Sử dụng PCR để chuẩn đoán bệnh sán lá gan ở cừu

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

<b>Sử dụng PCR để chuẩn đốn bệnh sán lá gan ở cừu.</b>

<b>Môn học: Thiết bị và kỹ thuật CNSH.</b>

1

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

<b>Nội dung </b>

2. Đối tượng nghiên.

3. Mẫu và phương pháp thực hiện.

1. Tổng quan đề tài.

3

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

1. Tổng quan đề tài.

Fasciola hepatica có một vịng đời phức tạp, qua đó nó u cầu sự tồn tại của vật chủ trung gian và vật chủ cuối cùng để phát triển và trưởng thành qua nhiều giai đoạn ấu trùng.

Nhiễm trùng bởi sán lá gan Fasciola spp. trong gia súc gặp thiệt hại kinh tế ước tính lên tới 3 tỷ USD hàng năm gây ảnh hưởng đáng kể đến phúc lợi của động vật và chất lượng thực phẩm xuất phát từ động vật, nó

cũng có tác động quan trọng đến sức khỏe của cộng đồng.

=> Mục tiêu: từ sự ảnh hưởng trên của sán lá gan chúng tôi muốn áp dụng kỹ thuật PCR để nhận biết sớm việc nhiễm sán lá gan ở động vật để có biện pháp phịng nhanh chóng.

4

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

<b>2.Đối tượng nghiên cứu</b>

Sán lá gan gây bệnh ở nhiều phần của cơ thể (ví dụ như mạch máu, đường tiêu hóa, phổi, gan) tùy thuộc vào loài.

<i>F. hepatica là sán lá gan ở </i>

cừu và gia súc.

Vật chủ trung giang là các loại ốc nước ngọt

<i>ốc Limnaea </i>

<i>viridis và Limnaea swinhoei.</i>

5

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

<b>3. Mẫu và phương pháp thực hiện </b>

<b>• Lấy mẫu và bảo quản mẫu:</b>

Các mẫu phân được thu thập tại các trang trại có cừu bị nhiễm hoặc nghi

nhiễm, các mẫu được bảo quản trong ống nghiệm ở nhiệt độ 4°C, cịn trong q trình chuyển mẫu thì lưu giữ mẫu ở -80°C.

6

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

<b>• Xét nghiệm mẫu trực tiếp:</b>

Cho khoảng 30 ml nước muối thông thường (dung dịch đẳng trương NaCl 0,9%) và ống

nghiệm chứa mẫu đặt ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, sàn lọc loại bỏ phần hạt lớn. Đem hỗn hợp cho vào ống Eppendorf ly tâm ở tốc độ 2.000 vòng trong 4 phút. Lấy phần lắng đi soi dưới kính hiển vi.

7

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

<b>• Sử dụng formalin etyl axetat</b>

Lấy vài gam mẫu đi gây cho vào ống nghiệm chứa 9 ml formalin 10% ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, thêm 2-3ml etyl axetat vào mỗi ống đậy nấp lắc trong 30 giây, loại bỏ khí sinh ra trong ống và ly tâm trong 4 phút ở tốc độ 2500 vòng . Từ kết tủa thu được, lấy một giọt đi soi dưới kinh hiển vi 4, 10 và 40×.

8

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

<i>Trứng của F. hepatica được phân lập từ mẫu gan của những động vật bị nhiễm, </i>

sau mỗi bước 5 giây lấy 1 giọt mẫu đem soi dưới kính để xác định xem trứng đã vỡ hay chưa, ngoài ra còn sử dụng máy Nanodrop để xác định nồng độ DNA sau khi trích xuất .

9

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

Trình tự primer R và primer F

<small>Thơng sốTrình tự</small> ^Chiều<small>dài</small>

<small>Tỉ lệGC</small>

<small>Kích thướcsản phẩm</small>

<small>Intergenic spacer (AF179871) primer F</small>

<small>GCTTGCA</small> ^{20 bp} ^60.0 ^50.0%

<small>220 bpIntergenic spacer </small>

<small>(AF179871) primer R</small>

<small>TTAGGT</small> ^{20 bp} ^60.0 ^50.0%

<small>11</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

Quá trình phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn:-Biến tính.

-Gắn mồi.-Kéo dài.

<small>12</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

Chu trình nhiệt

<small>13</small>Giai đoạn Nhiệt độ(⁰C) Thời gian(phút,

giây) ^{Số chu kì}Tiền biến tính 94 5 phút 1

Biến tính 94 1 phút 35Bắt cập 55 45 giây 35Kéo dài 72 1 phút 35Hậu kéo dài 72 5 phút 1

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

<b> Điện di và kiểm tra </b>

Mẫu đối chứng âm là nước vô trùng và đối chứng dương là đoạn DNA dài

220bp. Mẫu được điện di trong gel agarose 1% TBE và thuốc nhuộm an toàn DNA(1 μg/ml). g/ml).

<small>14</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

Tài liệu tham khảo

<small>15</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

Cảm ơn thầy và các bạn đã chú ý lắng nghe

<small>16</small>

</div>