuận đã giảng dạy và hướng dẫn nhóm nghiên

cứu và hoàn thành bài tiểu luận một cách hoàn chỉnh nhất.
Trong quá trình nghiên cứu và làm bài tiểu luận do kiến thức cịn hạn chế nên
có thể dẫn đến một vài quan điểm cũng như cách nhìn nhận cịn thiếu sót hay chưa
chính xác mong cơ và các bạn thơng cảm bỏ qua. Nhóm rất mong sẽ nhận được nhận
xét, góp ý của cơ và các bạn để có thể cải thiện hơn trong những bài luận sau.
Nhóm 02 xin chân thành cảm ơn.

MỤC LỤC


DANH MỤC HÌNH ẢNH
MỞ ĐẦU

1

NỘI DUNG

2

1. Tổng quan về Salmonella

2

2. Quy trình định tính Samonella

3

2.1 Phạm vi áp dụng

3

2.2 Ngun tắc

3

2.3 Mơi trường và hóa chất

4

2.4 Quy trình phân tích

7

2.5 Các bước tiến hành

8

2.6 Kết quả

12

KẾT LUẬN

13

TÀI LIỆU THAM KHẢO

14

CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM

15


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1-1 S.typhy gây bệnh sớt thương hàn

2

Hình 1-2 S. cholera-sius gây bệnh nhiễm trùng máu

2

Hình 1-3 S.typhymurium gây bệnh rới loạn tiêu hố

3

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây có rất nhiều báo cáo cho thấy phần lớn các vụ ngộ
độc thực phẩm là do vi sinh vật. Đã có nhiều cảnh báo, nhưng tình trạng ngộ độc thực
phẩm vẫn đang leo thang và ngày càng trở nên càng nghiêm trọng.
Có rất nhiều vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm như Clostridium botulinum,
Escherichia Coli, Listeria monocytogenes,... trong đó, Salmonella là lồi vi sinh vật
gây ngộ độc rất nguy hiểm. Salmonella gây ra bệnh thương hàn, nhiễm khuẩn đường
ruột và nhiều bệnh nghiêm trọng khác. Thế nên định tính, phát hiện sự có mặt của
Salmonella trong thực phẩm là vô cùng quan trọng.


NỘI DUNG
1. Tổng quan về Salmonella
Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, trực khuẩn gram âm, hơ hấp hiếu khí
hoặc kị khí tuỳ ý, có khả năng di động (trừ S.gallinarum và S.pullorum), sinh acid từ
glucose và manitol nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh phân giải
ure. Không tạo bào tử, hầu hết các chủng đều sinh ra H2S (trừ S.typhi).
Salmonella là một trong những tác nhân gây ra bệnh chủ yếu trong thực phẩm.
Có ba dạng bệnh do Salmonella gây ra. Sốt thương hàn do S.typhy, nhiễm trùng máu
do S.cholera-sius, rới loạn tiêu hố do S.typhymurium và S.enteritidis.

Hình 1-1 S.typhy gây bệnh sốt thương hàn


Hình 1-2 S. cholera-sius gây bệnh nhiễm trùng máu

Hình 1-3 S.typhymurium gây bệnh rối loạn tiêu hoá
Hầu hết các tiêu chuẩn về an tồn thực phẩm đều khơng cho phép có sự hiện
diện của Salmonella trong 25g/25ml mẫu. Theo phương pháp truyền thống việc phát
hiện Salmonella bao gồm những bước như tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập,
phục hồi và khẳng định.

Vi khuẩn này kém chịu nhiệt, dễ dàng bị tiêu diệt khi thức ăn được đun nấu phù
hợp. Việc làm lạnh, cấp đông, đảm bảo vệ sinh có tác dụng quan trọng làm giảm thiểu
nguy cơ nhiễm bệnh.
2. Quy trình định tính Samonella
2.1 Phạm vi áp dụng
Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 4829:2005 dùng để phát hiện
Salmonella trong tất cả các loại thực phẩm.


