KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN BACILLUS VÀ KHẢ NĂNG SINH ENZYME AMYLASE, PROTEASE

UBND TỈNH QUẢNG NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC QUẢNG NAM

KHOA LÝ – HÓA – SINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Tên đề tài
KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CUẨ VI KHUẨN BACILLUS VÀ KHẢ

NĂNG SINH ENZYME AMYLASE, PROTEASE

Sinh viên thực hiện
VÕ DUY UY

MSSV: 2113012740
CHUYÊN NGÀNH: SƯ PHẠM SINH – KTNN

KHÓA 2013 - 2017
Cán bộ hướng dẫn:
Ths. PHAN THỊ THANH DIỄM
MSCB:……………….

Quảng Nam, tháng 05 năm 2017

LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng của bản thân còn
nhờ vào sự chỉ dẫn, động viên tận tình từ quý thầy cơ cũng như sự ủng hộ của gia đình
và bạn bè.
Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo trường đại học Quảng Nam đã tạo điều kiện thuận lợi
nhất để tơi có thể sử dụng các thiết bị ở phịng thí nghiệm và hồn thành tốt khóa luận

tốt nghiệp của mình.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo Th.S Phan Thị Thanh Diễm đã tận
tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tơi trong suốt thời gian hồn thành khóa luận tốt
nghiệp này.
Mặc dù đã có nhiều nỗ lực để hồn thành đề tài nhưng do hạn chế về khả năng
của bản thân và thời gian thực hiên nên đề tài không tránh khỏi những thiếu sót. Kính
mong nhận được sự góp ý, chỉ bảo của q thầy cơ giáo và ý kiến đóng góp của các
bạn để đề tài được hoàn thiện hơn.

Quảng Nam, Tháng 5 năm 2017

Võ Duy Uy

MỤC LỤC

PHẦN 1: MỞ ĐẦU................................................................................................................................. 1
1. Lý do chọn đề tài............................................................................................................................. 1
2. Mục đích của đề tài ......................................................................................................................... 1
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ................................................................................................... 2
3.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................................................2
3.2. Phạm vi nghiên cứu...................................................................................................................2
4. Phương pháp nghiên cứu................................................................................................................. 2

PHẦN 2: NỘI DUNG ............................................................................................................................. 3
Chương 1: Tổng quan tài liệu.............................................................................................................. 3
1.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus........................................................................................................ 3
1.1.1. Đặc điểm phân loại.................................................................................................................3
1.1.2. Đặc điểm sinh học .................................................................................................................3
1.1.3. Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên ............................................................................4
1.1.3.1. Bacillus subtilis ...................................................................................................................4

1.1.3.2. Bacillus megaterium............................................................................................................5
1.1.3.3. Bacillus mensentericus ........................................................................................................6
1.1.3.4. Bacillus cereus ....................................................................................................................6
1.1.3.5. Bacillus pumilus ..................................................................................................................7
1.1.3.6. Bacillus polymyxa ...............................................................................................................7
1.1.3.7. Bacillus brevis .....................................................................................................................7
1.1.3.8. Bacillus simplex...................................................................................................................8
1.1.3.9. Bacillus lincheniformis........................................................................................................8
1.1.4. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus ............................................................8
1.1.4.1. Cấu tạo bào tử .....................................................................................................................8
1.1.5.2. Khả năng tạo bào tử ............................................................................................................9
1.2. Lịch sử nghiên cứu enzyme từ vi sinh vật.................................................................................... 9
1.3. Giới thiệu về enzyme amylase ................................................................................................... 11
1.3.1. Amylase từ vi sinh vật..........................................................................................................11
1.3.2. Đặc tính của amylase............................................................................................................12
1.3.2.1. α-amylase ..........................................................................................................................12
1.3.2.2. β-amylase .........................................................................................................................13

