hỗ trợ định danh chi nấm cantharellus dựa trên phân tích phát sinh chủng loài các gen nrlsu nrssu

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.56 MB, 87 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CHI NẤM

CANTHARELLUS DỰA TRÊN PHÂN TÍCH

PHÁT SINH CHỦNG LỒI

CÁC GEN nrLSU, nrSSU

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: Y DƯỢC

GVHD: PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy ThS. Lao Đức Thuận

SVTH: Ngô Văn Tài MSSV: 1553010168 Khóa: 2015

Bình Dương, tháng 05 năm 2019

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền đạt các kiến thức cơ bản nhưng rất cần thiết cho con đường học tập của sinh viên nói chung và của bản thân em nói riêng.

Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, em xin được gửi đến giảng viên PGS. TS. Lê Huyền Ái Thúy, ThS. Lao Đức Thuận đã quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn em giúp em nhận ra con đường học tập em yêu thích là Sinh học phân tử và đã đón nhận em vào làm việc trong phịng thí nghiệm. Thầy, cơ đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em được học tập và nghiên cứu.

Bên cạnh đó em xin được cảm ơn các bạn sinh viên và các anh chị phịng thí nghiệm Sinh học phân tử đã luôn quan tâm giúp đỡ, hỗ trợ em trong quá trình thực hiện đề tài này.

Trên tất cả, con xin gửi lời cảm ơn đến cha, mẹ và chị em trong gia đình đã ln tin tưởng, ủng hộ và động viên con mỗi khi con vấp ngã. Mọi người đã tạo điều kiện cho con học tập, tạo động lực cho con vững tin và trưởng thành hơn trong cuộc sống này.

Cuối cùng, em xin chúc quý thầy cô, các anh chị, các bạn, gia đình và tất cả mọi người sức khoẻ dồi dào, hạnh phúc và gặt hái được nhiều thành công trong cuộc sống.

Em xin chân thành cảm ơn! Tp.HCM, ngày 13 tháng 05 năm 2019

SINH VIÊN THỰC HIỆN

Ngô Văn Tài

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cantharellus cibarius

Hình 1.2. Hình biểu diễn tổng số lồi thuộc chi Cantharellus đã được cơng bố

theo nguồn thống kê eElurikkus.

Hình 1.3. Hình biểu diễn hệ thống cấu trúc vùng gene LSU Hình 1.4. Sơ đồ vị trí các vùng domain thuộc trình tự gen nrLSU

Hình 1.5. Cấu trúc gen và vị trí mồi NS1/NS4 khuếch đại vùng gen nrSSU

Hình 1.6. Bộ mẫu nấm trong nghiên cứu

Hình 3.1. Kết quả sắp gióng cột của mồi xi NS1 với trình tự gen nrSSU Hình 3.2. Kết quả sắp gióng cột của mồi ngược NS4 với trình tự gen nrSSU Hình 3.3. Kết quả Annhyb cặp mồi NS1 trên trình tự gen nrSSU

Hình 3.4. Kết quả Annhyb cặp mồi NS4 trên trình tự gen nrSSU Hình 3.5. Kết quả BLAST cặp mồi NS1/NS4 khuếch đại gen nrSSU

Hình 3.7. Kết quả sắp gióng cột của mồi xi LR0R với trình tự gen nrLSU Hình 3.8. Kết quả sắp gióng cột của mồi ngược LR5 với trình tự gen nrLSU Hình 3.9. Kết quả Annhyb cặp mồi LR0R trên trình tự gen nrLSU

Hình 3.10. Kết quả Annhyb cặp mồi LR5 trên trình tự gen nrLSU Hình 3.11. Kết quả BLAST cặp mồi LR0R/LR5 khuếch đại gen nrLSU Hình 3.12. Kết quả BLAST cặp mồi LR0R/LR5 khuếch đại gen nrLSU

Hình 3.13. Kết quả sản phẩm PCR gene nrSSU, nrLSU tách chiết theo phương

pháp phenol: chloroform bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB

Hình 3.14. Cây phả hệ phân tử được xây dựng trên loài khảo sát bằng phương

pháp lần lượt được biểu diễn là NJ/ML/MP trên vùng gene nrLSU (Các con số hiển

thị trên cây đều được giá trị bootstrap ≥50, mỗi phân nhánh được ủng hộ thông qua các giá trị bootstrap với nhau)

Hình 3.15. Cây phả hệ phân tử được xây dựng trên 29 loài khảo sát bằng

phương pháp lần lượt được biểu diễn là NJ/ML/MP trên cả vùng gene nrSSU (Các

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

con số hiển thị trên cây đều được giá trị bootstrap ≥50, mỗi phân nhánh được ủng hộ thơng qua các giá trị bootstrap với nhau)

Hình 3.16. Cây phả hệ phân tử được xây dựng trên 29 loài khảo sát bằng

phương pháp lần lượt được biểu diễn là NJ/ML/MP trên cả vùng gene nrSSU- nrLSU (Các con số hiển thị trên cây đều được giá trị bootstrap ≥50, mỗi phân nhánh

được ủng hộ thông qua các giá trị bootstrap với nhau)

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Bảng các mồi sử dụng trong thực nghiệm

Bảng 3.1. Thơng tin về trình tự và các thông số vật lý đánh giá của các cặp mồi nhằm khuếch đại các vùng gene

Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra DNA bằng quang phổ kế khảo sát trên 3 mẫu nấm

Cantharellus được tách chiết theo phương pháp phenol/chloroform bổ sung β-

mercaptoethanol và CTAB

Bảng 3.3. Tổng hợp kết quả hiệu chỉnh trình tự các mẫu nấm Cantharellus

Bảng 3.4. Kết quả chiều dài các trình tự trước và sau hiệu chỉnh

Bảng 3.5. Danh mục thơng tin trình tự trên các vùng gene nrSSU và nrLSU Bảng 3.6. Kết quả đồng bộ khối dữ liệu dựng cây phát sinh loài

Bảng 3.7. Kết quả dị tìm mơ hình tiến hóa của vùng gene nrLSU, nrSSU và

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH ... i

DANH MỤC BẢNG ...iii

ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Chi nấm cantharellus ... 2

1.1.1. Đặc điểm chung và thành phần loài ... 2

1.1.2. Phân loại khoa học ... 4

1.1.3. Tiềm năng ứng dụng ... 4

1.2. Đặc điểm phân bố của chi nấm Cantharellus ... 5

1.3. Phương pháp phân loại cổ điển ... 9

1.4. Phương pháp phân loại dựa trên phân tử ... 11

1.5. Nghiên cứu phát sinh loài ... 12

1.5.1 Định danh phân tử ... 12

1.5.2. Nuclear Large Subunit Ribosomal RNA (LSU)... 13

1.5.3. Small subunit ribosomal RNA (nrSSU, 18S ribosomal RNA) ... 15

1.5.4. Phương pháp phân tích phân sinh lồi đa gene ... 16

1.8.1. Phả hệ phân tử trong nghiên cứu phát sinh loài ... 21

1.8.2. Những bước cơ bản trong nghiên cứu phát sinh chủng loài ... 22

1.8.2.1. Chọn lựa market phân tử và sắp xếp bộ dữ liệu ... 22

1.8.2.2. Đọc và hiệu chỉnh trình tự ... 22

1.8.2.3. Sắp cột thẳng hàng các trình tự ... 22

1.8.2.4 Chọn mơ hình tiến hóa ... 23

1.8.2.5. Phân tích sự phát sinh chủng lồi ... 23

1.8.2.6. Dị tìm cây tiến hóa tối thích ... 23

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

1.8.2.7. Tiêu chuẩn tối ưu ... 24

1.8.2.8. Phân tích giá trị bootstrap ... 25

1.8.2.9. Kiểm tra cây tiến hóa ... 26

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ... 28

2.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ... 28

2.5.1. Thu nhận thông tin gen nrLSU, nrSSU và cặp mồi tương ứng ... 32

2.5.2 Đánh giá các thông số vật lý của mồi của nrLSU, nrSSU ... 32

2.5.3. Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi ... 32

2.5.4 Kiểm tra sản phẩm PCR và giải trình tự ... 33

2.6. Tiến hành thực nghiệm ... 33

2.6.1. Thu nhận mẫu ... 33

2.6.2. Tách chiết DNA tổng số từ mẫu nấm... 33

2.6.3. Kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm DNA đã tách chiết... 34

2.6.4. Trình tự mồi sử dụng cho phản ứng PCR ... 34

2.6.5. Hiệu chỉnh trình tự ... 35

2.6.6. So sánh với cơ sở dữ liệu Genbank ... 35

2.6.7. Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu DNA ... 36

2.6.8. Đồng bộ hóa bộ dữ liệu ... 36

2.6.9. Dị tìm mơ hình tiến hóa ... 36

2.6.10. Xây dựng cây phát sinh loài ... 37

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đánh giá mồi trên IDT ... 39

3.1.1. Kết quả kiểm tra mồi NS1/ NS4 ... 40

3.1.2. Kết quả kiểm tra mồi LR0R/LR5 ... 45

3.2. Kết quả thực nghiệm ... 48

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

3.3. Kết quả hiệu chỉnh trình tự ... 50

3.4. Kết quả định danh phân tử ... 52

3.4.1. Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu DNA ... 52

3.4.2. Xây dựng cây phát sinh loài phân tử ... 53

3.5. Kết quả định danh hình thái kết hợp với định danh phân tử ... 63

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận và đề nghị ... 66

5. TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 67

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nấm là một trong số nhóm sinh vật sống đa dạng trên trái đất được ứng dụng rất rộng rãi trong đời sống lẫn sản xuất và được công nhận trên nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới là có giá trị như thực phẩm dinh dưỡng (Chang và Miles

