(Luận Văn Thạc Sĩ Sinh Học Thực Nghiệm) Đánh Giá Khả Năng Ức Chế Enzyme Acetylcholinesterase Và Bảo Vệ Tế Bào Thần Kinh Của Nano Astaxanthin Trên Dòng Tế Bào Thần Kinh

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

Bà GIÁO DĂC VÀ ĐÀO T¾O

VIàN HÀN LÂM KHOA HâC VÀ CÔNG NGHà VIàT NAM

<b> HàC VIÞN KHOA HàC VÀ CƠNG NGHÞ </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

<b>LäI CÀM ¡N </b>

Vãi să kính trãng và cÁ t¿m lịng, em xin gÿi låi cÁm ¢n sâu sÃc, chân thành nh¿t n cụ TS. Hong Thỏ Minh Hin Trỗng phũng Công nghá TÁo, Vián Công nghá sinh hãc, Vián Hàn lâm Khoa hãc và Cơng nghê đã tÁn tình h°ãng d¿n từng chi tiÁt, chß d¿y tß mß và đßng hành cùng em trong suát quá trình hãc tÁp và thăc hián ln vn. Nhå có cơ, em đã tă tin và hoàn thành luÁn vn cąa bÁn thân thành công, nâng cao thêm hiÅu biÁt và kiÁn thćc trong lĩnh văc nghiên cću. Em có thêm nhiÃu trÁi nghiám trong cÁ lĩnh văc chuyên môn và kiÁn thćc đåi sáng. Em chân thành cÁm ¢n cơ HiÃn r¿t nhiÃu. Em ln kính mÁn, kính trãng và biÁt ¢n cơ.

Em xin gÿi låi cÁm ¢n đÁn GS. ĐÁng Dißm Hßng, TS. Ngơ Thá Hồi Thu, TS. Lê Thá ThÂm, TS. Nguyòn Cm H, KS. Nguyòn Mnh t cựng các b¿n nghiên cću viên phịng Cơng nghá TÁo, Vián Cơng nghá sinh hãc đã tÁn tình giúp đÿ, chß bÁo em trong quá trình thăc hián luÁn vn.

Em xin gÿi låi cÁm ¢n đÁn TS. Hoàng Mai Hà, TS. Hß Thá Oanh, phịng VÁt liáu tiên tiÁn, Vián Hoá hãc, Vián Hàn lâm đã cung c¿p cho em nguyên liáu nano astaxanthin.

Em xin gÿi låi cÁm ¢n đÁn Ban Lãnh đ¿o, các thÁy, cô giáo Khoa Công nghá sinh hãc, Hãc vián Khoa hãc và Cơng nghá đã chß d¿y, cung c¿p các kiÁn thćc chun mơn bá ích cho em đÅ em có hành trang tát nh¿t cho cơng viác cũng nh° t°¢ng lai sau này.

LuÁn vn đ°āc thăc hián trong khuôn khá đà tài Quỹ Phát triÅn Khoa hãc và Công nghá Quác gia - Nafosted, Bá Khoa hãc và Công nghá:<Nghiên cću chÁ t¿o và đánh giá ho¿t tính cháng oxy hóa và giÁm rái lo¿n chun hóa

<i>lipit cąa tá hāp nano astaxanthin/kaempferol trên mơ hình in vitro và in vivo= </i>

mã sá 108.06-2019.314 do TS. Hoàng Thá Minh HiÃn làm chą nhiám.

Và em xin gÿi låi cÁm ¢n đÁn bá mẹ, gia đình đã là hÁu ph°¢ng vāng chÃc đÅ em tiÁp tăc hành trình cho nhāng dă đánh sau này.

Em xin cÁm ¢n t¿t cÁ nhāng ng°åi b¿n, ln là ngn đáng viên, là nhāng låi khuyên, là nhāng kß niám trong suát 2 nm hãc nói chung và q trình thăc hián luÁn vn nói riêng.

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

CH¯¡NG 1. TàNG QUAN NGHIÊN CĆU ... 3

1.1. TàNG QUAN VÂ BàNH ALZHEIMER ... 3

1.1.1. Alzheimer ... 3

1.1.2. Các ph°¢ng pháp điÃu trá phân tÿ đái vãi bánh AD ... 4

1.1.3. Các mơ hình tÁ bào cho nghiên cću bánh AD ... 7

1.2. TàNG QUAN VÂ ASTAXANTHIN ... 7

1.2.1. Tác dăng cháng oxy hóa ... 8

1.2.2. Tác dăng cháng viêm ... 9

1.3. NANO ASTAXANTHIN VÀ TÁC DĂNG SINH HâC CĄA NÓ ... 11

CH¯¡NG 2. ĐàI T¯ĀNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĆU ... 15

2.1. ĐàI T¯ĀNG NGHIÊN CĆU ... 15

2.1.1. Đái t°āng nghiên cću... 15

2.1.2. Hóa ch¿t và thiÁt bá ... 15

2.2. PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĆU ... 15

2.2.1. Xác đánh ho¿t tính ćc chÁ enzyme acetylcholinesterase (AchE) ... 16

2.2.2. Ph°¢ng pháp ni c¿y tÁ bào ... 17

2.2.3. Ph°¢ng pháp đánh giá đác tính cąa nano astaxanthin ... 17

2.2.4. Ph°¢ng pháp đánh giá khÁ nng h¿p thu tÁ bào ... 17

2.2.5. Ph°¢ng pháp đánh giá khÁ nng bÁo vá tÁ bào cąa nano astaxanthin cháng l¿i stress oxy hóa trong tÁ bào C6 đ°āc cÁm ćng H2O2 ... 17

2.2.6. Ph°¢ng pháp đánh giá khÁ nng bÁo vá tÁ bào thÁn kinh C6 cąa nano astaxanthin cháng li tỏc hi gõy ỏc thn kinh gõy ra bỗi A³25-35 ... 18

2.2.7. Phân tích biÅu hián gen liên quan đÁn khÁ nng bÁo vá thÁn kinh cąa nano astaxanthin bằng ph°¢ng pháp quantitative Real-Time PCR (qPCR) ... 18

2.2.8. Ph°¢ng pháp xÿ lý sá liáu ... 19

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

CH¯¡NG 3. KÀT QUÀ VÀ THÀO LUÀN ... 20

3.1. NGHIÊN CĆU ĐÁNH GIÁ KHÀ NNG ĆC CHÀ ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE (ACHE) CĄA NANO ASTAXANTHIN ... 20

3.2. NGHIÊN CĆU ĐÁNH GIÁ MàT Sà ĐÀC ĐIÄM SINH HâC LIÊN QUAN ĐÀN KHÀ NNG BÀO Và TÀ BÀO THÀN KINH CĄA NANO ASTAXANTHIN ... 21

3.2.1. Nghiên cću đánh giá khÁ nng gây đác tÁ bào C6 cąa

3.3.1. Nghiờn cu nh hỗng ca nano astaxanthin đÁn să biÅu hián gen cąa các enzyme cháng oxy hóa trong tÁ bào C6... 27

3.3.2. Nghiên cu nh hỗng ca nano astaxanthin n s biu hiỏn gen cąa các enzyme gây viêm trong tÁ bào C6 ca nano astaxanthin ... 32

3.3.3. Nghiờn cu nh hỗng cąa nano astaxanthin đÁn să biÅu hián gen mã hóa cho các protein tham gia vào quá trình sinh táng hāp acetylcholine trong tÁ bào C6 ... 35