1.3.2.3. Glucoamylase ....................................................................................................................13
1.3.3. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật.....................................................................................14
1.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase của vi sinh vật........................14
1.3.4.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy.................................................................................14
1.3.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp amylase.........................15
1.3.5. Ứng dụng amylase sản xuất từ vi sinh vật............................................................................15
1.4. Giới thiệu về enzyme protease ................................................................................................... 15
1.4.1. Vi sinh vật tạo protease ........................................................................................................15
1.4.2. Đặc tính của protease ...........................................................................................................16
1.4.3. Sinh tổng hợp protease ở vi sinh vật ....................................................................................17
1.4.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật .......................17
1.4.4.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường.............................................................................17

1.4.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp protease ........................................17
1.4.5. Ứng dụng protease từ vi sinh vật..........................................................................................17
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu............................................................................... 19
2.1. Vật liệu ....................................................................................................................................... 19
2.2. Hóa chất và dụng cụ ................................................................................................................... 19
2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................................................ 19
2.3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus từ đất hoa màu, cỏ ủ, phân.........................................................19
2.3.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn.............................................................................19
2.3.1.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus ..........................................................................19
2.3.2. Quan sát đặc điểm hình thái của vi khuẩn phân lập được ....................................................20
2.3.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn phân lập được.....................................................21
2.3.3.1. Thử catalase trên lam kính ................................................................................................21
2.3.3.2. Thử phản ứng sinh hóa citrate ...........................................................................................21
2.3.3.3. Thử phản ứng sinh hóa nitrate...........................................................................................22
2.3.3.4. Thử phản ứng sinh hóa maltose ........................................................................................22
2.3.4. Phương pháp cấy dòng thuần ...............................................................................................22
2.3.5. Phương pháp kiểm tra hoạt độ của enzym amylase (bằng phương pháp Wolhge muth) .....23
2.3.5.1. Nguyên tắc: .......................................................................................................................23
2.3.5.2 Nguyên liệu: .......................................................................................................................23
2.3.5.3. Tiến hành:..........................................................................................................................23
2.3.5.4. Tính kết quả:......................................................................................................................24
2.3.6. Kiểm tra hoạt độ enzyme protease (bằng phương pháp Gross + Fluld) ...............................24
2.3.6.1. Nguyên tắc: .......................................................................................................................24

2.3.6.2. Nguyên liệu: ......................................................................................................................25
2.3.6.3. Tiến hành:..........................................................................................................................25
2.3.6.4. Tính kết quả.......................................................................................................................27
2.3.7. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn .27
2.3.7.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn .....27
2.3.7.2. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn .............................27

2.3.7.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn .....................28
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................................................. 29
3.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus phân lập được............................................. 29
3.1.1. Khảo sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis ..................................................29
3.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus.........................................................31
3.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis...............................34
3.2. Thử hoạt tính enzyme amylase các chủng tuyển chọn ............................................................... 34
3.3. Thử hoạt tính enzyme protease của vi khuẩn ............................................................................. 37
3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn.............. 40
3.4.1 . Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của chủng tuyển chọn .......40
3.4.2. Ảnh hưởng điều kiện pH cho sự sản xuất enzyme của chủng tuyển chọn ...........................41
3.4.3. Kết quả của nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sản xuất enzyme của các chủng tuyển chọn..........43
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................................... 46
1. Kết luận ......................................................................................................................................... 46
2. Kiến nghị ....................................................................................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................................... 47
PHỤ LỤC...................................................................................................................................................

DANH SÁCH CÁC BẢNG

STT TÊN CÁC BẢNG Ghi chú
29
1 Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus 31
34
2 Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus
35
Bảng 3.3 Khảo sát đặc điểm sinh hóa các chủng nghi ngờ là 36
3 38
39
Bacillus subtilis 40

Bảng 3.4 Quan sát ống nghiệm khi thử hoạt tính enzyme 42
4
44
amylase chủng tuyển chọn

