Công nghệ phôi vô tính và Ứng dụng

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>ĐỀ TÀI: CÔNG NGHỆ PHÔI VƠ TÍNH VÀ ỨNG DỤNG</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

<b>Mục lục</b>

<b>Cơng nghệ phơi vơ tính và ứng dụng...1</b>

<b>1. Phơi vơ tính...1</b>

2.1. Sự tạo phôi soma...2

2.2. Thiết lập một hệ thống tạo phơi thống nhất, hiệu suất cao...4

2.3. Tính bất hợp của giao tử trước khi thụ tinh...4

<i>2.5. Thụ phấn in vitro...5</i>

<b>3. Phương pháp thụ phấn in vitro...6</b>

3.1. Nguyên liệu ...6

3.2. Khử trùng nguyên liệu...6

3.3. Nuôi cấy noãn và bầu quả...7

3.4. Các nhân tố ảnh hưởng sự hình thành hạt sau khi thụ phấn in vitro đến trạng thái sinh lý của mẫu vật...8

3.5. Môi trường nuôi cấy...9

3.6. Điều kiện nuôi cấy...10

4.1.1. Cây Ledebouria revoluta...11

4.1.2. Tạo phôi soma (SE)...11

4.1.3. Hạt nhân tạo (AS)...12

4.1.4. Phương pháp phân tích RAPD...12

4.2. Mục đích:...13

4.3. Nguyên liệu và phương pháp...13

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

4.3.1. Nguyên liệu...13

4.3.2. Điều kiện chuẩn bị môi trường và nuôi cấy...13

4.3.3. Cảm ứng mô sẹo phôi...14

4.3.4. Chuẩn bị hạt giống nhân tạo và bảo quản ngắn hạn...15

4.3.5. Sự thích nghi và hiệu suất đồng ruộng của soma...16

4.3.6. Nghiên cứu tế bào học của cây bố mẹ và soma...16

4.3.7. Nghiên cứu nhiễm sắc thể...16

4.3.8. Phân tích RAPD của cây nguồn gốc và cây tái sinh có nguồn gốc từ phơi soma...17

4.3.9. Phân tích thống kê:...17

4.4. Các đánh giá nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng...18

4.4.1.Tác động của PGR và tinh trùng đối với trong quá trình tạo phôi...18

4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ natri alginate đến khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo...20

4.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản và thời gian bảo quản đến khả năng sống của hạt nhân tạo...21

4.4.4. Sự thích nghi và đánh giá thực địa của soma...21

4.4.5. Đánh giá độ trung thực di truyền bằng phân tích dấu RAPD...22

4.5. Kết quả và thảo luận ...23

<b>5. Kết luận...24</b>

<b>Tài liệu tham khảo...25</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

<b>Công nghệ phôi vô tính và ứng dụng 1. Phơi vơ tính</b>

Phơi vơ tính là phôi được hình thành từ tế bào soma của nucellar. Do vậy, cây từphơi vơ tính giống hệt với cây mẹ về cấu trúc di truyền và các tính trạng sinh họckhác. Phơi vơ tính cịn gọi là phơi soma , hay phơi sinh dưỡng , ở cây có múi cịngọi là phơi nucellar hay phơi tâm.

Hình 1. Hình dạng hạt phấn của một số loại cây trồng.

Hơn 200 loài cây trồng đã được nhân giống bằng phơi vơ tính. Phơi vơ tính đượctái sinh từ các tế bào mô sẹo phôi hoá in vitro. Phôi vô tính sau khi làm khơ có thểbảo quản lâu dài và cho nảy mầm vào thời vụ thích hợp. Hạt nhân tạo có thể hìnhthành từ phơi vơ tính và gieo bằng máy gieo hạt. Nhân giống một số cây lá nhọnnhư thông từ hạt nhân tạo đã đạt quy mơ cơng nghiệp .

Nhân giống bằng phơi vơ tính có các ưu điểm chính sau: Hệ số nhân giống cao.Các mô và tế bào sinh dưỡng nuôi cấy in vitro có thể tạo ra phơi vơ tính một cáchtrực tiếp hoặc thông qua giai đoạn trung gian là mô sẹo. Tế bào mơ sẹo có thể phânchia theo cấp số nhân và khi phân hoá thành phơi vơ tính sẽ tạo ra số lượng phơi vơtính khổng lồ trong thời gian ngắn. Ví dụ, ở cà phê người ta có thể tạo được

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

600.000 phơi vơ tính từ 1 gram sinh khối ban đầu trong vài tháng với tỷ lệ tái sinhcây từ phôi vô tính đạt 47%.

