Đánh giá sự thuần nhất của quần thể tế bào gốc trung mô được phân lập từ lớp lót trong tĩnh mạch dây rốn trẻ sơ sinh trong nuôi cấy in vitro

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến cố
GS.TS.
Nguyễn
Mộng Hùng, nguyên Trưởng phòng Công nghệ Tế bào Động vật –
Trung
tâm Nghiên cứu
Khoa học Sự sống. Thày là người đã đặt nền móng đầu tiên cho sự phát triển phòng Công
nghệ Tế bào Động vật để ngày hôm nay chúng tôi được học tập và nghiên cứu khoa học một
cách tốt nhất.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Lai Thành và ThS. Đặng Văn Đức, những
người thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cũng như kinh nghiệm
làm
việc từ
khi tôi bước vao nghiên cứu khoa học. Trong quá trình làm việc, các thầy luôn theo sát,
hướng dẫn tận tình cũng như đưa ra những lời nhận xét, góp ý quý báu để tôi có thể thực
hiện tốt
nghiên
cứu của
mình.
Tôi xin chân thành cám ơn tập thể cán bộ tại khoa D2, bệnh viện Phụ Sản Hà Nội
cũng như Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương đã tạo điều kiện giúp đỡ để tôi có được
điều kiện tốt nhất trong quá trình thực hiện những nghiên cứu của mình.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo công tác tại bộ môn Tế
bào – Mô phôi và Lý sinh cũng như các thày cô trong Khoa Sinh học đã truyền đạt cho tôi
những kiến thức cơ sở để tôi có thể thực hiện được khóa luận tốt nghiệp cũng như vận dụng
trong công việc sau này.
Ngoài ra, tôi còn phải gửi lời cảm ơn đến các anh, các chị, các bạn và các em sinh
viên đang học tập và công tác tại phòng Công nghệ Tế bào Động vật – những người đã nhiệt
tình giúp đỡ, hỗ trợ trong công việc học tập và nghiên cứu của tôi.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân đã quan tâm, động viên tinh

thần trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Cuối cùng, nghiên cứu của tôi được thực hiện dựa trên kinh phí đề tài nhánh cấp nhà
nước: “Nghiên cứu phân lập, nhân nuôi tế bào gốc MSC mạch máu dây rốn trẻ sơ sinh và
tế bào gốc phôi chuột. Theo dõi các tế bào gốc trong cơ thể nhận trong điều trị bệnh suy tủy
sau chiếu xạ liều cận chết ở động vật thí nghiệm”, mã số KC.04.01/06–10 do TS. Nguyễn
Lai Thành làm chủ nhiệm đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Khoa học và Công nghệ cùng
Ban Chủ nhiệm đề tài KC–04.04/06–10.
Hà Nội, tháng 6 năm 2011
Nguyễn Hồng Trường

Khóa luận tốt nghiệp 2011 Danh mục viết tắt
DANH MỤC VIẾT TẮT
Từ viết tắt Viết đầy đủ
BMP Bone morphogenetic protein
CD Cluster of differentiation
CFU–F Fibroblastic colony forming unit
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid
FBS Fetal bovine serum
MAPC Multipotent adult progenitor cell
MHC Major histocompatibility complex
MPC Mesodermal progenitor cell
MSC Mesenchymal stem cell
PBS Phosphate buffer saline
TGF Transforming growth factor
UV–MSC Umbilical vein derived mesenchymal stem cell
VEGF Vascular endothelial growth factor
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Mục lục
MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ 3
1.1.1. Định nghĩa tế bào gốc trung mô 3
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu tế bào gốc trung mô 3
1.1.3. Các nguồn thu nhận MSC 5
1.1.4. Các đặc điểm của MSC 6
1.1.4.1. Khả năng tự đổi mới 6
1.1.4.2. Chỉ thị bề mặt của MSC 8
1.1.4.3. Tiềm năng biệt hóa của MSC 9
1.1.5. Ứng dụng của tế bào gốc trung mô 12
1.1.5.1. Các bệnh về tim 12
1.1.5.2. Các bệnh về xương 12
1.1.5.3. Các bệnh về sụn 13
1.1.5.4. Các bệnh về gân 13
1.1.5.5. Các bệnh về thần kinh 14
1.1.5.6. Điều trị bỏng và tái tạo da 14
1.1.6. Nghiên cứu MSC ở Việt Nam 14
1.2. TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ TĨNH MẠCH DÂY RỐN 15
1.2.1. Cấu trúc dây rốn 15
1.2.2. Tế bào gốc trung mô từ tĩnh mạch dây rốn 16
1.3. FLOW CYTOMETRY VÀ ÚNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH DI
TRUYỀN TẾ BÀO 18
1.3.1. Lịch sử nghiên cứu Flow cytometry 18
1.3.2. Hệ thống Flow cytometry và nguyên tắc hoạt động 20
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 22
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU, VẬT TƯ, THIẾT BỊ 22
2.2.1. Dụng cụ vật tư tiêu hao 22
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học