2004). Trong đó, Cantharellus là một chi nấm ăn được quan trọng trong tự nhiên,

chi nấm này được tìm thấy ở khắp nơi trên thế giới như: Châu Á, Châu Phi, Châu Âu, Bắc Mỹ (Danell 1999, Dunham và cs, 2003). Chúng là loài nấm Mycorrhizal, là loài nấm cộng sinh với rễ thực vật, vì thế rất khó để ni trồng và chủ yếu là được

thu thập trong tự nhiên. Cantharellus có giá trị kinh tế cao nhờ hàm lượng protein,

chất béo, khoáng chất, vitamin và một số nutraceuticals trong thể quả của chúng điều đó dẫn đến nhiều nghiên cứu về sinh thái, sinh lý học và cây phát sinh loài của

chi nấm này (Danell 1994; Dunham et al., 2003; Eyssartier et al., 2009; Buyck and Hofstetter 2011; Tian et al., 2012; Buyck et al., 2013). Việc phân loại và định danh nấm Cantharellus đã được nghiên cứu kĩ lưỡng ở nhiều nơi trên thế giới dựa trên

một số khóa phân loại của Corner (1966), Largent (1986), Rolf Singer (1985) và chủ yếu là định danh hình thái, đặc điểm định danh hình thái của các lồi trong chi

nấm này khá rõ ràng, được miêu tả khá chi tiết trong nhiều bài báo (Buyck et al., 2013, Kumari et al., 2011, Matthew et al., 2013). Tuy nhiên, theo nghiên cứu của

Fries và Mueller (1984) trên các thử nghiệm tính tương thích trong quá trình sinh sản và các phương pháp thử nghiệm khác để mơ tả tồn bộ hệ thống của một đơn vị phân lồi cụ thể thì nhóm tác giả kết luận khơng thể dựa vào các tiêu chí hình thái để xác định giới hạn phân loài. Ngoài ra, Mehmann và cộng sự (1995) cho rằng phân loại về hình thái là chưa đủ để mơ tả chính xác phân giới nấm và cịn tốn nhiều thời gian. Việc dùng các mô tả bằng phân loại hình thái như vậy cho phép phân loại nhiều đơn vị phân loài nhưng nhiều điểm tương đồng giữa một số đặc điểm hình thái đã dẫn đến việc xác định sai một số lồi và khơng xác định được lồi mới trong nhiều đơn vị phân lồi phức tạp. Do đó, hiện nay các nghiên cứu ngoài việc sử dụng kỹ thuật định danh bằng hình thái, phần lớn đều ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào công tác định danh. Các nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử về các loại nấm

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

khác nhau đã làm sáng tỏ phân loại nấm trong tự nhiên (Hibbett và Vilgalys 1993;

Bunyard et al., 1994; Drehmel et al., 1999; Liu et al., 1999). Có hai vấn đề quan

trọng dẫn đến việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong định danh phân loài. Thứ nhất, sự ra đời của PCR đã cho phép phân tích một số lượng nhỏ tế bào nấm hoặc thậm chí là các bào tử đơn lẻ. Thứ hai, việc lựa chọn các loại mồi oligonucleotide đặc hiệu cho nấm, đã cung cấp cho việc giải ra dễ dàng các trình tự nucleotide (Guarro et al. 1999). Các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng trở nên quan trọng như một phương tiện để các nhà nghiên cứu có thể xác lập các mối quan hệ phân loại và phát sinh chủng lồi giữa các nhóm nấm nội loài (Zambino và Szabo 1993). Giới hạn phân loài các chủng nấm dựa trên một số đặc điểm hình thái có thể được ứng dụng bằng cách sử dụng các kỹ thuật dựa trên DNA như RAPD,

AFLP, RFLP hoặc phân tích trình tự DNA (ITS, nLSU, nSSU, nrSSU, RPB1 và RPB2). Bất kỳ phương pháp phân tử nào cũng có thể được kết hợp với các phương

pháp hình thái để xác định các loài nấm để đạt độ tin cậy cao (Khush et al. 1992; Calonje et al. 1997). Các phương pháp phát sinh loài phân tử thiết lập mối quan hệ tiến hóa dựa trên cây phát phả hệ phân tử đã chứng tỏ, phương pháp cung cấp nguồn thông tin có giá trị hướng tới mục tiêu mở nhiều hướng hiểu biết về mối quan

hệ giữa các nhóm nấm nội loài (Mitchell et al., 1995).

Việc phân tích đơn gene thường làm khó khăn trong việc xác định giới hạn phân loài và thiết lập một cây phát sinh phả hệ phân tử đạt mối liên kết chặt chẽ và độ tin cậy ủng hộ cao do bản chất tính khơng đồng nhất hay tính khơng thống nhất

giữa các trình tự gene trên các lồi Cantharellus (Olariaga, unpublished). Theo cơng

trình nghiên cứu của Buyck và cộng sự năm 2013 nhóm tác giả đã hệ thống lại và

ứng dụng bốn gen trong đó có nrLSU để định danh và xây dựng cây phả hệ phân tử của chi nấm Cantharellus. Bên cạnh đó nghiên cứu của Tang và cộng sự năm 2007 đã sử dụng 4 gen gồm nrSSU, nrLSU, Rpb2, Tub (β tubulin) để xây dựng cây phát

sinh loài đơn gen và đa gen với mục đích phân loại các chi trong họ Sordariomycetes (một lớp nấm thuộc ngành nấm túi Ascomycota). Nhóm tác giả đã tiến hành dựng cây đơn gen đối với 4 gen trên và trong đó kết hợp các gen

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

cậy cao hơn, mối quan hệ giữa các chi được thể hiện rỏ ràng hơn so với cây phát

sinh loài của gen nrLSU+Rpb2 kết luận được cây phát sinh loài dựa vào gen nrSSU

là cây đáng tin cậy và có ý nghĩa về mặt thống kê, tuy nhiên khi kết hợp cả gen

nrSSU với nrLSU thì các nhánh trong cây có mức ý nghĩa của cây khá cao (dựa vào

Bayesian và giá trị bootstrap) cho thấy khi kết hợp các gen thì làm tăng số lượng các nucleotide kết hợp trong dữ liệu cục bộ dẫn đến một hướng giải quyết mới cho cây phát sinh lồi [16].

Từ những thơng tin về cây phát sinh lồi của chi nấm Cantharellus, việc phân tích dữ liệu gen nrLSU, nrSSU là cần thiết cho sự hỗ trợ trong định danh lồi nấm Cantharellus. Từ đó, đề tài “HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CHI NẤM CANTHARELLUS DỰA TRÊN PHÂN TÍCH PHÁT SINH CHỦNG LOÀI CÁC GEN nrLSU, nrSSU”. được thực hiện trên nền tảng kế thừa những nghiên cứu trước nhằm hỗ trợ cho việc định danh chi nấm Cantharellus.

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

1.1. Chi nấm cantharellus

1.1.1. Đặc điểm chung và thành phần lồi

Hình 1.1. Cantharellus cibarius [52]

Họ Cantharellaceae gồm 2 chi lớn là Cantharellus và Craterellus, 2 chi nấm

này có đặc điểm hình thái khá giống nhau chúng có mũ khá rõ ràng ở thân cây hoặc có hình kèn trumpet. Các bề mặt mang bào tử của chúng xuất hiện ở mặt dưới nắp

và từ mịn đến nhăn. Tuy nhiên, ở Cantharellus có độ dày của thịt ở phần tai kèn lớn hơn so với Craterrellus (Kuo M. 2015).

Tên Cantharellus Adans .: Fr. có nguồn gốc từ tiếng pháp “chanterelle” mà

chúng ta tìm thấy trong các hồ sơ được công vào giữa thế kỷ 17 (Bauhin và Cherler

1651). Theo Eyssartier và Buyck (2000), tên “chanterel” được nhà thực vật học

người pháp Adanson (1763) sử dụng ở cấp độ chung. Khái niệm về tên chi của ông được thông qua và phê chuẩn bởi Fries (1821) với bản chỉnh hình được Latin hóa

như hiện tại. Như đại diện cho chi chanterelle, từ “cibarius” của Cantharellus cibarius có nguồn gốc từ tiếng latin là “thực phẩm” nên có thể dịch cả câu là “chén

thực phẩm”.

Thực tế, hầu hết các loài nấm thuộc chi nấm Cantharellus đều có thể ăn được,

có giá trị kinh tế cao và góp vai trò quan trọng trong tự nhiên. Chi nấm này được

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

tìm thấy ở nhiều nơi trên thế giới như: Châu Á, Châu Phi, Châu Âu, Bắc Mỹ

(Danell et al. 1999, Dunham et al. 2003). Chúng là loài nấm Mycorrhizal, loài nấm

cộng sinh với rễ thực vật, do đó rất khó để ni trồng và chủ yếu là được thu thập

trong tự nhiên. Cantharellus có giá trị kinh tế cao nhờ hàm lượng protein, chất béo,

khoáng chất, vitamin và một số nutraceuticals trong thể quả của chúng điều đó dẫn đến nhiều nghiên cứu về sinh thái, sinh lý học và cây phát sinh loài của chi nấm này

(Danell et al. 1994; Dunham et al. 2003; Eyssartier et al. 2009; Buyck and Hofstetter 2011; Tian et al. 2012; Buyck et al. 2013).

Theo nguồn thống kê eElurikkus ( chủ yếu ở Estonia,

châu Âu) có 325 lồi thuộc chi Cantharellus đã được mơ tả.

Hình 1.2. Hình biểu diễn tổng số lồi thuộc chi Cantharellus đã được công bố

theo nguồn thống kê eElurikkus.

Ngoài ra nhiều báo cáo nghiên cứu của các nhóm tác giả về cơng tác định

danh loài Nấm Cantharellus cũng đã được công bố (Corner 1966; Danell 1994a; Feibelman et al., 1997; Pegler et al., 1997; Persson và Mossberg 1997; Watling and Turnbull 1998; Dahlman et al., 2000; Eyssartier và Buyck 2001,2011,2013). Có hơn 70 lồi “Chanterellus thực” đã được cơng bố và nhiều lồi khác vẫn chưa được đặt tên. Hầu hết các lồi thuộc chi Cantharellus được tìm thấy trên các địa chất có

rừng với cây chủ ectomycorrhizal (một hình thức của mối quan hệ cộng sinh xảy ra giữa một symbiont nấm và rễ của các loài thực vật khác nhau).