CH¯¡NG 4. KÀT LUÀN VÀ KIÀN NGHà ... 38

KÀT LUÀN ... 38

KIÀN NGHà ... 38

DANH MĂC CƠNG TRÌNH CĄA TÁC GIÀ ... 39

DANH MĂC TÀI LIàU THAM KHÀO ... 40

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

<b>DANH MĀC CÁC KÝ HIịU, CC CH CI VIắT TT </b>

AICD ^{Amyloid precursor protein}intracellular domain

MiÃn nái bào cąa protein tiÃn ch¿t amyloid Akt Protein kinase B

ALS Amyotrophic lateral sclerosis Bánh x¢ cćng teo c¢ mát bên

APP Amyloid precursor protein Protein tiÃn ch¿t amyloid

CD4 Cluster of differentiation 4 Căm biát hóa 4 CNS Central nervous system Há tháng thÁn kinh

trung °¢ng COS Chitosan oligosaccharides

CTF Carboxy-terminal fragment DMEM Dulbecco’s modified eagle’s

medium DMSO Dimethyl sulfoxide

DNA Deoxyribonucleic acid

DSS Dextran sulfate sodium Dextran natri sulfat DTNB ^{Acid 5-}5’-dithiobis-2-

nitrobenzoic

Axit 5-nitrobenzoic EBI Early brain injury Ch¿n th°¢ng não sãm ERK ^{Extracellular regulated protein}

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

GABA Gamma-aminobutyric acid

GLUT-1 Glucose transporter-1 Ch¿t vÁn chuyÅn glucose-1 GST-α1 <i>Glutathione- S-transferase-</i>α1

H2O2 Hydrogen peroxide HO-1 Heme oxygenase-1 ICAM-1 ^{Intercellular adhesion}

molecule-1

Phân tÿ bám dính giāa các tÁ bào-1

IKK³ ^{Inhibitor of nuclear factor}kappa-B kinase subunit beta

Ch¿t ćc chÁ beta tiÅu đ¢n vá kappa-B kinase cąa nhân tá

MCAO ^{Middle cerebral artery}

occlusion TÃc đáng m¿ch não giāa MCP1 ^{Monocyte chemotactic}

protein 1

Protein hóa h°ãng đáng đ¢n bào 1

MPP <small>+</small> 1-methyl-4-phenylpyridinium

mRNA Messenger ribonucleic acid RNA thông tin MSK1 ^{Mitogen- and stress-activated}

protein kinase-1 NADP(H) ^{Nicotinamide adenine}

dinucleotide phosphate

ND Neurodegenerative disorders Các bánh thối hóa

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

thÁn kinh

NF-KB ^{Nuclear factor}chain-enhancer of activated B

kappa-light-YÁu tá h¿t nhân tng c°ång chußi nhẹ kappa cąa các

tÁ bào B ho¿t đáng

NFT Neurofibrillary tangles Các đám rái sāi thÁn kinh NMDA <i>N</i>-methyl-D-aspartate

iNOS Inducible nitric oxide synthase Táng hāp oxit nitric cÁm ćng

NR1 NMDA receptor subunit 1 Nrf2 ^{Nuclear erythroid 2-related}

factor 2

PGE2 Prostaglandin E2 PI3K Phosphoinositide 3-kinase PLGA Poly lactic- co -glycolic acid

ROS Reactive oxygen species

RPE Retinal pigment epithelial TÁ bào biÅu mô sÃc tá võng m¿c

SAH Subarachnoid hemorrhage ^Xu¿t huyÁt d°ãi m¿ng nhán Sp1 Specificity protein 1 Protein đÁc hiáu 1

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

STAT3 ^{Signal transducer and activator}of transcription 3

Bá chuyÅn đái tín hiáu và bá kích ho¿t phiên mã 3 TLR4 Toll-like receptor 4 Thă thÅ giáng Toll 4 TNF Tumor Necrosis Factors YÁu tá ho¿i tÿ khái u VEGF ^{Vascular endothelial growth}

factor

Yu tỏ trỗng nỏi mụ m¿ch máu tng

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

<b>DANH MĀC BÀNG </b>

<i>BÁng 2.1: BÁng trình tă các mßi đ°āc sÿ dăng trong qPCR ... 19 </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

<b>DANH MĀC HÌNH ÀNH </b>

Hình 1.1: Con đ°ång d¿n đÁn suy giÁm nhÁn thćc trong bánh Alzheimer. ... 4

Hình 1.2: C¢ chÁ tác đáng cąa các ch¿t cháng oxy hóa trong thối hóa

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

Hỡnh 3.11: nh hỗng ca nano astaxanthin n să biÅu hián cąa gen iNOS liên quan đÁn tình trng viờm ỗ t bo C6. ... 33 Hỡnh 3.12: nh hỗng ca nano astaxanthin n s biu hiỏn ca gen COX liờn quan n tỡnh trng viờm ỗ t bo C6. ... 33 Hỡnh 3.13: nh hỗng ca nano astaxanthin đÁn să biÅu hián cąa gen TNF-α liên quan n tỡnh trng viờm ỗ t bo C6. ... 34 Hỡnh 3.14: nh hỗng ca nano astaxanthin n s biÅu hián cąa gen IL-6 liên quan đÁn tình tr¿ng viờm ỗ t bo C6. ... 34 Hỡnh 3.15: nh hỗng ca nano astaxanthin n s biu hiỏn ca gen mã hóa cho ChAT tham gia vào q trình giÁi phúng acetylcholine trong t bo C6. ...37Hỡnh 3.16: nh hỗng cąa nano astaxanthin đÁn să biÅu hián cąa gen mã hóa cho VAChT tham gia vào q trình giÁi phóng acetylcholine trong tÁ bào C6 ...37

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

<b>MÞ ĐÀU </b>

Thối hóa thÁn kinh đã đ°āc xác đánh là să thay đái sinh lý bánh chą yÁu trong hÁu hÁt các rái lo¿n liên quan đÁn não. Bánh Alzheimer (AD) là mát trong nhāng bánh thối hóa thÁn kinh điÅn hình gây ra chćng m¿t trí nhã trong xã hái già hóa cąa chúng ta. Stress oxy hóa, viêm, tÁ bào chÁt theo ch°¢ng trình (apoptosis) và tng ho¿t tính cąa enzyme acetylcholinesterase (AChE) d¿n đÁn să thiÁu hăt cholinergic đ°āc xem nh° là các con đ°ång gây bánh chính. Kích ho¿t tÁ bào thÁn kinh đám và giÁi phóng cytokine/chemokine cąa các con đ°ång viêm, cũng nh° các gác tă do oxy hóa và tán th°¢ng ty thÅ trong con đ°ång stress oxy hóa d¿n đÁn q trình thối hóa thÁn kinh và ci cùng là gây chÁt tÁ bào.

MÁc dù có nhiÃu phát triÅn trong lĩnh văc chm sóc sćc khße lâm sàng, các liáu pháp bÁo vá thÁn kinh đái vãi chćng thối hóa thÁn kinh và các rái lo¿n liên quan đÁn gây chÁt tÁ bào thÁn kinh v¿n là nhāng thách thćc lâm sàng mà khơng có giÁi pháp hāu hiáu. Do đó, nhu cÁu phát triÅn ph°¢ng pháp điÃu trá đa măc tiêu liên quan đÁn các con đ°ång tín hiáu đang đ°āc các nhà khoa hãc đÁc biát quan tâm nghiên cću đÅ cÁi thián ch¿t l°āng cuác sáng cąa nhāng ng°åi mÃc bánh thối hóa thÁn kinh.

