hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh côn trùng dựa trên phân tích phát sinh chủng loài các gen nrlsu nrssu rpb1

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.08 MB, 90 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

------

BÁO CÁO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

HỖ TRỢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU NẤM KÝ SINH CƠN TRÙNG DỰA TRÊN

PHÂN TÍCH PHÁT SINH CHỦNG LOÀI CÁC GEN

nrLSU, nrSSU, Rpb1

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy, ThS. Trương Kim Phượng cùng các quý thầy cô trong nhà trường đã luôn sẵn sàng giúp đỡ, góp ý và giải đáp những thắc. Bên cạnh đó, tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến tất cả những người bạn đã luôn sát cánh, động viên tơi trong những lúc khó khăn khi thực hiện đề tài này.

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, những người đã luôn yêu thương, chia sẻ và gắn bó với con trong mọi nẻo đường.

Chúc quý thầy cô dồi dào sức khỏe và gặt hái nhiều thành công trong cuộc sống!

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 : Thơng tin về trình tự và các thông số vật lý đánh giá cặp mồi khuếch đại

gen nrLSU, nrSSU, Rpb1. ... 32

Bảng 3.2: Kết quả kiểm tra DNA bằng mật độ quang phổ kế các mẫu nấm tách chiết có bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB ... 44 Bảng 3.3: Hiệu chỉnh các nucleotide tại các vị trí (i) đến (vi) ... 47 Bảng 3.4: Tổng hợp kết quả hiệu chỉnh trình tự các mẫu nấm ký sinh côn trùng .... 50 Bảng 3.5: Kết quả chiều dài các trình tự trước và sau hiệu chỉnh ... 50 Bảng 3.6: Kết quả đồng bộ khối dữ liệu dựng cây phát sinh loài đơn và đa gen ... 52 Bảng 3.7. Kết quả dị tìm mơ hình tiến hóa của các gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 và đa gen ... 52 Bảng 3.8: Tổng hợp kết quả định danh các mẫu nấm từ dữ liệu phân tử đơn gen ... 61

Bảng 3.9: : Tổng hợp kết quả định danh các mẫu nấm từ dữ liệu phân tử đa gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 ... 61

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cordyceps sinensis (4.550 m ở Tây Tạng, Trung Quốc) [16] ... 1

Hình 1.4: Vị trí cặp mồi khuếch đại vùng gen nrSSU [43]. ... 16

Hình 1.5: Cấu trúc vùng gen Rpb1 ... 17

(Các vùng màu đen đại diện cho vùng bảo tồn cao) ... 17

Hình 2.1: Hình thái giải phẫu mẫu DL0038A ... 19

Hình 2.2: Hình thái giải phẫu mẫu DL0038B ... 19

Hình 2.3: Hình thái giải phẫu mẫu DL0067 ... 20

Hình 2.4: Hình thái giải phẫu mẫu DL0069 ... 20

Hình 2.5: Hình thái giải phẫu mẫu DL0075 ... 21

Bảng 2.1: Thông tin về trình tự của các cặp mồi sử dung trong thực nghiệm ... 27

Hình 2.6: Chu trình nhiệt PCR ... 29

Hình 3.1: Kết quả kiểm tra cặp mồi LR0R/LR5 bằng BLAST (NCBI) ... 35

Hình 3.2: Kết quả sắp gióng cột của mồi xi LR0R với trình tự gen nrLSU ... 36

Hình 3.3: Kết quả sắp gióng cột của mồi ngược LR5 với trình tự gen nrLSU ... 36

Hình 3.4: Kết quả Annhyb cặp mồi LR0R/LR5 trên trình tự gen nrLSU... 37

Hình 3.5: Kết quả kiểm tra cặp mồi NS1/NS4 bằng BLAST (NCBI) ... 38

Hình 3.6: Kết quả sắp gióng cột của mồi xi NS1 với trình tự gen nrSSU ... 39

Hình 3.7: Kết quả sắp gióng cột của mồi ngược NS4 với trình tự gen nrSSU ... 39

Hình 3.8: Kết quả Annhyb cặp mồi NS1/NS4 trên trình tự gen nrSSU ... 40

Hình 3.9: Kết quả kiểm tra cặp mồi CRpb1/Rpb1Cr bằng BLAST (NCBI) ... 41

(Y tương ứng C/T, D tương ứng A/G/T, W tương ứng A/T, R tương ứng A/G, N tương ứng A/T/G/C) ... 41

Hình 3.10: Kết quả sắp gióng cột của mồi xi CRpb1 với trình tự gen Rpb1 ... 42

Hình 3.11: Kết quả sắp gióng cột của mồi ngược Rpb1Cr với trình tự gen Rpb1 .... 42

Hình 3.12: Kết quả Annhyb cặp mồi CRpb1/Rpb1Cr trên trình tự gen Rpb1 ... 43

Hình 3.13: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen nrLSU, nrSSU tách chiết theo phương pháp phenol: chloroform bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB ... 45

Hình 3.14: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen Rpb1 tách chiết theo phương pháp phenol: chloroform bổ sung β-mercaptoethanol và CTAB ... 45

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

Hình 3.15: Hiệu chỉnh tín hiệu nhiễu ở đầu mạch xi của nrLSU ... 46

Hình 3.16: Vị trí sai lệch của hai kết quả giải trình tự ở đầu mạch xi của nrLSU 47 Hình 3.17: Hiệu chỉnh ở vùng giữa trên 2 mạch của gen nrLSU... 48

Hình 3.18: Hiệu chỉnh vùng 3, vùng 4 trên mạch xuôi nrLSU ... 48

Hình 3.19: Hiệu chỉnh vùng cuối mạch xi nrLSU... 49

Hình 3.20: Hiệu chỉnh vùng 3’ trên mạch xi của nrLSU ... 49

Hình 3.21: Hình kết quả BLAST trình tự gen nrLSU mạch xi đã hiệu chỉnh ... 49

Hình 3.22: Cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum likelihoood dựa trên gen nrLSU (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây NJ/MP/ML với giá trị bootstrap của 1000 lần lặp lại) ... 53

Hình 3.23: Cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum likelihoood dựa trên gen nrSSU (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây NJ/MP/ML với giá trị bootstrap của 1000 lần lặp lại ) ... 54

Hình 3.24: Cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum likelihoood dựa trên gen Rpb1 (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây NJ/MP/ML với giá trị bootstrap của 1000 lần lặp lại ) ... 55

Hình 3.25: Cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum likelihoood dựa trên các gen nrLSU, nrSSU và Rpb1 (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây NJ/MP/ML với giá trị bootstrap của 1000 lần lặp lại) ... 56

Hình 3.26: Một phần của cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum likelihoood dựa trên các gen nrLSU, nrSSU và Rpb1 (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây NJ/MP/ML với giá trị bootstrap của 1000 lần lặp lại) ... 58

Hình 3.27: Một phần của cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum likelihoood dựa trên các gen nrLSU, nrSSU và Rpb1 (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây NJ/MP/ML với giá trị bootstrap của 1000 lần lặp lại) ... 58

Hình 3.28: Một phần của cây phả hệ phân tử được xây dựng bằng phương pháp Maximum likelihoood dựa trên các gen nrLSU, nrSSU và Rpb1 (Các con số hiển thị trên lần lượt của các cây NJ/MP/ML với giá trị bootstrap của 1000 lần lặp lại) ... 59

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AICc Akaike Information Content BIC Bayesian Information Content BLAST Basic Local Agliment Search Tool

CTAB Cetyltrimethyl Ammonium Bromide EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

GTR General time reverible model ITS Internal Transcribed Spacer

rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic Acid

TEF-1α The Elongation Factor 1 alpha

UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

PHẦN 1. TỔNG QUAN VỀ CHI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG .... 1

1.1. Tổng quan chi nấm Cordyceps ... 1

1.1.1. Sơ lược về nấm Cordyceps ... 1

1.1.2. Ứng dụng ... 2

1.1.3. Phân loại học ... 4

1.1.4. Tình hình nghiên cứu chi nấm Cordyceps ở Việt Nam ... 7

1.2. Các phương pháp sinh học phân tử ... 9

1.2.1. Kỹ thuật PCR ... 9

1.2.2. Điện di... 9

1.2.3. Giải trình tự ... 10

1.3. Nghiên cứu phát sinh chủng loài ... 10

1.3.1. Phả hệ phân tử trong nghiên cứu phát sinh chủng loài ... 10

1.3.2. Những bước cơ bản trong nghiên cứu phát sinh chủng loài ... 11

1.4. Các gen sử dụng trong nghiên cứu phát sinh chủng loài của chi nấm Cordyceps ... 14

1.4.1. Gen nrLSU (nuclear ribosomal large subunit) ... 14

1.4.2. Gen nrSSU (nuclear ribosomal small subunit) ... 16

1.4.3. Gen Rpb1 (largest subunit of RNA polymerase II) ... 16

PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 18

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ... 18

2.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ... 18

2.2.1. Bộ mẫu sử dụng trong thực nghiệm ... 18

2.2.2. Dụng cụ - Thiết bị - Hóa chất ... 21

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

2.2.2. Danh mục các phần mềm và cộng cụ trực tuyến ... 23

2.2.3. Tiến trình nghiên cứu ... 24

2.2.4. Khảo sát in silico ... 25

2.2.5. Tiến hành thực nghiệm ... 26

PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ... 32

3.1. Khảo sát in silico các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR ... 32

3.1.1. Đánh giá mồi trên IDT ... 32

3.1.2. Kết quả kiểm tra mồi bằng BLAST, ClustalX2 và Annhyb của các cặp mồi LR0R/LR5, NS1/NS4, CRpb1/Rpb1Cr ... 34

3.2. Kết quả thực nghiệm ... 44

3.2.1. Xây dựng và kế thừa quy trình thực nghiệm khuếch đại gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 cho các mẫu nấm ký sinh côn trùng ... 44