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

1.1.2. Phân loại khoa học

Theo Kirk và cộng sự 2008 thì chi nấm Cantharellus được phân loại như sau:

Giới (Kingdom): Fungi

Ngành (Phylum): Basidiomycota Lớp (Class): Agaricomucetes

Bộ (Order): Cantharellales

Họ ( Family): Cantharellaceae

Chi (Genus): Cantharellus 1.1.3. Tiềm năng ứng dụng

Các phân tích sinh hóa cho thấy Cantharellus có chứa rất thành phần dinh

dưỡng như: protein, chất béo, khoáng chất (Ca, Fe, P, Po, Mg,..), vitamin (B2, B3, B5, B6, D và C). Ngoài ra, một số lồi có chứa nutraceuticals trong thể quả của chúng.

Carbohydrates: Carbohydrate xuất hiện trong nấm như 1 bộ phận của thành tế bào polysaccharides dưới dạng các polysaccharides tự do, oligosacccharides, monosaccharides và đường rượu. Tổng lượng carbohydrate trong nấm khoảng từ

9.94 mg/g ở C. isabellinus – 26.5 mg/g ở C. minor (Kumari et al. 2011). Barros và

cộng sự (2008) báo cáo oligosaccharide phổ biến nhất, tức là trehalose được tìm

thấy trong quả thể của C. cibarius với hàm lượng 3.12 g/100 g.

Protein và amino acids: Lượng protein chứa trong các loài nấm thường rất lớn (Ilievska và Petrovska 2000) và protein từ nấm được cho là có chất lượng tương đương với protein từ động vật (Longvah và Deosthale, 1998). Lượng protein trong

nấm Cantharellus cibarius được đánh giá là khá cao (1.06 mg/g) với lượng đạm lên

tới 34.17% (Pandey và Budhathoki, 2017), lượng acid glutamic là 15.6 μg/mg và chứa lượng nhỏ methionine (1.2 μg/mg) khối lượng khô.

Acid béo: So với động vật nấm có hàm lượng chất béo rất thấp. Lượng chất béo dao động từ 1.1-8.3% trọng lượng khô và 0.1-0.3% trọng lượng tươi.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

Cantharellus cibarius chứa linoleic và oleic acid trong khoảng 0.48%, các chất béo

bão hòa chiếm 39% (Kumari, 2011).

Hoạt tính chống oxy hóa và các hợp chất phenolic: Nấm có chứa các hợp chất polyphenolic được cơng nhận là một chất chống oxy hóa mạnh do khả năng đào thải

các electron tự do của chúng (Hirano et al., 2001). Cantharellus cibarius có sự hiện

diện của các hợp chất (3-, 4-, and 5-O-caffeoylquinic acid, caffeic acid, p-coumaric

acid và rutin). Màu hồng đỏ của C. cinnabarinus và cam của C. friesii được tạo

thành gần như hoàn toàn dựa trên canthaxanthin, một sắc tố được tìm thấy trong cá hồi và lông chim hạc (Gill và Steglich, 1987). Hợp chất này có khả năng bảo vệ các mơ của con người khỏi tác động của các gốc oxy hóa (Chen và Tappel, 1996).

Carotenoids (hay beta carotene): Beta carotene là hợp chất chính tạo nên màu

vàng của nhiều loài nấm Cantharellus (Arpin và Fiasson 1971; Gill và Steglich 1987; Mui et al. 1998) các chanterelle vàng, Cantharellus cinnabarius và Cantharellus minor chứa beta-carotene và lượng nhỏ các carotenoid khác (Gill và

Steglich 1987).

Vitamin: Những nghiên cứu về nấm Cantharellus đã chỉ ra rằng chúng là

nguồn cung cấp vitamin B như niacin, flavin và pyridoxine (Solomko và Eliseeva,

1988). Nấm Cantharellus cũng là nguồn giàu vitamin A và D (Pilz et al. 2003). Hawksworth và cộng sự (1983) báo cáo rằng quả thể của nấm Cantharellus cibarius

là một nguồn cung cấp vitamin A dồi dào. Các loài nấm bậc cao chứa lượng vitamin B1 và B2 có thể cung cấp tới hơn 40% nhu cầu hàng ngày của con người (Kelley

1997). Cantharellus cibarius có chứa hàm lượng vitamin B1 là 0.3 mg/100g và B2 là 0.12 mg/100g (Caglarirmak et al. 2002).

1.2. Đặc điểm phân bố của chi nấm Cantharellus

Chi nấm Cantharellus có lịch sử phân loại phức tạp và rộng rãi. Theo Index

Fungorum là một dự án quốc tế để lập chỉ mục tất cả các tên chính thức trong ngành

Nấm đã liệt kê được hơn 500 tên khoa học đã được áp dụng cho chi Cantharellus, mặc dù số lượng tên khoa học phù hợp chỉ dưới 100 loài (Pilz et al., 2003). Ngoài

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

các lồi có mối quan hệ đồng loài, nhiều loài đã được chuyển sang các chi khác như

Afrocantharellus, Arrhenia, Craterellus, Gomphus, Hygrophoropsis và Pseudocraterellus. Phương pháp phân tích phát sinh loài phân tử giúp cung cấp thông tin mới về các mối quan hệ họ hàng giữa các hệ nấm chanterelle. Sau đây là các loài thuộc chi Cantharellus:

Europe: C. amethysteu, C. cibarius, C. pallens, C. pseudominimus, C. romagnesianus, C. subpruinosus, C. friesii.

Ở châu Âu, loài C. cibarius là loài nấm dạng kèn màu vàng mọc rất phổ biến. Các loài C. friesii và C. cibarius var. amethysteus thường phân bố nhiều ở phía Nam châu Âu. C. pallens là loài nấm màu xanh xám (pale), mũ nấm gấp cuộn lai,

với hình thức sống là ectomycorrhizal quan hệ mật thiết với các cây gỗ thân gỗ (cây phì, hazels) và cây sồi (oaks). Eyssartier và Buyck (1999a) cũng đã mơ tả 2 lồi

khác là C. pseudominimus và C. romagnesianu. Năm 2000, loài Cantharellus subpruinosus đã được mô tả đầu tiên ở Pháp là loài thuộc họ Cantharellaceae bởi

nhóm tác giả Eyssartier G và Buyck B, được tìm thấy trong hệ sinh thái rêu kết hợp với rừng đang thời kỳ rụng lá và cây vân sam (spruce).

Africa: C. congolensis, C. longisporus, C. pseudocibarius, C. platyphyllus, C. tanzanicus, C. sublaevis, C. miomboensis, C. luteopunctatus, C. humidicolus, C. gracilis, C. cibarioides, C. afrocibarius.

Ở châu Phi, một vài loài bao gồm C. congolensis, C. longisporus, C. pseudocibarius và C. platyphyllus đã được mô tả từ rất lâu (Corner 1966). Việc

phân loại các loài nấm đã được nghiên cứu bởi các nhà nghiên cứ nấm khác nhau

(Harkonen et al., 1995; Buyck et al., 1996, 2000; Buyck và Eyssartier 1999b;

Eyssartier và Buyck 2001, Buyck và Hofstetter 2012). Các nhóm tác giả đã dựa trên các tiêu chí đặc điểm hình thái và phân tử để phân loài các loài thuộc chi

Cantharellus ở châu Phi. Việc mơ tả rõ đặc điểm hình thái và vẽ minh họa một cách

chi tiết hình thái cung cấp thông tin tổng quan cho 5 loài từ khu rừng nhiệt đới

Zambezian savannah ở châu Phi: C. afrocibarius, C. gracilis, C. humidicolus, C. miomboensis and C. tanzanicus.

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

Australia: C. ochraceoravus Grgurinovic, C. concinnus Berk (C. cibarius var. australiensis), C. viscosus Berk, C. lilacinus.

Eyssartier và Buyck (2001) đã tổng quan được 17 lồi Australian chanterelle có thể phân bố và công trình đã kết luận chỉ 3 tên loài là loài chanterelles thật ở

châu Úc. Cantharellus lilacinus là lồi thuộc chi nấm Cantharellus, được mơ tả đầu

tiên vào năm 1919 bởi các nhà thực vật học là botanists John Burton Cleland và Edwin Cheel và tìm thấy ở châu Úc.

Central and South America: C. cibarius, C. cinnabarinus, C. lateritius, C. cibarius, C. atrolilacinus, C. cascadensis, C. pleurotoides, C. californicus, C. texensis, C. tenuithrix, C. tabernensis, C. subalbidus, C. spectaculus, C. quercophilus, C. protectus, C. phasmatis, C. lewisii, C. guyanensis, C. formosus, C. flavus, C. appalachiensis, C. altipes.

