nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ở hai xã trọng điểm thuộc ninh bình phú yên và chế tạo kit lamp ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (6.62 MB, 196 trang )

Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu do chính tơi thực hiện dưới sự hướng dẫn trực tiếp của PGS.TS Trần Thanh Dương, TS Trương Văn Hạnh và các thầy cô là giảng viên cán bộ của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương. Trong quá trình thực hiện luận án, tôi được Chủ nhiệm đề tài và các thành viên tham gia đề tài cho phép sử dụng mẫu và một

phần số liệu của đề tài cấp nhà nước: “Nghiên cứu chế tạo các bộ kít LAMP

để chẩn đốn ký sinh trùng sốt rét, sán lá gan lớn, sán lá gan nhỏ, giun lươn đường ruột tại thực địa.”. Các số liệu và kết quả trong luận án là hồn tồn

trung thực, chưa được cơng bố ở bất kỳ cơng trình nào khác. Các bước tiến hành của đề tài đúng như đề cương nghiên cứu, chấp hành các quy định đạo đức trong tiến hành nghiên cứu.

Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về những cam kết này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2024

Tác giả

Phạm Thị Hà Trang

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

LỜI CẢM ƠN

Với lịng chân thành, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trần Thanh Dương, TS. Trương Văn Hạnh đã hướng dẫn và giúp đỡ tận tình trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hồn thành luận án.

Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Hồng Đình Cảnh, Viện trưởng cùng Ban Lãnh đạo Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương, các Khoa Sinh học phân tử, Ký sinh trùng đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Cao Bá Lợi cùng các cán bộ của Phòng Khoa học và Đào tạo, đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tơi nhiệt tình trong thời gian nghiên cứu, học tập và hoàn thành luận án.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Lãnh đạo, cán bộ y tế của Trung tâm Kiểm sốt bệnh tật tỉnh Ninh Bình và Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Phú Yên, cán bộ y tế tại Trung tâm y tế huyện Kim Sơn, huyện Tuy An và Trạm Y tế của hai điểm nghiên cứu đã hợp tác, tạo điều kiện giúp đỡ tơi trong q trình nghiên cứu tại thực địa.

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Sở Y tế Hà Nội, phòng Quản lý hành nghề y dược tư nhân và toàn thể bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, khuyến khích và hỗ trợ tơi trong q trình học tập, nghiên cứu.

Cuối cùng tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bố, mẹ, chồng, con đã ln khuyến khích, chia sẻ, động viên, giúp đỡ tơi trong những lúc khó khăn để hồn thành luận án này.

Hà Nội, ngày tháng năm 2024

Tác giả

Phạm Thị Hà Trang

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TĂT

Khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng

OR Odd Ratio Tỷ suất chênh

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi Polymerase TCCN,

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 3

1.1. Một số đặc điểm dịch tễ học nhiễm sán lá gan nhỏ ... 3

1.2.3. Điều trị bệnh sán lá gan nhỏ trên người ... 20

1.3. Các phương pháp xét nghiệm xác định tình trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ... 20

1.4. Kỹ thuật LAMP và nghiên cứu chế tạo bộ kít LAMP xét nghiệm phát hiện nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ... 22

1.4.1. Nguyên lý của kỹ thuật LAMP ... 22

1.4.2. Thành phần phản ứng LAMP ... 22

1.4.3. Cơ chế của phản ứng LAMP ... 23

1.4.4. Đánh giá kết quả của LAMP ... 25

1.4.5. Quy trình thực hiện LAMP ... 26

1.4.6. Tính ưu việt của kỹ thuật LAMP ... 27

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

1.4.7. Một số hạn chế của kỹ thuật LAMP ... 27

1.4.8. Một số ứng dụng của kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhỏ ở người ... 28

1.4.9. Chế tạo và chuẩn hóa bộ kit LAMP chẩn đốn sán lá gan nhỏ ... 30

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 36

2.1. Mục tiêu 1: Mô tả thực trạng và một số yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại hai xã trọng điểm thuộc tỉnh Ninh Bình và Phú Yên (2018-2020) ... 36

2.1.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu ... 36

2.1.2. Phương pháp nghiên cứu ... 37

2.2. Mục tiêu 2: Chế tạo kit LAMP xét nghiệm nhiễm Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini trên người ở quy mơ phịng thí nghiệm ... 43

2.2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu ... 43

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu ... 45

2.3. Đạo đức trong nghiên cứu ... 58

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ... 59

3.1. Thực trạng và một số yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại hai xã trọng điểm thuộc tỉnh Ninh Bình và Phú Yên (2018-2020) ... 59

3.1.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu ... 59

3.1.2. Tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại địa điểm nghiên cứu ... 60

3.1.3. Một số yếu tố liên quan đến tình trạng nhiễm sán lá gan nhỏ ở người .. 70

3.2. Chế tạo kit LAMP xét nghiệm nhiễm Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini trên người ở quy mô phịng thí nghiệm ... 78

3.2.1. Thiết kế, đánh giá lựa chọn các bộ mồi LAMP ... 78

3.2.2. Đánh giá tính đặc hiệu và khả năng hoạt động của bộ mồi LAMP thiết kế. ... 79

3.2.3. Khảo sát, tối ưu hóa các điều kiện phản ứng LAMP ... 81

3.2.4. Đóng gói thành phẩm bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ ... 87

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

3.3. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kít LAMP chẩn đốn sán lá

gan nhỏ, so sánh bộ mồi ... 88

3.3.1. Độ nhạy, độ đặc hiệu của kít LAMP chẩn đốn O. viverrini tại phịng thí nghiệm. ... 88

3.3.2. Độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit LAMP chẩn đoán C. sinensis ... 88

3.3.3. Kết quả so sánh bộ kít LAMP chẩn đốn sán lá gan nhỏ với bộ mồi có cùng mục đích. ... 89

3.3.4 Đánh giá độ ổn định của bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ . 90 3.4. Kết quả đánh giá bộ kít LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ tại thực địa tỉnh Phú Yên và Ninh Bình ... 95

3.4.1. Đánh giá bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. viverrini tại thực địa tỉnh Phú Yên ... 95

3.4.2. Kết quả đánh giá bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis tại thực địa tỉnh Ninh Bình ... 96

3.5. Xây dựng tiêu chuẩn và kiểm định các bộ kít LAMP ... 98

3.5.1. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở ... 98

3.5.2. Kết quả kiểm định các bộ kít LAMP chẩn đốn sán lá gan nhỏ .... 99

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ... 100

4.1. Mô tả thực trạng và một số yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình và Phú Yên (2018-2020) ... 100

4.1.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu ... 100

4.1.2. Kết quả nghiên cứu tỷ lệ, cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ trên người .. 102

4.2. Một số yếu tố liên quan đến tình trạng nhiễm sán lá gan nhỏ ở người ... 107

4.2.1. Liên quan giữa tuổi và tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ ... 107

4.2.2. Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và giới tính ... 109

4.2.3. Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và nghề nghiệp... 111

4.2.4. Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và trình độ học vấn ... 112

4.2.5. Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và việc sử dụng nhà tiêu .... 114

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

4.2.6. Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và việc sử dụng phân

tươi để chăn nuôi, trồng trọt... 115

4.2.7. Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và có ni chó mèo ... 116

4.2.8. Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và tình trạng ăn gỏi cá .... 118

4.2.9. Một số yếu tố khác liên quan đến tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ ... 119

4.3. Chế tạo kit LAMP xét nghiệm nhiễm Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini trên người ở quy mơ phịng thí nghiệm ... 122

4.3.1. Khảo sát vùng bảo thủ của gen đích, thiết kế và lựa chọn mồi LAMP ... 122

4.3.2. Tối ưu thành phần và điều kiện hoạt động của phản ứng LAMP .... 125

4.3.3. Khảo sát ngưỡng phát hiện của kỹ thuật LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ .. 130

4.3.4. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ ổn định của kít LAMP chẩn đốn sán lá gan nhỏ, so sánh kít LAMP với bộ mồi cùng mục tiêu ... 131

4.3.5. Đánh giá bộ kít LAMP chẩn đốn sán lá gan nhỏ tại thực địa tỉnh Phú Yên và Ninh Bình ... 133

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Phân loại cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ ... 41

Bảng 2.2. Yêu cầu về độ dài của mồi ... 50

Bảng 2.3. Yêu cầu về nhiệt độ nóng chảy của từng mồi ... 51

Bảng 3.1. Đặc điểm nhân khẩu học của đối tượng nghiên cứu ... 59

Bảng 3.2. Đặc điểm gia đình của đối tượng nghiên cứu ... 60

Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ trên người ... 60

Bảng 3.4. Tỷ lệ người nhiễm sán lá gan nhỏ theo nhóm tuổi ... 61

Bảng 3.5. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ theo giới tính ... 62