- Phơi vơ tính chứa một lượng chất dinh dưỡng tương tự với nội nhũ của phơihữu tính, có mầm chóp rễ và chồi đỉnh, do vậy có thể nảy mầm trực tiếp thành cây.Phơi vơ tính sau khi tạo hạt nhân tạo có thể bảo quản và lưu giữ dài hạn.

- Khả năng công nghiệp hoá và tự động hoá quá trình nhân giống quy mô lớn,đặc biệt là nhân giống bằng bioreactor. Các yếu tố di truyền, đặc tính của mô nuôicấy, thành phần môi trường và các yếu tố hoá lý khác nhau có tác động mạnh mẽlên quá trình phân hoá tế bào thành phơi vơ tính. Thidiazuron là một chất có hoạttính cực mạnh đối với tạo phơi vơ tính ở một số cây trồng, đặc biệt là cây lâmnghiệp và cây ăn quả , cây chè . Kỹ thuật tạo phơi vơ tính đã được áp dụng thànhcông trong nhân nhanh hàng loạt cây trồng.

<b>2. Phôi soma</b>

Được hình thành không thông qua quá trình tạo mô sẹo được gọi là phơi vơ tính,tế bào phơi vơ tính có thể được tạo ra trực tiếp và nhân sinh khối bằng hệ thốngni cấy thích hợp. Những tế bào phơi vơ tính này có khả năng tái sinh thành câyhoàn chỉnh hoặc được dùng làm nguyên liệu sản xuất hạt giống nhân tạo với lớpbao alginate. Phôi vô tính được xem như kỹ thuật mang lại nhiều hiệu quả caotrong nhân giống cây trồng.

<b>2.1. Sự tạo phôi soma </b>

Các tế bào trong phôi hợp tử biểu hiện các gen cần thiết cho chương trình pháttriển phôi. Giai đoạn trước khi hình thành tế bào phôi soma được gọi là tế bàotiền phôi. Sự phân chia của các tế bào tiền phôi để tạo thành một hệ thống các tếbào phôi trực tiếp được gọi là quá trình tạo phơi trực tiếp. Có nhiều tế bào phơikhơng cần dùng chất kích thích tăng trưởng. Có nhiều tế bào cần auxin để phânchia tế bào trước khi tạo ra tế bào phơi. Có nhiều tế bào hình thành phơi từ mơsẹo, trong trường hợp đó quá trình tạo phơi soma diễn ra gián tiếp.

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

Thuật ngữ PEDC (tế bào xác định tiền phôi) và tế bào xác định tạo phôi cảmứng (IEDC) được sử dụng để phân loại mơ, nhưng trên thực tế, đó là một quátrình tuần tự với điểm cuối của quá trình phát triển là hệ thống tế bào tạo phôi(EC).

Các tế bào trong các mô liên quan đến sinh sản, chẳng hạn như hạt phấn hoa vàchồi, có nhiều khả năng tiếp thu hệ thống tế bào phôi hơn các tế bào trong môtrưởng thành. Vì các mô chứa tế bào phôi nên việc kích thích phân chia tế bào ởgiai đoạn này là cần thiết để duy trì trạng thái phôi và hình thành tế bào phôi soma.

Các tế bào tạo phơi có thể có tính hệ thống trong các tế bào bình thường đượcni cấy trong mơi trường có chứa auxin và có thể cả cytokinin. Nồng độ cytokinincao trong tế bào thường dẫn đến khả năng tạo phôi thấp. Khi tế bào phôi được thuhoạch, sự hiện diện của auxin có thể làm giảm sự phát triển của phơi. Các yếu tốkhác góp phần vào sự phát triển của phôi bao gồm tỷ lệ amoni và nitơ nitrat ở giátrị pH vừa phải và thấp hoặc sự lặp lại của chu trình tạo phôi do giảm hoặc loại bỏhoàn toàn auxin trong môi trường.

Quá trình tạo phôi xảy ra thông qua hai con đường: PEDC và IEDC. Con đườngPEDC là con đường tạo phôi không hình thành mô sẹo, trong khi con đường IDEClà con đường hình thành mô sẹo.

Có hai bước để hệ thống hóa phơi:- Biệt hóa tế bào có khả năng tạo phơi- Phát triển hệ thống tế bào phôi mới.