3.2.2. Kết quả hiệu chỉnh trình tự ... 46

3.3. Kết quả định danh phân tử ... 51

3.3.1. Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu DNA ... 51

3.3.2. Xây dựng cây phát sinh loài phân tử ... 51

3.4. Kết quả định danh hình thái kết hợp sinh học phân tử ... 64

PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ... 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 67

PHỤ LỤC ... 72

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cordyceps là một chi nấm ký sinh côn trùng, thuộc họ Clavicipitaceae, bộ

Hypocreales, lớp Pyrenomycetes, ngành nấm túi Ascomycota. Chi nấm này có

thành phần loài rất đa dạng, ước tính khoảng 400 loài khác nhau như Cordyceps sinensis, Cordyceps takaomontana, Cordyceps neovolkiana,…phân bố ở nhiều quốc

gia Châu Á, bao gồm Việt Nam. Tuy nhiên, sự hiểu biết về thành phần lồi của chi nấm này cịn rất hạn chế bởi nhiều nguyên nhân khác nhau, đặc biệt phải kể đến là

những khó khăn gặp phải trong công tác phân loại, định danh.

Vào năm 1982, Kobayasi đã tiến hành định danh nấm ký sinh côn trùng dựa vào vật chủ ký sinh của chúng nhờ mối quan hệ mật thiết giữa nấm này với vật chủ mà chúng chọn để ký sinh. Bên cạnh đó, Lê Tấn Hưng và cộng sự (2010) cũng định danh nấm ký sinh côn trùng chủ yếu dựa trên phân tích đặc điểm hình thái (morphology): màu sắc, quả thể, sinh sản, bào tử. Nấm ký sinh có cấu trúc cơ thể khá đơn giản nhưng lại có thành phần lồi rất phong phú và đặc biệt hình dạng của chúng có khả năng bị biến đổi theo điều kiện môi trường. Chúng tồn tại ở hai thể: vơ tính (anamorph) và hữu tính (teleomorph).. Vì vậy, định danh dựa trên phân tích hình thái cịn gặp nhiều khó khăn và hạn chế.

Theo nghiên cứu của Sung et al. (2007), đã sắp xếp lại hệ thống nhóm nấm Cordyceps cũng như họ Clavicipitaceae dựa trên việc phân tích các dữ liệu từ 5 – 7 gen thuộc nhóm gen giữ nhà (house-keeping gene) bao gồm : nrSSU (nuclear ribosomal small subunit - tiểu đơn vị nhỏ ribosome), nrLSU (nuclear ribosomal large subunit - tiểu đơn vị lớn ribosome), Tef-1 (elongation factor 1α - nhân tố kéo dài 1α), Rpb1 (largest subunit of RNA polymerase II - tiểu đơn vị lớn nhất của RNApolymerase II), Rpb2 (second largest subunit of RNA polymerase II - tiểu đơn vị lớn thứ hai của RNA polymerase II), Tub (β tubulin) và Atp6 (mitochondrial

ATP6) của 162 taxon. Kết quả nghiên cứu này rất phù hợp với các phân tích bằng hình thái giải phẫu. Qua cơng trình này, các tác giả đã khẳng định các lồi thuộc nhóm nấm này nên được chia thành 3 họ là họ Clavicipitaceae với các chi

Metacordyceps, Hypocrella, Regiocrella và Torrubiella; họ Cordycipitaceae với chi

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

Cordyceps; họ Ophiocordycipitaceae với 2 chi Ophiocordyceps và Elaphocordyceps.

Bên cạnh đó, Tang et. al. (2007) đã sử dụng vùng gen nrSSU, nrLSU, Rpb2, Tub

(β tubulin) để tiến hành xây dựng cây phát sinh loài đơn gen và đa gen với mục đích phân loại các chi trong họ Sordariomycetes (một lớp nấm thuộc ngành nấm túi Ascomycota). Nhóm tác giả đã tiến hành dựng cây đơn gen đối với 4 vùng gen trên

và nối gen nrLSU+nrSSU và nrLSU+nrSSU+Rpb2…và nhận thấy một vài điểm như sau: (1) cây phát sinh loài của gen nrSSU thể hiện mức độ tin cậy cao hơn, mối

quan hệ giữa các chi được thể hiện rỏ ràng hơn so với cây phát sinh loài của gen

nrLSU và Rpb2; (2) cây phát sinh loài dựa vào gen nrSSU là cây đáng tin cậy và có ý nghĩa về mặt thống kê, tuy nhiên khi kết hợp cả gen nrSSU với nrLSU hoặc nrLSU+Rpb2 thì các nhánh trong cây có mức ý nghĩa của cây khá cao (dựa vào Bayesian và giá trị bootstrap), gen Tub kết hợp với gen nrLSU và Rpb2 cũng cho

kết quả khá khả quan; (3) khi kết hợp các vùng gen thì làm gia tăng số lượng các nucleotide kết hợp trong dữ liệu cục bộ, một hướng giải quyết cho cây phát sinh lồi.

Từ những thơng tin thu nhận được cho thấy việc phân tích dữ liệu gen nhóm gen giữ nhà kết hợp tin sinh học là cần thiết nhằm hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh cơn trùng. Vì vậy, chuyên đề khóa luận tốt nghiệp được thực hiện với tên đề

tài: “Hỗ trợ định danh các mẫu nấm ký sinh cơn trùng dựa trên phân tích phát

sinh chủng loài các gen nrLSU, nrSSU, Rpb1”.

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

PHẦN 1. TỔNG QUAN VỀ CHI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG

1.1. Tổng quan chi nấm Cordyceps

1.1.1. Sơ lược về nấm Cordyceps

Cordyceps là chi nấm ký sinh côn trùng, thuộc họ Clavicipitaceae, bộ

Hypocreales, lớp Pyrenomycetes, ngành nấm túi (Ascomycota) [28][45]. Tên

Cordyceps bắt nguồn từ tiếng Latinh bao gồm hai thành phần là “cord” và “ceps”

nghĩa là “chùy, dùi” và “đầu”, chúng kết hợp với nhau nhằm mô tả một tập hợp nấm có chất nền và quả thể phát triển từ xác cơn trùng (Hình 1.1)[19].

Cordyceps có thành phần lồi rất đa dạng. Uớc tính khoảng 400 loài khác nhau như Cordyceps sinensis, Cordyceps takaomontana, Cordyceps neovolkiana,…phân bố ở nhiều quốc gia Châu Á, bao gồm Việt Nam [12]. Chúng chủ yếu ký sinh trên

côn trùng ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Ngồi ra, chi nấm này cịn bao gồm

một số lồi ký sinh trên nấm Elaphomyces. Trong đó, lồi được biết đến nhiều nhất là Cordyceps sinensis. Cordyceps sinensis ký sinh trên các ấu trùng của các lồi bướm đêm thuộc chi Thitadores được gọi là “Đơng trùng hạ thảo”. Đây là một loại

dược liệu quý hiếm sử dụng trong y học cổ truyền một số quốc gia Đông Á, chẳng

hạn như Trung Hoa [19]. Cordyceps sinensis có dạng nấm, quả thể mọc trên xác sâu

bướm. Hình dạng quả thể: khơng có nắp, trơng như một lưỡi dao hoặc cành lá, màu nâu sẫm ở chân và màu đen ở đầu. Chúng được tìm thấy ở độ cao từ 4.200m đến 6.400m trên các đồng cỏ của dãy núi cao Himalaya và các dãy núi cao khác của Trung Quốc, Tây Tạng và Nepal [19][23].

Hình 1.1: Ophiocordyceps sinensis (ở Tây Tạng, Trung Quốc) [19]

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

Cordyceps có cấu trúc cơ thể khá đơn giản nhưng lại có thành phần loài rất

phong phú, đặc biệt hình dạng và hình thức sinh sản của chúng có khả năng bị biến đổi theo điều kiện môi trường. Vào mùa đơng, khi điều kiện khí hậu khắc nghiệt (nhiệt độ và độ ẩm thấp) nấm ký sinh dạng hệ sợi, hình thức sinh sản vơ tính (anamorph); vào mùa hè, khi nhiệt độ và độ ẩm cao tạo điều kiện thuận lợi để nấm hình thành quả thể, hình thức sinh sản hữu tính (teleomorph) [21]. Tiêu biểu như

Cordyceps takaomontana có đặc điểm hình thái sinh sản hữu tính (teleomorph), có thể bình và quả thể nhưng khóa phân loại của Sung et. al., (2007) đã đề cập tới thể vơ tính (anamorph) của nấm này lại là Isaria tenuipes [45].

Với khả năng ký sinh trên côn trùng, chi nấm Cordyceps đã và đang được sử

dụng như tác nhân kiểm soát sinh học với hiệu quả cao. Đặc biệt hơn, các hợp chất của một số loài thuộc chi nấm này đã được chứng minh có tiềm năng ứng dụng trong y dược [19].