5 Bảng 3.5 Hoạt độ enzyme amylase của chủng tuyển chọn

Bảng 3.6 Quan sát ống nghiệm khi thử hoạt tính enzyme
6

protease của chủng tuyển chọn

7 Bảng 3.7 Hoạt độ enzyme protese của chủng tuyển chọn

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh
8

enzyme của chủng tuyển chọn

Bảng 3.9 Ảnh hưởng điều kiện pH cho sự sản xuất enzyme của
9

chủng tuyển chọn

Bảng 3.10 Kết quả của nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sản xuất
10

enzyme của các chủng tuyển chọn

DANH SÁCH CÁC HÌNH

STT TÊN CÁC HÌNH Ghi chú
3
1 Hình 1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 9
20
2 Hình 1.2 Bào tử của Bacillus cereus và Bacillus anihracis 24
26
3 Hình 2.1 Sơ đồ pha loãng vi khuẩn 30
30
4 Hình 2.2 Sơ đồ pha lỗng để thử hoạt tính enzyme amylase 30
30
5 Hình 2.3 Sơ đồ pha lỗng để thử hoạt tính enzyme protease 30
30
6 Hình 3.1 Khuẩn lạc B1 32
32
7 Hình 3.2 Khuẩn lạc B2 32
33
8 Hình 3.3 Khuẩn lạc B3 33
33
9 Hình 3.4 Khuẩn lạc B4 36

10 Hình 3.5 Khuẩn lạc B5 37

11 Hình 3.6 Khuẩn lạc B6 38

12 Hình 3.7 Chủng Bacillus B1 39

13 Hình 3.8 Chủng Bacillus B2 41

14 Hình 3.9 Chủng Bacillus B3 43

15 Hình 3.10 Chủng Bacillus B4

16 Hình 3.11 Chủng Bacillus B5

17 Hình 3.12 Chủng Bacillus B6

18 Hình 3.13 Thử hoạt tính enzyme amylase chủng tuyển chọn

Hình 3.14 Biểu đồ hoạt độ enzyme amylase của các chủng
19

tuyển chọn

20 Hình 3.15 Thử hoạt tính enzyme protease chủng tuyển chọn

Hình 3.16 Biểu đồ hoạt độ enzyme protease của các chủng
21

tuyển chọn

Hình 3.17 Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đên khả
22

năng sinh enyme của vi khuẩn tuyển chọn

Hình 3.18 Biểu đồ ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enyme
23

của vi khuẩn tuyển chọn

24 Hình 3.19 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh 45

enyme của vi khuẩn tuyển chọn

PHẦN 1: MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Nguồn vi khuẩn trong tự nhiên rất đa dạng và phong phú. Từ khi những vi

sinh vật đầu tiên được phát hiện đến nay, lĩnh vực nghiên cứu vi sinh vật không
ngừng phát triển vượt bậc và mạnh mẽ [9].

Người ta đã tìm ra nhiều ứng dụng về vi sinh vật để áp dụng vào đời sống
và đạt rất nhiều thành công như: sản xuất thực phẩm cho người và thức ăn cho
gia súc, phân giải các chất độc, cải thiện cơng nghệp thuộc da… Trong đó một
trong những ứng dụng quan trọng trong thực tiễn đó là sản xuất enzyme từ vi
sinh vật [9].

Khi khó thu được enzyme từ các động vật, thực vật đa bào bậc cao, đặc
biệt trong điều kiện hiện nay enzyme được ứng dụng rất nhiều trong thực tiễn sản
xuất. Vì thế người ta sử dụng những chủng vi sinh vật vốn sản xuất enzyme có
hoạt độ cao, thời gian sinh trưởng ngắn để dễ dàng thu được enzyme đồng thời
tăng chất lượng của chúng, từ đó giảm giá thành sản phẩm.

Ở vi sinh vật, vi khuẩn Bacillus rất phong phú và đa dạng về loài và đặc
điểm sinh học. Người ta đã tìm ra nhiều chủng vi khuẩn Bacillus dễ ni cấy, có
khả năng sinh enzyme cao. Vì vậy vi khuẩn Bacillus ln đóng vai trị quan trọng
trong thực tiễn sản xuất và được nghiên cứu ngày một rộng rãi.