Vì vậy, nuôi cấy phôi cần có hai mơi trường:

- Mơi trường cần thiết cho sự phát triển của tế bào phôi

- Môi trường cần thiết để các tế bào này phát triển thành tế bào có khả năng tạophơi.

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

Tạo phơi soma là một mơ hình toàn năng có thể kiểm tra toàn bộ quá trình biệthóa tế bào và cơ chế toàn năng của tế bào thực vật.

<b>2.2. Thiết lập một hệ thống tạo phôi thống nhất, hiệu suất cao</b>

Một hệ thống phù hợp cho các mục đích nghiên cứu trên đã được thiết lập bằngcách sử dụng tế bào huyền phù cà rốt. Các cụm tế bào phôi được chọn lọc sau khiloại bỏ các cụm tế bào lớn bằng lưới lọc, ly tâm trong dung dịch Ficoll và chuyểnsang môi trường không chứa auxin và chứa zeatin (10<small>-7</small>M). Các cụm tế bào trải quaquá trình tạo phôi đồng nhất với tần suất khoảng 90% quá trình tạo phôi. Hệ thốngnày phù hợp để nghiên cứu quá trình tạo phôi ở các cụm tế bào hình thành phôi(gọi là cụm tế bào giai đoạn đầu). Tuy nhiên, các cụm tế bào này có thể biệt hóađể hình thành phơi trong môi trường chứa auxin và quá trình tạo phôi đã đượcghi nhận bằng cách xác định các cụm tế bào có khả năng tạo phơi ở giai đoạnnày. Như vậy là quá trình hình thành giai đoạn đầu tiên của tế bào. Các cụm tếbào đơn rất quan trọng để phân tích các quá trình tạo phơi. Cần phải có một hệthống có tần suất tạo phơi đơn bào cao.

Các tế bào đơn lẻ nhỏ, trịn và có tế bào chất dày đặc được gọi là tế bào giaiđoạn 0 và thu được bằng cách lọc và sàng. Tế bào giai đoạn 0 được nuôi cấytrong môi trường 2,4D (5,10<small>-8</small>M) trong 6 ngày, sau đó được chủn sang mơitrường khơng có auxin. Tần suất hình thành tế bào phơi cao. Các nghiên cứu đãchỉ ra rằng việc tiền xử lý tế bào bằng auxin là cần thiết và zeatin (10<small>-6</small>M),mannitol (10<small>-3</small> M) và chiết xuất 02 (40%) có hiệu quả trong việc thúc đẩy quátrình tạo phôi. Hệ thống này là một hệ thống hiệu quả để nghiên cứu quá trìnhtạo phôi soma đơn bào. Các tế bào pha 0 được nuôi cấy trong môi trường chứaauxin cho thấy mất khả năng biểu hiện toàn năng, trong khi điều ngược lại làđúng; việc chuyển các tế bào pha 0 được nuôi cấy trong môi trường chứa auxinsang môi trường khơng có auxin và biệt hóa thành phơi ở tần số cao, thể hiện hếttiềm năng của mình.

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

<b>2.3. Tính bất hợp của giao tử trước khi thụ tinh</b>

Nếu một hạt phấn lạ (của loài khác) rơi vào đầu nhụy thì đầu nhụy sẽ lập tứcsinh ra chất cản trở sự phát triển của phấn phấn hoặc tạo ra các biến dạng ốngphấn, cản trở quá trình thụ tinh. Sự khơng tương thích giao tử trước khi thụ tinhThụ phấn: Là quá trình vận động chuyển phấn hoa từ bao phấn đến nhụy hoa đểtạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thụ tinh ở hoa. Ở thực vật hạt kín có phươngpháp thụ tinh kép.

<b>2.4. Tính bất hợp giao tử sau khi thụ tinh</b>

Khi phấn hoa của loài lạ rơi vào đầu nhụy thì ống phấn vẫn phát triển bình thường và xảy ra quá trình nuôi dưỡng nhưng hạt không phát triển. Các kỹ thuật khác đã được phát triển để loại bỏ các rào cản tiền hợp tử đối với quá trình nuôi dưỡng tinh, bao gồm: phấn nền, phun phấn sơ khai, xử lý nhiệt đầu nhụy và chiếu xạ. Sự sáng tạo phấn bằng noãn cũng đã được sử dụng thành công để giải quyết tình trạngkhơng tương thích ở n thảo

