Tóm tắt: Nghiên cứu tác dụng điều trị suy thận mạn của bài thuốc GK1 trên thực nghiệm và lâm sàng

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (868.12 KB, 28 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

VIỆN Y HỌC CỔ TRUYỀN QUÂN ĐỘI

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2024

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. Phạm Xuân Phong 2. TS. Nguyễn Vĩnh Hưng

Phản biện 1: PGS. TS Phạm Bá Tuyến Phản biện 2: PGS. TS Phạm Quốc Toản Phản biện 3: PGS. TS Phạm Thị Vân Anh

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện vào hồi: giờ ngày tháng năm 2024

Có thể tìm hiểu luận án tại:

1. Thư viện Quốc Gia

2. Thư viện Viện Y học cổ truyền Quân đội

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Tran Thi Tuyet Nhung, Pham Xuan Phong, Trinh Hoai Nam, et al. (2021). Isolation and structural characterization of compounds

from Blumea lacera. Pharmacognosy Journal, 13, 999-1004.

2. Trần Thị Tuyết Nhung, Phạm Xuân Phong và cộng sự (2023). Nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của viên

nang GK1 trên động vật thực nghiệm. Tạp chí Y học Việt Nam,

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

1. Tính cấp thiết luận án

Thận là cơ quan có nhiều vai trị sinh học quan trọng trong cơ thể. Các bệnh lý về thận có tỷ lệ mắc cao. Năm 2021, ước tính khoảng 37 triệu người lớn tại Mỹ mắc bệnh thận mạn, chiếm tỷ lệ 15%. Trên thế giới, khoảng 10% dân số thế giới mắc bệnh thận mạn và hàng triệu người chết mỗi năm vì khơng được điều trị hợp lý. Số lượng bệnh nhân và chi phí điều trị suy thận mạn gia tăng nhanh ở nhiều nước trên thế giới. Phương pháp điều trị học hiện đại chủ yếu là điều trị triệu chứng, chế độ ăn giảm đạm kết hợp liệu pháp keto acid và sử dụng các biện pháp thay thế thận ở bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối như chạy thận nhân tạo, lọc màng bụng, ghép thận… Những phương pháp điều trị này rất tốn kém và có thể ảnh hưởng tới cơ quan khác như tim mạch, tâm thần kinh, huyết học hoặc vấn đề thải ghép ở bệnh nhân ghép thận.

Bài thuốc GK1 là kết hợp của bài thuốc Bảo thận thang và vị thuốc Hạ khơ thảo nam. Trong đó bài thuốc Bảo thận thang gồm Đại hồng, Bồ cơng anh, Thổ phục linh, Long cốt nung, Mẫu lệ nung đã được chứng minh có tác dụng điều trị suy thận mạn trên thực nghiệm và lâm sàng. Những thành phần được tìm thấy trong bài thuốc như rhein, emodin trong Đại hoàng, quercetin, kaempferol trong Hạ khô thảo nam có tác dụng chống oxy hóa, giảm phản ứng viêm, ức chế q trình xơ hóa cầu thận, xơ hóa kẽ thận, cải thiện tốt tình trạng suy thận mạn trên thực nghiệm. Vị thuốc Hạ khô thảo nam bước đầu có tác dụng điều trị dự phịng trên mơ hình chuột suy thận mạn. Kết quả nghiên cứu tác dụng dược lý cho thấy bài thuốc GK1 dạng viên nang có tác dụng điều trị suy thận mạn trên mơ hình chuột suy thận mạn bằng adenine. Tuy nhiên để chứng minh tác dụng điều trị suy thận mạn của bài thuốc GK1 dạng viên nang một cách đầy đủ, khoa học, đồng thời nghiên cứu chuyên sâu về các hoạt chất có giá trị sinh học cao của vị thuốc Hạ khô thảo nam trong bài thuốc GK1, đề tài được thực hiện với những mục tiêu sau:

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

3. Ý nghĩa thực tiễn và những đóng góp mới của luận án

Viên nang GK1 được ứng dụng trong điều trị suy thận mạn, được bào chế từ bài thuốc GK1 chuyển thành dạng dễ sử dụng, vận chuyển và bảo quản. Nghiên cứu đã tìm ra những hợp chất mới có giá trị sinh học cao, chứng tác dụng điều trị trên thực nghiệm của vị thuốc Hạ khô thảo nam trong bài thuốc GK1, đồng thời chứng minh tính an toàn, tác dụng điều trị của viên nang GK1 trên lâm sàng. Kết quả nghiên cứu cho thấy:

- Phân lập được 4 hợp chất là: β-sitosterol, artemetin, campesterol, acid protocatechuic và Hạ khơ thảo nam có tác dụng điều trị suy thận mạn trên thực nghiệm.

- Kết quả nghiên cứu minh chứng được tính an tồn của viên nang GK1 dựa trên nghiên cứu độc tính cấp và bán trường diễn.

- Viên nang GK1 cải thiện chức năng thận và triệu chứng ở bệnh nhân suy thận mạn trên lâm sàng, đặc biệt ở thể đàm thấp và thấp nhiệt.

4. Cấu trúc của luận án: Luận án gồm 134 trang, ngoài phần đặt vấn đề và kết luận, luận án có 4 chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu 34 trang Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 20 trang Chương 3: Kết quả nghiên cứu 41 trang Chương 4: Bàn luận 34 trang Và 44 bảng, 3 biểu đồ, 6 sơ đồ, 17 hình ảnh, 11 phụ lục, 134 tài liệu tham khảo (24 tiếng Việt, 103 tiếng Anh, 7 tiếng Trung).

Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Suy thận mạn theo y học hiện đại 1.1.1. Chẩn đoán, cơ chế suy thận mạn

Suy thận mạn được xác định khi bệnh nhân mắc bệnh thận mạn có mức lọc cầu thận < 60 ml/phút/1,73m2, tương ứng với bệnh thận mạn giai

đoạn G3a đến G5. Cơ chế bệnh sinh thường gặp của suy thận mạn là tiến

triển từ những suy thận cấp gây tổn thương đơn vị thận dẫn đến bù trừ, phì đại tế bào gian mạch, phì đại cầu thận, xơ cứng cầu thận, dày màng đáy cầu thận, xơ hóa mơ kẽ, dẫn đến sự tiến triển tăng dần, tăng hoạt động của các cytokine và các yếu tố tăng trưởng. Bên cạnh đó, diễn biến bệnh lý của các bệnh thận mạn khác nhau cũng đều tiến triển đến q trình xơ hóa thận và đặc trưng của xơ hóa thận là teo ống thận, cầu thận và xơ hóa mơ kẽ.

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

1.1.2. Điều trị bảo tồn suy thận mạn

Các phương pháp điều trị bảo tồn chủ yếu là thay đổi lối sống, chế độ dinh dưỡng, kiểm soát huyết áp, điều trị các bệnh lý kèm theo và các biến chứng của suy thận mạn (RLCH glucid, RLCH lipid, các biến chứng như: thiếu máu, suy dinh dưỡng, rối loạn điện giải, rối loạn chuyển hóa xương và khống chất). Trong đó, chế độ dinh dưỡng cần chế độ ăn giàu năng lượng, giảm protein, liệu pháp keto acid:

Liệu pháp keto acid: chế độ ăn giảm đạm bổ sung keto acid có tác

dụng giảm độc tố urê máu, giảm protein niệu, ngăn chặn suy dinh dưỡng, cải thiện chuyển hóa canxi-phosphat, cải thiện chứng cường cận giáp, cải thiện nhạy Insulin, cải thiện tình trạng tăng lipid máu, giúp kiểm sốt huyết áp tốt hơn, trì hỗn lọc máu để điều trị các triệu chứng của urê máu cao, làm chậm tiến triển của suy thận mạn, giúp cải thiện chất lượng cuộc sống của người bệnh.

