Ppt tbvktcnsh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CƠNG NGHỆ SINH HỌC

CHẨN ĐỐN BỆNH SÁNG MÁNG BẰNG
PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR

NHÓM: 6 GVHD: TS. Huỳnh Văn Biết

1

THÀNH VIÊN

Phạm Thị Thúy Nguyên 21126431

Nguyễn Thị Hà 21126320
Võ Uyên Chi
21126292

2

NỘI DUNG CHÍNH

1 GIỚI THIỆU

2 NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

3 KẾT QUẢ

3

1 GIỚI THIỆU

o Bệnh sán máng - bilharzia, do giun sán họ Schistosomatidae gây
ra.

o Trên quy mơ tồn cầu, cứ 30 người thì có một người mắc bệnh sán
máng.

o Chẩn đoán bệnh qua việc quan sát trứng bằng
kính hiển vi trong phân hoặc nước tiểu.

o Đã phát triển phương pháp phản PCR để cải
thiện khả năng phát hiện trực tiếp
Schistosoma.

4

1 GIỚI THIỆU

o Bệnh lây nhiễm qua da do bơi
hoặc lội ở những vùng nước bẩn,
nhiễm vào mạch máu của hễ tiêu
hóa hoặc hệ tiết niệu.

o Các triệu chứng cấp tính là
viêm da, vài tuần sau đó là
sốt, ớn lạnh, buồn nôn, đau
bụng tiêu chảy, khó chịu và
đau cơ.

5

2 NGUYÊN LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

Nguyên liệu

• Mẫu DNA/RNA: mẫu phân, nước tiểu, sinh
thiết hoặc huyết tương

• Mồi
• Enzyme tổng hợp (DNA polymerase)
• Deoxynucleotide triphosphate (dNTP)
• Dung dịch đệm và nồng độ Mg2+
• Chất phát huỳnh quang

6

2 NGUYÊN LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp

1 2 3

Tách chiết Kiểm soát Xét nghiệm
DNA chiết xuất ức realtime PCR
Schistosoma
chế

7

Tách chiết DNA

Máu và 1ml huyết Tách
nước tiểu thanh chiết acid

hoặc nucleic

1ml viên Thiết bị MagNA Pure Compact là hệ thống tách
nước chiết axit nucleic lâm sàng hoàn toàn tự động
tiểu
8

Tách chiết DNA

250mg - 500mg mẫu phân được hòa tan trong 1 mL PBS (-
20°C)

200 μL huyềnL huyền Sử dụng Bộ Thu được DNA
phù phân sau chuẩn bị mẫu
PCR tinh khiết
khi đập hạt
cao

9

Kiểm soát chiết xuất, ức chế

Thành phần Nồng độ Thiết bị LightCycler 2 được thiết kế cho các ứng dụng chẩn
DNA 2,5 µL đốn trong ống nghiệm kết hợp với bộ thuốc thử LightCycler

10X Taq SyBr 3,3 µL
Mồi BgO7 0,1 µL
Mồi BgO8 0,1 µL
MgCl2 4 mM
Tổng thể tích 10 µL

Q trình khuếch đại được tiến hành trên thiết bị LightCycler 2 (Roche
Diagnostics) trong 40 chu kỳ 15 giây ở 95°C, 10 giây ở 70°C và 20 giây ở
72°C, sau đó là bước đồng nhất.

10

Xét nghiệm Realtime PCR Schistosoma

Để đạt được độ nhạy phân tích cao, trình tự lặp lại song song
121 bp đóng góp khoảng 12% tổng trình tự bộ gen Schistosoma
mansoni đã được chọn làm gen mục tiêu PCR

Sơ đồ thể hiện vị trí gắn mồi của mồi và mẫu dị trong trình tự gen 121
bp và gen β-actin cactin của con người.

11

Xét nghiệm Realtime PCR Schistosoma

Thành phần Nồng độ

DNA 3 µL

10X Platinum Taq PCR-Buffer 2 µL

MgCl2 (50 µM) 1,5 µL

Mỗi dNTP 200 µM

Albumin huyết thanh 0,8 µg

Mồi SRA1 500 nM

Đầu dò SRP 300 nM

Taq polymerase 1,25 đơn vị Thiết bị LightCycler 2
Tổng thể tích 20 µL

Q trình khuếch đại được tiến hành trên thiết bị Roche LightCycler 2

bao gồm: 95°C/5 phút , 45 chu kỳ 58°C/30 giây và 95°C/10 giây. Huỳnh

quang được đo một lần trong mỗi chu kỳ ở cuối đoạn 58° 12

3 KẾT QUẢ

• Cải thiện việc phát hiện Schistosoma trong mẫu
nước tiểu và phân

• Hiệu quả, đáng tin cây hơn
• Ở những bệnh nhân có kính hiển vi âm tính, tỷ lệ

dương tính với PCR huyết thanh cũng tương đối cao

13

CẢM ƠN THẦY CÔ
VÀ CÁC BẠN ĐÃ
LẮNG NGHE

14