Bảng 3.6. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ theo nghề nghiệp ... 63

Bảng 3.7. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ theo trình độ học vấn ... 64

Bảng 3.8. Cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ tại điểm nghiên cứu ... 65

Bảng 3.9. Cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ theo nhóm tuổi ... 66

Bảng 3.10. Cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ theo giới tính ... 67

Bảng 3.11. Cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ theo nghề nghiệp ... 68

Bảng 3.12. Cường độ nhiễm sán lá gan nhỏ theo trình độ học vấn ... 69

Bảng 3.13. Lý do ăn gỏi cá của người dân tại địa điểm nghiên cứu ... 70

Bảng 3.14. Liên quan giữa nhiễm sán lá gan nhỏ và tiền sử ăn gỏi cá sống ... 71

Bảng 3.15. Liên quan giữa ăn gỏi cá và nhiễm sán lá gan nhỏ ở nam giới ... 71

Bảng 3.16. Liên quan giữa ăn gỏi cá và nhiễm sán lá gan nhỏ ở nữ giới ... 72

Bảng 3.17. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và tần suất ăn gỏi cá sống ... 73

Bảng 3.18. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và nguồn cá sử dụng ăn gỏi ... 73

Bảng 3.19. Liên quan giữa tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ và sử dụng hố xi hợp

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

Bảng 3.22. Liên quan giữa nhiễm sán lá gan nhỏ và có ao ni cá ... 76

Bảng 3.23. Mơ hình hồi quy đa biến ... 77

Bảng 3.24. Trình tự mồi LAMP thiết kế để chẩn đoán O. viverrini. ... 78

Bảng 3.25. Trình tự mồi LAMP thiết kế để chẩn đoán C. sinensis. ... 79

Bảng 3.26. Kết quả đánh giá sự chuyển màu của mẫu âm tính, dương tính với các nồng độ HNB sử dụng cho phản ứng LAMP ... 84

Bảng 3.27. Độ nhạy, độ đặc hiệu của kít LAMP chẩn đốn O. viverrini ... 88

Bảng 3.28. Độ nhạy, độ đặc hiệu của kít LAMP chẩn đốn C. sinensis. ... 88

Bảng 3.29. So sánh độ tương đồng kết quả xét nghiệm giữa bộ kit LAMP chế tạo với kỹ thuật LAMP sử dụng bộ mồi theo Lê Thanh Hòa và cs ... 89

Bảng 3.30. So sánh độ tương đồng kết quả xét nghiệm giữa bộ kit LAMP chế tạo với kỹ thuật LAMP sử dụng bộ mồi của Rahman và cs ... 90

Bảng 3.31. Kết quả khảo sát độ ổn định của bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. viverrini sau 6 tháng bảo quản... 91

Bảng 3.32. Kết quả khảo sát độ ổn định của bộ kít LAMP chẩn đốn sán lá gan nhỏ O. viverrini sau 4 lần làm tan và đông đá ... 91

Bảng 3.33. Kết quả khảo sát độ ổn định của bộ Kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ O. viverrini sau 12 tháng bảo quản ... 92

Bảng 3.34. Kết quả khảo sát độ ổn định của bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis sau 6 tháng bảo quản ... 93

Bảng 3.35. Kết quả khảo sát độ ổn định của bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis sau 4 lần làm tan và đông đá ... 94

Bảng 3.36. Kết quả khảo sát độ ổn định của bộ kit LAMP chẩn đoán sán lá gan nhỏ C. sinensis sau 12 tháng bảo quản ... 94

Bảng 3.37. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ O. viverrini phát hiện bằng Kato-Katz và bộ kít LAMP ... 95

Bảng 3.38. So sánh hệ số tương đồng kết quả xét nghiệm phát hiện sán lá gan nhỏ O. viverrini bằng bộ kít LAMP và real time PCR ... 96

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

Bảng 3.39. Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ C. sinensis phát hiện bằng Kato-Katz và

bộ kít LAMP ... 97Bảng 3.40. So sánh hệ số tương đồng kết quả xét nghiệm phát hiện sán lá gan

nhỏ C. sinensis bằng bộ kít LAMP và real time PCR ... 97

Bảng 3.41. Tiêu chuẩn cơ sở của bộ kít LAMP chẩn đốn sán lá gan nhỏ

Opisthorchis viverrini ... 98

Bảng 3.42. Tiêu chuẩn cơ sở của bộ kít LAMP chẩn đốn sán lá gan nhỏ

Clonorchis sinensis ... 98

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

Hình 1.3. Hình thể trứng của các loài sán lá gan nhỏ ... 4

Hình 1.4. Ấu trùng (Metacercariae) của sán lá gan nhỏ ... 5

Hình 1.5. Lồi ốc mang ấu trùng sán lá gan nhỏ tại Việt Nam ... 6

Hình 1.6. Cá lóc đồng ... 6

Hình 1.7. Cá chép ... 6

Hình 1.8. Chu kỳ phát triển của sán lá gan nhỏ C. sinensis ... 8

Hình 1.9. Phân bố của sán lá gan nhỏ tại Việt Nam ... 14

Hình 1.10. Các mồi thiết kế và vị trí bắt cặp trên gen đích ... 23

Hình 1.11. Sơ đồ phản ứng LAMP ở giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu ... 24

Hình 1.12. Sơ đồ phản ứng LAMP giai đoạn tái bản và kéo dài chuỗi ... 24

Hình 1.13. Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP ... 25

Hình 1.14. Sản phẩm LAMP khi quan sát bằng mắt thường ... 25

Hình 1.15. Hình ảnh sản phẩm LAMP nhuộm bằng SYBR green ... 26

Hình 1.16. Quy trình thực hiện LAMP ... 26

Hình 2.1. Bản đồ địa điểm nghiên cứu tại Ninh Bình ... 37

Hình 2.2. Bản đồ địa điểm nghiên cứu tại Phú Yên ... 37

Hình 2.3. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu chế tạo bộ kít LAMP chẩn đốn sán lá

gan nhỏ ... 45

Hình 3.1. Tỷ lệ người dân ăn gỏi cá ... 70

Hình 3.2. Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi F3-B3 của O. viverrini ... 80

Hình 3.3. Sản phẩm LAMP điện di trên gel agarose 2% sử dụng bộ mồi thiết kế đặc hiệu cho sán lá gan nhỏ O. viverrini và C. sinensis ... 81

Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm khảo sát nhiệt độ ủ mồi của phản ứng LAMP chẩn đốn O. viverrini. ... 82

Hình 3.5. Ảnh điện di sản phẩm LAMP khảo sát với các nồng độ MgSO4 ... 82

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

Hình 3.6. Ảnh điện di sản phẩm khảo sát thời gian của phản ứng LAMP ... 83

Hình 3.7. Ảnh sản phẩm LAMP với các nồng độ HNB khảo sát khi quan sát bằng mắt thường ... 84

Hình 3.8. Ảnh điện di sản phẩm LAMP trên gel agarose 2% xác định ngưỡng phát hiện sơ cấp của kít LAMP ... 85

Hình 3.9. Ảnh sản phẩm LAMP quan sát bằng mắt thường xác định ngưỡng phát hiện sơ cấp của kít LAMP ... 86

Hình 3.10. Biểu đồ ngưỡng phát hiện của kít LAMP chẩn đốn sán lá gan nhỏ O. viverrini ... 86

Hình 3.11. Biểu đồ ngưỡng phát hiện thứ cấp của kít LAMP chẩn đốn

sán lá gan nhỏ C. sinensis ... 87

Hình 3.12. Hình ảnh bộ kit LAMP chẩn đốn sán lá gan nhỏ ... 87

Hình 3.13. Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP chẩn đoán O. viverrini sau 1 tháng ... 92

Hình 3.14. Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP chẩn đoán O. viverrini sau 6 tháng ... 92

Hình 3.15. Hình ảnh sản phẩm LAMP chẩn đốn O. viverrini sau 1 tháng dựa vào chỉ thị màu ... 92

Hình 3.16. Hình ảnh sản phẩm LAMP chẩn đốn O. viverrini sau 6 tháng dựa vào chỉ thị màu ... 92

Hình 3.17. Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP chẩn đốn C. sinensis sau 1 tháng... 93

Hình 3.18. Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP chẩn đoán C. sinensis sau 6 tháng.... 93

Hình 3.19. Hình ảnh sản phẩm LAMP chẩn đoán C. sinensis sau 1 tháng dựa vào chỉ thị màu ... 94

Hình 3.20. Hình ảnh sản phẩm LAMP chẩn đoán C. sinenis sau 6 tháng dựa vào chỉ thị màu ... 94

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

C. sinensis và O. viverrini phân bố ở ít nhất 32 tỉnh thành [2].

Hai địa phương Ninh Bình và Phú Yên được coi là điểm nóng với tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ khá cao với nhiều yếu tố liên quan như thời tiết thuận lợi, địa hình nhiều sơng ngịi, ao hồ,…, trong đó, ngun nhân chính do tập quán ăn gỏi cá của nhân dân đã tồn tại lâu đời [3].