1.1.2. Ứng dụng

1.1.2.1. Trong nơng nghiệp

Các lồi nấm thuộc chi Cordyceps được ứng dụng phổ biến trong kiểm soát sinh học. Bởi vì Cordyceps mang đặc điểm là nấm ký sinh côn trùng nên chúng trở thành

thiên địch của rất nhiều loại cơn trùng gây hại [47]. Một số lồi điển hình được sử

dụng trong nơng nghiệp gồm: Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và Normurea rileyi. Trong đó, Beauveria bassiana (nấm bạch cương), chúng ký sinh

chủ yếu trên sâu bướm, cơn trùng cánh cứng, có khả năng gây độc nhanh cho ký chủ và an toàn với con người [47].

Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu đã thành công trong việc sử dụng nấm ký sinh cơn trùng phịng chống các loại sâu hại hay dịch bệnh. Tiêu biểu như chế phẩm nấm

Beauveria bassiana phịng trừ sâu róm hại thông và nấm Metarhizium anisopliae

tiêu diệt châu chấu hại ngô, bọ cánh cứng hại dừa,… mang lại hiệu quả kinh tế cao [9].

1.1.2.2. Trong y dược

Các nghiên cứu y học và dược học đã chứng minh các loài nấm ký sinh cơn trùng

có rất nhiều tác dụng như: kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư máu, ung thư

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

phổi và ung thư vú [25][38]. Một trong những loài nấm được biết đến nhiều nhất

chính là Ophiocordyceps sinensis (Đơng trùng hạ thảo). Loài nấm này ký sinh trên các ấu trùng của các loài bướm đêm thuộc chi Thitadores và là một loại dược liệu

quý hiếm sử dụng trong y học cổ truyền một số quốc gia Đông Á. Chúng được tìm thấy ở độ cao từ 4.200m đến 6.400m trên các đồng cỏ của dãy núi cao Himalaya và các dãy núi cao khác của Trung Quốc, Tây Tạng và Nepal [19][23]. Ngoài ra, các loài nấm khác của chi nấm này cũng đã được chứng minh có tiềm năng ứng dụng trong y dược. Điển hình như khả năng gây độc tế bào để chống tế bào ung thư của

Isaria tenuipes [19]. Hơn nữa, các hợp chất chứa trong Cordyceps có tác dụng điều hịa miễn dịch cơ thể và ngăn ngừa bệnh. Polysaccharide là một trong những hợp

chất chính có trong Cordyceps. Một số polysaccharide và các dẫn xuất đường khác

chẳng hạn như axit cordycepic [D-mannitol] được xác định là có hoạt tính dược lý. Các polysaccharide có khả năng diều tiết đường máu, chống ưng thư, chống di căn

và tăng cường hệ miễn dịch [19]. Ngồi ra, Cordyceps cịn có khả năng tăng cường

hệ miễn dịch nhờ việc sản xuất các tế bào lympho, tế bào NK (natural killer cell) và cải thiện các kháng thể [36].

Bên cạnh đó, lượng polysaccharide trong Cordyceps (chiếm khoảng 3 – 8% tổng

khối lượng) có khả năng điều trị bệnh tim và hỗ trợ giải độc gan[24]. Bên cạnh đó,

Cordyceps có vai trò rất quan trọng trong y dược và ẩm thực của người Trung Quốc vì sinh khối của Cordyceps chứa nhiều thành phần dinh dưỡng: các acid amin, các

vitamin (B1, B2, B12, E, K…) [19]. Chúng còn chứa 28 acid béo (bão hịa và khơng bão hịa), các dẫn xuất đường, rất nhiều phức hợp polysaccharide, protein, sterol, nucleoside và các nguyên tố vi lượng (K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al, Si, Ni, Sr, Ti, Cr, Ga, V và Zr) [19].

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

Hình 1.2: Một số nucleoside tiêu biểu trong Cordyceps sinensis [19]

Với độ đa dạng cao về các lồi nấm Cordyceps, Việt Nam có tiềm năng lớn trong

việc khai thác các loài nấm ký sinh côn trùng bản địa và ứng dụng trong y dược. Tuy nhiên, điều kiện tiên quyết khi sử dụng các sinh vật trong y dược chính là việc

xác định chính xác phân loại học của sinh vật đến mức loài [45]. Hiện nay, việc

phân loại các loài nấm thuộc chi Cordyceps vẫn đang được nghiên cứu và làm rõ

thơng qua việc kết hợp thơng tin về hình thái cũng như phân tử. 1.1.3. Phân loại học

1.1.3.1. Theo quan điểm hình thái

Định danh hình thái được xem là tiêu chuẩn vàng để định danh các vi khuẩn, vi nấm,… nói chung và chi nấm ký sinh cơn trùng nói riêng. Hiện nay, việc định danh và xây dựng hệ thống học các loài nấm ký sinh cơn trùng chủ yếu dựa trên phân tích hình thái giải phẫu: màu sắc, quả thể, sinh sản, bào tử,… [28] Hình thái đặc trưng

của Cordyceps gồm: quả thể thuôn dài (chất nền gồm nhiều sợi nấm và sinh sản vơ

tính), có thể túi dạng trụ, đỉnh túi dày, các bào tử túi dạng sợi, quả thể dạng màu nâu hoặc đen, dài từ 4-11 cm, trọng lượng khoảng 0,06 g [1][45]. Sâu khi còn tươi có dạng con tằm, có màu vàng đến vàng nâu, đầu màu đỏ nhạt, dài khoảng 3-5 cm [1]. Năm 1982, Kobayashi dựa trên cơ sở xử lý các thông tin từ việc phân tích 282

lồi trong chi Cordyceps, 59 lồi trong chi Torrubiella và 75 loài thuộc các chi lân

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

cận khác, đã xây đựng nên khóa định danh cho nhóm Cordyceps và Torrubiella

[28]. Khóa phân loại này cho đến nay vẫn dược áp dụng rộng rãi trong việc hỗ trợ

định danh các loài nấm dựa vào phân tích hình thái về chi nấm Cordyceps. Tiêu biểu như Sung et. al., (2007) đã sắp xếp lại hệ thống chi nấm Cordyceps và họ Clavicipitaceae. Theo thống kê của nhóm tác giả thơng qua những đặc điểm hình thái và vật chủ ký sinh, họ Clavicipitaceae gồm các nhóm: Cordyceps, Hypocrella và Torrubiella ký sinh chủ yếu trên động vật chân đốt và các loài nấm khác; Claviceps, Balansia và Epichloe thường gặp ở các loài cỏ cộng sinh; Elaphocordyceps bao gồm tất cả các loài sống ký sinh ở Elaphomyces hay ký sinh trên nhộng ve sầu; Cordyceps s.s thường ký sinh trên lá cây, rêu hoặc các lớp đất

trên cùng [45][46]. Chúng có màu vàng nhạt, quả thể mềm, chất nền dày, sợi nấm

được tổ chức lỏng lẻo, bào tử hình trụ. Đặc biệt, Cordyceps s.s sinh sản chủ yếu bằng ba loại bào tử sau: bào tử tách rời (Cordyceps militaris), bào tử nguyên (Cordyceps cardinalis và Cordyceps pseudomilitaris) và bào tử dạng “Bola” (Cordyceps bifusispora); Metarcordyceps có quả thể màu trắng, màu hoa cà, màu

tím hoặc màu xanh lá cây. Các mẫu nấm khơ lại có màu sẫm hơn hoặc màu đen

(Metarcodyceps taii); Ophiocordyceps được tìm thấy chủ yếu trong đất (Ophiocordyceps sinensis) và trong gỗ mục (Ophiocordyceps variabilis). Hình thái

quả thể đa dạng tùy theo loài, có thể là hình chỉ, dẻo hay hình chùy, có hệ sợi [45][46].

Mặc dù có lịch sử lâu đời, phương pháp định danh dựa trên hình thái có nhiều trở ngại. Thứ nhất, sự đơn giản trong các tiêu chí về hình thái khiến cho việc mơ tả nấm gặp nhiều khó khăn [35].

Thứ hai, sự không nhất quán giữa các đặc điểm hình thái có giá trị phân loại ở mức độ dưới chi và loài của các nhà phân loại học cũng phức tạp hóa quá trình định danh [29][28][33].

Thứ ba, trên thực tế, các mẫu vật được tìm thấy thường ở trạng thái vơ tính.

Trong quá trình phát triển, nấm Cordyceps có thể sinh sản bằng phương pháp

ngun phân (dạng vơ tính – anamorph) và giảm phân (teleomorph). Các mẫu nấm vơ tính này được định danh vào các chi vơ tính khác nhau thuộc họ Clavicipitaceae

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

và tồn tại song song với các chi hữu tính ở Cordyceps [41]. Sự phức tạp trong giai

đoạn sinh trưởng cũng góp phần khiến cho việc định danh dựa trên hình thái trở nên khó khăn. Chính vì vậy, các phương pháp định danh và phân loại loài khác đã và đang được xây dựng để bổ sung cho quá trình định danh bằng hình thái. Tuy nhiên, với trên 200 năm hình thành và phát triển, phương pháp định danh bằng hình thái vẫn là tiêu chuẩn vàng cho quá trình định danh sinh vật [7] [35][39]

1.1.3.2. Theo quan điểm phát sinh chủng loài

Hiện nay, định danh các lồi nấm ký sinh cơn trùng đều dựa trên kỷ thuật phân tích hình thái theo Kobayashi (1982) [28]. Tuy nhiên, việc phân loại chúng một cách chính xác là điều vơ cùng khó khăn. Những phân tích hình thái giải phẫu: màu sắc, quả thể, sinh sản, bào tử,… không thể đưa ra kết luận chính xác về lồi. Bên cạnh đó, nấm ký sinh cơn trùng tuy có cấu trúc đơn giản nhưng có thành phần lồi vơ cùng phong phú. Hình dạng và hình thức sinh sản của chúng có khả năng bị biến đổi theo điều kiện môi trường. Đặc biệt, chúng tồn tại ở hai thể: vơ tính (anamorph)

và hữu tính (teleomorph) điển hình như Tolypocladium inflatum là một thể vơ tính của Cordyceps sinensis [43][45]. Ngày nay, các nhà nghiên cứu ngoài việc sử dụng

kỹ thuật định danh truyền thống phần lớn đều ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào công tác định danh.