Cantharellus guyanensis được mô tả đầu tiên bởi Camille Montagne vào năm 1854. Cantharellus formosus được biết đến là nấm ăn được mọc từ các vùng Pacific

Northwest ở miền Bắc nước Mỹ, được chứng minh là tương đồng hình thái với lồi

C. cibarius ở Châu Âu vào năm 1990. Nấm hình dạng phểu, nhiều thịt, có màu vàng

đến cam. Ở phần dưới của mũ nấm mềm nhẵn, mùi vị ngọt, thơm dễ chịu. Mọc đơn lẻ đến từng cụm trên các rừng cây dạng có quả nón (tùng bách). Nấm mọc từ tháng

7 đến tháng 12. Một vài loài thuộc chi Cantharellus đã được công bố phân bố ở

miền Trung và miền Nam nước Mỹ và phía tây Ấn Độ và các vùng lân cận bao gồm

C. cibarius và C. cinnabarinus. Vào năm 2000, Lorelei Norvell đã thu thập được các loài C. lateritius và C. cibarius ở các khu rừng sồi trên núi Talamanca ở Costa Rica. Các nhóm nghiên cứu cịn tìm được thêm các lồi Cantharellus mới đã được thu thập trước đó bởi Halling (Halling và Mueller, 2000) và được đặt tên là C. atrolilacinu. C. cascadensis được tìm thấy ở American Pacific Northwest (Dunham et al. 2003). Henkel et al. (2006) cũng đã mơ tả lồi mới là C.pleurotoides từ Guyana. Gần đây, Arora and Dunham (2008) đã cơng bố thêm lồi mới là C. californicus, mộc ở các khu rừng sồi ở California, USA. Ở phía Bắc nước Mỹ trên các cây gỗ tùng phát hiện nấm thuộc chi nấm Cantharellus có màu hơi đỏ hồng,

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

nhỏ. C.texensissp. nov. được tìm thấy ở Gulf của Mexico stages và eastern United States, là lồi nấm mới có hình dạng giống C. cinnabarinus (Buyck. et al., 2011). Cantharellus subalbidus thường được tìm thấy ở vùng Tây Bắc nước Mỹ, tuy giống với các loại Cantharellus khác ngoại trừ màu sắc của nấm có màu trắng và các vết thâm có màu cam ở thân (Plischke et al. 2014). C. subalbidus có thể mang dạng

sống cộng sinh với các loài cây thân gỗ như thông, cây độc cần, Douglas-fir và

Pacific madrone (Trudell, S. et al., 2006; Wood et al., 2010; Arora and David 1986). C. subalbidus được tìm thấy phổ biến ở các khu rừng già hơn là ở các hệ rừng sinh thái trẻ (Dunham et al., 2006). Cantharellus appalachiensis là loài nấm ăn được phổ biến của chi Cantharellus, được mọc chủ yếu ở vùng đông bắc nước

Mỹ. Màu sắc mũ nấm luôn khác nhau từ màu nâu rồi đến màu vàng, thường là các

đốm nâu trên các mũ nấm ở nấm trường thành. C. appalachiensis sống cộng sinh và tìm thấy trên các rừng có gỗ cứng (Kuo, M. et al., 2006). Tên khoa học là C. appalachiensis sau đó cịn có tên khác là Appalachian Mountains. Cantharellus tabernensis được tìm thấy ở miền Nam nước Mỹ được mô tả vào năm 1996, mọc

chủ yếu trên các khu rừng xen kẽ cây thơng và cây gỗ cứng, có mối quan hệ mật

thiết với lồi Pinus elliottiitrees. Thể quả có mũ nấm màu vàng nâu với phần trung

tâm có màu đen nâu nhạt, và lá tia (ở mũ nấm) và cuống nấm có màu cam

(Feibelman et al., 1996). Vào năm 2011, các loài mới cũng được mô tả bao gồm Cantharellus altipes ở Texas, Cantharellus lewisii tìm thấy ở Bắc Mỹ và có mối cộng sinh với cây gỗ cứng (Buyck. et al., 2011). Đến năm 2013, Cantharellus phasmatis và Cantharellus flavus cũng được tìm thấy ở Bắc Mỹ (Foltz M. et al.,

2013).

Asia: C. subcibarius, C. cibarius, C. lateritius, C. cerinoalbus, C. subamethysteus, C. vaginatus, C. zangii

Cantharellus cibarius có mối quan hệ mật thiết với lồi C. subcibarius, được

công bố là phân bố ở các nước như là Pakistan, India, China, Thailand, Malaysia,

Japan, và Philippines (Pilz et al., 2003). C. lateritius được mô tả là phân bố ở Thái Lan, C. ianthinus, C. pudorinus, và Cr. Odoratus là ở Malaysia, singapore (Jones et

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

al. 1994). Gần đây, Eyssartier et al., (2009) đã cơng bố 5 lồi thuộc chi Cantharellus là C. cerinoalbus và C. subamethysteus được mô tả như là một loài

Trong khi đó 2 lồi là C. friesii Quel và C. luteocomus Biglow được công bố

bởi Bhatt and Lakhanpal (1988) được thu nhận từ Western Himalayas, India.

1.3. Phương pháp phân loại cổ điển

Đây là phương pháp phân loại dựa vào đặc điểm hình thái như kích thước, hình dạng cấu trúc thể quả, hình thái bào tử, cơ chế giải phóng bào tử, màu sắc và môi trường sống của nấm để phục vụ cho định danh.

Chi Cantharellus Fries được mô tả đầu tiên vào năm 1821 trong cuốn

“Systema Mycologicum” (Fries, 1821-1832). Hạn chế lớn nhất trong nghiên cứu của Fries đó việc thiếu minh hoạ cụ thể hình thái của nấm, đây là yếu tố vẫn phải được xem xét. Smith và Morse (1947) và Smith (1968) đã nghiên cứu bằng phương pháp định danh hình tháo ở mức hiển vi giúp việc nhận biết dễ dàng hơn và phân

biệt giữa hai lồi Craterellus ở phía tây và đông Bắc Mỹ, Cr. tubaeformis và Cr. infundibuliformis. Redhead (1979) đã công bố về vấn đề cần phải xem xét, ông cho

rằng Smith (1968) đã dùng các đặc điểm không nhất quán để phân biệt các cặp lồi

ở phía đơng so với phía tây Bắc Mỹ và cũng với tên loài là Cr. infundibuliformis là khơng có sẵn, bởi vì nó được coi là đồng loài với Cr. tubaeformis. Một số nhà nấm

học khác (Donk, 1964; Corner, 1966; Petersen, 1971) đã đặt họ Cantharellaceae với

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

họ Clavariaceae trong Aphyllophorales. Corner (1966) đã tiến hành kết hợp định danh hình thái dựa trên đặc điểm vĩ mô và vi mơ (mức kính hiển vi) của

Cantharellaceae và chia họ này thành ba chi viz. Cantharellus, Craterellus và một chi mới Pseudocaterellus, bao gồm 7 loài mới; Cantharellus cuticulatus, C. subcibarius, C. formosus, C. ianthinus, C. pudorinus, Craterellus sordidus và Cr. reniformis. Chi mới được mô tả Pseudocaterellus (Corner et al., 1966) của

Cantharellaceae đã được chứng minh bằng sự phát triển thể quả và có vách ngăn thứ cấp của sợi nấm tramal như để phân biệt với các chi khác, tách biệt với chi

Cantharellus (với hình thái thể quả và clamp của nấm phát triển tương tự, nhưng lại

khơng có vách ngăn thức cấp của sợi nấm). Các nghiên cứu hầu hết đều kết luận rằng như mọi loại kích thước thể quả đều lớn trung bình đến màu sắc thể quả đều là

màu vàng cam và đều có tên chung là Cantharellus cibarius. Singer (1986) chứng

minh các đặc điểm hình thái như hình dạng giống như bình hoa hoặc dạng kèn, basidia stichic và bào tử trơn nhẵn, ủng hộ mạnh mẽ về đặc điểm phân lồi thuộc họ Cantharellaceae.

Härkưnen et al., (1995, 2003) cơng bố 6 lồi và Buyck et al., (2000) đã cơng bố 11 lồi và giới thiệu hai loài mới: Cantharellus tomentosus và C.isabellinus var. parvisporus từ Tanzania. Năm 2008 một loài mới Cantharellus fistulosus từ

Tanzania với đặc điểm đặc trưng có một lỗ rỗng, cuống nhẵn mịn và quả nấm màu hồng, và điều này cho thấy sự khác biệt với màu thân quả và bề mặt mũ nấm là

vàng nâu đã cơng bố trước đó. Hankel et al., (2005) đã công bố một loài mới là Cantharellus pleurotoides từ vùng núi Pakaraima của Guyana, trong các khu rừng nhiệt đới với thực vật chiếm ưu thế là ectomycorrhizal Dicymbe spp. (thuộc họ

Caesalpiniaceae). Loại nấm này được tác giả đề cập là số ít trong số các lồi thuộc

chi Cantharellus được mơ tả trên tồn thế giới trong việc có pleurotoid basidioma

và hình thái khác và hệ sinh thái khác được cung cấp để phân loài mới. Olariaga và

Salced (2008) đã công bố nấm Cantharellus ilicis từ rừng Quercus của

Mediterranean Basin, có sự khác biệt so với các taxa khác do tổ hợp đặc điểm hình

thái kết hợp lại với fleshy basidiomata dày. Một loài mới Cantharellus californicus

được Arora và Dunham (2008) công bố, với các chanterelle vàng nổi bật của rừng

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

sồi ở California được đặc trưng như một lồi mới khi dùng cơng cụ sinh học phân tử

và hình thái học để phân loại. Các quan sát chỉ ra rằng Cantharellus californicus là

một loài lớn nhất trên thế giới, với những mảnh bào tử riêng rẻ thường nặng 1/2 kg (hoặc 1 pound) hoặc hơn khi trưởng thành. Dựa trên tài liệu đã nghiên cứu của Fries và Mueller (1984) trên các thử nghiệm tính khơng tương thích trong q trình sinh sản và các phương pháp thử nghiệm khác để mô tả tồn bộ hệ thống của một taxa cụ thể thì tác giả kết luận không thể dựa vào các tiêu chí hình thái để xác định giới hạn phân lồi.

Từ những dữ liệu trên cho ta thấy rằng phân loại hình thái khơng đủ để mơ tả

chính xác phân giới nấm (Mehmann et al., 1995) và ngoài ra còn tốn rất nhiều thời

gian. Tuy việc dùng các mơ tả bằng phân loại hình thái như vậy cho phép phân loại nhiều taxa, nhưng nhiều điểm tương đồng giữa một số đặc điểm hình thái đã dẫn đến việc xác định sai một số loài và khơng xác định được các lồi mới trong nhiều taxa phức tạp. Dẫn đến việc rất khó để xác định giới hạn phân lồi hoặc việc có biết chắc chắn hay không một loại hình thái học liệu có giống nhau hay không. Việc không rõ ràng sự khác biệt về hình thái đặc biệt giữa các lồi có lẽ là điều làm một số nhà nghiên cứu nấm phải đau đầu trong việc mô tả các phân lồi mới. Do đó, các

lồi thuộc chi Cantharellus có hình thái tương đồng nhau đều được xếp vào phân nhóm C. cibarius trong thời gian đầu (Eyssartier & Buyck ., 2000; Dunham et al., 2003 và Guevara et al., 2004). Vào thế kỷ 20, nhờ sự hỗ trợ bằng công cụ sinh học

phân tử đã cho thấy rằng sự khác biệt về hình thái tuy nhỏ, khơng rõ ràng nhưng có

thể lại xác định là các loài khác nhau của Cantharellus (Feibelman et al., 1996; Dunham et al., 2003).