Astaxanthin là mát trong nhāng carotenoid quan trãng, có ćng dăng điÃu trá phong phú và đa d¿ng đái vãi các bánh và gan, tim m¿ch, điÃu trá ung th°, bÁo vá da và mÃt cháng l¿i bćc x¿ tia căc tím và tng c°ång sćc đà kháng há tháng mißn dách. Bên c¿nh đó, các nhà nghiên cću cũng chß ra rằng astaxanthin có tác dăng bÁo vá há thÁn kinh và nh° là mát tác nhân bÁo vá thÁn kinh đa măc tiêu, astaxanthin tác đáng lên nhiÃu c¢ chÁ ho¿t đáng đÅ giÁi quyÁt các c¢ chÁ sinh lý bánh phćc t¿p cąa bánh thối hóa thÁn kinh. Tuy nhiên, nh°āc điÅm cąa astaxanthin là có đá tan trong n°ãc th¿p và dß bá oxi hóa d¿n d¿n đÁn sinh khÁ dăng bá h¿n chÁ. GÁn đây, trong đà tài <Nghiên cću chÁ t¿o và đánh giá ho¿t tính cháng oxy hóa và giÁm rái lo¿n chuyÅn hóa lipit c<i>ąa tá hāp nano astaxanthin/kaempferol trên mơ hình in vitro và in vivo= do </i>

quỹ Nafosted tài trā nm 2019 – 2023, phịng Cơng nghá tÁo, Vián Công nghá sinh hãc, Vián Hàn lâm KHCNVN kÁt hāp vãi Vián Hóa hãc đã chÁ t¿o thành cơng nano astaxanthin có tính sinh khÁ dăng (g¿p 5-6) và ho¿t tính cháng oxy hóa và giÁm lipit cao h¢n nhiÃu so vãi astaxanthin tă do.

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

Do đó, vãi nhāng lāi ích và tÁm quan trãng nh° vÁy, đà tài <Đánh giá

<b>khÁ nng ąc ch¿ enzyme acetylcholinesterase và bÁo vß t¿ bào thÁn kinh căa nano astaxanthin trên dòng t¿ bào thÁn kinh= đ°āc thăc hián. </b>

<b>1. Māc tiêu căa đÁ tài: </b>

Đánh giá đ°āc khÁ nng ćc chÁ enzyme acetylcholinesterase (AchE); KhÁ nng bÁo vá tÁ bào thÁn kinh cháng l¿i các tác nhân gây đác thÁn kinh và đánh giá biÅu hián mát sá gen liên quan đÁn ho¿t tính bÁo vá thÁn kinh cąa nano-astaxanthin trên dịng <b>tÁ bào C6. </b>

<b>2. Nái dung nghiên cąu: </b>

<b>- Nái dung 1: Xác đánh ho¿t tính ćc chÁ enzyme acetylcholinesterase (AchE). - Nái dung 2: Nghiên cću mát sá đÁc điÅm sinh hãc liên quan đÁn khÁ nng </b>

bÁo vá tÁ bào thÁn kinh cąa nano astaxanthin.

<b>- Nái dung 3: Nghiên cću biÅu hián mát sá gen liên quan đÁn ho¿t tính bÁo </b>

vá thÁn kinh cąa nano astaxanthin trên dòng tÁ bào C6 đ°āc cÁm ćng vãi các tác nhân gây đác thÁn kinh.

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

<b>CH¯¡NG 1. TàNG QUAN NGHIÊN CĄU 1.1. TàNG QUAN VÀ BÞNH ALZHEIMER </b>

<b>1.1.1. Alzheimer </b>

TÁ bào thÁn kinh là trung tâm cho ho¿t đáng bình th°ång cąa bá não con ng°åi vì chúng đóng vai trị quan trãng trong giao tiÁp. HÁu hÁt các tÁ bào thÁn kinh bÃt ngußn từ não, tuy nhiên, tÁ bào thÁn kinh cú mt ỗ mói nÂi trong c th. Cỏc t bào gác thÁn kinh t¿o ra phÁn lãn tÁ bào thn kinh ỗ tr em v sỏ lng ny gim ỏng k khi trỗng thnh. Khi cỏc t bo thn kinh bá chÁt hoÁc m¿t c¿u trúc hay chćc nng s¿ d¿n đÁn hián t°āng thối hóa thÁn kinh, ngun nhân chính gây ra sinh lý bánh cąa mát sá rái lo¿n não nh° bánh Alzheimer.

Chćng m¿t trí nhã Alzheimer (AD) là mát cn bánh phỏ bin nh hỗng n trớ nhó v nhÁn thćc. Sinh lý bánh cąa suy giÁm nhÁn thćc liên quan đÁn AD đ°āc cho là do m¿t tÁ bào thÁn kinh cholinergic. Ćc chÁ acetylcholinesterase (AChE) d¿n đÁn giÁm phân hąy và tích tă acetylcholine sau đó. L°āng acetylcholine d° thừa này d¿n đÁn tng kích thích các thă thÅ muscarinic và nicotinic, cung c¿p mát sá bián pháp điÃu trá giÁm trí nhã trong AD [1].

Các nghiên cću gÁn đây và sinh lý bánh AD đã chß ra rằng să tích tă amyloid-beta (A³) và protein Tau là trung tâm cąa să tiÁn triÅn cąa AD (Hình 1.1) [2]. Să hình thành các mÁng chća A³ trong não, đ°āc liên kÁt vãi các đám rái sāi thÁn kinh (neurofibrillary tangles - NFT) bao gßm Tau tng phosphoryl hóa, đã đ°āc xác đánh là đÁc điÅm cá điÅn cąa AD. Să hình thành mÁng bám làm gián đo¿n m¿ch hßi hÁi mã d¿n đÁn viác cąng cá trí nhã ngÃn h¿n kém thành các d¿u vÁt dài h¿n. Trong AD, có să m¿t mát tÁ bào thÁn kinh trên dián ráng, các kÁt nái khãp thÁn kinh bá lßi và tán th°¢ng há tháng d¿n truyÃn thÁn kinh thiÁt yÁu cÁn thiÁt cho các chćc nng cąa não, bao gßm cÁ trí nhã. Do đó, triáu chćng lâm sàng phỏ bin nht ỗ giai on u ca AD l suy giÁm trí nhã có chãn lãc. Ngồi ra, hßi hÁi mã và các chćc nng ph thuỏc vo thựy thỏi dÂng ỗ gia, chng h¿n nh° trí nhã tình tiÁt khai báo, cũng th°ång bỏ nh hỗng. Cuỏi cựng, suy gim chc nng iu hành, phán đoán và giÁi quyÁt v¿n đà là nhāng biÅu hián lâm sàng bá sung và th°ång xu¿t hián sãm [3]. Bên c¿nh đó, stress oxy hóa và să hình thành các lo¿i oxy phÁn ćng (ROS) cũng đ°āc coi là nguyên nhân chính gây ra bánh này.

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

<b>Hình 1.1: </b>Con đ°ång d¿n đÁn suy giÁm nhÁn thćc trong bánh Alzheimer [4]. Các monome amyloid-beta (A³) kÁt tă l¿i vãi nhau đÅ t¿o thành các oligome có c¿u trúc biÁn thÅ. Sau đó, các oligome tÁp hāp l¿i t¿o thành các sāi A³, sÃp xÁp t¿o thành các mÁng A³. Să hình thành mÁng bám gây ra phÁn ćng viêm bao gßm să hình thành các tÁp hāp Tau d¿n đÁn viác chuyÅn đái các tÁ bào thÁn kinh khße m¿nh thành các tÁ bào thÁn kinh bá bánh. Să hián dián cąa nhiÃu tÁ bào thÁn kinh bá bánh h¢n s¿ gây ra mát phÁn ćng viêm khác d¿n đÁn m¿t nhiÃu tÁ bào thÁn kinh h¢n và sau đó là m¿t chćc nng não cũng nh° suy giÁm nhÁn thćc.

Vì AD là mát bánh đa yÁu tá, nhiÃu ph°¢ng pháp điÃu trá đã đ°āc đà xu¿t đÅ điÃu trá nó.