2.2 Nguyên tắc
Quy trình phát hiện Salmonella bắt buộc phải qua năm giai đoạn và phải sử dụng
chủng đối chứng trong tồn bộ q trình phân tích.
Tiền tăng sinh: mẫu được tiền tăng sinh trong môi trường tăng sinh không chọn
lọc (BPW) ủ ở 370C trong khoảng 18h.
Tăng sinh chọn lọc: Sau giai đoạn tiền tăng sinh, dịch mẫu được chuyển qua môi
trường tăng sinh chọn lọc RVS ủ ở 41,50C và MKTTn ủ ở 370C trong khoảng 24h.
Phân lập: cấy ria dịch mẫu từ môi trường tăng sinh chọn lọc sang hai môi trường
rắn chọn lọc (XLD và HE), ủ ở 370C trong khoảng 24h.
Phục hồi: cấy chuyển các khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella trên các môi trường
phân lập sang môi trường dinh dưỡng.
Khẳng định: cấy chuyển sinh khối trên môi trường dinh dưỡng sang các môi
trường thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm kháng hút thanh học.
2.3 Mơi trường và hóa chất
⮚ Mơi trường XLD (Xylose Lysine Desoxycholate)
Mơi trường XLD: khuẩn lạc có màu hờng trong śt, có hay khơng có tâm đen.
Một sớ dịng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn
lạc.
- Cao nấm men: 3g
Vai trò: Cung cấp các dưỡng chất ( acid amin,...)
- L-lysine: 5g

Vai trò: Phân biệt Salmonella với các vi sinh vật không gây bệnh khác
- Xylose: 3.75g
Vai trị: Phân biệt các lồi Salmonella
- Lactose: 7.5g


Vai trò: Tạo acid dư thừa để ngăn cản sự đảo ngược thành pH kiềm bởi vi khuẩn
Coliform dương tính
- Sucrose: 7.5g
Vai trò: Tạo acid dư thừa để ngăn cản sự đảo ngược thành pH kiềm bởi vi khuẩn
Coliform dương tính
- Sodium deoxycholate: 2.5g
Vai trị: Ức chế sự phát triển của vi khuẩn gram dương
- Ferric ammonium citrate: 0.8g
Vai trò: Xác định sự sản xuất khí

H2S

- Sodium thiosulfate: 6.8g
Vai trị: chớng nấm men, mớc
- NaCl: 5g
Vai trị: Duy trì, cân bằng áp suất thẩm thấu của môi trường
- Agar: 15g
Vai trị: tác nhân làm đơng cứng mơi trường
- Phenol red: 0.08g
Vai trò: Chất chỉ thị giúp nhận biết sự phân huỷ của xylose, lactose và sucrose
⮚ Môi trường HE:
Khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến màu xanh lục, có hay khơng có
tâm đen.
Mơi trường thành phần HE (Hektoen Entric Agar)

- Proteose Peptone: 12.0g
Vai trò: Cung cấp Nitơ, nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật đặc biệt là amino acid
- Yeast Extract: 3.0g


Vai trò: Cung cấp protein (N) và vitamin
- Bile Salts No. 3: 9.0g
Vai trò: Ức chế sự sinh trường của tất cả vi khuẩn gram dương
- Lactose: 12.0g
Vai trò: Cung cấp năng lượng cho sự sinh trưởng và trao đổi chất
- Saccharose: 12.0g
Vai trò: Cung cấp năng lượng cho sự sinh trưởng và trao đổi chất
- Salicin: 2.0g
Vai trò: Phân biệt và làm giảm độc tính gây ra bởi các chỉ số màu để phục hồi tốt
của Salmonella
- Sodium chloride: 5.0g
Vai trò: Điều chỉnh trương lực
- Ferric Ammonium Citrate: 1.5g
Vai trị: Xác định sự sản xuất khí H_2S
- Agar: 14.0g
Vai trị: mơi trường ni dưỡng vi sinh vật
- Bromthymol Blue: 65.0g
Vai trò: Chất chỉ thị nhận biết các khuẩn lạc
- Acid Fuchsin: 0.1g
Vai trò: Chất chỉ thị nhận biết các khuẩn lạc
• Mơi trường BS
Bismuth sulfite và brilliant green: ức chế gram (+)
Disodium phosphate: tạo tính đệm cho mơi trường

Dextrose: cung cấp năng lượng cho vi sinh vật
Khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kim tím.