Trong đó, các gen giữ nhà “house-keeping gene” vẫn được sử dụng như các trình

tự gen đích trong việc phân tích phả hệ. Các gen này có đặc điểm là ln hiện diện hầu hết ở tất cả các tế bào, chúng thường xuyên biểu hiện ở mức độ cao và có độ bảo tồn cao. Một số gen giữ nhà được sử dụng trong phân tích định danh phân tử

điển hình như β-tubulin (Fraaije et. al., 2001; Mostert et. al., 2006), ITS và Rpb2 (Zhong Z. & Pfister D. H., 2004) [48]. Đặc biệt , Sung et. al., (2007) đã tiến hành sắp xếp lại hệ thống chi nấm Cordyceps và Clavicipitaceae dựa trên cơ sở phân tích mối quan hệ phát sinh loài (162 taxa) nhờ nhóm các gen (nrSSU, nrLSU, tef1, rpb1, rpb2, tub và atp6) kết hợp với phân tích hình thái. Kết quả của nghiên cứu dẫn đến sự tách rời một số loài nấm thuộc chi Cordyceps ra khỏi họ Clavicipitaceae

trước đây vào hai họ mới với các đặc điểm hình thái được miêu tả cụ thể.

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

Theo thống kê của nhóm tác giả, thơng qua những đặc điểm hình thái và vật chủ

ký sinh, họ Clavicipitaceae hiện tại gồm các chi: Metacordyceps, Hypocrella và Torrubiella ký sinh chủ yếu trên động vật chân đốt và các loài nấm khác; Claviceps, Balansia và Epichloe thường gặp ở các loài cỏ cộng sinh. Họ Cordycipitaceae với chi Cordyceps s.s thường ký sinh trên lá cây, rêu hoặc các lớp đất trên cùng. Chúng

có màu vàng nhạt, quả thể mềm, chất nền dày, sợi nấm được tổ chức lỏng lẻo, bào

tử hình trụ. Đặc biệt, Cordyceps s.s sinh sản chủ yếu bằng ba loại bào tử sau: bào tử tách rời (Cordyceps militaris), bào tử nguyên (Cordyceps cardinalis và Cordyceps pseudomilitaris) và bào tử dạng “Bola” (Cordyceps bifusispora). Họ Ophiocordycipitaceae với chi nấm Ophiocordyceps được tìm thấy chủ yếu trong đất (Ophiocordyceps sinensis) và trong gỗ mục (Ophiocordyceps variabilis) và chi nấm Elaphocordyceps bao gồm tất cả các loài sống ký sinh ở Elaphomyces. Hình thái

quả thể đa dạng tùy theo loài, có thể là hình chỉ, dẻo hay hình chùy, có hệ sợi [45][46].

Kết quả nghiên cứu của Sung và cộng sự (2007), một mặt là nền tảng cho việc

phân loại các loài nấm thuộc chi Cordyceps. Mặt khác, nghiên cứu này còn cho thấy

mối liên hệ giữa định danh theo quan điểm hình thái và quan điểm phát sinh chủng loài. Cụ thể, các kết quả của phát sinh chủng loài là cơ sở để đánh giá vai trị của các đặc điểm hình thái có ý nghĩa trong định danh ở mức độ họ, chi và loài.

1.1.4. Tình hình nghiên cứu chi nấm Cordyceps ở Việt Nam

Về dược học, Đái Duy Ban và cộng sự (2009) đã phát hiện, nhân nuôi thành công

loài Isaria cerambycidae và xác định một số hoạt chất sinh học thu nhận được từ

nuôi cấy [1].

Bên cạnh đó, nhóm tác giả Đinh Minh Hiệp và cộng sự (2014) đã nghiên cứu

tiềm năng ứng dụng liên quan đến chi nấm Cordyceps với đề tài “Nghiên cứu nhóm nấm Cordyceps ở Tây Nguyên và khảo sát tiềm năng ứng dụng của chúng trong y

dược” [3].

Về phân loại học, Phạm Quang Thu (2009) đã phát hiện ra hai loài mới cho khu

hệ nấm Việt Nam gồm Cordyceps nutans và Cordyceps gunnii [8]. Vũ Tiến Luyện và cộng sự (2014) đã nghiên cứu vùng gen nrLSU nhằm hỗ trợ định danh các mẫu

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

nấm Cordyceps thu nhận tai Langbiang – Đà Lạt [12]. Cùng lúc đó, Đinh Minh Hiệp và cộng sự (2014) đã định danh một số lồi nấm ký sinh cơn trùng bằng việc

phân tích phả hệ phân tử vùng ITS1-5.8S-ITS2 dựa vào kết quả phát sinh chủng loài

và cấu trúc bậc hai [2]. Gần đây nhất, Vũ Tiến Luyện và cộng sự (2015) đã thành

công trong việc định danh Cordyceps takaomontana từ hai mẫu nấm DL0038A,

DL0038B thu được từ núi Langbiang – Đà Lạt trên cơ sở định danh hình thái và

phân tích phát sinh lồi của gen nrLSU và Rpb1 [51]. Những cơng bố về thành phần

lồi của Đơng Trùng Hạ Thảo cũng được công bố vào những năm 1996 và 2001 có

ba lồi nấm thuộc chi Cordyceps đó là Cordyceps sinensis, Cordycep militaris và

Cordyceps sabrolifera (Trịnh Tam Kiệt, 2001) [11].

Năm 2010, Lê Tấn Hưng và cộng sự đã thu thập được 259 mẫu nấm ký sinh côn trùng. Chúng phân bố chủ yếu trên lá của những cây bụi và ký sinh trên các ký chủ thuộc tám bộ côn trùng khác nhau tại vườn quốc gia Cát Tiên [6]. Thông qua định danh sơ bộ về hình thái, nhóm thu nhận được 17 chi nấm côn trùng bao gồm:

Akanthomyces, Aschersonia, Conoideocrella, Cordyceps, Gibelluta, Hirsutella, Hymenostilbe, Hypocrella, Isaria, Metarhizium, Moelleriella, Nomuraea, Ophiocordyceps, Paecilomyces, Torrubiella và Verticilium. Tất cả các chi ghi nhận đều thuộc bộ Hypocreales, ngành Ascomycota. Nhóm nghiên cứu cũng đã thành công trong việc phát hiện lồi nấm ký sinh cơn trùng Cordyceps neovolkiana (mẫu

DL004) tại núi Langbiang-Đà Lạt thông qua định danh hình thái học kết hợp phân

tích phát sinh lồi dựa trên vùng trình tự ITS rDNA. Ngồi ra, Lê Thị Anh Đào và cộng sự (2010) đã công bố bài báo về chi nấm Cordyceps tại Việt Nam. Nhóm nghiên cứu đã phân lập và định danh được lồi nấm ký sinh cơn trùng Cordyceps pseudomilitaris tại núi Langbiang – Đà Lạt. Tại viện công nghệ sinh học (2011),

trường đại học Cần thơ đã phân lập và định danh được một số chủng nấm ký sinh

côn trùng thuộc loài Metarhizium anisopliae sorokin và Beauveria bassiana vuillemin ở đồng bằng sông Cửu Long bằng phương pháp PCR.

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

1.2. Các phương pháp sinh học phân tử

1.2.1. Kỹ thuật PCR

Năm 1985, phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) được phát minh bởi Kary Mullis [10]. Ơng đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này. PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử, sử dụng những thành phần cơ bản của hệ thống sao chép phức tạp trong tự nhiên để khuếch đại vùng DNA đặc hiệu [10]. Quá trình sao chép DNA với sự tham gia các thành phần: DNA polymerase, DNA mạch khuôn, mồi, dNTP, dung dịch đệm và MgCl2. Phản ứng này được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt (máy PCR) với từng nhiệt độ thích hợp cho mỗi phản ứng [22].

Một phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm các bước: biến tính (DNA mạch đơi được biến tính ở nhiệt độ cao 94oC - 95oC và tách thành hai mạch đơn), bắt cặp mồi (nhiệt độ cần cho sự bắt cặp giữa mồi với mạch khuôn là Ta,Ta < Tm khoảng 5oC, Tm là nhiệt độ nóng chảy của mồi, nhiệt độ bắt cặp phụ thuộc vào trình tự mồi, chiều dài mồi, % GC,…) và kéo dài (ở 72oC DNA polymerase hoạt động nối dài mạch mới) [4]. DNA được khuếch đại theo cấp số nhân: sau n chu kỳ tạo được 2n bản sao từ DNA mạch khuôn.