<b>1.1.2. Các ph°¢ng pháp điÁu trò phõn t ỏi vói bònh AD </b>

Cỏc phÂng phỏp điÃu trá AD đ°āc phân thành hai con đ°ång điÃu trá hiáu q chính là cholinergic và khơng cholinergic. æ nhāng bánh nhÁn bá AD, rái lo¿n d¿n truyÃn thÁn kinh cholinergic gây ra să suy giÁm ch¿t d¿n truyÃn thÁn kinh acetylcholine (ACh) [5].

AchE là mỏt enzyme cholinergic ch yu c tỡm thy ỗ cỏc điÅm nái thÁn kinh c¢ sau synap, đÁc biát là ç c¢ và dây thÁn kinh. Enzyme này thąy phân acetylcholine (ACh), mát ch¿t d¿n truyÃn thÁn kinh tă nhiên, thành axit axetic và choline. Vai trò chính cąa AChE là ch¿m dćt să truyÃn d¿n và truyÃn tín hiáu thÁn kinh giāa các khãp thÁn kinh đÅ ngn chÁn să phân tán ACh và kích ho¿t các thă thÅ gÁn đó. Do đó, các ch¿t ćc chÁ AchE có thÅ tái

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

cân bằng mćc acetylcholine bằng ho¿t đáng cąa AChE. Acetylcholine đ°āc tích tă trong khe sinap thÁn kinh. Con đ°ång này đ°āc gãi là ph°¢ng pháp tiÁp cÁn choline và đ°āc coi là ph°¢ng pháp điÃu trá triáu chćng chính cho AD.

Mát ph°¢ng pháp điÃu trá khác phă thuác vào viác ngn chÁn să tích tă cąa amyloid-beta (A). Do đó, b¿t kỳ hāp ch¿t nào, có thÅ làm giÁm hoÁc ngn chÁn să kÁt tă A giāa các n¢ron, đÃu có thÅ là mát ćng cÿ viên tiÃm nng cąa thuác cháng AD và có thÅ làm giÁm să tiÁn triÅn cąa bánh [6].

Bên cnh ú, cỏc phÂng phỏp tip cn khỏc bao gòm nhiÃu hāp ch¿t và đ°ång h°ãng nh° ch¿t cháng oxy hóa, kháng viêm, ćc chÁ Tau t¿o ra q trình phosphoryl hóa và NFT nái bào tích lũy, sÿ dăng u tá h°ãng thÁn kinh có ngn gác từ não, liáu pháp tÁ bào gác và liáu pháp nái tiÁt tá [7].

Trong đó, các phân tÿ oxy hóa (ví dă, reactive oxygen species - ROS v reactive nitrogen species - RNS) c to ra bỗi q trình hơ h¿p tÁ bào hc d¿n trun thÁn kinh s¿ kích ho¿t con đ°ång cháng oxy hóa bằng cách phân ly phćc hāp Nrf2/Keap1 (Nuclear factor-erythroid 2 p45-related factor 2/ Kelch-like ECH-associated protein 1). Khi đ°āc tách ra khßi Keap1, Nrf2 s¿ di chuyÅn vào nhân tÁ bào, kích ho¿t să biÅu hián cąa mát sá gen cân bằng nái mơi vãi trình tă AREs (antioxidant responsive elements) trong cỏc vựng khỗi ỏng ca chỳng, bao gßm glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD), heme oxigenase 1 (HO-1), glutathione S-transferase (GST) và catalase (CAT) (Hình 1.2A).

Khi cân bằng nái môi bá thay đái thúc đẩy sÁn xu¿t ROS/RNS quá mćc có thÅ kích ho¿t các tÁ bào thÁn kinh đám (tÁ bào hình sao và microglia) giÁi phóng các ch¿t gây viêm, làm gián đo¿n d¿n truyÃn thÁn kinh và rái lo¿n ho¿t đáng thÁn kinh đám, từ đó gây nên các bánh và rái lo¿n thối hóa thÁn kinh (Hình 1.2 B).

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

<b>Hình 1.2: C¢ chÁ tác đáng cąa các ch¿t cháng oxy hóa trong </b>

thối hóa thÁn kinh [8].

<b>Hình 1.3: C</b>¢ chÁ tác đáng cąa các ch¿t gây viêm trong thối hóa thÁn kinh [9].

Các kích thích khác nhau (ví dă: lipopolysaccharide - LPS, A³ ...) có thÅ tác đáng vào microglia, đÁc biát, să t°¢ng tác cąa LPS vãi thă thÅ giáng Toll 4/ căm biát hóa 14 (TLR4/CD14) có thÅ ho¿t hóa các tín hiáu nái bào (ví

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

dă: NF-κB, MAPK và JAK/STAT), d¿n đÁn ho¿t hóa các tÁ bào thÁn kinh đám và giÁi phóng các ch¿t trung gian gây viêm nh° oxit nitric cÁm ćng (inducible nitric oxidase synthase, iNOS), cyclooxygenase 2 (COX-2), các cytokine (ví dă interleukin-1³ (IL-1³), IL-6 và yÁu tá ho¿i tÿ khái u-α (tumor necrosis factor α, TNF-α)), chemokine (ví dă: protein hóa h°ãng đáng đ¢n bào 1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)),& có liên quan đÁn tình tr¿ng viêm thÁn kinh và d¿n đÁn tán th°¢ng tÁ bào thÁn kinh (Hình 1.3).

<b>1.1.3. Các mơ hình t¿ bào cho nghiên cąu bßnh AD </b>

Các dịng tÁ bào có khÁ nng ni c¿y án đánh th°ång đ°āc sÿ dăng đÅ nghiên cću đÅ nghiên cću các bánh thối hóa thÁn kinh bao gßm PC-12, Luhmes, SH-SY5Y và C6 [10]. Trong đó, tÁ bào Luhmes là tÁ bào tiÃn thân tÁ bào thÁn kinh phôi, tÁ bào PC-12 giáng nh° các tÁ bào thÁn kinh h¿ch giao cÁm, tÁ bào SH-SY5Y là tÁ bào đ°āc nhân bÁn từ dòng tÁ bào u nguyên bào thÁn kinh và tÁ bào C6 là dòng tÁ bào thÁn kinh đám đ°āc phân lÁp từ não cąa mát con chuát bá u thÁn kinh đám.

Sau khi biát hóa, các tác nhân gây đác thÁn kinh đ°āc thêm vào môi tr°ång nuôi c¿y tÁ bào đÅ gây ra đác tính và chÁt tÁ bào. Viác bá sung A³ oligomers, ch¿t cÁm ćng stress oxy hóa vào các tÁ bào thÁn kinh s¿ t¿o nên các kiÅu hình cholinergic gây ra apoptosis. Đây là mát mơ hình nái tiÁng cąa AD r¿t hāu ích đÅ đánh giá các tác dăng bÁo vá thÁn kinh tiÃm nng cąa các lo¿i thc mãi. Trong nhóm, các dịng tÁ bào sÿ dăng đÅ nghiên cću vai trò bÁo vá thÁn kinh nói trên, C6 là mát trong nhāng dịng tÁ bào có phÁn ćng nhanh chóng vãi các kích thích bên ngồi, chẳng h¿n nh° H2O2, có thÅ t¿o ra stress oxy hóa.

C6 là dịng tÁ bào thÁn kinh đám đ°āc phân lÁp từ não cąa mát con chuát mÃc bánh Glioma (u thÁn kinh đám). Khái u thn kinh ỏm c to ra bỗi N-nitrosomethylurea sau mát lo¿t q trình ni c¿y và chun đáng vÁt thay thÁ.