Bệnh nhân nhiễm sán lá gan nhỏ thường khơng có các triệu chứng trong một thời gian dài hoặc có triệu chứng nhưng khơng rõ ràng, điều này gây khó khăn cho việc chẩn đốn, điều trị và phịng bệnh. Điều đáng chú ý là người nhiễm sán lá gan nhỏ lâu ngày có thể bị xơ gan ở nhiều mức độ khác nhau, đặc biệt có nguy cơ ung thư biểu mơ đường mật [4]. Vì vậy việc chẩn đốn sán lá gan nhỏ là rất cần thiết.

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp xét nghiệm nhiễm sán lá gan nhỏ Trong đó, xét nghiệm phân bằng kỹ thuật Kato-Katz được sử dụng rộng rãi, dễ thực hiện, nhanh chóng và rẻ tiền, có thể ước tính cường độ nhiễm trùng. Tuy nhiên, độ nhạy của kỹ thuật Kato-Katz thấp, đặc biệt là đối với các trường hợp nhiễm cường độ nhẹ [5], [6].

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, việc ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán các tác nhân sinh học gây bệnh ngày càng được phát triển, đặc biệt là các kỹ thuật PCR, real time PCR để chẩn đoán sán lá gan nhỏ

O. viverrini hay C. sinensis cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhưng gặp nhiều

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

khó khăn khi áp dụng tại thực địa, phù hợp với những trung tâm y học lớn [7]. Gần đây, nhiều nghiên cứu có xu hướng chuyển sang các phương pháp khuếch đại ADN đẳng nhiệt (trong đó được áp dụng nhiều nhất là kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng trung gian - Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP) với những ưu điểm là độ nhạy và đặc hiệu tương đương kỹ thuật PCR nhưng chỉ cần các thiết bị xét nghiệm đơn giản, thời gian xét nghiệm rút ngắn xuống còn 30 - 60 phút, có khả năng phát triển thành các bộ sinh phẩm xét nghiệm (sau đây gọi là kit) phân tử cho phép ứng dụng được tại thực địa [8], [9]. Đến nay, tại Việt Nam chưa có kit LAMP được thương mại hóa để chẩn đốn nhiễm sán lá gan nhỏ trên người. Cần có các nghiên cứu, phát triển ứng dụng kỹ thuật LAMP trong chẩn đoán nhiễm sán lá gan nhỏ trên người, giúp khắc phục được một số tồn tại của các phương pháp chẩn đoán khác nhằm giải quyết các vấn đề trong nghiên cứu, đặc biệt có thể áp dụng rộng rãi tại thực địa.

Xuất phát từ những yêu cầu khoa học và thực tiễn trên đây, chúng tôi

tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ

trên người ở hai xã trọng điểm thuộc Ninh Bình, Phú Yên và chế tạo kit LAMP ứng dụng trong chẩn đoán tại cộng đồng” với các mục tiêu sau:

1. Mô tả thực trạng và một số yếu tố liên quan nhiễm sán lá gan nhỏ trên người tại hai xã trọng điểm thuộc tỉnh Ninh Bình và Phú Yên (2018-2020).

2. Chế tạo kit LAMP xét nghiệm nhiễm Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini trên người ở quy mơ phịng thí nghiệm.

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Một số đặc điểm dịch tễ học nhiễm sán lá gan nhỏ 1.1.1. Tác nhân gây bệnh

Trên thế giới, có ba loài sán lá gan thuộc họ Opisthorchiidae gây bệnh

cho người là Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini và Opisthorchis

felineus với đặc điểm sinh học, vòng đời và lâm sàng tương đối giống nhau

[10]. Ở Việt Nam hiện chỉ ghi nhận sự có mặt của 2 loài sán lá gan nhỏ là

Clonorchis sinensis và Opisthorchis viverrini.

1.1.1.1. Đặc điểm hình thái của sán lá gan nhỏ trưởng thành

A: O. felineus (7 - 12 x 2 - 3 mm)

B: O. viverrini (5,5 - 10 x 0,77 - 1,65 mm) C: C. sinensis (10 - 25 x 3 - 5 mm)

Sán lá gan nhỏ là loài sán lá lưỡng tính, sán trưởng thành có hình phẳng,

thon dài, hình lá hoặc dẹt, kích thước phụ thuộc vào từng lồi. O. viverrini là lồi có hình thái nhỏ nhất. C. sinensis trưởng thành kích thước lớn nhất [12].

Trên thân sán có cả bộ phận sinh dục đực và cái. Hai tinh hồn nằm ở phía sau,

chia nhiều múi (O. viverrini và O. felineus) hoặc chia nhiều nhánh nhỏ (C.

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

sinensis). Tử cung nhỏ xếp khúc nằm ở giữa thân, hồng thể hai bên. Ổ trứng

hình bầu dục, nhỏ, dưới ổ trứng là túi tinh, sau tinh hoàn là ống bài tiết [13].

1.1.1.2. Đặc điểm hình thái trứng sán lá gan nhỏ

Trứng sán lá gan nhỏ C. sinensis, O. felineus và O. viverrini rất giống

nhau và giống với trứng của các loài sán lá ruột nhỏ thuộc họ Heterophyidae

[3]. Vì vậy, trong nhiều trường hợp, phân loại dựa vào hình thái gặp nhiều

khó khăn và có thể bị nhầm lẫn. Trứng hình bầu dục, dài khoảng 19 - 35μm và rộng khoảng 10 - 20μm. Trứng có một lớp vỏ mỏng bắt màu vàng nhạt. Một đầu trứng có nắp, hai gờ của nắp nổi rõ. Đi trứng có núm con nhỏ gọi là mấu. Các mấu của mỗi loài là khác nhau. Bề mặt của vỏ trứng thô và không đều [14].

C. sinensis [15] O. viverrini [16] O. felineus [17]

Hình 1.3. Hình thể trứng của các lồi sán lá gan nhỏ

1.1.1.3. Đặc điểm hình thái ấu trùng sán lá gan nhỏ

Trong khuôn khổ luận án này chỉ đề cập tới giai đoạn ấu trùng nang là giai đoạn ấu trùng truyền qua cá cho người và các động vật có vú khác được gọi là metacercaria, nó được bao bọc trong các mô khác nhau của vật chủ (tôm, cá). Metacercaria của các loài sán lá gan nhỏ hình trịn hoặc bầu dục,

kích thước khác nhau tùy lồi. Metacercaria của C. sinensis kích thước 0,14 x 0,09-0,10 mm [18]. Metacercaria O. viverrini kích thước 0,19-0,25 x 0,15-0,22m [14]. Metacercaria O. felineus kích thước 0,25-0,30 x 0,19-

0,13-0,23mm [11].

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

C. sinensis O. viverrini O. felineus

Hình 1.4. Ấu trùng (Metacercariae) của sán lá gan nhỏ [17]

1.1.2. Vật chủ

- Vật chủ chính:

Vật chủ chính của sán lá gan nhỏ gồm người và một số động vật có vú như chó, mèo, lợn, chuột (Rattus norvegicus), một số động vật ăn cá hoang dã, có thể

cả chim, tuy nhiên người được coi là vật chủ dự trữ mầm bệnh quan trọng nhất

[12]. Tỷ lệ nhiễm C. sinensis cao ở động vật có vú bao gồm chó, mèo (0,8 –

4,85%) do đó kiểm sốt lây nhiễm của vật chủ trong ổ chứa bằng cách cho vật ni ăn thức ăn nấu chín hoặc chế biến đặc biệt và cải thiện việc quản lý phân của vật ni cũng đóng vai trị trong phịng chống nhiễm sán ở người [12], [19].

- Vật chủ trung gian thứ nhất:

Vật chủ trung gian thứ nhất của sán lá gan nhỏ gồm nhiều loài ốc khác nhau tùy địa điểm nghiên cứu. Ở các vùng lưu hành, Ốc nhiễm sán lá gan nhỏ thường được tìm thấy ở các nguồn nước gần làng, trong các hồ nước nông, ruộng lúa và đất ngập nước [20], [21], nơi có mức độ ơ nhiễm phân cao [22].

Việt Nam là quốc gia duy nhất lưu hành cả O. viverrini và C. sinensis, do đó sự phân bố của ốc P. manchouricus ở miền bắc và Bithynia spp. ở miền

Trung - Nam là yếu tố quyết định sự khác biệt về địa lý giữa hai loài sán lá gan nhỏ ở nước ta. Cần có nghiên cứu chi tiết hơn về vật chủ trung gian của ốc sên cũng như các vật chủ khác ở các vùng nối giữa các vùng lưu hành bệnh sán lá gan nhỏ.