<i><b>2.5. Thụ phấn in vitro</b></i>

<i>Phát triển hạt thông qua thụ phấn in vitro các noãn trần được mô tả như là “thụ</i>

tinh trong ống nghiệm” (test-tube fertilisation), trong khi quá trình tạo hạt nhờ thụ

<i>phấn núm nhụy của nhụy hoa hoàn chỉnh nuôi cấy in vitro được xem như là “thụphấn in vitro” (in vitro pollination). Ở hai quá trình này, sự thụ tinh của trứng xuất</i>

hiện bên trong noãn bởi các giao tử được phân phối nhờ ống phấn. Ngược lại, hiện

<i>tượng “thụ tinh trong ống nghiệm” ở các hệ thống động vật đòi hỏi sự dung hợp in</i>

<i>vitro của các trứng tách rời nhờ các tinh tử bơi tự do (free floating sperms) còn gọi</i>

là giao tử đực. Thực tế, các giao tử đực ở thực vật không bơi tự do mà được phân

<i>phối nhờ ống phấn. Thuật ngữ chung “thụ phấn in vitro” được dùng cho thụ phấn</i>

noãn (ovular pollination-gắn hạt phấn vào các noãn tách rời), thụ phấn bầu quả(ovarian pollination-gắn hạt phấn vào các bầu tách rời), thụ phấn giá noãn(placental pollination-gắn hạt phấn vào các noãn đính trên giá noãn) và thụ phấn

<i>núm nhụy (stigmatic pollination-gắn hạt phấn vào núm nhụy) dưới các điều kiện in</i>

<i>vitro.</i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

Thụ phấn trong ống nghiệm nghĩa là thực hiện quá trình tạo hợp tử không phụthuộc vào cơ thể mẹ. Công việc này bao gồm các bước sau: kích thích hạt phấn nảymầm, kích thích sinh trưởng ống phấn, ni noãn và thụ tinh noãn, nuôi hợp tửthành hạt.

<b>3. Phương pháp thụ phấn in vitro3.1. Nguyên liệu</b>

<i><b>Hình 2. Cấu tạo của hoa, bầu quả và phơi</b></i>

Các bầu quả (ovaries) có nhiều noãn (ovules) là nguyên liệu thực nghiệm tốt

<i>nhất. Ở các loài thuộc họ Solanaceae ( Nicotiana tabcum, N. alata, N. rustica,</i>

<i>Petunia hybrida), họ Papaveraceae ( Papaver somniferum, Eschscholtziacalifornica, Argemone mexicana) và họ Caryophyllaceae (Melandrium album, M.rubrum, Agrostemma githago, Dianthus caryophyllus), giá noãn được bao phủ bởi</i>

hàng trăm noãn. Do có một số lượng lớn noãn không bị tổn thương khi phân lập

<i>giá noãn, nên đã góp phần vào thành cơng trong thụ phấn in vitro của chúng và sự</i>

phát triển cơ bản của hạt. Một nguyên liệu không thể thay thế khác là hạt phấn(pollen), cần phải tạo ra sự sinh trưởng tốt của ống phấn trong nuôi cấy, sự nảy

<i>mầm của hạt phấn in vitro có thể gặp khó khăn ở một số họ nhưng có thể khắcphục bằng cách ngâm noãn (ví dụ: Brassica oleracea) một ngày trước khi thụ</i>

phấn trong Cl2 1% là nhân tố thích hợp cho sinh trưởng của ống phấn.

<b>3.2. Khử trùng nguyên liệu</b>

Các nụ hoa chỉ sử dụng cho nuôi cấy trước khi bao phấn ở giai đoạn nứt ra. Cácnhụy hoa (pistils) sau khi loại bỏ đài và tràng hoa, hoặc các bầu quả riêng rẽ, được

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

khử trùng sơ bộ bằng cách rửa nhanh với EtOH 70%, khử trùng bề mặt bằng cáctác nhân thích hợp, và cuối cùng rửa sạch bằng nước cất vô trùng. Bầu quả sau đóđược bóc vỏ cẩn thận bằng dao mổ, forcep, hoặc kim để lộ phần noãn gắn vào giánoãn. Giá noãn hoàn toàn, hoặc một phần của nó có mang noãn, được dùng trongthụ phấn giá noãn. Để thực hiện thụ phấn núm nhụy in vitro, các nhụy được táchrời và khử trùng cẩn thận bề mặt bằng dung dịch khử trùng và sau đó thấm khơnúm nhụy.