<b>1.2. TàNG QUAN VÀ ASTAXANTHIN </b>

Astaxanthin là mát carotenoid tă nhiên có màu đß, dß hịa tan trong lipid vãi công thćc phân tÿ C40H52O4 và khái l°āng mol 596,84 g/mol. Astaxinthin có mÁt trong trong nhiÃu sinh vÁt biÅn nh° cá hßi, tơm, nhun thÅ, tôm hùm, hay trong vi sinh vÁt và mát sá loài thăc vÁt.

Các nghiên cću lâm sàng và trên đáng vÁt thăc nghiám đã chćng minh

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

rằng astaxanthin có nhiÃu ho¿t tính sinh hãc nh° tiêu diát hiáu quÁ các gác tă do, kháng viêm, cháng lão hóa, giÁm să hình thành khái u, phòng ngừa bánh tim m¿ch và tai biÁn m¿ch máu não, bÁo vá gan, cháng tiÅu đ°ång, bÁo vá c th khòi bc x tia cc tớm v.v... Bờn c¿nh đó, các nhà nghiên cću cũng chß ra rằng astaxanthin có tác dăng bÁo vá há thÁn kinh và nh° là mát tác nhân bÁo vá thÁn kinh đa măc tiêu, astaxanthin tác đáng lên nhiÃu c¢ chÁ ho¿t đáng đÅ giÁi quyÁt các c¢ chÁ sinh lý bánh phćc t¿p cąa bánh thối hóa thÁn kinh.

<b>1.2.1. Tác dāng cháng oxy hóa </b>

Stress oxy hóa là mát ch¿t trung gian chính trong bánh lý cąa các bánh thÁn kinh. Să xáo trán tr¿ng thái cân bằng cąa các phÁn ćng tiÃn oxy hóa/cháng oxy hóa trong tÁ bào có thÅ d¿n đÁn stress oxy hóa, gây ra să hình thành ROS (reactive oxygen species) và các gác tă do.

Tác dăng cháng oxy hóa cąa astaxanthin cũng đã đ°āc nghiên cću trong các mơ hình thí nghiám và tình tr¿ng thÁn kinh c¿p tính (hình 1.4). Lee và

<i>cáng să đã báo cáo rằng astaxanthin cung c¿p tác dăng bÁo vá thÁn kinh </i>

cháng l¿i stress oxy hóa gõy ra bỗi s thiu ht oxy-glucose trong cỏc t bào u nguyên bào thÁn kinh ng°åi SH-SY5Y và thiÁu mỏu nóo cc bỏ trong 10 phỳt ỗ chuỏt [11]. Trong mát mơ hình cht bá đát quỵ do thiÁu máu căc bá, viác điÃu trá tr°ãc bằng astaxanthin làm gim sn xut ROS v gim peroxid húa lipid ỗ não cùng bên cąa chuát bá tÃc đáng m¿ch não giāa (middle cerebral artery occlusion - MCAO) [12]. Đßng thåi, astaxanthin làm giÁm nhßi máu

<i>não và thúc đẩy phăc hßi chćc nng vÁn đáng sau MCAO [12]. Zhang và cáng să đã phát hián ra rằng sÿ dăng astaxanthin có khÁ nng làm giÁm tán </i>

th°¢ng não sãm (early brain injury - EBI) sau khi xu¿t huyÁt d°ãi nhán (subarachnoid hemorrhage - SAH) thông qua các đÁc tính cháng oxy hóa cąa nó [13]. ĐiÃu trá bằng astaxanthin đ°āc cho là mang l¿i tác dăng bÁo vá bằng cách khôi phăc các enzym cháng oxy hóa nái sinh glutathione (GSH) và superoxide dismutase (SOD) sau SAH [13]. Wu <i>và cáng să đã báo cáo rằng </i>

viác điÃu trá astaxanthin sau SAH đã t¿o điÃu kián thuÁn lāi cho con đ°ång Nrf2-ARE và cÁi thián EBI trong mát mơ hình bÅ chća prechiasmatic cąa SAH [14]. Astaxanthin kích ho¿t con đ°ång truyÃn tín hiáu Nrf2-ARE làm tng să biÅu hián cąa các enzyme do Nrf2 điÃu khiÅn nh° heme oxygenase-1

<i>(HO-1), NAD(P)H quinine oxidoreductase-1 (NQO-1) và glutathione- </i>

S-transferase-α1 (GST-α1) đÅ cháng l¿i stress oxy hóa [14] (Hình 1.4).

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

<b>Hình 1.4: </b>Tác dăng cháng oxy hóa cąa astaxanthin trong các bánh thÁn kinh [15].

Astaxanthin t¿o điÃu kián cho să phân ly và truyÃn tin nái bào cąa yÁu tá liên quan đÁn hßng cÁu h¿t nhân 2 (Nrf2), thơng qua viác kích ho¿t các con đ°ång truyÃn tín hiáu PI3K/Akt và ERK, góp phÁn làm tng biÅu hián cąa các enzyme điÃu hòa Nrf2 nh° HO-1, NQO-1, và GST-α1 cháng l¿i stress oxy hóa. Ngồi ra, astaxanthin điÃu hịa ng°āc âm tính đ°ång truyÃn tín hiáu Sp1/NR1, làm giÁm viác sÁn xu¿t ROS nái bào và stress oxy hóa.

<b>1.2.2. Tác dāng cháng viêm </b>

Viêm đ°āc đánh nghĩa là mát lo¿t các phÁn ćng mißn dách phćc t¿p xÁy ra và mÁt sinh hãc nh° mát phÁn ćng đái vãi các vÁt th°¢ng cąa c¢ thÅ. Trong há tháng thÁn kinh trung °¢ng (CNS), tình tr¿ng viêm đóng vai trị quan trãng trong cÁ tình tr¿ng c¿p tính (đát quỵ và ch¿n th°¢ng) và tình tr¿ng thối hóa thÁn kinh mãn tính (ví dă: AD, PD). ĐÁc biát, astaxanthin thÅ hián tác dăng kháng viêm trong viêm màng bß đào do lipopolysacarit gây ra bằng cách trăc tiÁp ngn chÁn ho¿t đáng cąa enzym táng hāp oxit nitric (nitric oxide synthase - NOS) (Hình 1.5). Ngồi ra, astaxanthin ćc chÁ biÅu hián gen cąa các ch¿t trung gian gây viêm (TNF-α và IL-1³) và làm giÁm viêm màng bß đào do nái đác tá gây ra bằng cách ngn chÁn con đ°ång truyÃn tín hiáu phă thuác NF-κB [16]. Trong điÃu kián bình th°ång, NF-κB, mát phân tÿ