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

Hình 1.5. Lồi ốc mang ấu trùng sán lá gan nhỏ tại Việt Nam

(Nguyễn Văn Đề, Đại học Y Hà Nội, 2012)

- Vật chủ trung gian thứ hai:

Vật chủ trung gian thứ hai của sán lá gan nhỏ C. sinensis gồm nhiều loài

cá nước ngọt, chủ yếu là cá họ Cyprinidae (chép) [12]. Một nghiên cứu (2020)

tại chợ cá tỉnh Yên Bái cho thấy tỷ lệ nhiễm C. sinensis trên cá khá cao là 69,7%, cường độ nhiễm là 81,2% metacercariae/cá [23]. Ấu trùng sán O.

viverrini được xác định ký sinh trên nhiều loài cá khác nhau, phổ biến nhất là

cá diếc (Carassius auratus) với tỷ lệ nhiễm ấu trùng nang là 28,1%, ngồi ra

có các lồi khác như cá lóc, cá chép,… [24].

Hình 1.6. Cá lóc đồng (C. striata) [25] Hình 1.7. Cá chép (C. carpio) [26]

Vòng đời của sán lá gan nhỏ liên quan tới hai vật chủ trung gian nên đặc điểm dịch tễ học cũng liên quan tới hai vật chủ trung gian này trong đó vật chủ trung gian thứ nhất (ốc) có vai trị quyết định đến phân bố của sán do chỉ một số ít ốc có thể nhiễm sán. Vai trò của vật chủ trung gian thứ hai ít quan trọng hơn do rất nhiều lồi cá có thể mang ấu trùng sán, tuy nhiên khả năng lây nhiễm vào vật chủ chính phụ thuộc vào cá.

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

1.1.3. Đường lây và cơ chế lây truyền bệnh

1.1.3.1. Đường lây

Ăn gỏi cá hoặc cá chưa nấu chín nhiễm nang ấu trùng sán là nguy cơ số 1 gây nhiễm sán lá gan nhỏ cho người [27], tỷ lệ nhiễm cao ở những cộng đồng có thói quen ăn gỏi cá. Tập quán làm nhà vệ sinh trên ao hồ, nuôi cá bằng phân người là những yếu tố góp phần quan trọng lan truyền bệnh. Tập quán này gặp ở nhiều nước trên thế giới [12], [19].

1.1.3.2. Cơ chế lây truyền bệnh:

Vòng đời sán lá gan nhỏ phức tạp, qua nhiều vật chủ [2]:

(1) Giai đoạn ở người: Sán trường thành ký sinh ở đường mật đẻ trứng, trứng theo mật xuống ruột rồi theo phân phân ra ngoại cảnh. Trứng rơi vào môi trường nước tiếp tục phát triển

(2) Giai đoạn ở ốc: Trứng sán bị ốc nuốt, trong ốc trứng nở thành ấu trùng lông (miracidia), ấu trùng lông phát triển qua hai giai đoạn là nang bào tử (sporocysts), bào tử trùng (rediae), sau đó phát triển thành ấu trùng đuôi (cercariae).

(3) Giai đoạn ở môi trường nước: Ấu trùng đuôi rời ốc bơi tự do trong nước. (4) Giai đoạn ở cá: Ấu trùng đuôi xâm nhập vào cá nước ngọt, rụng đuôi, phát triển thành thành ấu trùng nang ký sinh trong cá (metacercariae).

Giai đoạn phát triển trên người hoặc động vật: Khi ăn phải cá có ấu trùng nang chưa được nấu chín thì sau khi ăn, ấu trùng này vào trong dạ dày xuống tá tràng rồi ngược theo đường mật lên gan, phát triển thành sán lá gan trưởng thành ký sinh và gây bệnh ở đường mật. Thời gian từ khi ăn phải ấu trùng nang trong cá đến khi thành sán trưởng thành từ 26 – 30 ngày.

Sán lá gan nhỏ có tuổi thọ lâu dài trong vật chủ chính là con người, một

báo cáo về trường hợp C. sinensis sống trong cơ thể người hơn 26 năm [28].

Để gây nhiễm được cho người hay vật chủ khác, sán lá gan nhỏ phải ở giai đoạn ấu trùng có khả năng gây nhiễm (giai đoạn nang ấu trùng).

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

Hình 1.8. Chu kỳ phát triển của sán lá gan nhỏ C. sinensis (nguồn USA-CDC 2013)

1.1.4. Sức cảm thụ và miễn dịch

Mọi người đều có thể mắc bệnh khi bị nhiễm sán lá gan nhỏ. Người khơng có miễn dịch tự nhiên với sán lá gan nhỏ, sau khi nhiễm mầm bệnh có thể dễ dàng bị tái nhiễm [2].

1.1.5. Một số yếu tố liên quan đến nhiễm sán lá gan nhỏ trên người

Yếu tố nguy cơ lớn nhất của nhiễm sán lá gan nhỏ là ăn gỏi cá, ăn cá nấu chưa chín. Có nhiều yếu tố liên quan đến hành vi này.

1.1.5.1. Tập quán ăn gỏi cá

Thói quen ăn gỏi cá là một trong các yếu tố nguy cơ quan trọng ở những người nhiễm sán lá gan nhỏ, điều nay đã được chứng minh ở nhiều nghiên cứu tại Việt Nam và một số nước châu Á khác [29], [30].

Hoàng Quang Vinh (2017): những người ăn gỏi cá trong vòng 5 năm có nguy cơ nhiễm bệnh cao hơn nhiều so với những người không bao giờ ăn gỏi

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

cá (OR = 9,06; 95% CI: 4,36 - 18,83). Những người chưa bao giờ ăn gỏi cá

cũng bị nhiễm sán [29].

Nghiên cứu (2020) tại Yên Bái và Thanh Hóa cho thấy những người có tiền sử ăn cá sống trong vịng 12 tháng có nguy cơ nhiễm cao gấp 8 lần so với những người không ăn cá sống. Tuy nhiên khoảng 20,7% người nhiễm bệnh nhưng lại trả lời là khơng ăn cá sống, có thể do họ quên hoặc họ không muốn thừa nhận việc ăn cá sống. Một giả thuyết khác được đặt ra là có thể do ấu trùng nang đã lây nhiễm chéo qua dụng cụ nấu ăn [31].

Một nghiên cứu khác tại Thái Lan (2021) cho thấy thói quen và tần suất ăn cá sống hoặc chưa nấu chín có tên là Koi pla (gỏi cá sặc), một món ăn truyền thống thường thấy ở miền Bắc và Đơng Bắc Thái Lan, góp phần làm tỷ

lệ nhiễm O. viverrini cao hơn các vùng khác [32].

1.1.5.2. Độ tuổi, giới tính, nghề nghiệp

Tuổi: Nói chung nhiễm sán lá gan nhỏ quan sát thấy ở tất cả các nhóm tuổi, tuy nhiên thường gặp ở người lớn, hầu hết là những người trên 20 tuổi, đặc biệt ở độ tuổi lao động. Tỷ lệ và cường độ nhiễm tăng theo tuổi [33], [34].

Nghiên cứu tại Trung Quốc (2021) cho thấy tỷ lệ nhiễm C. sinensis cao nhất ở

nhóm 40 - 49 tuổi, gấp 33,51 lần nhóm 3 - 9 tuổi (95% CI: 10,13 - 110,86) [35]. Điều này cho thấy cho thấy thói quen ăn gỏi cá nước ngọt vẫn phổ biến ở những người lớn tuổi địa phương. Nhiễm sán lá gan nhỏ ở trẻ em có thể do các bà mẹ cho con mình ăn cá sống [12].

Giới: Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy tỷ lệ và cường độ nhiễm ở

nam cao hơn nữ [36]. Nam giới làm tăng nguy cơ nhiễm C. sinensis gấp 6,51

lần so với nữ giới (95% CI: 4,67 - 9,08). Tương tự, tại Việt Nam đa số nghiên cứu đều ghi nhận tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ ở nam cao hơn so với nữ. Hoàng

Quang Vinh (2017) cho thấy nam có nguy cơ nhiễm C. sinensis cao gấp 2,33

lần so với nữ (95% CI: 1,37 - 3,61, p <0,001). Ngồi ra, nghiên cứu cũng tìm thấy mối quan hệ rõ ràng giữa giới tính, thói quen ăn gỏi cá và uống rượu. Tỷ

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

lệ nhiễm ở nam, ăn cá sống (67,41%) cao hơn ở nữ (32,59%). Nam (88%) uống rượu cùng với ăn cá sống nhiều hơn so với nữ (12%, p = 0,000). Điều này phản ánh văn hóa Việt Nam, đàn ông khi “nhậu” thường uống rượu với “đồ nhắm” (như gỏi cá).