2.4 Quy trình phân tích


Cân 25g mẫu rắn hoặc 25ml mẫu
lỏng
2.5 Các bước tiến hành
Bao PE vô trùng chứa 25g/25ml mẫu
Thêm 225ml BPW
Cân một lượng 25g mẫu rắn hoặc
thử đong một thể tích 25ml mẫu lỏng với sai số
Dập mẫu trong 1 phút
cho phép± 5% của phần mẫu thử đại diện cho vào bao PE vơ trùng (hoặc bình tam
Ủ / (182)h
giác), bổ sung 225ml môi trường BPW và đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu
1 ml
0,1 ml
10ml môi(stomacher)
trường RVCtrong
broth60
Ủ giây.
10ml môi trường MKTTn
ở (/(24)h
broth. Ủ ở /(24)h
Bước 1: Tiền tăng sinh (tăng sinh sơ bộ)
Mẫu được tiền tăng sinh trong môi trường
sinhagar.

không
Cấytăng
lên HE
Ủ ởchọn lọc (BPW) ủ
Cấy lên XLD
agar.
Ủ
ở
/(24)
h
/(18-24)h
ở 37oC±3h trong khoảng 18h±3h.

Trypton
e broth

VP

ONPG

LDC

Ure
sugar

TSI

Khơng cóBước
khuẩn
điểnsinh

hìnhchọn
hoặclọc
2:lạc
Tăng
Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi
nghi ngờ từ mỗi môi trường phân
ngờ, cấy lên NA/TSA. Ủ ở /(243) h
lập
Trộn đều dịch tiền tăng sinh, chuyển 0,1ml vào ớng nghiệm chứa 10ml mơi
Thử 4 khuẩn lạc cịn
Thử 1 khuẩn lạc
±3h; đồng thời chuyểnlại
trường RVS, ủ ở 41,5±1oC trong
24
1ml
vào ống
đã được
đánhnghiệm
hoặc nghi ngờ
chứa 10ml môi trường MKTTn, ủ ở 37±1oC trong 24±3h. Cẩn thận không được để
Thử kháng huyết
quá nhiệt độ ủ tối đa (42,5oC).
thanh
Bước 3: Phân lập
Dùng que cấy vòng cấy phân lập từ mỗi canh thang tăng sinh chọn lọc RVS
Ủ ở /(243)h
và MKTTn lên mỗi đĩa thạch
chứa môi trường chọn lọcBáo
XLDcáo
vàkết

HE.quả
Sau khi cấy,
lậtphát
ngược
các đĩa sao cho đáy hướng lên trên và ủ ở 37oC±1oC trong 24±3h.
Khơng
hiện
Salmonella trong
Âm tính
Sau khi ủ 24±3h, kiểm tra các đĩa về sự có mặt của các khuẩn lạc điển hình và
25g/25ml
các khuẩn lạc khơng điển hình mà có thể nghi ngờ là Salmonella. Trên môi trường
XLD khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu hờng trong śt, có hoặc khơng có
tâm màu đen. Trên môi trường HE khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu xanh
lam, có hoặc khơng có tâm đen. Đánh dấu vị trí các khuẩn lạc này dưới đáy đĩa.
Bước 4: Phục hồi trên môi trường dinh dưỡng NA/TSA
Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ mỗi đĩa trên môi trường
phân lập XLD và HE. Nếu mỗi đĩa có ít hơn 5 khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc
nghi ngờ, thì lấy tất cả khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ đó cấy ria trên NA/TSA.
Ủ ở 37oC±1oC trong 24±3h