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

dimer bao gßm các tiÅu đ¢n vá p50 và p65, t°¢ng tác vãi cht c ch NF-B (IB) v duy trỡ chỳng ỗ tr¿ng thái b¿t ho¿t trong bào t°¢ng [17]. Khi đ°āc kớch thớch, IB tri qua quỏ trỡnh phosphoryl húa bỗi IκB kinase ³ (IKK³) và bá phân hąy thông qua con đ°ång proteasome ubiquitin [18, 19]. Să phân ly cąa IκB từ phân tÿ dimer p50/p65 đã t¿o ra tín hiáu chuyÅn phân tÿ NF-κB tãi nhân, d¿n đÁn să chuyÅn vá trí cąa NF-κB (p65) vào nhân đÅ điÃu chßnh q trình phiên mã cąa các gen gây viêm [20]. ĐiÃu trá bằng astaxanthin làm giÁm hiáu quÁ tình trng viờm liờn quan n NF-B ỗ gan ca chuỏt đ°āc n chÁ đá nhiÃu đ°ång và ch¿t béo cao bằng cách ćc chÁ quá trình phosphoryl hóa IKK³ và truyÃn tin nái bào cąa tiÅu đ¢n vá NF-κB (p65) [21]. Astaxanthin cũng ćc ch biu hiỏn gen do ROS gõy ra bỗi NF-B (p65) và giÁm sÁn xu¿t các cytokine tiÃn viêm (IL-1³, IL-6 và TNF-α) trong các tÁ bào đ¢n nhân U937 bằng cách khôi phăc mćc đá sinh lý cąa protein tyrosine phosphatase-1 (SHP-1) [22]. Trong mát mô hình cht thí nghiám và tng sinh m¿ch màng đám, Izumi-Nagai đã chćng minh rằng điÃu trá bằng astaxanthin d¿n đÁn să ćc chÁ đáng kÅ să xâm nhÁp cąa đ¿i thăc bào vào quá trình tng sinh m¿ch màng đám [23]. H¢n nāa, astaxanthin ngn chÁn să phân hąy IκB-α và truyÃn tin nái bào NF-κB, d¿n đÁn giÁm các yÁu tá gây viêm (IL-6, yÁu tỏ tng trỗng nỏi mụ mch mỏu (vascular endothelial growth factor - VEGF), phân tÿ bám dính giāa các tÁ bào-1 (intercellular adhesion molecule-1 - ICAM-1), và protein hóa h°ãng đáng đ¢n bào 1 (monocyte chemotactic protein 1 - MCP1) [23]. Astaxanthin cũng làm giÁm viêm d¿ dày ỗ chuỏt bỏ

<i>nhiòm Helicobacter pylori, cm nhißm tÁ bào lympho T từ Th1 sang Th1/Th2 </i>

[24]. Ngoài ra, astaxanthin làm giÁm sÁn xu¿t oxit nitric (NO) và ho¿t đáng táng hāp oxit nitric cÁm ćng (inducible nitric oxide synthase - iNOS) trong đ¿i thăc bào, d¿n đÁn ćc chÁ cyclooxygenase và điÃu hòa giÁm prostaglandin E2 (PGE2) v TNF- ỗ chuỏt [25]. S dng astaxanthin trong chÁ đá n kiêng đã ćc chÁ đáng kÅ să hot húa NF-B bt thồng ỗ niờm mc i trng, làm giÁm biÅu hián gen cąa IL-1³, IL-6 và COX-2, góp phÁn làm suy giÁm viêm đ¿i tràng do dextran natri sulfat (dextran sulfate sodium - DSS) [26]. Lee và các đßng nghiáp đã phát hián ra rằng astaxanthin ngn ngừa quá trình viêm bằng cách ngn chÁn să ho¿t hóa tín hiáu NF-κB và sÁn xu¿t các cytokine gây

<i>viêm (ví dă: TNF-α và IL-1³) bằng cách sÿ dăng cÁ mơ hình in vitro và in </i>

<i>vivo</i> [27]. Trong tÁ bào sừng cąa con ng°åi, Terazawa và cáng să đã chćng

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

minh rằng astaxanthin làm gián đo¿n q trình tă phosphoryl hóa và tă ho¿t hóa protein kinase-1 (MSK1), d¿n đÁn giÁm q trình phosphoryl hóa NF-κB (p65) và thiÁu ho¿t đáng liên kÁt DNA cąa NF-κB [28]. KÁt quÁ là, să biÅu hián và bài tiÁt PGE2, IL-8 do UVB gây ra đ°āc điÃu chßnh giÁm trong các tÁ bào sừng này cąa con ng°åi [28].

<b>Hình 1.5: Tác </b>dăng cháng viêm cąa astaxanthin trong các bánh thÁn kinh [15].

Thông qua viác ngn chÁn să thối hóa IκB-α và ćc chÁ trun tin nái bào NF-κB, astaxanthin ćc chÁ các yÁu tá gây viêm IL-6, ICAM-1 và MCP1. Astaxanthin cũng ćc chÁ truyÃn tin nái bào NF-κB và làm giÁm viỏc sn xut cỏc cytokine gõy viờm ỗ h bỡ bằng cách khôi phăc mćc sinh lý cąa SHP-1.

<b>1.3. NANO ASTAXANTHIN VÀ TÁC DĀNG SINH HàC CĂA NÓ </b>

MÁc dù có nhiÃu ho¿t tính sinh hãc q nh°ng astaxanthin l¿i đ°āc xÁp vào nhóm ho¿t ch¿t có đá tan trong n°ãc r¿t th¿p. Do đó, nhiÃu ph°¢ng pháp đã đ°āc áp dăng đÅ cÁi thián khÁ nng h¿p thă cũng nh° bÁo vá ho¿t tính đÁy tiÃm nng cąa astaxanthin nh° là công nghá nano, biÁn đái c¿u trúc, t¿o phćc ch¿t vùi& Trong đó, cơng nghá nano mang l¿i hiáu quÁ v°āt trái h¢n cÁ trong viác nâng cao đá phân tán và cÁi thián să h¿p thu vào trong tÁ bào. Đ°āc thiÁt kÁ phù hāp vãi đ°ång đi cąa thuác bên trong c¢ thÅ, tiÅu phân nano có khÁ nng giúp vÁn chuyÅn thuác đÁn đúng vá trí cÁn giÁi phóng ho¿t ch¿t hc

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

đích sinh hãc nh° tÁ bào bánh, mô bánh hoÁc bào quan bên trong tÁ bào bánh. Trên đ°ång vÁn chun đÁn đích có nhiÃu tác nhân phân hąy nh°: nhiát đá, đá ẩm, oxy, khơng khí và ánh sáng, pH, dách sinh lý, enzyme. Do đó, các ho¿t ch¿t kém bÃn nh° astaxanthin đ°āc bao bãc bên trong tiÅu phân nano s¿ tránh đ°āc các tác đáng trên và đ°a thc đÁn đích an tồn. Đßng thåi, viác đó s¿ tránh đ°āc să phân bá thuác đÁn các mô lành và tÁ bào lành.

Nm 2011, Meor Mohd Affandi và nhóm nghiên cću đã chÁ t¿o thành cơng nano nhũ t°¢ng bằng ph°¢ng pháp ly tâm tỏc ỏ cao 9000 vũng/phỳt ỗ ỏp sut 800 bars. Nh tÂng nano astaxanthin bao gòm cỏc thnh phn: 4% w/w ch¿t ho¿t đáng bà mÁt, 2% w/w astaxanthin, 14% w/w dÁu và 80% w/w n°ãc. SÁn phẩm nano thu đ°āc có kích th°ãc là 150-160 nm, dß hịa tan trong n°ãc và có khÁ nng tng ho¿t tính sinh hãc mà khơng thay đái c¿u trúc hóa hãc cąa astaxanthin [29].

Trong thí nghiám nghiên cću tác dăng bÁo vá da do tia căc tím cąa nano astaxanthin, astaxanthin tan trong dÁu và lutein cąa Harada và cáng să đã cho th¿y, chuát đ°āc uáng nano astaxanthin có tác dăng giÁm viêm, giÁm sá l°āng tÁ bào niêm m¿c bá chÁt cùng vãi giÁm mćc đá biÅu hián cąa các gen COX-2, p-IkB-a, TNFa và CD45 cao nh¿t khi so sánh vãi các nhóm chuát đ°āc uáng astaxanthin pha trong dÁu và lutein [30]. Nghiên cću chćng minh rằng nano astaxanthin có hiáu quÁ trong viác bÁo vá bà mÁt mÃt cháng l¿i các tác đáng có h¿i cąa viác tiÁp xúc vãi tia UVB c¿p tính, mà khơng có tác dăng phă b¿t lāi rõ ràng nào đ°āc quan sát th¿y. Nano astaxanthin t¿o ra mát ch¿t hịa tan trong n°ãc có ngn gác tă nhiên đÁy hća hẹn đÅ bÁo vá cháng l¿i tán th°¢ng bà mÁt mÃt trong điÃu kián cng thẳng oxy hóa cao khi sÿ dăng theo đ°ång uáng.