1.2. Suy thận mạn theo y học cổ truyền

1.2.1. Bệnh danh, biện chứng luận trị, phân thể suy thận mạn

Có nhiều bệnh danh mơ tả cho suy thận mạn, tuy nhiên bệnh danh “thận lao” là phù hợp nhất. Cơ chế bệnh sinh: suy thận mạn do chức năng thăng giáng của tạng phủ thất thường, không phân được thanh trọc, làm nghịch loạn, là chứng của chính hư tà thực, vị trí bị bệnh lấy hai tạng tỳ thận làm chủ. Chính hư là do chức năng tạng phủ suy giảm mà chủ yếu là hai tạng tỳ, thận. Tà thực là các sản vật bệnh lý như các chứng đàm thấp, thấp nhiệt, thấp trọc, huyết ứ, thủy khí... gây nên. Các thể chính hư gồm: tỳ thận khí hư, tỳ thận khí âm lưỡng hư, can thận âm hư, tỳ thận dương hư, âm dương lưỡng hư và các thể tà thực gồm: đàm thấp, thấp nhiệt, thủy khí, huyết ứ và phong động. Nguyên tắc điều trị: cơng bổ kiêm trị, phù chính trừ tà.

1.2.2. Các nghiên cứu YHCT về suy thận mạn

Thông qua các phương pháp kỹ thuật hiện đại như phân tích thành phần hóa học, nghiên cứu thực nghiệm và lâm sàng, nhiều bài thuốc, vị thuốc y học cổ truyền đã được chứng minh vai trò, tác dụng trong điều trị suy thận mạn. Những thành phần hóa học đã được nghiên cứu có tác dụng trong suy thận mạn như rhein, emodin trong đại hoàng, quercetin, kaempferol trong Hạ khô thảo nam, Ngưu tất, astragaloside IV, calycosin, astragalus polysaccharide trong Hoàng kỳ, acid rosmarinic, tanshinones, acid salvianolic A chứa trong Đan sâm, hydroxy safflower yellow A trong

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

Hồng hoa… có tác dụng chống viêm, chống xơ hóa, giảm stress oxy hóa, giảm xơ hóa và ngăn cản tiến triển của suy thận mạn.

1.3. Mơ hình thực nghiệm gây suy thận mạn

Phương pháp gây suy thận mạn bằng adenine được sử dụng trong nhiều nghiên cứu tiền lâm sàng do có các ưu điểm như kỹ thuật dễ thực hiện, thời gian tiến hành mơ hình ngắn hơn các phương pháp khác, kết quả đánh giá rõ ràng, quan sát được nhiều biến đổi về mặt chức năng, hình thái giải phẫu bệnh. Phương pháp đánh giá kết quả gây mơ hình gây suy thận mạn chủ yếu dựa trên xơ hóa thận, xơ hóa mơ kẽ thận thơng qua xét nghiệm hydroxyproline để tính tốn hàm lượng collagen hoặc qua hình ảnh mô bệnh học thận nhuộm 3 màu. Bên cạnh đó, mơ hình gây suy thận mạn cịn được đánh giá dựa trên giảm mức lọc cầu thận thông qua tăng nồng độ urê, creatinin huyết thanh so với nhóm chứng. Khắc phục nhược điểm của các mơ hình gây suy thận mạn bằng adenine trước đó như lượng adenine đưa vào không đồng đều giữa các con chuột, hoặc tỷ lệ chuột chết sau gây mơ hình cao, Ngơ Thị Tuyết Mai và cộng sự đã nghiên cứu xây dựng mơ hình gây suy thận mạn bằng adenine trên chuột nhắt trắng với mức liều chính xác, đồng đều giữa các chuột là 100 mg/kg TLCT, uống cách ngày trong 5 tuần và đưa thẳng vào dạ dày chuột qua kim đầu tù. Kết quả gây được mơ hình suy thận mạn ổn định, tỷ lệ chuột sống đạt 100% tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.