TH1: từ mỗi đĩa thử một khuẩn lạc đặc trưng, nếu cho các kết quả thử nghiệm
sinh hóa hóa phù hợp thì kết luận phát hiện Salmonella trong mẫu.
TH2: nếu khuẩn lạc đầu tiên cho kết quả thử nghiệm sinh hóa khơng phù hợp
thì tiến hành thử bớn khuẩn lạc cịn lại đã được đánh dấu, một trong bớn khuẩn lạc
này cho kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp thì kết luận phát hiện Salmonella
trong mẫu và ngược lại thì kết luận khơng phát hiện Salmonella trong mẫu.
Bước 5: Khẳng định sinh hóa và kháng huyết thanh
Từ các khuẩn lạc đã chọn cấy ria lên NA/TSA, dùng que cấy cấy vào các môi

trường sau:
⮚Thạch TSI
Nguyên tắc: xác định khả năng sử dụng nguồn Carbohydrate cụ thể kết hợp với
môi trường tăng trưởng căn bản, có hoặc khơng có sinh hơi và hydrogen sulfide
(H2S).
Cách lấy mẫu: cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch và cấy đâm sâu xuống đáy. Ủ
ở 37±1oC trong 24±3h. Diễn giải những thay đổi trong môi trường như sau:
+ Cấy đâm sâu
● Màu vàng glucose dương tính (sử dụng glucose)
● Màu đỏ hoặc khơng đổi màu glucose âm tính (khơng sử dụng glucose)
● Màu đen sinh hydro sunfua. Bọt hoặc vết rạn sinh khí từ glucose
+ Cấy bề mặt nghiêng của thạch
● Màu vàng lactose và/hoặc sucrose dương tính (sử dụng lactose và/hoặc
sucrose)
● Màu đỏ hoặc khơng đổi màu lactose và sucrose âm tính (khơng sử dụng lactose
cũng như sucrose)
Các khuẩn lạc Salmonella điển hình thể hiện tính kiềm (màu đỏ) trên bề mặt nghiêng
của thạch và khi cấy đâm sâu mang tính acid (màu vàng) có sinh khí (bọt khí) và (với
khoảng 90% trường hợp) sinh hydrosunfua (thạch bị đen).


⮚Lysine decarboxylase
Nguyên tắc: sử dụng để phát hiện vi khuẩn sinh các enzyme decarboxylase, các
enzyme này thường tương tác với các amino acid có gớc carboxyl (-COOH) ở ći,
tạo thành amine hay diamine và carbon dioxide (CO2)
Cách lấy mẫu: cấy ngay phía dưới của bề mặt mơi trường lỏng, phủ một lớp paraffin
hay dầu khống lên trên bề mặt mơi trường. Ủ ở 37±1oC trong 24±3h. Salmonella có
phản ứng lysine decarboxylase dương tính nên sau khi ni cấy, mơi trường vẫn giữ
ngun màu tím. Phản ứng âm tính khi mơi trường có màu vàng.
⮚Thạch ure

Nguyên tắc: sử dụng để phát hiện khả năng phân cắt ure thành amoniac do hoạt tính
của enzyme urease từ VSV và kết quả là mơi trường bị kiềm hóa do NH3 được tạo ra.
Cách lấy mẫu: cấy ria trên bề mặt thạch nghiêng của thạch. Ủ ở 37±1oC trong 24±3h.
Nếu phản ứng dương tính, mơi trường từ màu đỏ chuyển thành màu hồng và sau đó
chuyển thành đỏ hờng. Ngược lại, nếu phản ứng là âm tính thì mơi trường khơng đổi
màu (vàng cam).
⮚Mơi trường phản ứng Indol
Nguyên tắc: phát hiện khả năng oxy hóa tryptophan thành các dạng của indol: Indol,
Skatol (methyl indol) và indol-acetate
Cách lấy mẫu: cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5ml môi trường tryptone water.
Ủ ở 37±1oC trong 24±3h. Sau khi ủ, thêm 1ml thuốc thử kovac’s, nếu phản ứng dương
tính thì trên bề mặt mơi trường xuất hiện một mặt màu đỏ chứng tỏ phản ứng dương
tính, xuất hiện màu khác là phản ứng âm tính.
⮚Phát hiện β -galactosidase
Nguyên tắc: xác định khả năng lên men lactose của vi sinh vật
Cách lấy mẫu: cho một vòng đầy các khuẩn lạc nghi ngờ vào ớng vơ trùng có chứa
0,25ml dung dịch muối sinh lý. Thêm một giọt Toluen và lắc ống. Đặt ống này vào
trong nồi cách thủy ở 37oC và để trong vài phút (khoảng 5 phút). Thêm 0,25ml thuốc