1.2.2. Điện di

Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường. Sự dịch chuyển này do thành phần lực điện trong lực Lorentz [30].

Điện di (electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là một kỹ thuật để phân

tích các phân tử DNA, RNA hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện (isoelectric point). Kỹ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn diện và tạo điện trường đều, một bản gel (thường là agarose hay polyacrylamide) đóng vai trị là thể nền để phân tách các phân tử và các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide,…) để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di [30].

Kỹ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền (gel). Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử (polymer) được liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

với kích thước các mắc lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân tử (agarose, polyacrylamide) và phản ứng tạo liên kết chéo. Các phân tử được phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sự khác nhau của: (1) lực của điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau), (2) kích thước của phân tử so với kích thước lỗ của gel và (3) hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử [41] Rehner S. A. 2009, “Molecular systematics of entomopathogenic fungi”, Insect pathogens, CABI, p. 145-165.

[42].

1.2.3. Giải trình tự

Thông tin di truyền của mọi cơ thể sinh vật được lưu giữ trong phân tử có tên là DNA. Đây là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn được tạo thành từ bốn loại nucleotide gồm: A (Adenine), T (Thymine), G (Guanine), C (Cystosine) . Các nucleotide này sắp xếp nối tiếp nhau theo một trình tự xác định và trình tự này khơng những đặc trưng ở từng lồi mà cịn khác nhau ở từng các thể trong cùng một loài [22] Giải trình tự gen là phương pháp nhằm phát hiện thứ tự sắp xếp bốn loại nucleotide: A, T, G, C trên phân tử DNA được phát minh bởi Maxam, Gilbert

(1997) và Sanger et al., (1997). Phương pháp giải trình tự gen dựa vào sự thủy giải

đặc trưng phân tử DNA cần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học. Phương pháp này được thực hiện theo trình tự sau: (1) đoạn DNA cần xác định trình tự cần phải đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 32P ở đầu 5’, (2) các nucleotide trong phân tử DNA được đánh dấu sẽ được xử lý hóa chất khác nhau làm biến đổi và cắt phân tử DNA tại những vị trí nucleotide khác nhau, bốn nhóm bị tác động bao gồm: G, A+G, T+C, và C, kết quả sẽ tạo thành những đoạn oligonucleotide có chiều dài khác nhau 1 base, (3) các đoạn này được điện di trên gel polyacrylamide và hiển thị bằng máy phóng xạ tự ghi. Từ kết quả phóng xạ tự ghi của bốn nhóm trên có thể xác định được vị trí của bốn loại nucleotide trong chuỗi DNA [4][22].

1.3. Nghiên cứu phát sinh chủng loài

1.3.1. Phả hệ phân tử trong nghiên cứu phát sinh chủng loài

Phả hệ phân tử nghiên cứu về mối quan hệ tiến hóa của tập hợp các trình tự gen dựa vào sự phân tích sự khác biệt di truyền phân tử (DNA, RNA và protein). Các

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

mối quan hệ di truyền giữa các loài được biểu diễn bằng cây phát sinh loài. Dựng cây phát sinh lồi là một q trình phức tạp, địi hỏi độ chính xác cao vì tập hợp dữ liệu phát sinh lồi có thể bao gồm hàng trăm lồi khác nhau (một trong số đó có thể đã thay đổi tỷ lệ đột biến). Do đó, xây dựng cây phát sinh loài được ứng dụng rộng rãi như là một công cụ cần thiết dựa trên công cụ tin sinh học để giải quyết các vấn đề khó khăn trong q trình xác định mối quan hệ tiến hóa [26].

1.3.2. Những bước cơ bản trong nghiên cứu phát sinh chủng loài

Bước 1: Sắp gióng cột (xây dựng bộ dữ liệu cục bộ và xử lý bộ dữ liệu của phả

hệ phân tử).

Bước 2: Lựa chọn mơ hình tiến hóa tối thích. Bước 3: Xây dựng cây phát sinh loài.

Bước 4: Đánh giá cây phát sinh loài.

1.3.2.1. Xây dựng cơ sở dữ liệu

Thu nhận dữ liệu từ phương pháp giải trình tự Thu nhận dữ liệu từ ngân hàng cơ sở dữ liệu NCBI

1.3.2.2. Sắp gióng cột (xây dựng bộ dữ liệu cục bộ và xử lý bộ dữ liệu của phả hệ phân tử)

Bước sắp gióng cột là một trong những bước quan trọng nhất trong phân tích phát sinh chủng lồi vì nó tạo ra bộ dữ liệu để sử dụng cho bước tiếp theo là lựa chơn mơ hình tiến hóa tối thích. Bộ dữ liệu để xây dựng cây phát sinh lồi gồm có DNA, RNA, protein. Bước đầu tiên trong sắp gióng cột bao gồm sự chọn lựa phương pháp và khai thác dữ liệu liên quan để tiến hành sắp gióng cột. Phương pháp này sẽ phân tích vùng trình tự khơng rõ ràng và kiểm tra việc chèn hoặc xóa gap (indels) để tiến hành xử lý trong chương trình dựng cây phát sinh loài. Một phần mềm hỗ trợ đắc lực cho q trình sắp gióng cột là ClustalX2, trình tự dữ liệu sau khi được sắp gióng cột bằng ClustalX2 sẽ được đưa vào chương trình xây dựng cây để tiến hành dựng cây phát sinh loài [14].

Trong bước sắp xếp thẳng hàng chiều dài của trình tự sẽ khơng đồng nhất và bộ dữ liệu phát sinh lồi thường khơng giống nhau. Nguyên nhân dẫn đến sự không đồng nhất về chiều dài là xuất hiện các vùng indels. Cách giải quyết các vùng indels

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

là tiến hành đồng bộ hóa chiều dài trình tự bằng cách loại bỏ phân tích tất cả các

vùng chứa “gap” (Swofford et. al., 1996). Phương pháp này giúp lựa chon mơ hình

tiến hóa phù hợp nhất nhưng lại làm cho vùng biến động bị mất đi ảnh hưởng đến sự phân nhóm trong cây phát sinh lồi [14].

Vậy nên, khi sắp gióng cột cho một phân tích phát sinh loài cần quan tâm đến một số điểm sau: (1) Bước sắp gióng cột trong phân tích phát sinh lồi là một trong những bước quan trọng nhất bởi vì nó sẽ xậy dựng được bộ dữ liệu để đưa vào mơ hình tiến hóa một cách phù hợp nhất, (2) sắp gióng cột rất dễ dàng để chỉnh sửa, xóa một vùng khơng phù hợp và chèn hoặc xóa khoảng trống để phản ánh chính xác hơn có thể xảy của q trình tiến hóa dẫn đến sự khác nhau giữa các chuỗi trình tự, (3) việc tiến hành sắp gióng cột rất hữu ích để thực hiện các phân tích dựa trên một loạt sự sai khác của các nucleotide, giúp xác định các vùng bảo tồn ảnh hưởng đến kết quả và những khía cạnh khác của kết quả [14].

1.3.2.3. Lựa chọn mơ hình tiến hóa tối thích

Việc lựa chọn mơ hình tiến hóa cũng quan trong khơng kém q trình sắp gióng cột và xây dựng cây phát sinh lồi. Mơ hình tiến hóa được lựa chọn phụ thuộc vào kết quả của sắp gióng cột. Theo sự phát triển của cơng nghệ và khoa học thì có hai mơ hình tiến hóa được tính tốn và đánh giá dựa trên các thuật toán khác nhau để xây dựng cây phát sinh lồi cho dữ liệu trình tự. Một mơ hình dựa vào sự thay thế giữa các trình tự trong các chuổi trình tự, cịn lại là dựa vào tỷ lệ xác xuất, tần suất của sự thay thế giữa các nucleotide trong các vùng trình tự khác nhau trong bộ dữ liệu [14].

Một vài mơ hình tiến hóa ngẫu nhiên phổ biến gồm phương pháp: Jukes-Cantor, Kimura, Hasegawwa-Kishino-Yano (HKY), Tamura-Nei, General Time Reversible (GTR),… Trong đó, mơ hình tiến hóa phức tạp nhất là mơ hình có khả năng hồi biến tổng qt theo thời gian (General Time Reversible model). Mơ hình này thường tạo thành dang ghép GTR+G+I kết hợp với các thong số như tỉ lệ thông số ma trận, tần suất base và phân bố Gamma [14].

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

1.3.2.4. Xây dựng cây phát sinh loài

Phương pháp xây dựng cây được tiến hành bằng phần mềm có sẵn được trình bày

chi tiết trong tài liệu của Saitou, 1996; Swofford. et. al., 1996;. Li, 1997 và được mô

tả trên Internet. Phương pháp xây dựng cây phát sinh loài được thực hiện dựa trên phương pháp khoảng cách và phương pháp đặc tính. Phần lớn các cuộc thảo luận về cây phát sinh loài phân tử đều đề cập đến tính hữu ích của phương pháp khoảng cách (distance-based method) và phương pháp đặc tính (character-based methods) của các trình tự (Saitou, 1996; Li, 1997). Phương pháp khoảng cách là q trình tính tốn khoảng cách liên kết giữa giữa từng cặp base (ví dụ: liên kết giữa nu T và nu A, G-C hoặc ngược lại) theo một tiêu chuẩn tối thích và sử dụng kết quả khoảng cách trên để xây dựng cây phát sinh lồi. Phương pháp đặc tính sẽ xây dựng một cây cơ bản sau đó cây này được đưa vào các mơ hình có các thơng số tiến hóa để dị tìm ra cây tối ưu dựa vào số liệu thực tế của các trình tự. Khoảng cách giữa từng cặp base, các tiêu chuẩn tối thích để xây dựng cây được xác định bởi địa hình học của cây (topology). Phương pháp khoảng cách áp dụng với phương pháp Neighbor-Joining và phương pháp đặc tính áp dụng cho phương pháp Maximum pasinomy và maximum likelihood [14].