Do đó, tận dụng nguồn vi khuẩn Bacillus phong phú trong tự nhiên, chúng
tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn
Bacillus và tìm hiểu khả năng sinh enzyme amylase, protease” từ đó sản xuất
thử nghiệm chế phẩm sinh học để ứng dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao năng
suất và giảm chi phí sản xuất, tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi.

2. Mục đích của đề tài
- Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus từ đất hoa màu, cỏ ủ, phân.

1

- Tìm hiểu khả năng sinh enzyme amylase và protease của vi khuẩn nhằm ứng
dụng sản xuất chế phẩm sinh học với mục đích nâng cao năng suất và tăng hiệu
quả kinh tế trong chăn nuôi.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.1. Đối tượng nghiên cứu

- Vi khuẩn Bacillus
- Khả năng sinh enzyme amylase, enzyme protease của vi khuẩn
3.2. Phạm vi nghiên cứu
Phân lập vi khuẩn Bacillus từ đất hoa màu, cỏ ủ, phân.
4. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp thực nghiệm: Các thí nghiệm được tiến hành tại phịng thí
nghiệm trường Đại học Quảng Nam.
- Phương pháp nghiên cứu lý thuyết: đọc, phân tích, so sánh, tổng hợp tài
liệu.
- Phương pháp thống kê và xử lý số liệu

2

PHẦN 2: NỘI DUNG
Chương 1: Tổng quan tài liệu
1.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus
1.1.1. Đặc điểm phân loại
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli

Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus sp. [8]

Hình 1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis
( />
b/b9/Bacillus_subtilis_Gram.jpg)
1.1.2. Đặc điểm sinh học

Bacillus là vi khuẩn gram dương, catalase dương tính, nhóm vi khuẩn này
thường được tìm thấy trong mơi trường có độ biến động cao, sinh trưởng dưới
điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí khơng bắt buộc, sử dụng khí oxi làm chất nhận khi
trao đổi khí trong q trình trao đổi chất. Chúng có khả năng tạo ra bào tử khi
xảy ra các điều kiện khắc nghiệt như thiếu dinh dưỡng, nhiệt độ cao. Phần lớn tế

3

bào có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu có kích thước
khác nhau (0,5 - 2,5) x (1,2 – 10) µm.

Bào tử có tính kháng nhiệt cao, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp

suất thẩm thấu, khi gặp điều kiện lợi có thể nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh
dưỡng.

Vi khuẩn Bacillus có bao nhầy (giác mạc), bao nhầy có cấu tạo polypeptit
giúp chúng có khả năng chịu được các điều kiện khắc nghiệt [6].

Hầu hết Bacillus không gây độc cho người và động vật, một số gây độc
cho cơn trùng. Chúng có khả năng sinh enzyme ngoại bào do đó được ứng dụng
niều trong cơng nghệp, nơng nghiệp và bảo vệ môi trường…

1.1.3. Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên

1.1.3.1. Bacillus subtilis
Bacillus subtilis được nhà khoa học cùng thời với Robert Koch tên là

Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 [8].
Bacillus subtilis được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân bố nhiều trong

đất và đặc biệt là ở cỏ khô.
Chúng phân hủy pectin và polysaccarit ở mô thực vật và góp phần gây nên

các nốt trên củ khoai tây bị u. Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy
xác định mà khơng cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng. Sự sinh
trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc
động thực vật. Chúng khơng sinh trưởng trên thực phẩm có tính axit ở điều kiện
tối ưu. Chúng là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì. Phần lớn thơng tin chúng ta
có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền của các vi khuẩn Gram dương khác
đều nhận được từ việc nghiên cứu Bacillus subtilis [8].
Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước ( 3 – 5) x 0,6 µm.

Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi [8].
Khuẩn lạc khô, vô màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo ra lớp
màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt
vào mơi trường thạch. Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 360C – 500C, tối đa

4

khoảng 600C, là loại ưa nhiệt cao. Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được
nhiệt khá cao.

Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6µm – 0,9µm. Phân bố khơng theo
ngun tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng khơng chính tâm. Chúng phát
tán rộng rãi. Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển
của vi khuẩn. Chúng khơng có khả năng trao đổi chất nên có thể sống được vài
năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200 – 300 năm [1].

Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có những
đặc tính tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử
dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease,
inosine, ribosides, acid amin, subtilisin. Ngồi ra nhờ khả năng bám dính proton
lên bề mặt mà Bacillus subtilis có thể loại bỏ được chất thải phóng xạ như
Thorium (IV) và Plutonium (IV) [5]. Đặc biệt, Bacillus subtilis được sử dụng
trong lên men Natto của Nhật – một thực phẩm chức năng rất bổ dưỡng cho sức
khỏe [7].

1.1.3.2. Bacillus megaterium
Megaterium có nghĩa là “ con thú lớn”. Tế bào của nó khá lớn khoảng gấp

hơn 2 lần tế bào của Bacillus subtilis, chiều ngang (1,2 – 1,5) µm có thể đến 2
µm, dài từ 3 – 12 µm, ở các ống ni già thì tế bào ngắn hơn, trịn hơn, đơi khi

hình thoi với đầu hẹp lại. Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dinh dưỡng dự trữ
(hạt mỡ, glycogen) [8].

Bào tử lớn hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 x (0,7-1) µm, bào tử lớn
nhất có đường kính từ 1,2 đến 1,5 µm [8]. Chúng nằm lệch tâm thường theo
chiều ngang hoặc xiên của tế bào. Khuẩn lạc tròn đều khơng thùy, khơng nếp,
mép trịn đều hoặc hơi lượn sóng, trơng giống giọt bạch lạp, lồi nhẵn, nhưng
thường có vòng viền quanh đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa hay đục. Sinh
trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần them bất kỳ một yếu tố
sinh trưởng nào. Bacillus megaterium cũng sản sinh ra các enzyme tương tự
Bacillus subtilis, do đó nó cũng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp.

5

1.1.3.3. Bacillus mensentericus
Bacillus mensentericus còn được gọi là trực khuẩn khoai tây do nó có mặt

chủ yếu trên khoai tây. Trực khuẩn gần giống Bacillus subtilis, mảnh dài hoặc
ngắn (3- 10) x (0,5 – 0,6) µm, có thể đứng riêng rẽ hoặc chuỗi dài. Bào từ hình
bầu dục và kéo dài 0,5 – 0,9 µm, nằm ở vị trí bất kỳ trong tế bào, tế bào Bacillus
mensentericus khơng bị phình to khi mang bào tử. Khuẩn lạc bám chặt vào mơi
trường thạch, có khi dính vào mơi trường, mỏng, nhăn nheo, xám nhạt – trắng, có
thể màu Crem, vàng nâu, hồng hoặc đen như Bacillus mensentericus niger (đen),
Bacillus mensentericus ruber (hồng). Bacillus mensentericus sinh trưởng và phát
triển tốt nhất ở nhiệt độ 36 – 450C tối đa 50 – 550C. pH = 4,5 – 5 thì nó ngừng
phát triển. Bacillus mensentericus có hoạt tính amylase và protease lớn hơn hẳn
Bacillus subtilis, nhưng lên men đường lại kém hơn. Hai loại trực khuẩn này rất
phổ biến trong tự nhiên, chúng lây nhiễm làm hư hỏng thực phẩm, nhất là các
thực phẩm có chứa nitơ và các sản phẩm giàu đường (bánh kẹo, hoa quả) đây
cũng là loại được ứng dụng vào ngành công nghệ sản xuất enzyme protease,

amylase… Ngồi ra, nó cịn sinh ra một loại hợp chất có hoạt tính kháng với một
số vi khuẩn khác ( như Vibrio) gọi là bacterioxin, ở Bacillus subtilis gọi là
subtilin hay Irutin A, B [8].