thử để phát hiện β -galactosidase và lắc đều. Đặt lại ống vào nồi cách thủy để ở 37 oC
trong 24±3h, kiểm tra ống thường xuyên. Màu vàng cho thấy phản ứng dương tính.
Phản ứng thường xuất hiện trong khoảng 20 phút. Nếu sử dụng đĩa giấy bán sẵn, thì
theo các chỉ dẫn của nhà sản xuất.
⮚Voges – Proskauer
Nguyên tắc: Xác định khả năng sinh acetylmethylcarbinol (acetoin) trong quá trình lên
men glucose của một số vi sinh vật
Cách lấy mẫu: cho một vòng đầy các khuẩn lạc nghi ngờ vào trong ớng vơ trùng có
chứa 3ml mơi trường VP. Ủ ở 37±1oC trong 24±3h. Sau khi ủ, thêm 2 giọt dung dịch
creatine, 3 giọt dung dịch α -naphthol và sau đó thêm 2 giọt dung dịch kali hydroxyde

(KOH), lắc đều sau mỗi lần thêm từng loại thuốc thử. Khi xuất hiện màu hồng đến
màu đỏ sáng trong 15 phút chứng tỏ phản ứng dương tính, cịn phản ứng âm tính khi
dịch vi khuẩn không đổi màu.
⮚Thử phản ứng kháng huyết thanh
+ Loại trừ chủng tự ngưng kết: nhỏ 1 giọt nước ḿi sinh lý lên phiến kính thủy tinh
đã được làm sạch một cách cẩn thận, dùng que cấy vòng trộn đều dung dịch với khuẩn
lạc cần thử, để thu được huyền phù đục và đồng nhất. Lắc nhẹ phiến kính 30-60 giây.
Quan sát kết quả trên nền tới, tớt nhất là dùng kính lúp. Nếu có một sự vón cục, khơng
rời nhau (ít hoặc nhiều) của vi khuẩn thì chúng xem như tự ngưng kết, không cần thử
phản ứng hút thanh tiếp theo. Nếu khơng có sự vón cục và vi khuẩn rời nhau, thì
chúng xem như khơng tự ngưng kết, cần tiếp tục thử phản ứng huyết thanh.
+ Kiểm tra O, H,…
Nhỏ một giọt anti-O hoặc H lên lam kính sạch, dùng que cấy lấy một ít sinh khối của
vi khuẩn từ môi trường Nutrient Agar để phân tán vào giọt huyết thanh, chờ 30-60
giây, quan sát trên nền đen. Phản ứng dương tính khi có hiện tượng ngưng kết xảy ra.
Đôi khi cần quan sát hiện tượng ngưng kết trên kính lúp hoặc kính hiển vi với độ
phóng đại thấp. Ngược lại, nếu vi khuẩn phân bớ đều trong huyết thanh, làm cho dung
dịch đục đều được xem là kết quả âm tính.


Mẫu được kết luận dương tính với Salmonella khi có khuẩn lạc đặc trưng trên
các môi trường phân lập và cho kết quả sinh hóa sau: TSI/KIA: đỏ/vàng; có/khơng có
H2S và sinh hơi; Ure (-); Indol (-); VP (-); ONPG (-); LDC (+).
2.6

Kết quả

Phát hiện (hay không phát hiện) Salmonella trong 25g mẫu rắn hoặc 25ml mẫu lỏng.

KẾT LUẬN
Trong thực phẩm khơng được phép có sự hiện diện của Salmonella bởi
Salmonella vô cùng nguy hiểm, là tác nhân gây bệnh chủ yếu trong thực phẩm. Sau
khi hoàn thành bài tiểu luận này, chúng em có thêm nhiều kiến thức chuyên sâu về
trực khuẩn Salmonella cũng như phương pháp định tính Salmonella (bao gờm phạm vi
áp dụng, ngun tắc, mơi trường hóa chất, quy trình phân tích, các bước tiến hành).
Trong đó quy trình phát hiện Salmonella bắt buộc phải trải qua 5 giai đoạn và phải sử
dụng chủng đới chứng trong tồn bộ q trình phân tích.


TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Giáo trình phân tích vi sinh, Trường Đại học Cơng nghiệp thực phẩm thành phớ
Hờ Chí Minh, năm 2016.