1.4. Cơ sở nghiên cứu bài thuốc GK1

1.4.1. Thành phần, cơ sở nghiên cứu bài thuốc GK1

Bài thuốc GK1 có nguồn gốc từ bài thuốc Bảo thận thang và vị thuốc Hạ khơ thảo nam. Trong đó, bài thuốc Bảo thận thang đã được chứng minh có tác dụng điều trị suy thận mạn trên thực nghiệm và lâm sàng. Những nghiên cứu y học hiện đại gần đây cho thấy, rhein, emodin trong Đại hồng có tác dụng bảo vệ thận, dụng ức chế quá trình xơ hóa thận, giảm protein niệu, giảm creatinin máu. Vị thuốc Hạ khơ thảo nam có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, có tác dụng hạ creatinin, urê, acid uric ở chuột dùng profenofos (50mg/kg) đường uống. Một số thành phần hóa học đã được tìm thấy trong Hạ khô thảo nam như: acid rosmarinic, quercetin và kaempferol… có tác dụng chống oxy hóa, giảm phản ứng viêm, ức chế q trình xơ hóa cầu thận, xơ hóa kẽ thận, cải thiện tốt tình trạng suy thận mạn trên thực nghiệm.

Theo y học cổ truyền, bài thuốc Bảo thận thang có tác dụng thanh nhiệt giải độc, trừ thấp, hóa đàm. Vị thuốc Hạ khơ thảo nam có vị đắng,

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

tính bình, tác dụng thanh nhiệt giải độc, tiêu viêm. Dựa trên lý luận y học cổ truyền và kết quả nghiên cứu thực nghiệm và lâm sàng, nghiên cứu kết hợp Bảo thận thang và vị Hạ khô thảo nam được thực hiện nhằm mục đích tạo ra bài thuốc GK1 với hiệu quả tốt hơn trong điều trị suy thận mạn.

1.4.2. Cơ sở nghiên cứu tác dụng của bài thuốc GK1 dạng viên nang trên lâm sàng

Nghiên cứu đánh giá tác dụng bài thuốc GK1 dạng viên nang trên mơ hình thực nghiệm suy thận mạn cho thấy: Tỷ lệ sống, tăng trọng lượng cơ thể, số lượng hồng cầu, hemoglobin, tiểu cầu, các chỉ số đánh giá chức năng thận như urê, creatinin và mô bệnh học của nhóm chuột suy thận mạn được điều trị GK1 liều 600mg/kg/ngày (tương đương liều dùng ở người trên lâm sàng) và nhóm chuột suy thận mạn điều trị GK1 liều 1200mg/kg/ngày được cải

thiện rõ khi so sánh với nhóm đối chứng bệnh lý.

Chương 2

CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Chất liệu nghiên cứu: Vị thuốc và cao chiết toàn cây trên mặt

đất của Hạ khô thảo nam (Blumea lacera (Burn.F.) DC); Bài thuốc GK1

dạng viên nang (gọi tắt là Viên nang GK1): hàm lượng 500mg tương ứng

với các dược liệu Đại hồng (Rhizoma Rhei) 870 mg, hạ khơ thảo nam

(Blumea lacera) 1300 mg, Thổ phục linh (Rhizoma Smilacis glabrae)

1300 mg, Bồ công anh (Herba Lactucae indicae) 1300 mg, Long cốt nung

(Os Draconis) 2610 mg, Mẫu lệ nung (Concha Ostreae) 2610 mg. Viên

nang GK1 đạt TCCS, được sản xuất tại Trung tâm Nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất thuốc – Học viện Quân y; Adenine: mã A8626-25, hàm lượng 99% (Sigma, Hoa Kỳ), được pha trong dầu ăn với hàm lượng 10 mg/ml

dầu; Viên nén bao phim Ketosteril 600mg của hãng Fresenius Kabi (Đức.

Hạn sử dụng 12/10/2021, lô 18P3956.