Nghề nghiệp: cũng là một trong các yếu tố liên quan đến tình trạng lây nhiễm sán lá gan nhỏ. Các nhóm ngành nghề có tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ cao như là nông dân, ngư dân, đây là những người thường xuyên tiếp xúc với nguồn nước, đất và phân [31], [37]. Tuy nhiên, một số nghiên cứu lại khơng tìm thấy mối liên hệ giữa nghề nghiệp và nguy cơ nhiễm sán lá gan nhỏ [38].

1.1.5.3. Một số yếu tố khác

- Yếu tố kinh tế - xã hội:

Kinh tế kém phát triển ảnh hưởng đến vệ sinh an toàn thực phẩm. Dân trí thấp ảnh hưởng đến ý thức và hiểu biết về biện pháp phòng chống bệnh. Pháp lệnh an tồn thực phẩm chưa thực sự có hiệu quả, và vệ sinh môi trường chưa được quy hoạch hợp lý.

Hồng Quang Vinh (2017) cho thấy trình độ học vấn ảnh hưởng đến tỷ

lệ nhiễm C. sinensis, người có trình độ học vấn càng cao thì nguy cơ nhiễm càng thấp. Những người có trình độ trung học cơ sở có nguy cơ nhiễm C.

sinensis thấp hơn (OR=0,63; 95% CI: 0,38-1,05) so với nhóm có trình độ tiểu

học. Tất cả 14 người có trình độ cao đẳng, đại học đều không nhiễm sán lá gan nhỏ [29].

- Tập quán sinh hoạt và canh tác:

Tình trạng dùng phân tươi nuôi cá và đổ nước thải mang mầm bệnh xuống ao ở các khu vực nông thôn là điều kiện giúp cho mầm bệnh sán lá gan hồn thành nốt chu kì gây bệnh và phát tán ra môi trường nước xung quanh. Nhà có ao ni cá cũng được coi là yếu tố nguy cơ [39].

Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Thanh Huyền (2018) cho thấy những người thực hành sử dụng hố xí khơng đạt tiêu chuẩn vệ sinh thì có nguy cơ

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

nhiễm sán lá nhỏ cao gấp 2,5 lần so với nhóm sử dụng nhà vệ sinh đạt tiêu chuẩn (95% CI: 1,49 - 4,10). Những người thực hành sử dụng phân ủ dưới 6 tháng có nguy cơ bị nhiễm sán lá nhỏ gấp 2,6 lần so với những người sử dụng phân ủ trên 6 tháng (95% CI: 1,66 - 4,22) [40].

Ngồi ra, súc vật thả rơng (chó, mèo,..) và cả động vật hoang dã chính là ổ dự trữ mầm bệnh làm ô nhiễm môi trường, chúng là vật chủ cảm nhiễm với sán lá gan nhỏ, do chúng ăn cá sống có chứa ấu trùng sán lá. Những hộ gia

đình ni mèo có nguy cơ nhiễm sán O. viverrini gấp 7 lần so với các hộ

không nuôi mèo (95% CI: 1,36 – 36,09) [37].

Di biến động dân cư đã kéo theo mầm bệnh và tập quán ăn gỏi cá từ vùng này sang vùng khác [31].

- Yếu tố môi trường tự nhiên

Yếu tố khí hậu, nhiệt độ, độ ẩm, lượng mưa có liên quan đến sự phát triển của vật chủ trung gian (ốc, cá) [41].

Khu hệ động vật/thực vật bao gồm các loài ăn ốc, ăn cá và cả những động/thực vật làm thức ăn cho cá đều ảnh hưởng đến vật chủ trung gian của sán lá gan nhỏ [42].

Thảm họa thiên tai hàng năm cũng gây nên các biến động sinh thái đối với vật chủ trung gian sán lá gan nhỏ (ốc và cá) và phát tán mầm bệnh [31].

1.1.6. Các biện pháp phịng chống

- Khơng ăn gỏi cá và các loại thực phẩm chế biến từ cá chưa nấu chín. - Khơng dùng phân người ni cá, khơng phóng uế xuống nguồn nước. - Truyền thông giáo dục sức khỏe cho cộng đồng về phòng chống bệnh sán lá gan nhỏ.

- Định kỳ tẩy sán cho chó, mèo, lợn.

- Điều trị dự phòng tại cộng đồng: Áp dụng Hướng dẫn tẩy sán lá gan nhỏ tại cộng đồng theo quyết định số 1931/QĐ-BYT ngày 19/5/2016 của Bộ trưởng Bộ Y tế [43].

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

1.1.7. Đặc điểm phân bố và tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ ở người trên thế giới và Việt Nam

1.1.7.1. Đặc điểm phân bố và tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ trên thế giới

Bệnh sán lá gan nhỏ phân bố trên thế giới rất đa dạng và có mặt ở nhiều

quốc gia khác nhau. Có khoảng 680 triệu người trên tồn thế giới có nguy cơ

bị nhiễm sán lá gan nhỏ. Ước tính cho thấy 45 triệu người sống ở châu Á và

châu Âu bị nhiễm bệnh, với khoảng 35 triệu người nhiễm C. sinensis, 10 triệu người nhiễm O. viverrini và 1,2 triệu người nhiễm O. felineus [44].

C. sinensis gây bệnh phổ biến nhất trong số 3 loài sán lá gan nhỏ gây bệnh ở người chủ yếu ở châu Á bao gồm Trung Quốc, Hàn Quốc, miền bắc Việt Nam và miền Đông nước Nga. Hơn nữa, những người di cư hoặc du lịch từ các vùng lưu hành bệnh sẽ làm tăng nguy cơ truyền bệnh sang các nước khác [45].

Theo Điều tra Toàn quốc về Ký sinh trùng Đường ruột (NSIP) năm

2012, C. sinensis là ký sinh trùng phổ biến nhất ở Hàn Quốc với tỷ lệ nhiễm

là 1,9% dân số [46].

Một nghiên cứu (2020) được thực hiện trên 2.521 người tại một quận của

tỉnh Quảng Tây, tỷ lệ nhiễm C. sinensis vẫn khá cao, lên tới 28,9%. Phần lớn

(66,2%) nhiễm cường độ nhẹ. Tỷ lệ nam giới nhiễm vừa và nặng (37,5%) cao hơn ở nữ giới (18,1%) (p <0,05). Tỷ lệ nhiễm cao nhất ở những người từ 30 - 59 tuổi. Tần suất tiêu thụ cá sống có liên quan đến cường độ nhiễm trùng. Điều này cho thấy thói quen ăn gỏi cá vẫn phổ biến ở 1 số nơi trên Thế giới, đặc biệt là khu vực Đông Á và Đông Nam Á [38].

Tương tự như C. sinensis, dân cư nhiễm sán O. viverrini thường sống ở

những vùng có nhiều ao, hồ và dọc những con sơng [47]. Ước tính có khoảng

12,39 triệu người nhiễm O. viverrini tại 4 quốc gia lưu hành chủ yếu bao gồm

Thái Lan (6,71 triệu), CHDCND Lào (2,45 triệu), Việt Nam (2,07 triệu) và Campuchia (1,00 triệu) [48].

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

Myanmar vốn không phải là vùng lưu hành của O. viverrini. Một nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm O. viverrini ở vùng nông thôn Hạ Myanmar là

9,3%, có khả năng khu vực lưu hành mới của Myanmar nằm gần các khu vực có tỷ lệ sán lá gan nhỏ lưu hành cao tại Thái Lan và do chính sách mở cửa biên giới bắt đầu từ năm 2015 dẫn đến việc gia tăng di cư giữa các nước Cộng đồng Kinh tế ASEAN (AEC) (Thái Lan, Cộng hòa Dân chủ Nhân dân Lào, Campuchia, Việt Nam và Myanmar) [49]. Một cuộc khảo sát khác ở ba quận

của Yangon cho thấy tỷ lệ hiện mắc O. viverrini là 0,7% [50].

Có một thực tế đáng lo ngại là mặc dù các chương trình điều trị và kiểm soát nhiễm sán lá gan nhỏ ở người đã được thực hiện trong nhiều thập kỷ ở tất cả các quốc gia khu vực hạ lưu sông Mê Kông song mức độ lưu hành cao của

O. viverrini và/hoặc C. sinensis cũng như tỷ lệ mắc ung thư đường mật vẫn

cao đáng báo động [51].

Loài O. felineus ít phổ biến nhất trong số 3 loài sán lá gan nhỏ. Nó đã

được báo cáo từ các quốc gia châu Âu trừ Phần Lan, Na Uy và Thụy Điển.