Neighbor-Joining (NJ) là thuật toán thuật toán được áp dụng phổ biến cho việc xây dựng cây khoảng cách tiến hóa, khơng phụ thuộc vào bất kể các tiêu chí tối ưu hóa nào. Khi xây dựng cây tiến hóa trước tiên các trình tự được xây dựng theo mơ hình phân rã hình ngơi sao. Hai trình tự có mức độ tương đồng cao nhất được phân nhóm với nhau và được xem là một nhánh. Một trình tự khác được so sánh với nhánh vừa thiết lập trên để tìm ra khoảng cách tiến hóa, bước này được thực hiện lặp lại cho đến khi còn duy nhất một trình tự cuối được phân chia nhánh. Phương pháp NJ là tương đối nhanh chóng [14].

Maximum Parsimony (MP) là phương pháp hà tiện tối đa với tiêu chuẩn tối ưu hóa tuân theo các nguyên tắc tốt nhất của dữ liệu để xây dựng cây một cách đơn giản nhất. Nguyên lý của phương pháp này là tìm kiếm một cây sao cho số lượng thay đổi tiến hóa là thấp nhất nhằm giải thích những sự khác nhau được nhìn thấy qua các

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

đơn vi phân loại hiện hữu (OTUs). Cây MP là cây ngắn nhất với những thay thế ít nhất hay ít đột biến nhất [14].

Maximum Likelihood (ML) là phương pháp khả năng tối đa, sẽ phân tích tất cả các vấn đề phát sinh loài trong bộ dữ liệu. ML sẽ tìm kiếm các mơ hình tiến hóa để tìm ra khả năng tối đa nào cao nhất phù hợp với bộ dữ liệu quan sát. Cây phát sinh loài sử dụng phương pháp ML cần sử dụng một lượng lớn thời gian để tính tốn và khơng thể đồng thời vừa tìm kiếm mơ hình tiến hóa phù hợp vừa tối ưu hóa các mơ hình thay thể để phù hợp với bộ dữ liệu cho trước. Mơ hình ML có thể thực hiện bằng phần mềm PAUP để tiết kiệm thời gian tính tốn và có thể lặp đi lặp lại để tìm kiếm một cây ML tối ưu nhất. Vì vậy, đây là phương pháp tiêu tốn nhiều thời gian nhưng lại cho kết quả đáng tin cậy nhất [14].

1.3.2.5. Đánh giá cây phát sinh loài

Sau khi xây dựng thành cơng của cây phát sinh lồi, bước tiếp theo là việc đánh giá các địa hình học (topology) của cây. Để đánh giá mức ý nghĩa cho quá trình phân nhánh của cây có thể thực hiện phương pháp đánh giá giá trị bootstrap. Efron là người đã đề cập đến giá trị bootstrap trong quá trình xây dựng cây phát sinh loài vào năm 1979. Felsenstein (1985) đã khẳng định giá trị bootstrap là một phương pháp để đánh giá cây phát sinh lồi cần phân tích. Phương pháp này thường dùng để kiểm tra độ tin cậy của cây cụ thể là đánh giá độ tin cậy của sự phân nhóm lồi trên một cây dựa vào số lượng, chiều dài của trình tự nucleotide/acid amin. Với giá trị bootstrap lớn hơn 70% tương ứng với giá trị xác xuất lớn hơn 95% thì giá trị phân nhóm được ủng hộ mạnh mẽ. Tương tự, giá trị bootstrap lớn hơn 50% thì sự phân nhánh của trình tự trong bộ dữ liệu được ủng hộ đánh giá cao cho việc phân nhóm đó (Hillis và Bull, 1993) [14].

1.4. Các gen sử dụng trong nghiên cứu phát sinh chủng loài của chi nấm

Cordyceps

1.4.1. Gen nrLSU (nuclear ribosomal large subunit)

Gen mã hóa RNA của ribosome (nrSSU, nrLSU) chứa nhiều thơng tin di truyền

có tính bảo tồn cao, được biết rộng rãi trên thế giới và có khả năng thiết kế được các cặp mồi phổ quát giúp khuếch đại và giải trình tự các trình tự của nhiều lồi nấm

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

[44]. Trong đó, vùng 18S-28S là vùng phiên mã chính (Vilgalys et. al., 2004); vùng

18S hình thành tiểu đơn vị nhỏ (SSU); vùng 28S, 5,8S và 5S hình thành tiểu đơn vị lớn (LSU) của rRNA [44]. Vùng 5,8S rRNA có cấu trúc, chức năng liên quan chặt chẽ với tiểu đơn vị lớn của rRNA và có nguồn gốc từ một phần của vùng 23S ở sinh vật nhân sơ. Vùng 5S rDNA thường khơng có vị trí cố định, chỉ có ở nhân của một

số loài nấm (Guarro et. al., 1999).

nrLSU-rRNA là gen mã hóa RNA 25S-28S của ribosome (tiểu phần lớn của

ribosom). Các trình tự mã hóa cho rRNA có tính bảo tồn cao do đó phù hợp cho các

nghiên cứu ở cấp họ hay xa hơn. Cấu trúc của nrLSU-rRNA ngoài những vùng bảo

tồn cịn có những vùng biến động gọi là domain D1/D2/D3 (D-divergence region, các số được đánh thứ tự 1, 2, 3... bắt đầu từ đầu 5’-3’) [44]. Các domain khác nhau của 25-28S rDNA (tiểu phần lớn LSU) chứa nhiều thông tin cho phép so sánh các

cấp phân loại từ cao xuống đến cấp độ loài (Gueho et. al., 1993). Đặc biệt, vùng

DNA D1/D2 mã hóa cho tiểu phần lớn của ribosome gần đây được xem là rất hữu ích cho việc phân loại phần lớn các lồi nấm có giá trị y dược (Kurtzman &

Robnett, 1997; Fell. et. al., 2000). Cặp mồi LR0R/LR5 là cặp mồi phổ quát được

biết đến nhiều nhất và cũng được sử dụng trong nhiều nghiên cứu phả hệ phân tử nấm trong những năm gần đây (Vilgalys & Hester, 1990). Cặp mồi này được thiết kế để khuếch đại vùng D1-D2 và cho kết quả khuếch đại khoảng 800-1300bp.

(Sonnenberg et. al., 2007). Ngoài ra, một số cơng trình đã ứng dụng thành công

trong nghiên cứu định danh ở loài nấm ký sinh côn trùng hay các loài nấm khác

điển hình: sử dụng vùng D1/D2 của tiểu đơn vị lớn nrLSU (28S) ở vùng rDNA trong phân loại cấp độ lồi của Orpinomyces spp.,…

Hình 1.3: Vị trí cặp mồi khuếch đại vùng gen nrLSU [44].

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

1.4.2. Gen nrSSU (nuclear ribosomal small subunit)

nrSSU-rRNA là vùng gen mã hóa 18S rRNA (đơn vị hình thành tiểu phần nhỏ của ribosome), nrSSU tiến hóa tương đối chậm, thường được sử dụng trong nghiên cứu các sinh vật có ít quan hệ về mặt di truyền (Guarro et. al., 1999). Gen nrSSU có

tính bảo tồn cao do đó nó phù hợp cho các nghiên cứu ở cấp họ và xa hơn, được

dùng trong việc khảo sát mối quan hệ tiến hóa giữa các lồi [20]. Vùng nrSSU có

thể được đọc trình tự bằng một cặp mồi phổ quát (universal primer). Các cặp mồi này được thiết kế dựa trên các trình tự nucleotide bảo tồn của gen 18S rRNA

(White. et. al.,1990). Cặp mồi NS1/NS4 được sử dụng trong nghiên cứu này bởi

tính phổ quát giúp khuếch đại và giải trình tự được nhiều mẫu nấm ký sinh côn trùng. Đây là cặp mồi đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu phả hệ phân tử trong

những năm gần đây (White. et. al., 1990). Điển hình như Bruns et. al., (1991) đã phân tích gen nrSSU để chia giới nấm thành 4 lớp Acrasiomycota, Myxomycota, Oomycota, và fungi. Ngoài ra, nghiên cứu của Spatafora et. al., 2007 và Sung et. al, 2007 đã sử dụng các dữ liệu, gen House keeping gene trong trong đó có nrSSU để

xây dựng cây phát sinh loài nhằm định danh các chi, loài nấm ký sinh cơn trùng [17].

Hình 1.4: Vị trí cặp mồi khuếch đại vùng gen nrSSU [15].

1.4.3. Gen Rpb1 (largest subunit of RNA polymerase II)

Gen Rpb1 mã hóa cho tiểu phần lớn tứ nhất cho enzym RNA polymerase II.