2.2. Đối tượng nghiên cứu

2.2.1. Chiết xuất, phân lập một số hoạt chất và đánh giá tác dụng điều trị của vị thuốc Hạ khơ thảo nam trên mơ hình thực nghiệm suy thận mạn:

Vị thuốc Hạ khô thảo nam; Chuột nhắt trắng chủng Swiss gồm: 7 con không gây suy thận mạn, uống nước theo nhu cầu và 45 con đã được gây suy thận mạn bằng adenine đưa thẳng vào dạ dày chuột, liều 100mg/kg trọng lượng, uống cách ngày trong 5 tuần.

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

2.2.2. Đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của viên nang GK1: Chuột nhắt trắng chủng Swiss (n = 120 con), thỏ trắng chủng

Newzealand White (n = 30).

2.2.3. Đánh giá tác dụng của viên nang GK1 dạng điều trị suy thận mạn trên lâm sàng

Nghiên cứu tiến hành trên 60 bệnh nhân được chẩn đoán suy thận mạn

độ I, II, IIIa (tương đương với bệnh thận mạn G3a-G4). Tiêu chuẩn lựa

chọn: bệnh nhân từ 18 tuổi trở lên, khơng phân biệt giới tính, đồng ý tham

gia nghiên cứu; Tiêu chuẩn loại trừ: Các bệnh lý cấp tính, truyền nhiễm:

sốt, nhiễm trùng cấp, ung thư, bệnh về máu, viêm gan cấp, xơ gan, giai đoạn cấp tai biến mạch máu não, mất nước, mất máu cấp tính, suy thận cấp, lao, HIV..., phụ nữ có thai và cho con bú. Bệnh nhân bỏ thuốc 3 ngày liên tục, không làm đủ các xét nghiệm.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Chiết xuất, phân lập một số hoạt chất và đánh giá tác dụng điều trị của vị thuốc Hạ khô thảo nam trên mô hình thực nghiệm suy thận mạn

2.3.1.1. Chiết xuất, phân lập một số hoạt chất của Hạ khô thảo nam:

Chiết xuất cao Hạ khô thảo nam, phân lập một số hoạt chất từ phân đoạn có tác dụng điều trị suy thận mạn.

2.3.1.2. Đánh giá tác dụng điều trị của vị thuốc Hạ khô thảo nam trên mô hình thực nghiệm suy thận mạn: Thời gian nghiên cứu: 5 tuần. Chuột

nhắt trắng được chia thành 4 lô: Lô 1 (chứng sinh học, n = 7): không gây suy thận mạn, uống nước cất; Lô 2 (chứng bệnh, n = 15): chuột suy thận mạn uống nước cất; Lô 3 (HKTN 4gDL/kg, n = 15): chuột suy thận mạn, uống dịch chiết Hạ khô thảo nam liều 4g dược liệu/kg TLCT/ngày (tương đương liều dùng trên lâm sàng); Lô 4 (HKTN 8gDL/kg, n = 15): chuột suy thận mạn, uống dịch chiết Hạ khô thảo nam liều 8g dược liệu/kg TLCT/ngày (gấp đôi liều dùng trên lâm sàng). Theo dõi: tình trạng chung, hoạt động, cân nặng, số lượng chuột sống/chết. Xét nghiệm urê, creatinin, AST, ALT, tổng phân tích tế bào máu trước và sau nghiên cứu, xét nghiệm mô bệnh học thận tại Khoa Giải phẫu bệnh-Bệnh viện Quân y 103.

2.3.2. Đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của viên nang GK1: Theo Hướng dẫn của WHO và Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm

sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu - Bộ Y tế.

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

* Độc tính cấp: Xác định LD50 của thuốc thử theo đường uống trên chuột nhắt trắng theo phương pháp Litchfield - Wilcoxon.

* Độc tính bán trường diễn: Thỏ được chia thành 3 lơ, mỗi lô 10 con,

nghiên cứu trong 60 ngày. Lô chứng: uống nước cất; Lô trị 1: uống hỗn dịch viên nang GK1 liều 0,15g/kg/ngày; Lô trị 2: uống hỗn dịch viên nang GK1 liều 0,45 g/kg/ngày. Theo dõi: tình trạng chung, trọng lượng cơ thể của thỏ, chức phận tạo máu, ALT, AST, urê, creatinin máu, cấu trúc vi thể gan, thận, lách thỏ.