Hình 3. Qui trình nuôi cấy bao phấn cây lúa

Phân lập hạt phấn ở điều kiện vô trùng, bao phấn được loại bỏ khỏi nụ hoa hoặccác hoa đã mở được giữ trong các đĩa petri có giấy lọc vơ trùng cho tới khi nứt ra,các hạt phấn sau đó được đặt trong các noãn nuôi cấy, giá noãn hoặc núm nhụy tùythuộc vào bản chất thí nghiệm. Nói chung, hạt phấn được đặt trực tiếp lên bộ phậnnhụy nuôi cấy tốt hơn khi dàn trải trên môi trường chung quanh noãn.

<b> 3.3. Nuôi cấy noãn và bầu quả</b>

Noãn. Sinh trưởng của ống phấn gắn trên noãn trần (bare ovules) thường bị ứcchế bởi sự có mặt của nước trên bề mặt của noãn. Màng nước này phải được làmkhô bằng giấy lọc và sau đó, noãn khơ ráo được phủ bằng hạt phấn. Các hạt pháttriển từ các noãn có phơi hình cầu hoặc phơi già có thể dễ dàng phân biệt, một số

<i>kết quả đã đạt được ở Gynandrophát sinhis gynandra, Impatiens balsamina,</i>

<i>Nicotiana tabacum và Allium cepa. Tuy nhiên, các noãn sau khi thụ phấn in vitro</i>

mang hợp tử đơn bào (single-celled zygote) cần các điều kiện sinh trưởng phức tạp

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

hơn. Kỹ thuật cho các noãn tự thụ phấn hoặc thụ phấn chéo là giống nhau. Trongsự phát triển ở các giai đoạn phát sinh phôi tiếp theo thì noãn tự thụ phấn thườngđược giữ trên giá noãn cho tới khi tạo thành hạt, trong khi ngược lại noãn thụ phấnchéo cần giá noãn chỉ từ 6-8 ngày nuôi cấy đầu tiên. Sau đó, chúng có thể đượcchuyển tới mơi trường ni khơng có giá noãn.

Bầu quả. Kỹ thuật nuôi cấy bầu quả được phát triển bởi Nitsch (1951), ông đãnuôi thành công bầu quả tách từ các hoa thụ phấn in vitro để phát triển thành quảchín (Cucumis và Lycopersicum). Các quả này mang hạt có thể nảy mầm đượcnhưng chúng có kích thước nhỏ hơn các quả phát triển ở điều kiện tự nhiên. Cáctác giả khác cũng đã nuôi cấy thành công các noãn tách rời từ một số loài (Linariamacroccana, Tropaeolum majus, Iberis amara, Hyoscyamus niger) trên môi trườngchứa muối khoáng và sucrose. Bổ sung vitamin B vào mơi trường giúp quả đạtkích thước bình thường và các hạt có thể nảy mầm được. Các môi trường nuôi cấyngày càng giàu dinh dưỡng hơn do bổ sung IAA hoặc nước dừa, thậm chí cho quảcó kích thước lớn hơn các quả hình thành trong điều kiện in vivo (Anethumgraveolens).

Thành phần bao hoa như mày hoa và lá bắc có vai trị quan trọng trong sự pháttriển của quả và phôi ở cây một lá mầm. Các bầu quả tách rời sớm sau khi đã thụphấn của Triticum aestivum và T. spelta chỉ phát triển trong quá trình nuôi cấy khibao hoa được duy trì nguyên vẹn. Nếu thiếu nhân tố này, sự tổng hợp DNA và kéodài tế bào của các tế bào phơi lúa mạch có thể xảy ra nhưng sự phân chia tế bàokhông xuất hiện.

<b>3.4. Các nhân tố ảnh hưởng sự hình thành hạt sau khi thụ phấn in vitro đếntrạng thái sinh lý của mẫu vật</b>

Trạng thái sinh lý của nhụy ở thời điểm tách rời noãn ảnh hưởng đến sự hìnhthành hạt sau khi thụ phấn in vitro. Bề mặt noãn hoặc núm nhụy (trong thụ phấnnúm nhụy) ẩm ướt có thể ảnh hưởng xấu đến nảy mầm của hạt phấn hoặc pháttriển của ống phấn và tiếp theo đó là hình thành hạt kém. Sự nảy mầm của hạt phấntrên núm nhụy và sự sinh trưởng của ống phấn dọc theo vịi nhụy có ảnh hưởngđến sự tổng hợp các protein, là các nhân tố đôi khi có thể ức chế hoàn toàn ống

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

phấn trong bầu quả. Do đó, cần phải xác định bộ phận nào của nhụy tồn tại hàngrào ngăn cản. Để cải thiện khả năng thụ phấn in vitro, mức độ bất hợp phải đượcgiảm xuống bằng cách tách bộ phận tổng hợp các protein ức chế và thụ phấn trựctiếp phần còn lại của nhụy dưới các điều kiện thí nghiệm.