1.1.3.4. Bacillus cereus
Đây là loại có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus

mycoides, Bacillus thuringiensis. Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất,
khơng khí… Chúng thường sinh sơi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể
sinh ra độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng. Chúng được áp dụng để sản xuất
kháng sinh, giống Bacillus này có độc tính, gây ngộ độc thực phẩm [8].

Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1 – 1,5) x (3 – 5) µm, có khi dài
hơn, chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi. Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x
(1,2 – 1,5) µm nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và khơng bào.
Khuẩn lạc của Bacillus cereus phẳng, khá khuyếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép
lồi lõm [3].

6

1.1.3.5. Bacillus pumilus
Bào tử phát tán rộng khắp mọi nơi, thường Bacillus pumilus có mặt trong

đất nhiều hơn Bacilus subtilis.
Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan khơng ranh giới. Tế bào của nó gần
giống tế bào Bacillus subtilis.

1.1.3.6. Bacillus polymyxa
Bacillus polymyxa có khuẩn lạc vơ màu, phẳng hoặc lồi, trơn, nhày, lan

dần ra xung quanh, mép đơi khi có thùy. Tế bào của Bacillus polymyxa có kích
thước (0,6 – 1) x (2 – 7)µm, đứng riêng rẽ hay xếp thành đơi, chuỗi ngắn. Khi
hình thành bào tử tế bào đó sẽ phồng lên hình quả chanh. [3]

Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao.
Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng (1,7 – 2,6) µm, nằm giữa tế
bào. Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây. Chúng cịn có
khả năng cố định đạm. [8]
Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì vậy
người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kem và những mơi
trường có tính axit yếu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là nguồn để sản
xuất kháng sinh polymyxin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ
yếu là cho cơng nghiệp dược.

1.1.3.7. Bacillus brevis
Người ta thường tìm thấy và phân lập chúng từ đất và thực phẩm.
Khuẩn lạc của chúng màu trắng, đơi khi có sắc vàng, lồi hoặc phẳng lấp

lánh, mép răng cưa giống dạng mỡ đặc.
Bacillus brevis là trực khuẩn kích thước (0,7 – 1) x (3 – 5)µm. Chúng

thường đứng riêng rẽ. Bào tử hình bầu dục, có kích cỡ ( 0,8 – 1) µm, nằm cuối tế
bào làm cho đầu tế bào hơi phồng to lên [3]. Về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus
brevis yêu cầu một hỗn hợp axit amin cho sinh trưởng và phát triển, không cần
bổ sung vitamin [8].

7

1.1.3.8. Bacillus simplex
Khuẩn lạc giống khuẩn lạc Bacillus cereus, phẳng, khá khuyếch tán, với

bề mặt hơi xù xì (dạng bột hoặc hạt nhỏ), hơi lõm, màu đục, mép lồi lõm. Đặc
biệt khuẩn lạc của Bacillus simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết
vào môi trường [3].

Tế bào của nó nhỏ bé, có kích thước (2 – 5) x 0,6 µm, thường đứng riêng
rẽ khơng kết thành chuỗi.

Bào tử hình bầu dục, có kích thước 0,6 x 0,9 µm, nằm lệch tâm.

1.1.3.9. Bacillus lincheniformis
Chúng được áp dụng trong việc sản xuất loại vỏ bao poly D – glutamate
và phẩm đỏ cùng với nhiều chủng khác.
Bào tử của chúng phát tán chủ yếu trong đất. Chúng sinh trưởng phát triển
trên các loại thực phẩm. Đặc biệt chúng có khả năng sản xuất ra bacitracin, một
kháng sinh có ích trong y học, nên chúng được ứng dụng phổ biến trong công
nghiệp dược [8].

1.1.4. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus

1.1.4.1. Cấu tạo bào tử
Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ.
Vỏ bào tử có nhiều lớp. Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự

thẩm thấu của nước và các chất hoà tan trong nước.
Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào

chất đồng nhất. Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có
thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm.