Khoảng 12,5 triệu người có nguy cơ nhiễm O. felineus, chủ yếu gặp ở khu vực

Nga, Đơng Âu [12]. Một loạt các động vật có vú như mèo, chó, cáo, gấu được

biết đến là vật chủ chính và là nguyên nhân truyền bệnh cho ốc Bithynia [52].

Hầu hết các bệnh nhân nhiễm sán khơng có triệu chứng [53], có bằng

chứng cho thấy O. felineus là một yếu tố nguy cơ của ung thư biểu mô đường

mật (CCA) [54], [55].

Nghiên cứu của tác giả Olga S. Fedorova (2020) và cộng sự tại phía Tây

Siberia, Liên bang Nga cho thấy tỷ lệ nhiễm O. felineus trong cộng đồng là

60,2%. Một trong các yếu tố nguy cơ là ăn gỏi cá nước ngọt [52].

Tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ khác nhau ở từng vùng địa lý. Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu quy mơ trong quá khứ nhằm mục đích lập bản đồ phân bố các loài sán lá gan nhỏ ở người tuy nhiên số liệu trên tồn cầu cịn nhiều phức tạp và khác nhau ở các nghiên cứu do nhiều lý do. Dựa trên xét nghiệm PCR

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

được phát triển trong hai thập kỷ gần đây đã phát hiện C. sinensis trong các khu vực lưu hành truyền thống của O. viverrini và O. felineus [56]. Dữ

liệu ban đầu liên quan đến bệnh sán lá gan nhỏ ở một số khu vực bị đánh giá thấp, việc thiếu hụt các dữ liệu trong quá khứ ở một số nước như Hong Kong, Macau, Việt Nam, Nga đặc biệt là Cộng hòa dân chủ nhân dân Triều Tiên dẫn đến sự khơng chính xác khi ước tính tình trạng nhiễm bệnh trong tương lai. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ có thể đang gia tăng và mở rộng tới nhiều khu vực địa lý vốn không phải vùng lưu hành truyền thống. Điều này do nhiều nguyên nhân như: thói quen ăn uống khó thay đổi và dân số ngày càng tăng trong các khu vực lưu hành bệnh, gia tăng buôn bán quốc tế các sản phẩm nuôi trồng thủy sản nước ngọt làm lây lan sán lá gan nhỏ cũng như các loài ký sinh trùng truyền từ động vật sang cá khác [57].

1.1.7.2. Đặc điểm phân bố và tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ tại Việt Nam

Tại Việt Nam, C. sinensis nhiễm trên

người lần đầu tiên được báo cáo năm 1887 [58]. Sau đó, Thành phố Sài Gịn thơng báo

có 291 người nhiễm C. sinensis, nhưng chủ

yếu những người này có nguồn gốc từ miền Bắc di cư vào Nam [59]. Mãi sau này (năm

1994), ca nhiễm sán O. viverrini đầu tiên

mới được phát hiện trên những cư dân ở Phú Yên, miền Trung Việt Nam [60]. Từ đó đến nay, có rất nhiều nghiên cứu về tình trạng

nhiễm C. sinensis và O. viverrini trong các

khu vực lưu hành.

Hình 1.9. Phân bố của sán lá gan nhỏ tại Việt Nam [3]

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

Việt Nam là nước đang phát triển, miền bắc có khí hậu cận nhiệt đới gió mùa với 4 mùa riêng biệt. Miền nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa khí hậu nóng và ẩm quanh năm với 2 mùa. Hai đới khí hậu khác biệt là điều kiện

thuận lợi cho cho sự xuất hiện và phân bố của 2 loài sán lá gan nhỏ: C.

sinensis lưu hành ở ít nhất 21 tỉnh miền bắc và O. viverrini lưu hành ở ít nhất

11 tỉnh miền trung và khu vực Tây Nguyên, tỷ lệ nhiễm khác nhau tùy địa

điểm [43].

Các tỉnh: Nam Định (nơi cao nhất là 26,0–37,5%), Ninh Bình (tỷ lệ nhiễm dao động từ 23,5–31,0%), Phú n, Bình Định được coi là điểm nóng nhiễm sán lá gan nhỏ, tập quán ăn gỏi cá của nhân dân đã tồn tại lâu đời [3].

Trước đây, chẩn đoán nhiễm C. sinensis và O. viverrini chỉ dựa vào xét

nghiệm tìm trứng trong phân có thể đã dẫn đến xác định sai ở cấp độ loài. Trên thực tế rất khó phân biệt trứng sán lá gan nhỏ Opisthorchiidae spp (giữa

C. sinensis và O. viverrini) và trứng sán lá ruột nhỏ Heterophyidae spp. Tỷ lệ

nhiễm H. pumilio và H. taichui phổ biến hơn C. sinensis và O. viverrini và

chúng thường đồng lây nhiễm ở người. Các cuộc khảo sát tại Nam Định và Ninh Bình cho thấy tỷ lệ nhiễm trứng sán lá gan nhỏ trong phân lần lượt là 22,7 – 64,9% và 9,4 – 30,9% dân cư. Đáng ngạc nhiên là các mẫu sán lá sau

tẩy được xác định là sán lá ruột, ngược lại tỷ lệ sán xác định là C. sinensis lại

rất thấp. Vì vậy, các báo cáo trước đây về tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ ở Việt Nam có thể đã cao hơn thực tế [3].

Một báo cáo về 76 trường hợp nhiễm C. sinensis trên người được ghi

nhận tại Xã Thuận Hạnh, tỉnh Đắk Nông, miền Trung Việt Nam gần Campuchia. Tuy nhiên, tất cả những người bị nhiễm bệnh đều di cư từ các tỉnh Nam Định và Ninh Bình [61].

Chưa có báo cáo về tình trạng nhiễm O. viverrini trên người tại khu vực miền Nam, mặc dù tìm thấy ấu trùng sán lá gan nhỏ trên cá lóc Channa

striata (Channidae) ở An Giang và sán trưởng thành trên mèo ở Tây Ninh [3].

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

Các nghiên cứu trong 20 năm gần đây đã đi sâu xác định lồi bằng hình thái phối hợp với các phương pháp sinh học phân tử đã cho thấy rõ thành phần loài ở các khu vực nhiễm bệnh.

Điều tra cắt ngang (2020) của Nguyễn Thị Bích Thảo tại 4 xã lưu hành

sán lá gan nhỏ của Yên Bái và Thanh Hóa cho thấy tỷ lệ nhiễm C. sinensis

khá cao 40,4%, dao động từ 26,5% - 53,3%. Các yếu tố nguy cơ bao gồm: giới tính nam, tiền sử ăn gỏi cá trong vòng 12 tháng, học vấn thấp, chưa điều trị, 19-39 tuổi, nhà tiêu không hợp vệ sinh [31].

Số liệu điều tra 5 năm gần đây của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương cho thấy tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ tại Bình Định là 6,8%; Quảng Trị 8,9%; Đăk Lăk 4,8%; Phú Yên 15,3%; Quảng Nam 4,3%; Hịa Bình 24,4%; Nam Định 11,8%; Ninh Bình 21%, Thanh Hóa 21,6%, Yên Bái 23 – 64,7%, Sơn La < 1% [62]. Tuy nhiên, còn rất nhiều địa phương mà người dân có thói quen ăn gỏi cá nhưng chưa được đánh giá và chưa có số liệu về thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ để có thể tiến hành các biện pháp can thiệp và phòng chống bệnh như tại vùng lòng hồ Thác Bà thuộc tỉnh Yên Bái, một số huyện của tỉnh Ninh Bình, tỉnh Phú Yên và Bình Định.

1.1.7.3 Một số đặc điểm về tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ tại hai xã của Ninh Bình và Phú Yên

- Một số đặc điểm tự nhiên về địa điểm nghiên cứu + Xã Yên Lộc, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình:

Tổng diện tích tự nhiên: 712,84 ha trong đó đất nơng nghiệp 533,2 ha. Dân số: 8.709 người, trong đó có 4.904 người trong độ tuổi lao động. Địa hình xã Yên Lộc tương đối bằng phẳng, có vị trí giao thơng thuận lợi (nằm trên quốc lộ 10, cách trung tâm huyện 3km). Đất đai mầu mỡ, cảnh quan thiên nhiên tươi đẹp, thuộc vùng nhiệt đới gió mùa khí hậu ơn hồ, chế độ thủy triều lên xuống đều đặn thuận lợi cho cây trồng. Có nhiều ao, sơng, ngòi là điều kiện thuận lợi cho phát triển nghề nuôi cá và chăn nuôi gia sức gia cầm.