Enzym này có vai trị xúc tác q trình phiên mã RNA từ DNA ở Eukaryote. Trong

đó, gen Rbp1 có chứa vùng lập lại heptapeptide hay chính xác hơn là chuỗi amino

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

acid Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro- (Tyrosine-Serine-Proline-Threonine-Serine-Proline-) có tên là CTD, trong đó Ser ở vị trí thứ 5 phosphoryl hóa bởi hoạt động kinase của TFII, kích hoạt enzyme RNA polymerase II chuyển dịch qua promotor và phiên mã.

Do cấu trúc lặp lại đặc biệt này đã làm cho gen Rpb1 có độ bảo tồn cao giúp phân biệt giữa các nhóm lồi [20]. Gen Rpb1 có trọng lượng phân tử khoảng 200kDa và

chỉ có một bản sao duy nhất trong tế bào (ngoài trừ một số loài thực vật và các loài

thuộc chi Trypanosoma là có gen tương đồng (paralogous)) [40].

Hình 1.5: Cấu trúc vùng gen Rpb1 [40]

(Các vùng màu đen đại diện cho vùng bảo tồncao)

Năm 1997, Croan et. al., đã sử dụng gen Rpb1 để nghiên cứu mối quan hệ họ hàng giữa các loài nấm Leihmania. Tác giả đã so sánh trình tự gen giữa DNA và RNA polymerase. Gen Rpb1 còn được sử dụng để phân tích phát sinh loài ở mức sâu hơn. Hirt et. al., (1999) đã dùng trình tự gen Rpb1 để chứng minh Microsporidia (sinh vật hoại sinh hoặc ký sinh) có quan hệ với giới nấm. Đặc biệt, Sung et. al., (2007) đã tiến hành sắp xếp lại hệ thống chi nấm Cordyceps và Clavicipitaceae dựa trên cơ sở phân tích mối quan hệ phát sinh loài (162 taxa) nhờ các gen (nrSSU, nrLSU, Tef1, Rpb1, Rpb2, Tub và Atp6) kết hợp phân tích hình thái.

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: 04/03/2016 – 16/05/2016.

Địa điểm: Phịng thí nghiệm sinh học phân tử Trường Đại Học Mở Tp. Hồ Chí Minh, 68 Lê Thị Trung, Phường Phú Lợi, Tp. Thủ Dầu Một, Bình Dương.

2.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Bộ mẫu sử dụng trong thực nghiệm

Các mẫu hệ sợi nấm được phân lập và làm thuần từ các mẫu nấm ký sinh côn trùng thu thập từ những chuyến đi thực địa tại vùng núi Langbian khu vực tỉnh Lâm Đồng do Hội Sinh Học Tp. Hồ Chí Minh cung cấp gồm các mẫu DL0038A, DL0038B, DL0067, DL0069, DL0075.

Các mẫu nấm sau khi được thu nhận sau những chuyến đi thực địa tại núi Langbiang, Đà Lạt, các mẫu nấm ký sinh côn trùng và xác côn trùng được thu nhận tại vùng nhanh chóng được tiến hành quan sát, mơ tả, chụp hình và phân tích tại phịng thí nghiệm sử dụng kính hiển vi quang học Rax Vision (Mỹ). Để phân lập mẫu, một mảnh mô nhỏ ở phần sinh sản của quả thể được tách ra và dán lên nắp của đĩa petri chứa môi trường PGA (Potato Glucose Agar) để thu nhận bào tử túi sau 24 giờ ở nhiệt độ 25 ± 2oC. Hình dạng và sự nảy mầm của bào tử túi được quan sát dưới kính hiển vi soi ngược Rax vision (Mỹ). Sau đó tiến hành cấy truyền qua các đĩa petri chứa mơi trường PGA để phân tích các dẫn liệu hình thái ở giai đoạn vơ tính.

Mẫu được định danh theo phương pháp Kobayashi Y. (1982), Sung et. al., (2007).

Kết quả đình danh hình thái mẫu được mơ tả cụ thể như sau:

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

Mẫu DL0038A

Hình 2.1: Hình thái giải phẫu mẫu DL0038A

Chú thích: A. Thể bó (quả thể) nấm Cordyceps takaomontana (DL0038A) trong tự

nhiên; B. Ký chủ bị bao bọc bởi lớp sợi dày tạo giả hạch màu trắng; C. Thể chén nhô cao; D. Hệ sợi phát triển trên môi trường Agar, màu vàng khi già; E. Hệ sợi phân nhánh mạnh; F. Thể bình; G. Hình thành bào tử đốt; H; Bào tử đốt.

Mẫu DL0038B

Hình 2.2: Hình thái giải phẫu mẫu DL0038B

Chú thích: A. Quả thể Cordyceps takaomontana (DL0038B) còn non, được bao phủ

bởi lớp bụi bào tử màu trắng, thể chén chưa nhô lên khỏi bề mặt quả thể; B. Hệ sợi phát triển trên môi trường PGA; C, D. Một số dạng bào tử vơ tính; E. Hệ sợi với nhiều cấu trúc thể bình.

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

Mẫu DL0067

Hình 2.3: Hình thái giải phẫu mẫu DL0067

Chú thích: A. Mẫu nấm DL0067, B. Hệ sợi khuẩn lạc trên môi trường PGA, C. Bào tử đính; D, E. Cấu trúc cuống bào tử đính và thể bình; F. Vật chủ.

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

Mẫu DL0075

Hình 2.5: Hình thái giải phẫu mẫu DL0075

Chú thích: A. Bào tử đính, B. Vách ngăn trên hệ sợi; C. Hệ sợi.

Với những cố gắng,dựa vào atlats phân loại định danh nấm ký sinh côn trùng mới

nhất được xuất bản (Luangsa-ard et. al. 2007, 2009, 2010) các mẫu nấm được định danh như sau: DL0038A: Cordyceps takaomontana, DL0038B: Cordyceps takaomontana, DL0067: Isaria sp., DL0069: Simplicillium sp., DL0075: Cordyceps

2.2.2.2. Thiết bị

Máy vortex (Vortex ZX3, Velp Ý)

Máy lý tâm lạnh (Hettich Universal 320R, Đức) Bộ điện di DNA (Biorad)

Tủ ủ nhiệt (Multitemp III) Cân kỹ thuật (Satorious, Đức) Tủ hút khí độc (Ascent Max)

Máy quang phổ kế (Scanning UV/VIS, Smart Spec, Biorad) Máy luân nhiệt (My-Cycle Thermal, Biorad)

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

Máy chụp ảnh gel (Gel Doc XR System, Biorad) Lị vi sóng (Sharp)

dd H2O (đã hấp) Proteinase K 1mg/ml

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

2.2.2. Danh mục các phần mềm và cộng cụ trực tuyến

Annhyb: phiên bản 4.946 (Olivier Friad, 2012) là phần mềm giúp làm việc và

quản lý các trình tự nucleotide dưới nhiều định dạng.

ClustalX2: là một phần mềm (giao diện windows) dùng cho việc so sánh sự

tương đồng của hai hay nhiều trình tự sinh học.

Sea View: phiên bản 4.2.12 (Manolo Gouy) là phần mềm có các tính năng hỗ trợ

cho các phân tích tương đồng, sắp gióng cột các trình tự.

Chromas Lite: phiên bản 2.1.1 là phần mềm có tính năng mở, chỉnh sửa và lưu

các tập tin trình tự thuộc nhiều dạng khác nhau (Fasta, text, EMBL, SwissProt,…) đặc biệt là các trình tự được giải bằng hệ thống ABI dưới dạng biểu đồ huỳnh quang.

MEGA: phiên bản 6.06 (Kumar, 2013) là phần mềm dùng để xây dựng cây phát

sinh loài theo các phương pháp Maxsimum Parsimony, Maxsimum Likelihood, Neighbor Joining.

NCBI ( phần mềm trực tuyến dùng cho việc khai

thác thông tin.

BLAST ( phần mềm trực tuyến với

các thông số mặc định sẵn trên NCBI nhằm đánh giá độ đặc hiệu của mồi, sự tương đồng giữa các trình tự gửi giải với các trình tự trên NCBI,…

IDT analyzer ( giúp xác định các thông số

quan trọng của mồi như: chiều dài mồi, %GC, nhiệt độ nóng chảy, khả năng hình thành cấu trúc thứ cấp (Hairpin-dimer, Self-dimer, Hetero-dimer).

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

2.2.3. Tiến trình nghiên cứu

Mẫu nấm ký sinh côn trùng

Tách chiết DNA từ các mẫu nấm ký sinh côn trùng theo phương pháp Phenol/Chloroform

Khuếch đại vùng gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 với cặp

mồi tương ứng và điện di

Giải trình tự sản phẩm PCR đã khuếch đại và hiệu chỉnh trình tự

Kiểm tra độ tương đồng bằng BLAST

Kết luận

Xây dựng bộ dữ liệu DNA gồm các mẫu đã giải trình

tự và các trình tự theo bài báo của Sung et. al., 2007

Dị tìm mơ hình tiến hóa và xây dụng cây phát sinh loài (MP, ML, NJ) bằng phần mềm MEGA 6.06

Phân tích định danh hình thái Phân tích cây phát sinh loài và so

sánh kết quả với cơng trình

nghiên cứu của Sung et. al., 2007

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

2.2.4. Khảo sát in silico

2.2.4.1. Thu nhận thông tin gen và cặp mồi tương ứng

Dựa vào cơng trình nghiên cứu của ơng Sung et. al., (2007) và tham khảo các bài báo có đề cập đến gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 cũng như là cặp mồi tương ứng của các

gen. Tiến hành thu nhận thông tin về vai trị, chức năng, vị trí nằm trên exon, mức độ bảo tồn của gen. Bên cạnh đó, tìm hiểu các nguyên nhân, lý do mà các nhà

nghiên cứu lại sử dụng gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 để tiến hành hỗ trợ định danh các chi nấm trong họ nấm túi Ascomycota. Sau đó tiến hành thu nhận thơng tin về tiêu

chí đánh giá cặp mồi này, các cơng trình nghiên cứu khác có sử dụng cặp mồi này, khảo sát kích thước sản phẩm khuếch khi dùng cặp mồi này.