2.3.3. Đánh giá tác dụng của viên nang GK1 điều trị suy thận mạn trên lâm sàng

Thiết kế nghiên cứu: tiến cứu, có đối chứng, so sánh trước sau điều trị. Cỡ mẫu nghiên cứu tính theo cơng thức dành cho thử nghiệm lâm sàng. Tiêu chuẩn chẩn đoán: Theo y học hiện đại (suy thận mạn độ I, II, IIIa, chưa có chỉ định điều trị lọc máu, tương đương bệnh thận mạn giai đoạn G3a-G4). Tiêu chuẩn phân thể theo y học cổ truyền (Thể chính hư: tỳ thận khí hư, tỳ thận khí âm lưỡng hư, can thận âm hư, tỳ thận dương hư, âm dương lưỡng hư; Thể tà thực: đàm thấp, thấp nhiệt, thủy khí, huyết ứ, phong động).

- Phương pháp tiến hành: Lựa chọn bệnh nhân đạt tiêu chuẩn chẩn đốn và loại trừ. Nhóm đối chứng: 30 bệnh nhân, sử dụng ketosteril 600mg x 10 viên/ngày x 30 ngày. Nhóm GK1: 30 bệnh nhân, sử dụng GK1 x 6 viên/ngày x 30 ngày. Bệnh nhân được sử dụng các thuốc hạ áp, hạ đường máu… nếu có bệnh kèm theo và được hướng dẫn chế độ ăn uống, sinh hoạt cho người suy thận mạn. Theo dõi theo bệnh án mẫu: tuổi, giới, cân nặng, triệu chứng cơ năng, thực thể, xét nghiệm (tổng phân tích tế bào máu, glucose, urê, creatinin, acid uric, albumin, protein, AST, ALT, GGT, điện giải đồ) tại ngày 0, ngày 15 và ngày 30. Theo dõi triệu chứng y học cổ truyền, tác dụng không mong muốn.

- Đánh giá kết quả điều trị: Chỉ số hiệu quả = (điểm trước điều trị - điểm sau điều trị)*100%/điểm trước điều trị. Hiệu quả tốt (Tổng điểm giảm ≥ 60%; kết hợp MLCT tăng ≥ 20%/creatinin máu giảm ≥ 20%). Có hiệu quả (Tổng điểm giảm ≥ 30%, kết hợp MLCT tăng ≥ 10%/creatinin máu giảm ≥ 10%. Ổn định (Tổng điểm triệu chứng lâm sàng giảm từ 0-30%, kết hợp mức lọc cầu thận tăng từ 0 đến < 10%/ creatinin máu tăng từ 0 đến < 10%. Không hiệu quả (Triệu chứng lâm sàng không cải thiện hoặc tăng nặng hoặc MLCT giảm hoặc creatinin máu tăng).

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

2.4. Xử lý số liệu: Các số liệu được xử lý trên phần mềm SPSS 20.0.

Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

2.5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu thành phần hố

học của Hạ khơ thảo nam tại Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng sản xuất thuốc và Viện Đào tạo Dược, Học viện Quân y từ 3/2019-12/2020. Nghiên cứu thực nghiệm: tại Viện Nghiên cứu Y dược học Quân sự-Học viện Quân y, từ tháng 6/2019-3/2020. Nghiên cứu lâm sàng: tại Viện Y học cổ truyền Quân đội từ tháng 3/2020-05/2022.

2.6. Đạo đức nghiên cứu: Nghiên cứu được chấp thuận bởi Hội đồng

Đạo đức Viện Y học cổ truyền Quân đội.