Bào tử khác tế bào dinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hố học và tính
chất sinh lý.

8

Hình 1.2 Bào tử của Bacillus cereus và Bacillus anihracis

1.1.5.2. Khả năng tạo bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo

bào tử trong những điều kiện nhất định.
Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử theo chu trình phát triển tự

nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường bị
kiệt quệ).

Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn
tất.

Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và
nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại
và tạo thành tiền bào tử. Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp màng.
Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào dinh
dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện
thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra. Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ và
bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ra
một bào tử.

1.2. Lịch sử nghiên cứu enzyme từ vi sinh vật
Trước thế kỷ thứ XVII, người ta đã biết sử dụng các quá trình enzyme

trong đời sống song chỉ có tính chất kinh nghiệm thực tế và thơng qua hoạt động
của vi sinh vật. Đó là các quá trình lên men rượu, muối dưa, làm tương và nước
chấm. Ở thời kỳ này người ta chưa hiểu về bản chất enzyme và các quá trình lên
men.

Từ thế kỷ XVII đến thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã bắt đầu tìm hiểu bản
chất của các quá trình lên men. Thời kỳ này đã khái quát hiện tượng lên men như

9

là hiện tượng phổ biến trong sự sống và enzyme là yếu tố gây nên sự chuyển hóa
các chất trong quá trình lên men.

Vào những năm 1600 của thế kỷ XVII, Van Helmont là người đầu tiên cố
gắng tìm hiểu bản chất của quá trình lên men. Những nghiên cứu thực nghiệm
đầu tiên về enzyme nói chung và về enzyme amylase nói riêng được bắt đầu vào
những năm 1811 – 1814. Những nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi của nhà bác
học người Nga – Viện sĩ K.S Kirhof. Ông nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột
dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm (malt) và nhận thấy rằng trong
malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường. Mười chín năm sau (1833),
hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Pessoz đã chứng minh chất có thể phân
giải tinh bột thành đường có thể tách được ở dạng bột. Danh từ Diastase là do hai
nhà khoa học dùng để gọi cho enzyme amylase ở lúc bấy giờ.

Tiếp đó, người ta cũng đã tìm ra và tách được nhiều enzyme khác như
Pepsin (Emberle và Shwan). Năm 1857, Convisart tách được tripxin từ dịch tụy,
đó là protease đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm. Năm 1879, Wurtz được xem
là người đầu tiên tách được protease thực vật. Từ 1918 – 1919 Waksman đã phát
hiện được khả năng sinh protease từ xạ khuẩn. Tuy nhiên ban đầu protease từ vi

sinh vật không được coi trọng. Mãi đến những năm 50 của thế kỷ XX protease
mới được sử dụng cực kỳ phổ biến trong các ngành công nghiệp… [6]

Giai đoạn từ giữa thế kỷ XIX đến 30 năm đầu của thế kỷ XX, ở giai đoạn
này một số lượng lớn các enzyme hịa tan đã được tách chiết. Trong thời kỳ này
có hai trường thái đấu tranh với nhau đó là trường phái Pasteur và trường phái
Liebig. Trường phái Pasteur cho rằng không thể tách enzyme ra khỏi tế bào, tác
dụng và tính chất của enzyme gắn liền với sự sống. Trường phái Liebig chống lại
trường phái Pasteur, ông cho rằng không có hoạt động của tế bào vi sinh vật cũng
có thể lên men, tức là enzyme có thể tách ra khỏi hoạt động sống của tế bào, cũng
là một chất hóa học tương tự như các chất xúc tác. Giai đoạn này, cơng trình của
nhà bác học vĩ đại người đức E. Fisher đã đặt nền móng cho những khái niệm

10

hiện đại về tính đặc hiệu của enzyme về sự tương tác không gian giữa enzyme và
cơ chất.