Thời gian tách noãn khỏi nhụy ảnh hưởng đến sự hình thành hạt sau khi thụphấn in vitro. Các noãn được tách ra sau khi nở hoa từ 1-2 ngày cho khả năng hìnhthành hạt cao hơn khi tách noãn vào ngày ra hoa. Ở ngô và bông, thụ phấn in vitrosau khi xuất hiện râu tơ từ 3-4 ngày cho kết quả tạo hạt tốt hơn.

<b>3.5. Môi trường nuôi cấy</b>

Maheshwari (1958) đã nuôi cấy thành công noãn trên môi trường dinh dưỡngbao gồm muối khoáng theo Nitsch, vitamin theo White , và 5% sucrose. Noãn củaPapaver rhoeas và P. somniferum được tách 6 ngày sau khi thụ phấn (DAP- daysafter pollination) và thu được hợp tử hoặc tiền phơi có hai tế bào (two-celledproembryo) chứa một vài nhân nội nhũ (endosperm nuclei). Sinh trưởng của phôi ởgiai đoạn đầu thấp hơn nhưng ngay sau đó ở giai đoạn hình cầu sinh trưởng nhanhhơn và đạt kích thước 0,93 mm so với 0,65 mm của phôi in vivo. Bổ sung kinetinvà CH là cần thiết để kích thích sinh trưởng ban đầu của phôi. Một số noãn của hoalan (orchids) được phân lập từ các bầu quả đã thụ phấn sinh trưởng tốt trên dungdịch đơn giản có sucrose 10%, nhưng noãn của Zephyranthes (mang một hợp tử vàmột nhân nội nhũ sơ cấp) cần bổ sung nước dừa hoặc casamino acid vào môitrường Nitsch. Ở Trifolium repens, noãn (1-2 DAP) phát triển thành hạt trưởngthành chỉ khi môi trường nuôi cấy được bổ sung dịch chiết các loại quả non nhưdưa chuột hoặc dưa hấu.

Trong nuôi cấy in vitro các noãn đã được thụ phấn ở hầu hết các loài thì mơitrường Nitsch có cải biến được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên, môi trường Stewardvà Hsu (S-H) thích hợp hơn cho ni cấy các thể lai cùng loài hoặc khác loài saukhi thụ tinh các noãn non . Mơi trường ni cấy chứa IAA 10 µg/L hoặc kinetin0,1 µg/L làm tăng số lượng hạt được tạo thành từ noãn. Nồng độ cao hơn củakinetin thường gây ức chế. Nguồn nitrogen (hỗn hợp các amino acid hoàn chỉnh)

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

không ảnh hưởng đến tần số thụ tinh của các bầu quả của ngô được thụ phấn invitro, nhưng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển tối thích của hạt .

Áp lực tthẩm thấu của môi trường cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của noãntách rời, noãn chứa các phôi hình cầu phát triển thành hạt trưởng thành trên môitrường chứa sucrose từ 4-10%, nhưng các noãn non đã được thụ tinh có một hợp tửvà một vài nhân nội nhũ, hoặc các noãn vừa mới thụ tinh cần 6% và 8% sucrose.

<b>3.6. Điều kiện ni cấy</b>

Nói chung, nhiệt độ và ánh sáng có ảnh hưởng đến quá trình thụ tinh trong ốngnghiệm. Thông thường bước một của quá trình này xảy ra ở nhiệt độ phịng vàkhơng cần sự chiếu sáng đặc biệt. Chỉ ở giai đoạn sau, nuôi cấy bầu quả cần đượcduy trì ở 22-26<small>o</small>C và các điều kiện thích hợp khác có lợi cho phát sinh phơi. Saukhi thụ phấn trong ống nghiệm một vài ngày, một số noãn mở rộng, và ống phấnchui hoàn toàn vào trong túi phôi, cả phôi lẫn nội nhũ đều phát triển. Hiện tượngnày có thể xác minh bằng các thí nghiệm tế bào-phơi học (cytoembryology).