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Kết quả chiết xuất, phân lập một số hoạt chất và đánh giá tác dụng điều trị của vị thuốc Hạ khô thảo nam trên mơ hình thực nghiệm suy thận mạn

3.1.1. Kết quả chiết xuất, phân lập một số hoạt chất

3.1.1.1. Chiết xuất các phân đoạn dịch chiết từ cao đặc Hạ khô thảo nam: Từ 200 g phần trên mặt đất của dược liệu Hạ khô thảo nam chiết

xuất, loại tạp và cô đặc thu được 27,5 g cao đặc chiết xuất. Phân tán cao chiết này trong 100 ml nước cất ở 70°C. Khuấy đều, sau đó chiết lỏng-lỏng với 200ml n-hexan (chiết lặp lại 3 lần), cất thu hồi dung môi thu được 3,6g cao phân đoạn n-hexan (ký hiệu là BL-H) và lớp nước. Lớp nước tiếp tục được lắc lần lượt với dung môi DCM (200 ml/lần x 3 lần) và dung môi EtOAc (200ml /lần x 3 lần), cất thu hồi dung môi thu được 3,82g cao phân đoạn DCM (ký hiệu là BL-D) và 6,20g cao phân đoạn EtOAc (ký hiệu là BL-E).

3.1.1.2. Phân lập các hợp chất

Phân lập các hợp chất từ phân đoạn DCM: cao DCM (BL-D; 3,82g)

được phân lập bằng sắc kí cột silica gel, rửa giải bằng n-hexan/aceton

(30/1-0/1, v/v) thu được 6 phân đoạn: BLD-I (35,6mg), BLD-II (88,4mg), BLD-III (113,7mg), BLD-IV (301,7mg), BLD-V (482,5mg), BLD-VI (198,1mg). Phân đoạn BLD-IV (301,7mg) được phân lập bằng sắc kí cột

silica gel, rửa giải bằng n-hexan/EtOAc (10/1-0/1, v/v) thu được 3 phân

đoạn (BLD-IV-1, BLD-IV-2, BLD-IV-3). Tinh chế phân đoạn BLD-IV-1 (43,2mg) bằng sắc kí cột silica gel rửa giải bằng DCM/aceton (10/1, v/v) thu được hợp chất BLD1 (12,1mg). Phân đoạn BLD-V (482,5mg) được phân lập bằng sắc kí cột silica gel, rửa giải bằng DCM/EtOAc (20/1-0/1,

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

v/v) thu được 3 phân đoạn (BLD-V-1, BLD-V-2, BLD-V-3). Tinh chế phân đoạn BLD-V-2 (40,8mg) bằng sắc kí cột silica gel rửa giải bằng DCM/Aceton (15/1, v/v) thu được hợp chất BLD2 (15,2mg).

Phân lập các hợp chất từ phân đoạn EtOAc: cao EtOAc (BL-E;

6,20g) được phân lập bằng sắc kí cột silica gel, rửa giải bằng DCM/ EtOAc (30/1-0/1, v/v) thu được 6 phân đoạn: BLE-I (1,20g), BLE-II (0,63g), BLE-III (0,73g), BLE-IV (2,47mg), BLE-V (540 mg) và BLE-VI (210 mg). Phân đoạn BLE-I (1,2g) được phân lập bằng sắc ký cột silica

gel, rửa giải bằng n-hexan/ aceton (15/1, 0/1, vv) thu được các phân đoạn:

BLE-I-1 (175 mg), BLE-I-2 (430 mg), BLE-I-3 (76 mg), BLE-I-4 (56 mg). Phân đoạn BLE-I-02 tiếp tục được tách trên sắc ký cột silicagel trên cột có chiều dài 40cm, đường kính 1cm và rửa giửa với hệ dung môi CH2Cl2/EtOAc (20/1, v/v) thu được hợp chất BLE1 (17,2 mg). Phân đoạn BLE-IV (2,47g) tiếp tục được phân lập bằng sắc ký cột silica gel, rửa giải bằng CH2Cl2/MeOH (20/1, 0/1, vv) thu được các phân đoạn BLE-IV-1 (320 mg), BLE-IV-3 (840 mg), BLE-IV-2 (364 mg). Phân đoạn BLE-IV-3 (840 mg) được tách trên cột silica gel pha đảo, rửa giải bằng hệ dung môi MeOH/H2O (1/3, 3/1 v/v), thu được hai phân đoạn BLE-IV-3a và BLE-IV-3b. Tiến hành tinh chế trên cột silica gel pha thuận và rửa giải với hệ dung môi DCM/MeOH/H2O (10/2/1, 6/4/1) thu được hợp chất BLE2 (27,6 mg). Như vậy, từ cao ethanol được chiết xuất từ phần trên mặt đất của cây Hạ khô thảo nam đã phân lập được 4 hợp chất từ ký hiệu là BLD1, BLD2, BLE1, BLE2.