1.4. Phương pháp phân loại dựa trên phân tử

Bằng phương pháp khuếch đại trình tự mục tiêu (PCR – Polymerase Chain Reaction), đây là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng, với nguyên tắc tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer)

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

đặc hiệu cho đoạn DNA này. Phương pháp này không qua các khâu giải phẫu hình thái, định danh hình thái, cơ chế hay chu trình sống của lồi. Phương pháp PCR thuận lợi khi áp dụng cho bất kỳ giai đoạn nào trong vịng đời của một lồi nấm bao gồm thể quả, các nấm rễ cộng sinh (mycorrhizas), hệ sợi nấm thuần được phân lập

bằng phương pháp in vitro. Phương pháp giúp tăng độ tin cậy cho việc thu thập

nguồn dữ liệu sinh học một cách đa dạng thuộc giới Nấm. Các nghiên cứu phân tử về các loại nấm khác nhau đã làm sáng tỏ phân loại nấm trong tự nhiên (Hibbett và

Vilgalys 1993; Bunyard et al., 1994; Drehmel et al., 1999; Liu et al., 1997).

Có hai vấn đề quan trọng dẫn đến việc sử dụng các kỹ thuật phân tử trong định danh phân loài. Thứ nhất, sự hình thành của các tế bào nấm hoặc thậm chí bào tử đơn, vật liệu mẫu nấm khô hay sự mất cân bằng hệ sinh thái nấm. Thứ hai, việc lựa chọn các loại mồi oligonucleotide đặc hiệu cho nấm, đã cung cấp cho việc giải ra dễ

dàng các trình tự nucleotide (Guarro et al. 1999). Các kỹ thuật phân tử ngày càng

trở nên quan trọng như một phương tiện để các nhà nghiên cứu có thể xác lập các mối quan hệ phân loại và phát sinh chủng loài giữa các nhóm nấm nội lồi (Zambino và Szabo 1993). Giới hạn phân loài các chủng nấm dựa trên một số đặc điểm hình thái có thể được ứng dụng bằng cách sử dụng các kỹ thuật dựa trên DNA

như RAPD, AFLP, RFLP hoặc phân tích trình tự DNA (ITS, nrLSU, mtSSU, nrSSU và RPB1). Bất kỳ phương pháp phân tử nào cũng có thể được kết hợp với các phương pháp hình thái để xác định các lồi nấm để đạt độ tin cậy cao (Khush et al. 1992; Calonje et al. 1997). Các phương pháp phát sinh loài phân tử thiết lập mối

quan hệ tiến hóa dựa trên cây phát phả hệ phân tử đã chứng tỏ, phương pháp cung cấp nguồn thông tin có giá trị hướng tới mục tiêu mở nhiều hướng hiểu biết về mối

quan hệ giữa các nhóm nấm nội loài (Mitchell et al., 1995).

1.5. Nghiên cứu phát sinh loài

1.5.1 Định danh phân tử

Định danh phân tử là phương pháp nghiên cứu về phân loại, mối quan hệ của sinh vật ở mức độ phân tử dựa trên sự so sánh sự khác biệt trình tự nucleotide và axit amin trong di truyền phân tử DNA, RNA, protein. Trong nghiên cứu định danh

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

phân tử, việc lựa chọn vùng trình tự DNA, RNA, protein để khảo sát giữa các loài là một bước quan trọng, các trình tự này cần phải đảm bảo tính bảo tồn cao trong cùng

một lồi nhưng biến động lớn giữa các loài khác nhau. Vùng gen giữ nhà keeping gen) đã được sử dụng phổ biến trong nhiều năm gần đây để định danh một

(house-số loài. Kết quả của việc định danh phân tử thể hiện qua một cây phả hệ phân tử. Các nhà nghiên cứu có thể phân tích dựa vào các chỉ tiêu như địa hình học của cây phả hệ phân tử, giá trị bootstrap, sự phân nhóm để lý giải mối tương quan của các đối tượng trên cây. Ngồi ra, việc kết hợp với các dữ kiện hình thái, giải phẫu học nhằm định danh chính xác các đối tượng quan tâm. Hiện nay, định danh phân tử đang trở thành ngành khoa học được chú trọng trong phân loại học, bổ sung cho phân loại học truyền thống những phương pháp nghiên cứu mới và giải quyết vẫn đề chưa sáng tỏ như tính đa dạng di truyền, phát sinh loài, Hỗ trợ định danh các loài mà định danh hình thái cịn hạn chế.

1.5.2. Nuclear Large Subunit Ribosomal RNA (LSU)

Hình 1.3. Hình biểu diễn hệ thống cấu trúc vùng gene LSU

Gen mã hóa RNA của ribosome (nrSSU, nrLSU) chứa nhiều thông tin di

truyền có tính bảo tồn cao, được biết rộng rãi trên thế giới và có khả năng thiết kế được các cặp mồi phổ quát giúp khuếch đại và giải trình tự các trình tự của nhiều

lồi nấm. Trình tự nrLSU-rRNA là gen mã hóa RNA 25S-28S của ribosome (tiểu

phần lớn của ribosom). Các trình tự mã hóa cho rRNA có tính bảo tồn cao do đó

phù hợp cho các nghiên cứu ở cấp họ hay xa hơn. Cấu trúc của nrLSU-rRNA ngoài

những vùng bảo tồn cịn có những vùng biến động gọi là domain D1/D2 (D- divergence region, các số đuợc đánh thứ tự 1, 2,…bắt đầu từ đầu 5’-3’). Các domain

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

khác nhau của 25-28S rDNA (tiểu phần lớn LSU) chứa nhiều thông tin cho phép so sánh các cấp phân loại từ cao xuống đến cấp độ loài (Gueho. et. al., 1993). Ðặc biệt,

vùng DNA D1/D2 mã hóa cho tiểu phần lớn của ribosome gần đây được xem là rất hữu ích cho việc phân loại phần lớn các lồi nấm có giá trị y duợc (Kurtzman &

Robnett, 1997; Fell. et. al., 2000). Cặp mồi LR0R/LR5 là cặp mồi phổ quát được

biết đến nhiều nhất và cũng được sử dụng trong nhiều nghiên cứu phả hệ phân tử nấm trong những năm gần đây (Vilgalys & Hester, 1990). Cặp mồi này được thiết kế để khuếch đại vùng D1-D2 và cho kết quả khuếch đại khoảng 800-1300bp.

(Sonnenberg. et. al., 2007).

Hình 1.4. Sơ đồ vị trí các vùng domain thuộc trình tự gen nrLSU

Nhiều cơng trình nghiên cứu phân tích phát sinh phân tử gene nuclear large

subunit rRNA (nrLSU) trên chi thuộc loài Cantharellus đã được tiến hành và tìm ra được nhiều lồi mới (Redhead et al. 1997; Dunham et al. 2003; Arora and Dunham

2008). Và từ nghiên cứu này giải quyết được nhiều vấn đề nội-ngoại trong mối quan

hệ tiến hóa lồi thuộc chi Cantharellus như cơng tác hồn thành phân tử gen nrLSU

phải được tiến hành song song trong q trình phân tích phát sinh loài. Nghiên cứu về các mối quan hệ phát sinh lồi trong họ Cantharellaceae qua việc phân tích trình

tự của nrLSU trong nghiên cứu của Feibelman et al., 1997. Khoảng 325 bp gần đầu

5' của gene nuclear 28S ribosomal được giải trình tự, khi đem so sánh và chứng

minh thì Cantharellus và Craterellus nên được coi là các chi khác biệt. Việc phân

tích phát sinh loài bằng cách sử dụng phương pháp parsimony đã chỉ ra rằng

Cantharellus tubaeformis và Pseudocraterellus sinuosus nên được phân loài thuộc

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

chi Craterellus. Tiếp theo đó, năm 2003 nhóm tác giả này đã phân tích tổng quan và ước lượng được chiều dài phân tử 650bp ở đầu 5’ của gene nrLSU. Từ đó đã hỗ trợ cho việc cung cấp thơng tin phân tử giúp phân loại ra một số loài Cantharellus mới (C. formosus, C. subalbidus, và C. cascadensis) và một số loài thuộc chi Craterellus, nhưng vùng này thường có độ phân giải cấp độ lồi rất thấp giữa các lồi có mối quan hệ huyết thống đối với nhau (Buyck et al. 2011), đặc biệt là trong loài Cantharellus. Năm 2015 đã tìm ra một vài tổ hợp chuỗi trình tự ITS2-nrLSU trên các mẫu nấm có bào đãm màu cam và bạch tạng trên một số lồi European Cantharellus và việc phân tích phát sinh sử dụng tổ hợp gene của vùng ITS2-nrLSU

cho kết quả ủng hộ cho mối liên kết cây phát sinh phả hệ phân tử trên các nốt cho

một số lồi thuộc chi Cantharellus có cùng huyết thống gần gũi với nhau (Olariaga et al. 2015). Cặp mồi LR0R/LR5 là cặp mồi phổ quát được biết đến nhiều nhất và

cũng được sử dụng trong nhiều nghiên cứu phả hệ phân tử nấm trong những năm gần đây (Vilgalys & Hester, 1990). Cặp mồi này được thiết kế để khuếch đại vùng

D1-D2 và cho kết quả khuếch đại khoảng 800-1300bp (Sonnenberg et. al., 2007).