Liu và cáng să đã nghiên cću chÁ t¿o astaxanthin bao bãc trong các h¿t nano poly (axit lactic-co-glycolic) (PLGA) và chitosan oligosaccharide (COS). Să bao bãc tát cąa các h¿t nano PLGA và COS đã cho kÁt quÁ sÁn phẩm nano chća astaxanthin có d¿ng hình cÁu, kích th°ãc h¿t trung bình khng 150 nm. Hiáu su¿t bao bãc (> 85%) và khÁ nng tÁi (> 15%) cąa astaxanthin trong các h¿t nano là t°¢ng đái cao. Phân tích tia X cho th¿y rằng astaxanthin đ°āc bao bóc ỗ dng vụ đánh hình. Các h¿t nano có khÁ nng phân tán tát và án đánh trong dung dách n°ãc và có khÁ nng t°¢ng thích tÁ bào cao [31].

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

Bên c¿nh đó, Guan và cáng să cũng đã chÁ t¿o thành cơng sÁn phẩm nano chća astaxanthin bằng ph°¢ng pháp đông khô. Bát nano cho khÁ nng phân tán r¿t tát trong n°ãc. Tuy nhiên hàm l°āng astaxanthin có trong sn phm tÂng ỏi thp chò 2,9%. Kt qu th nghiám trên chuát cho th¿y vãi liÃu uáng là 2,4 mg/kg, sau 28 ngày sÿ dăng liên tiÁp khơng có đác tính [32].

Trong nghiên cću cąa Sun và cáng să, nhũ t°¢ng nano astaxanthin khơng chća n°ãc (ASX-NANE) c ch to bng phÂng phỏp òng nht ỏp sut cao [33]. SÁn phẩm kÁt hāp các °u điÅm cąa ch¿t mang nano và nhũ t°¢ng khơng chća n°ãc. ASX-NANE thu đ°āc có d¿ng hình cÁu vãi să phân bá kích th°ãc đßng đÃu và hiáu su¿t bám cao (98,4 ± 0,3%). Phân tích FTIR chß ra rằng astaxanthin đã đ°āc bao bãc thành công vào lõi lipit cąa ASX-NANE. Há nano nhũ t°¢ng này có tính án đánh trong khong thồi gian 4 tun ỗ 25C v cú th bÁo vá astaxanthin cháng l¿i să oxy hóa. Nghiên cću tÁ bào

<i>in vitro</i> cho th¿y ASX-NANE có đác tính th¿p và có thÅ bÁo vá tÁ bào cháng l¿i stress oxy hóa. Nghiên cću thẩm th¿u trong áng nghiám và các phÁn mô hãc da cho th¿y să thẩm th¿u tng c°ång cąa astaxanthin và să biÁn đái cąa lãp sừng vãi să h¿p thă toàn thân th¿p và biÅu bì khơng thay đái. Do đó, nhũ t°¢ng nano khơng chća n°ãc có thÅ là mát chiÁn l°āc thích hāp đÅ sÁn xu¿t chÁ phẩm astaxanthin bơi t¿i chß.

Bằng ph°¢ng pháp nhũ hóa - bay h¢i, Oh và cáng să đã chÁ t¿o astaxanthin lecithin nano-liposol (ASTA @ Lec NS) có kích th°ãc 169-187 nm và chß sá đa phân tán <0.3 [34] ASTA @ Lec NS án đánh trong mát thåi gian đą dài và dß dàng đơng khơ thành bát khi thêm mát l°āng sucrose thích hāp. Ngồi ra, khÁ nng hòa tan trong n°ãc tát cąa ASTA @ Lec NS đã cÁi thián đáng kÅ sinh khÁ dăng cąa astaxanthin. SÁn phẩm ASTA @ Lec NS có thÅ lo¿i bß các gác tă do (ROS) và thúc đẩy quá trình chāa lành vÁt th°¢ng cąa các tÁ bào NIH 3T3 (ngun bào sāi) hiáu q h¢n mà khơng gây ra b¿t kỳ đác tính tÁ bào nào. KÁt quÁ nghiên cću đã khẳng đánh khÁ nng cháng oxy <i>hóa t¿i chß và in vitro cąa ASTA@Lec NS đÃu cao h¢n so vãi </i>

astaxanthin tinh khiÁt và lecithin.

æ n°ãc ta, các nghiên cću và bào chÁ d¿ng nano cąa các ho¿t ch¿t có ho¿t tính sinh hãc đang đ°āc quan tâm và phát triÅn trong nhāng nm gÁn đây. Tuy nhiên, viác nghiên cću chÁ t¿o d¿ng nano astaxanthin nói riêng cho tãi thåi điÅm hián t¿i là r¿t ít. Liên quan tãi ho¿t ch¿t này, t¿i Viát Nam mãi

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

chß triÅn khai nghiên cću chiÁt tách astaxanthin từ các ngußn nguyên liáu khác

<i>nhau, trong đó các nghiên cću đÃu đ°a ra kÁt luÁn: Vi tÁo Haematococcus </i>

<i>pluvialis</i> là ngn ngun liáu cho hàm l°āng tích lũy astaxanthin cao nh¿t và sÁn phẩm astaxanthin thu đ°āc có khÁ nng ćng dăng sÿ dăng đ°āc cho con ng°åi [35].

Trong đà tài <Nghiên cću chÁ t¿o và đánh giá ho¿t tính cháng oxy hóa và giÁm rái lo¿n chun hóa lipit cąa tá hāp nano astaxanthin/kaempferol trên

<i>mơ hình in vitro và in vivo</i>= do quỹ Nafosted tài trā nm 2019 – 2023, nhóm nghiên cću phịng Cơng nghá tÁo, Vián Công nghá sinh hãc đã kÁt hāp vãi Vián Hóa hãc đã chÁ t¿o thành cơng nano astaxanthin có tính sinh khÁ dăng (g¿p 5-20 lÁn) và ho¿t tính cháng oxy hóa và giÁm lipit cao h¢n so vãi astaxanthin tă do. Chính vì vÁy, <Đánh giá khÁ nng ćc chÁ enzyme acetylcholinesterase và <b>bÁo vá tÁ bào thÁn kinh cąa nano astaxanthin trên </b>

dòng tÁ bào thÁn kinh= đ°āc tiÁn hành đÅ làm rõ h¢n và vai trị cąa nano astaxanthin, đßng thåi góp phÁn đánh h°ãng cho các nghiên cću sau này.

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

<b>CHĂNG 2. I TỵNG V PHĂNG PHP NGHIấN CU 2.1. I TỵNG NGHIấN CU </b>

<b>2.1.1. ỏi tng nghiên cąu </b>

Nano astaxanthin có ngn gác từ astaxanthin tách chiÁt từ vi tÁo lăc

<i>Haematococcus pluvialis</i> do TS. Hồng Mai Hà, phịng VÁt liáu tiên tiÁn, Vián Hoá hãc, Vián Hàn lâm cung c¿p vãi kích th°ãc h¿t là 98 ± 2 nm, hình cÁu, chß sá PDI là 0,184 ± 0,003 và giá trá tuyát đái cąa thÁ zeta là 36,8 mV. Nano astaxanthin phân bá đßng đÃu và phân tán tát trong n°ãc.

TÁ bào thÁn kinh đám C6 (ATCC, CCL-107™) do TS. Nguyßn Vn Trā, Vián Công nghá sinh hãc, Vián Hàn lâm KHCNVN cung c¿p.