<b>3.7. Kiểu gen</b>

Phản ứng của bầu quả in vitro trong mối liên quan với sự hình thành hạt tùythuộc vào từng loài. Hạt phấn của các loài họ cải khó nảy mầm trong ni cấy vàngười ta phải cải tiến kỹ thuật nuôi cấy cho phù hợp bằng cách nhúng noãn củaBrassica oleracea trong dung dịch CaCl2 1%, sau đó gieo chúng trên một lớpgelatin 10% mỏng (10 µm) rồi thụ phấn với hạt phấn. Lớp gelatin mỏng được bảoquản trong đĩa petri có phủ giấy lọc gắn vào nắp hộp. Sau 24 giờ nuôi, noãn đượcthụ tinh và chủn lên mơi trường Nitsch có agar cho tới khi tạo hạt.

<b>3.8. Ứng dụng của thụ phấn in vitro</b>

Được ứng dụng ít nhất ở 3 lĩnh vực: vượt qua sự tự bất hợp (self-incompability), vượt qua sự bất hợp khi lai (cross-in compability) của các giao tử vàsản xuất thể đơn bội thông qua quá trình sinh sản (parthenogenesis).

Các loài Petunia axillaris và P. hybrida là tự bất hợp. Hạt phấn nảy mầm tốt trênnhụy được tự thụ phấn nhưng tồn tại một hàng rào ngăn cản ở trong bầu quả đã cảntrở sự phát triển của ống phấn, làm cho ống phấn không thể thụ tinh với noãn. Cáchàng rào trong các taxon này có thể được vượt qua bằng sự thụ phấn in vitro và sự

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

hình thành hạt xuất hiện bình thường. Ở loài P. axillaris tính bất hợp cũng có thểvượt qua nhờ sự thụ phấn nụ hoa in vivo (in vivo bud pollination).

Nuôi cấy thành công các noãn được thụ phấn in vitro đã tăng khả năng sản xuấtcác thể lai. Lai cùng loài (intraspecific), khác loài (interspecific), khác chi(intergeneric) và khác họ (interfamilia) cũng đã được tiến hành thông qua sự thụphấn giá noãn và noãn in vitro. Một ứng dụng khác của thụ phấn in vitro là sảnxuất các thể đơn bội của Mimulus luteus cv. Tigrinus grandiflorus bằng cách thụphấn các noãn tách tời của nó với Torenia fournieri. Thể đơn bội của M. luteusphát triển bằng trinh sản. Sự phát triển bằng quá trình sinh sản như thế của các thểđơn bội trong nuôi cấy từ các noãn được thụ phấn nhưng không thụ tinh đã đượcthông báo ở các loài Hordeum vulgare, Nicotiana tabacum và Triticum aestivum.

<b>4. Ứng dụng tạo phôi soma tần số cao và hạt nhân tạo để sản xuất hàng loạtcây giống Ledebouria revoluta</b>

<b>4.1. Giới thiệu</b>

<b>4.1.1. Cây Ledebouria revoluta</b>

Một loại thảo mộc có củ hành Ledebouria revoluta thuộc họ Măng tây(Danhsách thực vật 2013) được sử dụng theo truyền thống trong hệ thống y học dân tộccủa Ấn Độ và Nam Phi (Chopra et al.1956; Mulholland và cộng sự. 2013;Muleya và cộng sự. 2014). Ledebouria revoluta mang lại nhiều lợi ích cho timchứa glycosides—Scillarin-A, Scillarin-B, 3-benzyl-4-chro manones, Scillareninbis-L-rhamnoside, v.v. và do đó được biết đến như một loại cây bảo vệ tim mạch(Rao và Rangaswami967; Moodley và cộng sự. 2006). ). Do nhu cầu sử dụng rấtlớn trong các ngành công nghiệp dược phẩm nên nhu cầu về nguyên liệu trồngtrọt chất lượng của Ledebouria revoluta Ấn Độ ngày càng tăng. Kết quả là, mộtviệc thu thập quá mức bất h ợp pháp môi trường sống tự nhiên đang nổi lênvấnđề hiện nay, đòi hỏi phải phát triển một phương pháp nhân giống hiệu quả vànhanh chóng.

<b>4.1.2. Tạo phơi soma (SE)</b>

</div>