Từ những năm 30 của thế kỷ XX đến nay, bản chất hóa học của enzyme
chỉ được xác định đúng đắn sau khi kết tinh được enzyme. Cơng trình của hai
nhà khoa học người Mỹ là Summer và Northrop đã khẳng định một cách dứt
khoát bản chất hóa học của enzyme là protein. Năm 1981, Cech đã chứng minh
được enzyme không nhất thiết phải là Protein bằng các xác định được một ARN
có tính chất hoạt hóa như enzyme. Hiện nay, nghiên cứu enzyme phát triển rất
mạnh nhờ áp dụng thành quả khoa học hiện đại như điện di, sắc ký, quang phổ,
đồng vị phóng xạ đã cho phép nghiên cứu cấu trúc cũng như tác động của nhiều
loại enzyme.

1.3. Giới thiệu về enzyme amylase

1.3.1. Amylase từ vi sinh vật
Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả đó là nấm mốc, nấm men

và vi khuẩn, cịn xạ khuẩn thì ít hơn. Để thu amylase người ta thường dùng các
giống vi sinh vật sau:

+ Nấm mốc: Aspergillus, Rhizopus.
+ Nấm men: Candida, Saccharomyces, Endomycopsis, Endomyces .
+ Vi khuẩn: Bacillus mesentericus, B. subtilis, B. macecassavanum,
Clostridium acetobutylium, Penicillium saccharophila,… [2]
Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh (4 – 6 lần so với vi
khuẩn ưa ẩm) và phát triển tốt ở nhiệt độ tương đối cao, nên khi nuôi chúng ở
nhiệt độ cao ít bị nhiễm vi sinh vật khác.
Trong số vi khuẩn ưa ấm tạo amylase mạnh, thì Bacillus subtilis được
nghiên cứu và sử dụng rộng rãi nhất. Riêng ở Nhật, hàng năm người ta sản xuất
tới hàng chục nghìn tấn chế phẩm amylase và protease từ loài vi khuẩn ưa ấm và
hiếu khí này. Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của Bacillus subtilis là 370C.

11

1.3.2. Đặc tính của amylase
Hiện nay người ta đã biết rõ có 6 loại enzyme amylase trong đó αamylase,

β-amylase, gluco-amylase (γ-amylase) thủy phân các liên kết α –1,4- glucoside
của tinh bột và các polysaccharide; 3 amylase còn lại (dextrine –6-
glucanhidrolase, amilopectin -6- glucanhidrolase, oligodexin -6- glucanhidrolase
hay dextrinase) thuỷ phân các liên kết α – 1,6 - glucoside trong polysaccharide và
các dextrin cuối.

Các enzyme amylase có nguồn gốc khác nhau thì thường khác nhau về

tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thuỷ phân.

1.3.2.1. α-amylase

α-amylase: α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α –1,4- glucoside

nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen và polysaccharide) một

cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào. Khi tác dụng lên tinh bột, enzyme

này giải phóng ra glucose ở dạng α- mutamer, nên năm 1924 Kuhn gọi nó là α-

amylase. [9]

α-amylase khơng chỉ thuỷ phân hồ tinh bột mà nó thuỷ phân cả hạt tinh

bột còn nguyên, song với tốc độ rất chậm. Dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột

có thể chuyển thành maltotrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy

nhiên, α-amylase thường thuỷ phân tinh bột thành dextrin phân tử thấp không

cho màu với iod và một ít maltose, do đó α-amylase có tác dụng làm giảm độ

nhớt của hồ tinh bột rất mạnh (dịch hoá).

Tinh bột α-amylase α- dextrin + maltose + glucose

(hoặc glucogen) (nhiều) (ít)

α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng, α -

amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác. Tất cả các α-amylase đều bị

kiềm hãm bởi kim loại nặng như: Cu2+, Ag+, Hg2+. So với α-amylase của nấm

mốc, amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hố trội hơn hoạt lực đường hóa.

α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn cơng những hạt tinh bột bị vỡ,

cịn α-amylase vi khuẩn lại có khả năng phân huỷ các hạt tinh bột còn nguyên lẫn

12