<b>2.1.2. Hóa ch¿t và thi¿t bß </b>

Hóa ch¿t: Môi tr°ång nuôi c¿y tÁ bào dulbecco's modified eagle medium (DMEM)/high glucose (Gibco™, Thermo Fisher, Singapore), fetal bovine serum (FBS; Sigma), penicillin, và streptomycin (Invitrogen, Mỹ), ascobic acid (Trung Quác), galantamine hydrobromide (Sopharma AD, Bulgaria), H2O2 (Trung Quác), A³25-35 (purity ≥ 97%, No. A.4559; Sigma, USA), acetylcholinesterase inhibitor screening Kit (MAK 119; Sigma, USA), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Invitrogen, USA), TRIzol™ (Invitrogen, Singapore), Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit (New England BioLabs Inc., UK), Mßi (Cơng ty Phù Sa, Viát Nam).

ThiÁt bá: Dùng cho nghiên cću gßm Cân kỹ thuÁt Precisa XB 1200C (Switzerland), Cân phân tích Shimadzu AY 120 (NhÁt BÁn); Máy ly tâm Sorvall® LEGEND RT (Đćc), Máy khu¿y từ Kika Labortechnik (Đćc), Máy ly tâm Sorvall Legen RT 1900W (Kendro, Germany), Nßi khÿ trùng (ALP, NhÁt BÁn), Tą l¿nh th°ång, Pipetteman các lo¿i (Gilson, France) và các dăng că thơng th°ång cąa phịng thí nghiám.

<b>2.2. PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU </b>

KhÁ nng bÁo vá tÁ bào thÁn kinh cąa nano astaxanthin đ°āc tiÁn hành t¿i Phịng Cơng nghá tÁo, Vián Công nghá sinh hãc, Vián Hàn lâm KHCNVN từ tháng 2-9/2023 nh° đ°āc trình bày trong hình 2.1.

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

<b>Hỡnh 2.1: SÂ ò nghiờn cu khÁ nng bÁo vá tÁ bào thÁn kinh cąa </b>

nano astaxanthin.

<b>2.2.1. Xác đßnh ho¿t tính ąc ch¿ enzyme acetylcholinesterase (AchE) </b>

Tác dăng ćc chÁ enzym AChE (Sigma Aldrich, Singapore) cąa m¿u thÿ đ°āc tiÁn hành bằng kit Acetylcholinesterase Inhibitor Screening Kit (MAK324, Sigma, Mỹ) theo h°ãng d¿n cąa nhà sÁn xu¿t. Ph°¢ng pháp này dăa trên nguyên tÃc sau: C¢ ch¿t acetylthiocholin iodid (ACTI) bá thąy phân nhå xúc tác cąa AChE t¿o thiocholin. Thiocholin sau đó phÁn ćng vãi axit 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic DTNB t¿o thành sÁn phẩm acid 5-thio-2-nitro benzoic có mu vng v so mu ỗ bóc súng 412 nm. L°āng sÁn phẩm đ°āc t¿o thành tỷ lá thuÁn vãi hot ỏ ca AChE. Galantamine (ỗ nòng ỏ 4, 20, 100 và 500 µg/mL) đ°āc sÿ dăng làm đái chćng d°¢ng tính. Ho¿t tính AChE đ°āc đánh giá dăa trên đá h¿p thă cąa nano astaxanthin hoÁc galantamine đo đ°āc ỗ bóc súng 412 nm bằng máy microplate reader (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Đánh giá kÁt quÁ thông qua phÁn trm ćc chÁ ho¿t đá enzym AChE (I%) theo cơng thćc:

I% = (1-∆ODtest/∆ODNo inhibitor) × 100%.

Trong đó: I%: phÁn trm ho¿t tính AChE bá ćc chÁ; ΔODtest: Să thay đái giá trá OD412 cąa giÁng chća nano astaxanthin hoc cht chun ỗ thåi điÅm 0 phút và 10 phút ΔODNo inhibitor: Să thay đái giá trá OD412 cąa giÁng đái chćng khơng ćc chÁ.

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

<b>2.2.2. Ph°¢ng pháp nuôi c¿y t¿ bào </b>

TÁ bào C6 đ°āc nuôi c¿y trên mơi tr°ång DMEM có chća 10% FBS, 100 U/mL penicillin, và 0,1 mg/mL streptomycin trong tą nuôi c¿y vô trùng ç 37 °C, 5% CO2.

<b>2.2.3. Ph°¢ng pháp đánh giá đác tính căa nano astaxanthin </b>

Đác tớnh ca nano astaxanthin ỗ cỏc nòng ỏ khỏc nhau (10, 50, 100, 200 và 500 µg/mL) trên dịng tÁ bào C6 đ°āc phân tích theo ph°¢ng pháp so màu MTT ((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) theo công bá cąa Hien và cáng să (2023) [36] că thÅ là tÁ bào C6 đ°āc nuôi c¿y vào trong đĩa 96 giÁng vãi mÁt đá 2 x 10<small>4</small> tÁ bào/giÁng/100 μL môi tr°ång đÁy đą. Ą qua 24 giå cho tÁ bào phát triÅn án đánh. Sau đó, tÁ bào đ°āc ą vãi nano astaxanthin hoÁc n°ãc c¿t khÿ trùng (0,01%) trong 24 giå tiÁp theo. Sau 24h, bá sung 5 µL cąa dung dách MTT (5 mg/mL) vào từng giÁng và tiÁp tăc ą trong 4 giå. Môi tr°ång đ°āc lo¿i bò sau 4h v bỏ sung 100 àL DMSO hũa tan các tinh thÅ đ°āc t¿o thành vãi MTT. Màu cąa dung dách đ°āc đãc ç b°ãc sóng 570nm bằng bằng máy microplate reader (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Tỷ lá sáng sót cąa tÁ bào đ°āc tính bằng cách so sánh đá h¿p thă cąa m¿u vãi m¿u đái chćng. Trong đó phÁn trm sáng sót cąa tÁ bào đ°āc xác đánh nh° sau:

Tỷ lá tÁ bào sáng (%) = (Sá tÁ bào sáng/Táng sá tÁ bào) x 100%. Thí nghi<b>ám đ°āc lÁp l¿i ít nh¿t ba lÁn. </b>

<b>2.2.4. Ph°¢ng pháp đánh giá khÁ nng h¿p thu t¿ bào </b>

KhÁ nng h¿p thu cąa nano astaxanthin so vãi astaxanthin tă do trong tÁ bào C6 đ°āc tiÁn hành theo ph°¢ng pháp đ°āc mơ t bỗi Hien v cỏng s [36]. C th l, các tÁ bào C6 đ°āc nuôi c¿y tr°ãc trong 24 giồ vói mt ỏ 1ì10<small>6</small> t bo trờn mòi a và sau đó đ°āc xÿ lý bằng 5 µg/mL astaxanthin tă do hoÁc 50 µg/mL nano astaxanthin (chća mát l°āng tÂng Âng 5 àg/mL astaxanthin) trong 4 giå. Sau thåi gian ą, các tÁ bào đ°āc rÿa ba lÁn bằng dung dách muái đám phát phát (PBS), ly giÁi và ly tâm ỗ 2000 vũng/phỳt trong 3 phỳt. Nòng đá cąa astaxanthin trong các tÁ bào đ°āc xác đánh bng phÂng phỏp sc ký lòng hiỏu nng cao (HPLC), theo báo cáo tr°ãc đây cąa Hien và cáng să [36].

<b>2.2.5. Ph°¢ng pháp đánh giá khÁ nng bÁo vß t¿ bào căa nano astaxanthin cháng l¿i stress oxy hóa trong t¿ bào C6 đ°ÿc cÁm ąng H<small>2O2 </small></b>

</div>