1.5.3. Small subunit ribosomal RNA (nrSSU, 18S ribosomal RNA)

Trình tự nrSSU–rRNA là vùng gen mã hóa 18S rRNA (đơn vị hình thành tiểu phần nhỏ của ribosome), nrSSU tiến hóa tương đối chậm, thường được sử dụng trong nghiên cứu các sinh vật có ít quan hệ về mặt di truyền (Guarro. et. al., 1999). Gen nrSSU có tính bảo tồn cao do nó phù hợp cho các nghiên cứu ở cấp họ và xa hơn, được dùng trong việc khảo sát mối quan hệ tiến hóa giữa các lồi. Vùng nrSSU

có thể được đọc trình tự bằng một cặp mồi phổ quát (universal primer). Các cặp mồi này được thiết kế dựa trên các trình tự nucleotide bảo tồn của gen 18S rRNA

(White. et. al.,1990). Cặp mồi NS1/NS4 được sử dụng trong nghiên cứu này bởi

tính phổ quát giúp khuếch đại và giải trình tự được nhiều mẫu nấm. Ðây là cặp mồi đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu phả hệ phân tử trong những năm gần đây

(White. et. al., 1990).

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

Hình 1.5. Cấu trúc gen và vị trí mồi NS1/NS4 khuếch đại vùng gen nrSSU

Các nghiên cứu phát sinh gen ở mức phân loại cao hơn dựa vào các tiểu đơn vị

nhỏ (nrSSU) và các chuỗi nrLSU cho công tác nghiên cứu phát sinh lồi phân tử

cho phân nhóm nấm cantharelloid đã khơng được ủng hộ mạnh mẽ bởi những khó khăn khi phân tích kết quả các giả trị ủng hộ liên kết giữa các nhóm lồi đều thấp, ngun nhân được đặt ra là do tốc độ tiến hóa phân tử của các gen rDNA hạt nhân trong các phân loại này tăng lên trong phân nhánh các tập hợp thuộc chi nấm

Cantharellus (Moncalvo et al., 2006). Tuy nhiên, nghiên cứu này cịn phân tích đa gene dựa trên sự kết hợp trên 4 gene bao gồm nrSSU, nrLSU, mtSSU, RPB2 đã cung

cấp thêm nguồn giải quyết triệt để và tạo thêm giá trị ủng hộ mạnh mẽ cho nhiều

phân nhánh trong nhiều tập hợp nhóm lồi thuộc chi Cantharellus. 1.5.4. Phương pháp phân tích phân sinh lồi đa gene

Một số nghiên cứu phát sinh loài dựa trên ribosomeDNA (Artjariyasripong. et. al. 2001, Sung. et. al., 2001, Stensrud. et. al., 2005) không thể giải quyết và hỗ trợ

định danh một cách rõ ràng của một họ nấm (ví dụ, đơn ngành của Clavicipitaceae), mặc dù đã cung cấp nhiều luận cứ để xây dựng cây phát sinh loài hỗ trợ định danh họ này. Nhưng nghiên cứu này bị hạn chế bởi thơng tin trình tự và DNA ribosome không đủ để giải quyết các mối quan hệ giữa các chi, lồi, nhóm có quan hệ xa tuy đã áp dụng các mô hình, phương thức tính tốn về mặt thống kê. Ngoài ra các nghiên cứu phát sinh gen ở mức phân loại cao hơn dựa vào các tiểu đơn vị nhỏ

(nrSSU) và các chuỗi nrLSU cho công tác nghiên cứu phát sinh loài phân tử cho

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

phân nhóm nấm cantharelloid đã khơng được ủng hộ mạnh mẽ bởi những khó khăn khi phân tích kết quả các giả trị ủng hộ liên kết giữa các nhóm lồi đều thấp, ngun nhân được đặt ra là do tốc độ tiến hóa phân tử của các gen rDNA hạt nhân trong các

phân loại này tăng lên trong phân nhánh các tập hợp thuộc chi nấm Cantharellus (Moncalvo et al., 2006). Khó khăn trong xây dựng cây phát sinh loài đơn gen

(phylogenies single-gen) được khắc phục bằng cách phân tích phát sinh lồi của bộ dữ liệu bao gồm nhiều gen mã hóa nằm trong nhân (phylogenies đa gen) vì thơng tin phát sinh lồi ở nhiều gen lớn hơn trong bất kỳ đơn gen nào.

Trong nghiên cứu của Kumari et al. (2011) và Shao et al. (2014) thì Ribosomal nuclear large subunit (nrLSU) đã được sử dụng để ủng hộ cho sự thiết

lập mối quan hệ phát sinh loài mới, nhưng vùng này thường có độ phân giải cấp độ

lồi rất thấp giữa các lồi có mối quan hệ huyết thống đối với nhau (Buyck et al. 2011), đặc biệt là trong loài Cantharellus. Ngày càng nhiều nghiên cứu như của

Hazels và oaks. Olariaga và Buyck (1999a) đã mơ tả nhiều trình tự di truyền cho

các loài thuộc chi Cantharellus ở các lục địa khác nhau thuộc Châu Âu nhưng

khơng có bất kỳ nghiên cứu nào ước đoán vùng giới hạn phân loài của chi

Cantharellus khi sử dụng các thơng tin di truyền có sẵn này.

Việc phân tích lại để xác định giới hạn phân lồi và các nhóm có mối quan hệ đơn huyết thống trong tập hợp nhóm cantharelloid đã được đề cập bởi nhóm nghiên

cứu Moncalvo et al., 2006. Nhóm tác giả đã phân tích dựa trên thơng tin trình tự các gene nrLSU, nrSSU, mitSSU và RPB2. Kết quả phân tích ủng hộ mạnh mẽ mối quan hệ 6 phân nhóm giữa 2 chi Cantharellus và Craterellus. Các phân nhóm Craterellus có thể được ghi nhận trong khu vực ôn đới: Cr. cornucopioides (bao gồm Cr. fallax và Cr. konradii), phân nhóm Cr. tubaeformis (bao gồm Cr. infundibuliformis), Cr. odoratus, Cr. lutescens và Cr. ignicolour. Đặc biệt trong nghiên cứu này việc phân tích đa gene dựa trên sự kết hợp trên 4 gene bao gồm nrSSU, nrLSU, mtSSU, RPB2

đã cung cấp thêm nguồn giải quyết triệt để và tạo thêm giá trị ủng hộ mạnh mẽ cho

nhiều phân nhánh trong nhiều tập hợp nhóm lồi thuộc chi Cantharellus. Và kết quả

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

cũng cho thấy hai lồi C. minor và C. appalachiensis có mối quan hệ gần gũi với các lồi nhóm lồi C. cinnabarinus.

1.6. Tình hình nghiên cứu

1.6.1 Trong nước

Ở Việt Nam các nghiên cứu về chi nấm Cantharellus chưa nhiều. chỉ mới là

những khởi đầu về phát hiện và định danh qua hình thái. Và vẫn cịn rất ít cơng

trình cụ thể nào về định danh phân tử của chi nấm Cantharellus.

Năm 2014, Phan Hữu Hùng (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và cộng sự tiến hành phân tích thành phần hóa học và định danh các lồi nấm cộng sinh trong rừng thông Đà Lạt dựa trên

so sánh hình thái giải phẫu và cơng bố về sự tồn tại của chi Cantharellus cibarius

tại Việt Nam.

Ngoài ra, sinh học phân tử đã được ứng dụng hỗ trợ cho phân tích hình thái

cũng như phát sinh loài của chi Nấm Cantharellus tại Việt Nam. Cơ sở dữ liệu làm tiền đề cho xây dựng cây phát sinh lồi được nhóm tác giả Trinh Van Hanh et al., 2018 ứng dụng thành công với vùng gene mục tiêu là nrLSU, phân tích được 6 phân nhóm của Cantharellus. Bộ dữ liệu này góp phần giúp hỗ trợ định danh các mẫu Nấm Cantharellus tại Việt Nam sau này.

1.6.2. Ngoài nước

Chi nấm Cantharellus đã và đang được nghiên cứu tốt ở các nơi trên thế giới

đặc biệt về phần định danh hình thái, đặc điểm hình thái của chi nấm này được phân

tích khá kỹ (Danell 1994; Dunham et al., 2003; Logde et al. 2004) tuy vậy khả năng

phân biệt các lồi theo định danh hình thái có độ chính xác khơng cao.

Do đó, Trong những năm gần đây tình hình nghiên cứu về chi nấm

Cantharellus này được nghiên cứu rộng rãi đặc biệt sử dụng các dữ liệu từ các gen thuộc nhóm gen giữ nhà (house-keeping genes) như : ITS (internal transcribed spacer), nrLSU (nuclear ribosomal small subunit - tiểu đơn vị nhỏ ribosome), nrSSU (nuclear ribosomal large subunit - tiểu đơn vị lớn ribosome), Tef1

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

(elongation factor 1α - nhân tố kéo dài 1α), Rpb1 (largest subunit of RNA polymerase II - tiểu đơn vị lớn nhất của RNA polymerase II), Rpb2 (second largest subunit of RNA polymerase II - tiểu đơn vị lớn thứ hai của RNA polymerase II)…

nhằm mục đích hỗ trợ định danh chính xác hơn.

Một số cơng trình tiêu biểu như: Năm 2013 việc phân tích đa gene dựa trên

bốn gene nrLSU, nrSSU, RPB2 và tef-1 đã xây dựng thành công cơ sở dữ liệu và thể

hiện mối quan hệ phát sinh loài phân tử rõ ràng để định danh hơn 1 nữa số loài nấm

Cantharellus trên thế giới dựa trên nghiên cứu của nhóm tác giả của Buyck et al.,

2013 và kết luận có 6 phân nhóm lồi được công nhận và phân nhóm

Afrocantharellus được coi như một chi riêng biệt. Năm 2016, phân tích phát sinh lồi đã thành cơng trong việc phân tích đa gene bao gồm: ITS2, nrLSU, Tef-1, RBP2 bởi nhóm tác giả Olariaga, Ibai, et al., 2016 và kết luận cơng trình phù hợp với cơng trình nghiên cứu định danh phân tử trên toàn loài Cantharellus của Buyck et al.

(2013).