2.2.4.2. Đánh giá các thông số vật lý của mồi

Sau khi thu nhận thông tin và trình tự cặp mồi khuếch đại gene nrLSU, nrSSU, Rpb1 tiến hành kiểm tra và đánh giá các thông số vật lý của cặp mồi bằng công cụ

trực tuyến IDT analyzer ( giúp xác định các thông số quan trọng của mồi. Các thông số của mồi phải đạt những tiêu chí sau: chiều dại nằm trong khoảng 17-28 bp, %GC nằm trong khoảng 40-60%, khơng có lặp lại các nucleotide G hay C liên tiếp dài hơn 3 nucleotide tại đầu 3’ của mồi, Tmnằm trong khoảng 50-65oC, ΔG (kcal/mole) phải lớn hơn hoặc bằng -9 kcal/mole.

2.2.4.3. Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi

Sau khi đánh giá các thông số của mồi, tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng phần mềm trực tuyến như BLAST để kiểm tra đoạn mồi có tính phổ qt hay khơng và mức độ tương đồng với các lồi nào trên ngân hàng dữ liệu NCBI. Đồng

thời thu nhận các trình tự fasta của gen nrLSU, nrSSU, Rpb1 có trên Genbank của

NCBI về và sắp gióng cột với cặp mồi tương ứng để kiểm tra kích thước sản phẩm

dự kiến có sai khác gì nhiều so với các bài báo công bố về gen nrLSU, nrSSU, Rpb1.

2.2.4.4. Kiểm tra sản phẩm PCR và giải trình tự

Các sản phẩm khuếch đại được kiểm tra dựa vào thang chuẩn. Xem xét băng sản phẩm có sáng rõ, kích thước có đúng với kết quả đã khảo sát hay khơng. Sau đó, sản phẩm PCR được gửi giải trình tự ở cơng ty Nam Khoa.

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

140 µl CTAB 10%, 392 µl NaCl 2,5M, 7 µl β-mercaptoethanol 99,9%, 21 µl dd H2O, 70 µl Proteinase K 1mg/ml), đảo ống đều.

Ủ qua đêm ở nhiệt độ 65oC.

Bước 2: Tách chiết DNA bộ gen bằng phương pháp Phenol/Chloroform

Tiến hành ly tâm 13,000 vòng/phút trong 20 phút.

Loại bỏ phần cặn, thu dịch nổi, bổ sung 700 µl dung dịch PCI (Phenol/Choroform/Isoamylalcohol với tỷ lệ 25:24:1), lắc đều ống và ly tâm 13,000 vịng/phút trong 10 phút.

Thu V µl dịch nổi, bổ sung V µl dung dịch PCI (như trên) lắc đều ống và ly tâm 13,000 vòng/phút trong 10 phút (lặp lại cho đến khi khơng cịn protein).

Thu V1 µl dịch nổi, bổ sung V1 µl Choroform, lắc đều. Ly tâm 13,000 vịng/phút trong 10 phút.

Thu V2 µl dịch nổi, tiến hành bổ sung 1/10 V2 µl dung dịch NaOAc 3M, lắc đều. Bổ sung V2 µl Isopropanol, lắc đều và ủ ở nhiệt độ 4oC trong vòng 2 giờ.

Ly tâm 13,000 vòng/phút trong 20 phút. Loại bỏ dịch nổi, thu tủa. Bổ sung 1000 µl ethanol 70o.

Ly tâm 13,000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC, loại dịch nổi, thu tủa. Loại bỏ ethanol và làm khô cặn bằng cách phơi qua đêm ở nhiệt độ phịng. Bổ sung 100µl TE 1X.

Lưu giữ mẫu tại -20oC.

b. Kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm DNA đã tách chiết

Tiến hành đo OD260 và OD280 để xác định nồng độ DNA, các thông số liên quan (Mẫu đo OD phải tiến hành pha loãng 50 lần).

c. Khuếch đại trình tự bằng phản ứng PCR

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

Sử dụng các cặp mồi phổ quát để khuếch đại các gen mục tiêu nrSSU, nrLSU, Rpb1 của các mẫu nấm ký sinh côn trùng. Toàn

bộ các mồi sử dụng trong thực nghiệm được liệt kê sau đây:

Bảng 2.1: Thông tin về trình tự của các cặp mồi sử dung trong thực nghiệm

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

Thành phần cho một phản ứng PCR: Master mix (2X): 7,5 µl

Primer forward 10µM: 0,5 µl Primer reverse 10µM: 0,5 µl DNA: 1 µl

dd H2O: 5,5 µl

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

Xem kết quả bằng máy chụp ảnh gel (Gel Doc XR System, Biorad).

2.2.5.2. Hiệu chỉnh trình tự

Sau khi có kết quả giải trình tự tiến hành hiệu chình trình tự. Kết quả giải trình tự được hiển thị bằng phần mềm Chromas Lite 2.1.1. Kiểm tra các peak ở hai đầu của mồi xuồi và mồi ngược, nếu peak không rõ ràng phải tiến hành hiệu chỉnh. Đối với mạch F thì tiến hành xuất (export) thành file fasta còn mạch R phải tiến hành Reverse & Complement sau đó mới xuất thành file fasta. Sử dụng phần mềm Sea View phiên bản 4.2.12 tiến hành sắp gióng cột kiểm tra độ tương đồng, hiệu chỉnh trình tự của hai mạch. Sử dụng chức năng Dot plot trên NCBI để so sánh hai trình tự, sắp xếp các vùng trùng nhau. Nếu có những lỗi (mismatch) hay những khoảng trống (gap) trong trình tự thì cần mở lại trình tự bằng phần mềm Chromas Lite 2.1.1

4oC

(x1) (x35)

Y giây XoC

72oC 72o

C 30 giây

1 phút 5 phút 95o

C 95o

C 5 phút

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

để tái kiểm tra, so sánh và rút ra kết luận. Cuối cùng dùng phần mềm Chromas Lite 2.1.1 xuất ra trình tự DNA chính xác nhất.

2.2.5.3. So sánh với cơ sở dữ liệu Genbank

Sau khi hiệu chỉnh trình tự và xuất ra trình tự chính xác nhất của đoạn DNA thì bước tiếp theo là đưa trình tự vào chương trình BLAST để đánh giá. Nếu kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng về chiều dài, khơng có sự sai khác giữa các giữa các nucleotide với trình tự nghiên cứu thì trình tự hiệu chỉnh được chấp nhận. Trường hợp trình tự hiệu chỉnh có sai khác đối với các trình tự trên Gen bank của NCBI thì tiến hành xem xét lại các nucleotide có sự sai khác này dựa vào peak tương ứng trên Chromas Lite 2.1.1 để xác định chính xác có thể là lỗi kỹ thuật trong q trình hiệu chỉnh. Cịn nếu peak khơng rõ ràng (khơng thể nhận biết là nucleotide nào) thì tiến hành thu nhận các trình tự có mức độ tương đồng cao nhất so với trình tự nghiên cứu trên NCBI, sắp gióng cột và kiểm tra tần số xuất hiện tại nucleotide cần hiệu chỉnh rồi xác định nucleotide cần thay thế ở vị trí đó. Kết thúc việc kiểm tra và hiệu chỉnh là thu được trình tự DNA chính xác, đạt độ tin cậy lớn nhất.

2.2.5.4. Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu DNA và đồng bộ hóa bộ dữ liệu

Ngoài các mẫu nấm được trực tiếp thu nhận trình tự, trình tự của các loài nấm

thuộc chi Cordyceps và các chi họ hàng trong họ Clavicipitaceae được tham khảo chủ yếu trong bài báo của Sung et. al., 2007 và trên Genbank sau đó đưa bộ dữ liệu

vào trong phân tích phát sinh lồi. Để đảm bảo tính đúng đắn, các trình tự thu được phải có nguồn gốc rõ ràng (bài báo công bố, mã truy cập trên Genebank, tên loài, tên ngân hàng giống cung cấp).

Bộ dữ liệu sau khi được tổng hợp thì tiến hành đồng bộ lại sau khi tiến hành xây dựng cây phát sinh loài cục bộ. Quá trình đồng bộ được thực hiện sau khi sắp gióng cột nhằm tạo sự đồng nhất về chiều dài của các trình tự, tăng mức độ tin cậy và giá trị bootstrap cho cây phát sinh lồi.

2.2.5.5. Dị tìm mơ hình tiến hóa và xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA 6.06 (Kumar, 2013)

Xác định mơ hình tiến hóa phù hợp nhất để dựng cây Maximum Likelihood bằng chức năng Find Best DNA/Protein Models (ML) trong phần mềm MEGA 6.06

</div>