Nhận dạng các hợp chất phân lập: Sử dụng các phương pháp phân

tích phổ thực nghiệm, kết hợp đối chiếu với các tài liệu tham khảo và ngân hàng các hợp chất tự nhiên để xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được. BLD1 được xác định là β-sitosterol; BLD2 là một flavonoid: artemetin hay erianthin; BLE1 được xác định là campesterol; BLE2 là một acid thơm: acid protocatechuic.

3.1.2. Kết quả đánh giá tác dụng điều trị của vị thuốc Hạ khô thảo nam trên mô hình thực nghiệm suy thận mạn

3.1.2.1. Tình trạng chung, tỷ lệ sống chết của các nhóm chuột

Khác với lơ chứng bệnh tình trạng chung ở tuần 3 của lô chuột dùng Hạ khô thảo nam đều cải thiện (lông đỡ bết, đỡ xù, chuột nhanh nhẹn, ăn khá hơn). Trọng lượng cơ thể của lô chuột dùng Hạ khô thảo nam đều tăng so với trước nghiên cứu và cao hơn lô chứng bệnh, p < 0,05.

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

Biểu đồ 3.1. Tỷ lệ chuột sống, chết

Sau nghiên cứu, lô chứng bệnh (lô 2) chuột uống nước cất có tỷ lệ chết cao nhất (53,33%), cao hơn ở lô dùng Hạ khô thảo nam liều 4g DL/kg TLCT/ngày (lô 3) và lô chứng sinh học (lô 1), p < 0,05.

3.1.2.2. Ảnh hưởng của HKTN đến nồng độ urê, creatinin huyết thanh chuột

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của HKTN đến nồng độ urê huyết thanh

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của HKTN đến nồng độ creatinin huyết thanh

Kết quả Bảng 3.1 và 3.2 cho thấy: trước nghiên cứu, cả 3 lơ chuột suy thận mạn có chỉ số urê, creatinin máu tương đương nhau, p > 0,05 và cao hơn lô chứng sinh học, p < 0,05. Sau nghiên cứu, 2 lô dùng Hạ khô thảo nam đều có chỉ số urê, creatinin máu thấp hơn so với lô chứng bệnh, p < 0,05, chỉ số creatinin máu giảm so với trước điều trị, p < 0,05.

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

3.1.2.3. 3.1.2.3. Ảnh hưởng của HKTN đến một số chỉ số công thức máu chuột

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của HKTN đến số lượng hồng cầu

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của HKTN đến nồng độ hemoglobin

Kết quả Bảng 3.3, Bảng 3.4 cho thấy, sau nghiên cứu, lơ dùng Hạ khơ thảo nam có số lượng hồng cầu, hemoglobin không khác biệt so với lô chứng sinh học với p > 0,05 và cao hơn lơ chứng bệnh, p < 0,05.

Ngồi ra, kết quả nghiên cứu chỉ số bạch cầu và tiểu cầu khơng có sự thay đổi giữa các lơ và của từng lô giữa các thời điểm, p > 0,05.

3.1.2.4. Hình ảnh mơ bệnh học thận

(1: Cầu thận, 2: khoang Bowman, 3: tổ chức xơ, 4: ống thận giãn)

Hình 3.1. Hình ảnh mơ bệnh học nhu mô thận các lô (200X)

</div>