1.5. Nguyên tắc tách chiết và thu nhận DNA ở lồi nấm

Thành tế bào nấm có khoảng 80% là các polysaccharides góp phần tạo nên cấu trúc vững chắc cho tế bào. Ngoài polysaccharides, vách tế bào cịn có sự hiện diện của protein. Các thành phần chính của polysaccharide bao gồm α, β-glucan, chitin, chitosan. Các sợi α, β-glucan được sắp xếp phức tạp chồng chéo lên nhau chúng kết hợp với protein màng tạo thành mạng lưới vách tế bào vững chắc. Protein (hoặc là glycoprotein) tham gia một phần nhỏ cấu thành nên thành tế bào (<20%). Dựa vào thành phần cấu tạo cho thấy rằng các tế bào nấm có cấu trúc đa lớp. Thành phần và cấu trúc của các tế bào có thể thay đổi theo tuổi tác và điều kiện mơi trường sống. Ngành nấm đảm Basidiomycota có chứa thành phần chính của vách tế bào chủ yếu là các sợi chitin và glucans với mối liên kết 1,3 và 1,6 β-D-glucosyl. Chitin là một polymer của N-acetyl-D-glucosamine, có cơng thức cấu trúc là một bội số của hai 2n(C8H15NO6) glucosamine acetyl (chitobiose) và 2 cấu tử này liên kết với nhau bằng liên kết 1-4-glucosidic. Chitin có cấu trúc gần giống với cellulose, sự khác biệt duy nhất là trong chitin có các nhóm phụ aminoacetyl thay thế nhóm hydroxyl gắn

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

vào các nguyên tử carbon thứ hai của cellulose. Thành phần của thành tế bào (sự hiện diện của α-glucan và chitin) khác nhau giữa các loài nấm khác nhau. Chitin nằm phân tán xung quanh đan xen với β-(1-3) và β-(1-6)-glucan trong vách tế bào

(Hartland. et. al., 1994; Klis. et. al., 2002), ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình tách

chiết và thu nhận DNA. Vì vậy, quá trình thu nhận DNA gặp nhiều khó khăn cho

rất nhìu chi nấm khác nhau trong đó có chi nấm Cantharellus là chi thuộc phân

ngành nấm đảm Basidiomycota.

Kuo. et. al., đã nghiên cứu và bổ sung các chất bổ trợ cho việc tách chiết như

là β- mecaptoethanol và CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide). Lý do việc lựa chọn bổ sung các hóa chất này: (1) CTAB có vai trò quan trọng, giúp thu nhận DNA đạt độ tinh sạch cao, nâng cao hiệu suất tách chiết, (2) β-mercaptoethanol là chất khử có vai trị loại bỏ protein. Bản chất β-mecaptoethanol (HOCH2CH2SH) có khả năng phân cách liên kết disulfide (cắt liên kết S-S), làm cho cấu trúc bậc 3 và bậc 4 của protein bị phá vỡ, loại bỏ các liên kết disulfide dẫn đến quá trình tủa protein trong các bước tách chiết DNA dễ dàng hơn.

1.7. Kĩ thuật PCR và giải trình tự

1.7.1. Kĩ thuật PCR

Năm 1983, Kary Mullis người phát minh ra kĩ thuật PCR[42]. Ông đã đưa ra các nguyên tắc cơ bản giúp phát triển và triển khai kỹ thuật này tại Cetus Corporation, nơi ông làm việc[42]. Kỹ thuật này được thương mại hóa và được bán bản quyền vào năm 1991 với giá 300 triệu USD[42]. PCR sử dụng những thành phần cơ bản của hệ thống sao chép phức tạp trong tự nhiên để sao chép một phân đoạn ngắn DNA trong ống nghiệm[42]. Quá trình sao chép DNA với sự tham gia của các thành phần như: DNA khuôn, dNTP, mồi, enzyme polymerase, MgCl2 và dung dịch đệm. Phản ứng này được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt, hay còn gọi là máy

PCR. Thực chất PCR là phương pháp tạo dòng DNA in vitro, không cần sự hiện

diện của tế bào[18]. Một phản ứng bao gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm các bước: biến tính (DNA được biến tính ở nhiệt độ cao 94o

C - 95oC và tách thành hai mạch đơn), bắt cặp mồi (nhiệt độ cần cho sự bắt cặp giữa mồi với mạch khuôn là Ta, Ta <

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

Tm khoảng 5oC, Tm là nhiệt nóng chảy mồi, nhiệt độ bắt cặp phụ thuộc vào trình tự mồi, %GC...), kéo dài (nhiệt độ được tăng lên 72o

C để enzym polymerase hoạt động, nối dài mạch mới)[22]. Sau n chu kỳ tạo được một lượng lớn bản sao 2n

từ DNA gốc.

1.7.2. Giải trình tự

Các phương pháp giải trình tự DNA là kĩ thuật xác định tất cả những thành

phần nucleotide hình thành nên phân tử DNA. Maxam và Gilbert (1997), Sanger et al., (1997) là những người lần đầu tiên công bố phương pháp giải trình tự. Phương

pháp giải trình tự dựa vào sự biến đổi hóa học của DNA được mô tả bởi Maxam và Gibert (1997). Phương pháp này dựa vào sự thủy giải đặc trưng phân tử DNA cần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học[18]

. Nguyên tắc của phươngmột gốc phospho đồng vị phóng xạ (32P), (2) xử lý đoạn DNA đã đánh dấu với chất hóa học có thể làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên DNA, (3) nạp DNA đã xử lý vào 4 giếng trên gel polyacrylamide biến tính và tiến hành điện di. Sau đó chiếu trên một phim nhạy tia X, những vị trí dừng lại của DNA trên gel điện di tạo thành các vạch trên phim vì các vị trí này đều đánh dấu phóng xạ 32P. Từ đó có thể đọc được trình tự của các nucleotide của đoạn DNA[22]

1.8. Phả hệ phân tử

1.8.1. Phả hệ phân tử trong nghiên cứu phát sinh loài

Phả hệ phân tử là nghiên cứu về mối qua hệ tiến hóa của tập hợp các trình tự gen, dựa vào phân tích sự khác biệt di truyền phân tử (DNA, RNA, protein). Kết quả phân tích phân tử được thể hiện qua cây phả hệ [17]

Dựng cây phả hệ phân tử là một quá trình phức tạp bởi thực tế không thể xây dựng một cây đúng nhất. Tập hợp dữ liệu phát sinh lồi có thể bao gồm hàng tram loài khác nhau một trong số đó có thể thay đổi tỷ lệ đột biến dẫn đến ảnh hưởng tiến hóa. Do đó, có rất nhiều mơ hình tiến hóa khác nhau và các phương pháp phân tích phát sinh chủng lồi, dị tìm cây tiến hóa tối thích cho một phân tích phát sinh chủng lồi, dị tìm cây tiến hóa tối thích cho một phân tích phát sinh loài [17]

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

1.8.2. Những bước cơ bản trong nghiên cứu phát sinh chủng loài

1.8.2.1. Chọn lựa market phân tử và sắp xếp bộ dữ liệu

Bước đầu tiên là xác định protein hay trình tự DNA sẽ là dữ liệu được chọn và xây dựng bộ cơ sở dữ liệu cục bộ bao gồm các trình tự khác nhau có liên quan. Các trình tự quan tâm có thể lấy từ trang NCBI hay các cơng cụ tìm kiếm tương đồng khác, để tạo ra một cơ sở dữ liệu cục bộ [17]

Các dữ liệu được chọn để nghiên cứu chỉ nhắm vào một họ gen sẽ giúp việc lựa chọn dữ liệu và phân tích phát sinh chủng lồi dễ dàng hơn. Tuy nhiên, sự phát sinh chủng lồi của một nhóm sinh vật có thể mở rộng hơn, ví dụ như có kết hợp nhiều gen hoặc nhiều vùng DNA khác nhau sẽ giúp cho phân tích phát sinh chủng lồi chính xác và đáng tin cậy hơn.

1.8.2.2. Đọc và hiệu chỉnh trình tự

Các phân tích phát sinh chủng lồi đều dựa trên sự khác biệt khi quan sát các trình tự được so sánh theo cột thẳng hàng. Do đó, lỗi một hay nhiều trình tự cũng sẽ có thể đến một cây tiến hóa khơng chính xác. Đặc biệt đối với trường hợp vùng DNA có độ bảo tồn cao và sử dụng mơ hình tiến hóa phức tạp thì ảnh hưởng này sẽ cho ra kết quả có độ sai lệch rất lớn. Để tránh trường hợp lỗi trình tự do chủ quan, người ta buộc phải đọc trình tự cả hai sợi để việc hiệu chỉnh sau đó được đảm bảo tính khách quan hơn.

1.8.2.3. Sắp cột thẳng hàng các trình tự

Việc sắp cột thẳng hàng thường được tự động hóa bằng máy tính, có thể dùng phần mềm Clustal W hoặc Clustal omega để thực hiện công việc này. Tuy nhiên, với những gen hay vùng DNA kém bảo tồn thì quá trình sắp xếp thẳng hàng tự động rất dễ gây ra lỗi. Do đó, với gen hay vùng DNA có độ biến thiên cao cần được trực tiếp thực hiện quá trình sắp xếp thẳng hàng bằng mắt. Với những vùng khơng có khả năng sắp xếp thẳng hàng thì cần phải loại bỏ trước khi đưa vào phân tích để tránh xảy ra lỗi.

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

1.8.2.4 Chọn mơ hình tiến hóa

Sự thay đổi mơ hình tiến hóa của chuỗi trình tự phân tử là kết quả của đột biến, một số trong đó xảy ra một cách tình cờ hoặc do chọn lọc tự nhiên. Tỷ lệ thay đổi sẽ khác nhau giữa các OTUs (operational taxanomic unit), phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kích thước gen hay phần trăm GC. Để thiết lập một cây phát sinh loài hoàn chỉnh các chuỗi dữ liệu cần trải qua q trình kiểm tra dị tìm mơ hình tiến hóa thích hợp.