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

+ Xã An Mỹ, huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên:

Tổng diện tích đất tự nhiên khoảng 1.354,5 ha, tổng dân số 10.710 người. Mật độ dân số 789 người/km2, đô thị loại V chuyên ngành, tiểu vùng phía Nam của huyện Tuy An. Là cửa ngõ, đầu mối phía Đơng, nằm tại giao đường DT643 và Quốc lộ 1, đóng vai trị kết nối giao thương với các đơ thị Vân Hịa, Trà Kê. Đồng thời, là đơ thị cửa ngõ phía Bắc của thành phố Tuy Hịa. Địa hình đa dạng: đồng bằng, ven biển và đồi núi, được thiên nhiên ưu đãi tạo nên nhiều cảnh quan.

- Tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ tại địa phương

+ Tại Ninh Bình:

Nghiên cứu của tác giả Đồn Thúy Hịa tại Yên Khánh, Ninh Bình cho

thấy: Tỷ lệ nhiễm C. sinensis là 19,5%. Tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm sán

trung bình ở nam cao hơn ở nữ (p< 0,001; OR = 3,994). Người ăn gỏi cá có nguy cơ nhiễm sán cao gấp 5,8 lần không ăn gỏi cá (p<0,001). Đa số (87,2%) nhiễm nhẹ, khơng có ca nhiễm nặng [63].

Nghiên cứu của tác giả Hồng Quang Vinh tại xã Gia Thịnh, Ninh Bình (2017) trên 510 người (bao gồm cả ngư dân và người kinh doanh cá) cho

thấy: tỷ lệ nhiễm C. sinensis trung bình là 16,5% (từ 2% đến 34,4%). Yếu tố

liên quan bao gồm nam giới, trình độ học vấn thấp, tần suất tiêu thụ cá sống và nơi sinh sống. Tỷ lệ nhiễm bệnh ở người ăn cá sống đánh bắt từ sông cao hơn đáng kể so với những người ăn cá từ ao ni (P <0,05) [29].

Điều tra của Đồn Thúy Hịa (2020) tại Kim Sơn và Yên Khánh, Ninh Bình cho thấy tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ là 20,1%. Tỷ lệ nhiễm ở nam giới (26,6%) cao hơn ở nữ (8,3%) (p< 0,001). Đa số (87,2%) nhiễm nhẹ, không có đối tượng nào nhiễm mức độ nặng [63].

+ Tại Phú Yên:

Năm 2008, Nguyễn Văn Chương và công sự nghiên cứu tỷ lệ nhiễm O.

viverrini Phú Yên và Bình Định từ 3,92% - 7,67% [64].

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

Các điều tra từ năm 2015-2018 của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng và Côn

trùng Trung ương cho thấy O. viverrini phân bố ở các tỉnh miền Trung và khu

vực Tây Nguyên, trong đó Phú Yên là 15,3%.

Gần đây, không có nhiều điều tra về thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ được thực hiện tại Phú Yên. Một số nghiên cứu tiến hành tại Bình Định, địa

phương tiếp giáp với Phú Yên và cũng được coi là vùng lưu hành O. viverrini

với tỷ lệ nhiễm cao.

Đào Thị Hà Thanh và Bùi Văn Tuấn (2015) điều tra tại Bình Định trên 254 người bằng kỹ thuật Kato-Katz. Kết quả cho thấy: Tỷ lệ hiện mắc là 11,4%

(95%CI: 8-16), giới tính nam và việc tiêu thụ cá sống (Carassius auratus) là những yếu tố nguy cơ. Sán trưởng thành thu được là O. viverrini [65].

Kết quả nghiên cứu định loài bằng PCR và Real-time PCR của tác giả

Nguyễn Thị Thanh Huyền (2018) phát hiện sán C. sinensis có mặt tại Bình Định bên cạnh sán O. viverrini, tỷ lệ nhiễm 2 loài sán lá gan nhỏ C. sinensis là

3,0% và O. viverrini là 21,3%. Đây được xem như lần đầu tiên phát hiện

C. sinensis ở Nam Trung bộ. Điều này có thể giải thích là do hiện tượng biến

động dân cư với sự giao lưu của hai miền Bắc và Nam, bệnh nhân có thể mang mầm bệnh từ miền Bắc vào miền Nam và ngược lại. Điều này thúc đẩy việc tiếp tục nghiên cứu xác định sự phân bố các loài sán lá gan nhỏ ở người trong tình hình hiện nay, đặc biệt ở những vùng vốn không phải vùng lưu hành truyền thống của sán lá gan nhỏ [40].

1.2. Đặc điểm lâm sàng, chẩn đoán và điều trị bệnh sán lá gan nhỏ trên người

1.2.1. Đặc điểm lâm sàng bệnh sán lá gan nhỏ trên người

Tùy thuộc vào thời gian mắc bệnh và cường độ nhiễm cũng như các yếu tố ảnh hưởng mà các biểu hiện lâm sàng điển hình hay khơng điển hình.

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

Đa số trường hợp nhiễm bệnh khơng có triệu chứng lâm sàng hoặc có một số triệu chứng như: rối loạn tiêu hóa, mệt mỏi, chán ăn, gầy sút…

Một nghiên cứu năm 2004 đưa ra ước tính có khoảng 15 triệu người

nhiễm C. sinensis ở Đông Á, đặc biệt là ở Trung Quốc, Hàn Quốc và Việt

Nam, có thể gây ra gần 5.000 trường hợp ung thư biểu mô đường mật hàng năm trong tương lai [57].

Năm 2009, sán lá gan Clonorchis sinensis được Cơ quan Nghiên cứu

Ung thư Quốc tế (IARC) thuộc Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào loại "gây ung thư cho người" (chất gây ung thư nhóm I) dựa trên sự liên quan đến căn nguyên của ung thư đường mật [67].

Ca bệnh nghi ngờ có các xét nghiệm sau:

- Tìm thấy trứng sán lá gan nhỏ trong phân hoặc dịch tá tràng.

- Xét nghiệm miễn dịch dương tính với kháng nguyên hoặc kháng thể của sán lá gan nhỏ.

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

1.2.2.3. Chẩn đoán phân biệt

- Áp xe gan do các loại ký sinh trùng khác, viêm gan do vi rút, sỏi túi mật, viêm đường mật, viêm tụy, cơn đau dạ dày.

- Ung thư đường mật, ung thư gan nguyên phát.

1.2.3. Điều trị bệnh sán lá gan nhỏ trên người

Praziquantel được xác định có hiệu quả điều trị khỏi cao tới 90 - 95% và khơng xảy ra tình trạng kháng thuốc và tái nhiễm [68].

Praziquantel liều 75mg/kg chia 3 lần/ngày, dùng 1 ngày, uống cách nhau 4 giờ sau ăn. Hoặc Praziquantel liều 75mg/kg x 3 lần/ngày, dùng 1 ngày [2].

Một số nghiên cứu cho thấy: Trong điều trị nhiễm C. sinensis ở người

với liều 25mg/lần x 3 lần/ngày x 1 ngày, tỷ lệ khỏi là 85% và tỷ lệ giảm trứng

trong phân là 99,7% trong điều trị O. viverrini với liều 40mg/kg thì tỷ lệ khỏi là 90% và tỷ lệ giảm trứng > 99,7%; điều trị O. felineus với liều 25mg/lần x 3

lần/ngày x 1 ngày tỷ lệ khỏi là 90% và tỷ lệ giảm trứng là 100% [12].

1.3. Các phương pháp xét nghiệm xác định tình trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên người

Phương pháp Kato-Katz được WHO khuyến nghị và sử dụng rộng rãi [69] trong các điều tra dịch tễ học lớn, đánh giá hiệu quả của thuốc, theo dõi và đánh giá can thiệp,…Phương pháp này tương đối dễ thực hiện, có khả năng định lượng và xác định cường độ nhiễm [70]. Tuy nhiên, kỹ thuật Kato-Katz cũng như các phương pháp chẩn đốn dựa vào hình thái học thường có độ nhạy thấp, dễ bỏ sót, đặc biệt ở những trường hợp nhiễm cường độ nhẹ, nằm trong vùng có tỷ lệ lưu hành thấp [71].

Phương pháp tập trung trứng bằng ly tâm lắng cặn theo Esteban và cộng sự (1997) hoặc ly tâm lắng cặn formalin–ether cải tiến là phương pháp tập trung trứng giun sán và bào nang đơn bào dựa trên ngun lý ly tâm lắng cặn có độ chính xác cao, ngồi trứng giun sán có thể phát hiện được đơn bào thể kén, dễ dàng kiểm tra lại các mẫu nghi ngờ do phân có thể được bảo quản

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

trong Formalin 10%. Trong các nghiên cứu kỹ thuật Kato-Katz và ether thường được sử dụng để sàng lọc hàng loạt trong vùng lưu hành sán, được coi là có độ nhạy và độ tin cậy tương đương [72]. Tuy vậy, tương tự như phương pháp Kato-Katz do lượng trứng trong phân ít nên dễ bỏ sót bệnh nhân, khó áp dụng trong xét nghiệm tại thực địa.

formalin-Xét nghiệm miễn dịch chẩn đoán sán lá gan nhỏ: phản ứng ELISA (enzyme-Linked immunosorbent assay) có độ nhạy cao, độ đặc hiệu tùy thuộc vào từng loại test và cịn nhiều tranh luận, có hiện tượng dương tính kéo dài và dương tính chéo giữa các lồi, khó triển khai tại thực địa [73].

Phát hiện trứng sán lá gan nhỏ trong phân bằng các phương pháp sinh học phân tử đã được phát triển từ nhiều năm trước đây [74]. Kỹ thuật PCR sử dụng các gen đích rất đa dạng như gen ty thể, bộ đệm phiên mã nội (Internal

Transcribed Spacer - ITS), cytochrome c oxidase 1 (cox1), NADH dehydrogenase 1 (nad1),... có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hơn kỹ thuật xét nghiệm hình thái học

và kỹ thuật miễn dịch ngay cả khi cường độ nhiễm sán thấp. Tuy nhiên, các kỹ thuật này khó áp dụng tại các cơ sở y tế do phải đầu tư hệ thống phịng thí nghiệm hiện đại, đào tạo nhân lực và chi phí đắt [7], [75]. Gần đây có xu hướng chuyển sang các phương pháp khuếch đại ADN đẳng nhiệt với ưu điểm là độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương kỹ thuật PCR nhưng loại bỏ được các bước luân nhiệt nên chỉ cần các thiết bị xét nghiệm đơn giản, nhỏ gọn, thời gian xét nghiệm rút ngắn xuống còn 30 - 60 phút, có khả năng phát triển thành các bộ kit phân tử cho phép ứng dụng được tại thực địa.

Trong các điều tra trước đây, hầu hết, chỉ sử dụng phương pháp chẩn đoán dựa vào hình thái học; một số nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử chỉ dùng để xác định loài là chính, khơng xác định được chính xác tỷ lệ nhiễm của từng loài sán.

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

1.4. Kỹ thuật LAMP và nghiên cứu chế tạo bộ kít LAMP xét nghiệm phát hiện nhiễm sán lá gan nhỏ trên người

Kỹ thuật LAMP được phát triển vào năm 2000 bởi nhóm tác giả T. Notomi (Nhật Bản) [76]. Đây là một phương pháp khuếch đại ADN có tính đặc hiệu, hiệu quả cao và thời gian ngắn, bằng cách tận dụng ưu điểm khuếch

đại của enzyme Bst ADN polymerase và 4 mồi được thiết kế đặc biệt để nhận

diện 6 vùng trình tự cách xa nhau trên ADN đích.

Dù mới được phát triển trong gần 20 năm nhưng LAMP cũng đã được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực như phát hiện, chẩn đoán các mầm bệnh trên người và trong lĩnh vực thú y, công nghiệp thực phẩm, môi trường.

1.4.1. Nguyên lý của kỹ thuật LAMP

Kỹ thuật LAMP sử dụng 4 - 6 mồi khác nhau được thiết kế đặc biệt để nhận ra 6-8 vùng riêng biệt trên gen đích và phản ứng diễn ra ở một nhiệt độ duy nhất. LAMP chỉ xảy ra khi cả 4 chuỗi mồi, bao gồm các mồi F3, B3, FIP (F1c+F2), BIP (B1c+B2) bám được vào các vị trí đích của khn, tạo ra sản phẩm ADN-vịng. Thành phần phản ứng gồm có ADN khn, mồi, enzyme Bst DNA polymerase, dung dịch đệm phản ứng. Quá trình tái bản gen đích chỉ diễn ra trong một bước duy nhất thường ở 550C - 650C, hiệu quả khuếch đại cao khoảng 109 - 1010 bản sao trong thời gian từ 15 - 60 phút. Sản phẩm của phản ứng có thể quan sát bằng mắt thường do sự kết tủa của muối pyrophotphate (Mg2P2O7) dưới dạng vẩn đục màu trắng hoặc phát quang khi nhuộm bằng các chất chỉ thị màu (SYBR green, HNB, Xanhmachit…). Do vậy, LAMP thường được sử dụng để tạo các kit chẩn đoán nhanh [77].

1.4.2. Thành phần phản ứng LAMP

Kỹ thuật LAMP dựa trên nguyên lý tổng hợp ADN thay thế chuỗi tự

xoay vòng được thực hiện bởi sự xúc tác của enzyme Bst ADN polymerase và

hai cặp mồi trong và mồi ngoài được thiết kế đặc biệt. Ở các bước đầu của

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

phản ứng cả 4 mồi được sử dụng, nhưng sau đó chỉ các mồi trong được sử dụng để tổng hợp ADN thay thế chuỗi [76].

Hình 1.10. Các mồi thiết kế và vị trí bắt cặp trên gen đích [78]

Cặp mồi trong gồm 2 mồi: Mồi xuôi (forward inner primer- FIP) và mồi ngược (backward inner primer- BIP) và mỗi mồi có chứa hai trình tự riêng biệt tương ứng với trình tự sense và antisense của ADN đích.

Thiết kế mồi có thể thực hiện tự động, sử dụng các phần mềm thiết kế mồi LAMP trực tuyến.

Thành phần cơ bản của phản ứng LAMP bao gồm: Các cặp mồi, dung

dịch đệm, enzym Bst ADN polymerase, ADN khn, chất nhuộm màu (nếu có).

1.4.3. Cơ chế của phản ứng LAMP

Gồm ba giai đoạn chính: tạo vật liệu khởi đầu, tái bản và kéo dài chuỗi, cuối cùng là lặp lại chu kỳ [76]. Để khởi động phản ứng LAMP, hỗn hợp phản ứng LAMP được ủ ở nhiệt độ đẳng nhiệt trong khoảng 60-65°C (nhiệt

độ hoạt động của Bst ADN polymerase) trong 1 giờ.

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

Hình 1.11. Sơ đồ phản ứng LAMP ở giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu [78]

- Chu kỳ tái bản và kéo dài chuỗi

Để khởi đầu cho chu kì phản ứng LAMP, FIP bắt cặp bổ sung với ADN đầu vịng ở vị trí F2c để tiến hành tổng hợp mạch bổ sung thay thế. Mặt khác, BIP sẽ bổ sung vào đầu kia của mạch ADN đầu vịng và xảy ra q trình tổng hợp ADN tương tự. Kết quả của phản ứng tạo ra hỗn hợp các sợi đôi ADN chứa nhiều trình tự ADN mục tiêu với kích thước khác nhau.

Hình 1.12. Sơ đồ phản ứng LAMP giai đoạn tái bản và kéo dài chuỗi [78]

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

1.4.4. Đánh giá kết quả của LAMP

- Đánh giá kết quả bằng điện di [79]: Kết quả dương tính cho vạch smear dài.

Hình 1.13. Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP [79]

- Đánh giá kết quả không bằng điện di [79]:

Do lượng sản phẩm của phản ứng LAMP rất lớn nên ta có thể quan sát bằng mắt thường nếu có một số hóa chất nhuộm thích hợp:

Kết quả phản ứng LAMP được đánh giá thông qua độ đục của hỗn hợp phản ứng mà khơng cần điện di. Khi ADN đích được khuếch đại bởi LAMP, một chất kết tủa trắng bắt nguồn từ magnesium pyrophosphate (một sản phẩm phụ của phản ứng LAMP) sẽ xuất hiện. Có thể quan sát và so sánh độ đục với mẫu âm tính (đục hơn là dương tính), hoặc tiến hành đo độ hấp thụ ở 650nm.

Hình 1.14. Sản phẩm LAMP khi quan sát bằng mắt thường

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

Một phương pháp khác là sử dụng các chất nhuộm màu cho vào mẫu trước hoặc sau khi chạy LAMP. Ví dụ: bổ sung SYBR Green I, ethidium bromide hay Fluorescent sau khi có sản phẩm LAMP, bổ sung Hydroxyl Napthol Blue (HNB) vào phản ứng LAMP trước khi tiến hành nhân bản. Rồi quan sát dưới đèn UV. Kết quả dương tính có hiện màu đặc trưng hay phát sáng.

Hình 1.15. Hình ảnh sản phẩm LAMP nhuộm bằng SYBR green [79]

a. Quan sát dưới đèn UV b. Quan sát thơng thường

1.4.5. Quy trình thực hiện LAMP

Các bước tiến hành phản ứng LAMP: Lấy mẫu, tách ADN/ARN, khuếch đại đẳng nhiệt và phát hiện sản phẩm.

Hình 1.16. Quy trình thực hiện LAMP

(nguồn Eiken Genome site Việt hóa) [78]

</div>