Mơ hình tiến hóa đơn giản nhất, có tốc độ biến đổi cũng được giả định là bằng nhau ở mỗi dạng đột biến điểm. Khi đó số lượng các dạng biến đổi trong mơ hình tiên hóa này được thiết lập là 1.

Mơ hình tiến hóa phức tạp nhất hiện nay là mơ hình có khả năng hồi biến tổng quát theo thời gian (General time reverible model). Mơ hình này cho rằng có 6 kiểu biến đổi và trong đó mỗi kiểu biến đổi có một tốc độ khác nhau.

Một số mơ hình tiến hóa ngẫu nhiên phổ biến như Jukes-Cantor, Tamura 3 – parameter, Kimura 2 – parameter (K2P), Hasegawa – Kishino – Yano (HKY), Tamura Nei, General Time Reversible (GTR),…

1.8.2.5. Phân tích sự phát sinh chủng lồi

Một số phương pháp nhằm suy luận cây phát sinh chủng loài đã được biết khá rõ ràng hiện nay đều là những phương pháp kết hợp thuật tốn dị tìm cây tối thích và một nhóm tiêu chuẩn tối ưu chọn trước. Tiến trình thực hiện của nó được dị tìm những cây tiến hóa tối thích, sau đó những cây tiến hóa này được đánh giá dưới tiêu chuẩn tối ưu chọn trước để cho ra một cây tiến hóa tốt nhất.

1.8.2.6. Dị tìm cây tiến hóa tối thích

Trong thực nhiệm, người ta thường chọn hai phương pháp dị tìm cây tiên hóa đó là phương pháp branch-and-bound và phương pháp heuristics.

Trong phương pháp branch-and-bound, một cây được coi là tốt nhất sẽ được lựa chọn, sau đó cây này được đánh giá cho điểm tiếp theo các tiêu chuẩn đã chọn trước. Cây này sẽ được giữ trong bộ nhớ và điểm của cây này được xem là “điểm

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

chuẩn”. Điểm các cây khác được so sanh, nếu dưới điểm chuẩn sẽ bị bỏ qua, nếu cao hơn điểm chuẩn thì sẽ trở thành cây tốt nhất mới với điểm chuẩn mới. Tiến trình cứ tiếp tục cho đến hết. Thuật tốn này cho phép dị tìm cây tiến hóa tốt nhất nhưng lại tiêu tốn nhiều thời gian.

Phương pháo heurustics mặc dù không cho kết quả chính xác cao như phương phá trên nhưng vẫn thường được sự dụng.

Ngồi ra, cịn một phương pháp nữa là phương pháp phân rã hình ngơi sao. Phương pháp này có ngun lý là đâu tiên một hình cây dạng ngơi sao khơng hoàn chỉnh được tạo ra, kế đến một taxa liên hệ gần nhất được đưa vào sao cho nó phải tìm được vị trí tốt nhất. Tiến trình thực hiện nhiều lần cho đến khi cây tiến hóa hình thành.

1.8.2.7. Tiêu chuẩn tối ưu

Tiêu chuẩn tối ưu là q trình thiết lập mơ hình tiến hóa tốt nhất về lịch sử tiến hóa dựa vào những thơng tin chưa hoàn chỉnh của dữ liệu. Phương pháp sử dụng tiêu chuẩn tối ưu có 2 bước theo thứ tự: đầu tiên là xác định một tiêu chuẩn có chức năng tính điểm cây. Bước hai là tìm một cây thay thế với một tiêu chuẩn này rồi từ đó dị tìm ra một cây. Q trình tốt sẽ cho ra nhiều giải pháp thay thế tối ưu.

Tiêu chuẩn marsimum parsimony (MP) có mơ hình tiến hóa là một hàm ẩn. tiêu chuẩn MP giả định rằng cây tiến hóa tốt nhất mơ tả tiến trình tiến hóa tốt nhất tức ít đột biến nhất, cây vì thế có điểm thấp nhất (hà tiện) theo một tiêu chuẩn định sẵn. Nguyên lý của phương pháp marsimum parsimony là tìm kiếm một cây sao cho số lượng thay đổi tiến hóa là thấp nhất để giải thích những sự khác nhau được nhìn thấy qua các đơn vị phân loại hiên hữu OTUs (operational taxanomic unit). Cây sẽ tính điểm thấp nhất (điểm hà tiện) nên thông thường phương pháp parsimony sẽ chọn cây có tổng chiều dài nhỏ nhất.

Phương pháp hà tiện không ràng buộc (unweighted parsimony) thường được sử dụng, phương pháp này xem tốc độ tiến hóa của các base ở tất cả các vị trí đều như nhau nên thường áp dụng thuật tốn tự tìm tịi (heuristic algorithm).

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

Tiêu chuẩn trong phương pháp khoản cách (Distance method) có mơ hình tiến hóa là hàm hiện. Khoảng cách chính là khoảng cách tiến hóa giữa các cặp đối tượng đang được so sánh. Về nguyên tắc, phương pháp khoản cách sẽ cố tìm ra một cây thích hợp dựa vào ma trận khoản cách gen và các cặp trình tự.

Trong phương pháp khoảng cách (distance method), từng cặp trình tự một sẽ được sắp cột thẳng hàng cặp đôi và ứng với từng cặp, khoảng cách di truyền sẽ được tính tốn. Để có được cây tiến hóa, phương pháp phân rã hình ngơi sao thường được sử dụng ví dụ phương pháp neighbour joining. Do phương pháp neighbour-joining là một trong những phương pháp nhanh nhất để dị tìm cây tiến hóa nên nó thường được sử dụng để phân tích khối dữ liệu lớn với nhiều taxa.

Phương pháp Maximum Likelihood (ML) khả năng tối đa là phương pháp tiêu tốn nhiều thời gian nhất nhưng lại cho kết quả đáng tin cậy nhất. Ứng với mỗi mơ hình tiến hóa được chọn, phương pháp này sẽ tính tốn khả năng xác xuất ( dưới dạng – ln L) mà một cây tiến hóa có thể có từ chuỗi trình tự phân tích. Cây tiến hóa có xác suất cao nhất là cây cuối cùng được chọn.

Ngoài 3 phương pháp kể trên cịn có phương pháp Bayes.

1.8.2.8. Phân tích giá trị bootstrap

Phân tích bootstrap là một phương pháp thống kê để có được ước tính về các lỗi sai sót khi dựng cây. Thường được dùng để kiểm tra tính chính xác và đánh giá độ tin cậy của sự phân nhóm lồi trên một cây. Ưu điểm của phương pháp này là nó có thể áp dụng cho tất cả các phương pháp dựng cây cơ bản.

Chỉ số bootstrap: là tần số xuất hiện của một nhóm (cluster) trên số lần giản đồ được thiết lập. Đơn vị tính là phần trăm (%). Theo Felsenstein (1985), bootstrap là một công cụ hỗ trợ cho việc xây dựng cây phát sinh lồi. Chỉ số bootstrap nói lên độ tin cậy của sự gần gũi giữa các taxa được nhóm trên cây phả hệ.

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

1.8.2.9. Kiểm tra cây tiến hóa

Để kiểm tra một cây tiến hóa nhà nghiên cứu có thể sử dụng cây do họ định sẵn để so sánh với cây tốt nhất mà họ nhận được. Trong bước này, sau khi chọn được cây tốt nhất nhà nghiên cứu sẽ hiệu chỉnh thay đổi các vị trí taxa quan tâm.

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Các mẫu nấm được thu từ các mẫu nấm Cantharellus thu thập từ những

chuyến đi thực địa tại vùng núi Langbian khu vực tỉnh Lâm Đồng do giáo viên hướng dẫn cung cấp gồm các mẫu C002, C004, C007. Các mẫu nấm sau khi được thu nhận sau những chuyến đi thực địa tại núi Langbiang, Đà Lạt, các mẫu nấm

Cantharellus thu nhận tại vùng nhanh chóng được tiến hành quan sát, mơ tả, chụp

hình và phân tích tại phịng thí nghiệm sử dụng kính hiển vi quang học Rax Vision (Mỹ). Kết quả đình danh hình thái mẫu được mơ tả cụ thể như sau: Với những cố

gắng, dựa vào atlats phân loại định danh nấm Cantharellus (Deepika, K. et al., 2013; Redhead, S. A. et al., 1997) các mẫu nấm được định danh như sau: C002: Cantharellus appalachiensis, C004: Cantharellus minor, C007: Cantharellus cibarius.

Hình 1.6. Bộ mẫu nấm trong nghiên cứu

C002: C. appalachiensisC004: C. minorC007: C. cibarius

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

2.2.2. Dung cụ - thiết bị - hóa chất. Dụng cụ

Các dụng cụ thơng thường trong phịng thí nghiệm sinh học phân tử. Các dụng cụ chính gồm: kẹp lấy mẫu, đèn cồn, eppendorf, pipetteman, đầu típ, ống đong, erlen,…

2.2.3. Thiết bị

Máy vortex (Vortex ZX3, Velp Ý)

Máy ly tâm lạnh (Hettich Universal 320R, Đức) Bộ điện di DNA (BioRad) Tủ lạnh (LG)

Hóa chất cần thiết cho quy trình tách chiết (Lysis Buffer) gồm:

100mM Tris-HCl pH 1M 10mM EDTA 0.5M 2% SDS 10% 0.1M NaCl 0.5M (Đã hấp) 1% β-mercaptoethanol 99.9% 1% CTAB dd H2O (đã hấp) 100µg/ml proteinase K 1mg/ml PCI: Phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1 v/v/v). TE buffer (Tris 1M pH 8.0 và EDTA 0.5M) Ethanol 70%; Isopropanol

Hóa chất cần thiết cho q trình PCR và điện di gồm: Master Mix (2X) line); Primer forward 10 µM; Primer reverse 10 µM; dd H2O (đã hấp); Agarose 1.5g TBE 1X 100 ml; Gel red.

(bio-2.3. Danh mục các phần mềm sử dụng

Danh mục các phần mềm và trang web được sử dụng:

</div>