Khóa luận tốt nghiệp 2011 Mục lục
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu 23
2.2.3. Hóa chất 24
2.2.3.1. Môi trường nuôi cấy tế bào 25
2.2.3.2. Các dung dịch Enzyme 25
2.2.3.3. Các dung dịch khác 25
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.3.1. Quy trình thí nghiệm 26
2.3.2. Thu nhận dây rốn 26
2.3.3. Phân lập MSC từ lớp lót tĩnh mạch dây rốn 26
2.3.4. Phương pháp phủ gelatin lên bề mặt nuôi cấy 29
2.3.5. Phương pháp nuôi cấy chọn lọc MSC 29
2.3.6. Phương pháp cấy chuyển tế bào 30
2.3.7. Phương pháp phân tích tế bào bằng Flow Cytometry 30
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
3.1. KẾT QUẢ NUÔI CẤY VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ THUẦN NHẤT CỦA
QUẦN THỂ TẾ BÀO NUÔI CẤY NGUYÊN PHÁT 31
3.1.1. Kết quả phân lập và đánh giá độ thuần nhất của quần thể tế
bào khi mới được phân lập 31
3.1.2. Kết quả nuôi cấy chọn lọc quần thể tế bào 34
3.2. KẾT QUẢ NUÔI CẤY VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ THUẦN NHẤT CỦA
QUẦN THỂ TẾ BÀO NUÔI CẤY THỨ PHÁT 36
3.2.1. Kết quả nuôi cấy và đánh giá độ thuần nhất của quần thể tế
bào sau lần cấy chuyển thứ nhất (16 ngày) 36
3.2.2. Kết quả đánh giá chất lượng quần thể tế bào gốc trung mô sau
thời gian nuôi cấy lâu dài in vitro (40 ngày) 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40
KẾT LUẬN 40
KIẾN NGHỊ 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Danh mục hình minh họa
DANH MỤC HÌNH MINH HỌA
Hình 1. Khả năng tự đổi mới của MSC 6
Hình 2. Tiềm năng biệt hóa của MSC 10
Hình 3. Những giải thích khả dĩ cho tính mềm dẻo của tế bào gốc 11
Hình 4. Cấu tạo của dây rốn 16
Hình 5. Sơ đồ của một máy Flow cytometry điển hình 21
Hình 6. Dây rốn trẻ sơ sinh thu nhận từ bệnh viện Phụ sản Hà Nội 22
Hình 7. Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm 26
Hình 8. Rửa bề mặt dây rốn bằng dung dịch muối Ringer 27
Hình 9. Bơm Collagenase vào trong tĩnh mạch dây rốn 28
Hình 10. Ủ dây rốn trong dung dịch Ringer ở 370C 28
Hình 11. Mát – xa dây rốn 29
Hình 12. Tế bào 2 ngày nuôi cấy in vitro sau khi phân lập 32
Hình 13. Kết quả phân tích quần thể tế bào phân lập từ lớp lót tĩnh mạch bằng
phương pháp dòng chảy tế bào 33
Hình 14. Tế bào sau 7 ngày nuôi cấy chọn lọc dòng tế bào gốc 35
Hình 15. Tế bào sau 14 ngày nuôi cấy chọn lọc dòng tế bào gốc 36
Hình 16. Quần lạc tế bào gốc trung mô sau 16 ngày nuôi cấy 37
Hình 17. Kết quả phân tích quần thể tế bào sau 16 ngày nuôi cấy và chọn lọc 37
Hình 18. Quần lạc tế bào gốc trung mô sau 40 ngày nuôi cấy 38
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Danh mục hình minh họa
Hình 19. Kết quả phân tích quần thể tế bào sau 40 ngày nuôi cấy và chọn lọc 39
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Danh mục bảng
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Dữ liệu về sự biểu hiện chỉ thị bề mặt của MSC 8
Bảng 2. Lịch sử phát triển của Flow cytometry 18

Bảng 3. Dụng cụ và vật tư tiêu hao được sử dụng trong đề tài 22
Bảng 4. Các thiết bị nghiên cứu được sử dụng trong đề tài 23
Bảng 5. Các hóa chất được sử dụng trong đề tài 24
Bảng 6. Thành phần của môi trường nuôi cấy tế bào 25
Bảng 7. Nồng độ của các dung dịch enzyme 25
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Mở đầu
MỞ ĐẦU
Những nghiên cứu mở rộng về tế bào gốc người đã trở thành một lĩnh vực ngày
càng nhận được sự quan tâm trong suốt một thập kỷ qua. Việc sử dụng tế bào gốc
người đã cung cấp một công cụ hiệu quả và đa dạng các phương pháp điều trị một số
bệnh trong y học. Một nỗ lực là việc tìm kiếm tế bào gốc đa tiềm năng trong các mô
trưởng thành và tránh vấn đề về đạo đức cũng như là vấn đề tạo khối u khi sử dụng tế
bào gốc phôi người.
Một loại tế bào gốc đa tiềm năng là tế bào gốc trung mô đã trở thành ứng viên
cho một số ứng dụng trong liệu pháp thay thế và sửa chữa tế bào cũng như công nghệ
mô trong y học tái tạo nhờ vào tiềm năng biệt hóa đa dạng của nó. Tế bào gốc trung mô
(Mesenchymal stem cells – MSCs) là tế bào có khả năng tăng sinh và biệt hóa thành
nhiều dòng tế bào trung mô khác nhau bao gồm tế bào mỡ, xương, sụn và gân. Hơn
thế, các nhà khoa học còn tìm ra được điều kiện cảm ứng đặc hiệu để biệt hóa MSCs
thành các dòng tế bào không phải trung mô như tế bào gan, thận, cơ tim, thần kinh.
MSCs có thể được phân lập và nhân lên trong điều kiện ex vivo mà không làm thay đổi
đáng kể về kiểu hình và đặc tính của chúng.
Trước đây, tủy xương là nguồn chính để phân lập MSCs cho nghiên cứu trong
phòng thí nghiệm cũng như lâm sàng. Tuy nhiên, phân lập MSCs từ tủy xương gặp một
số hạn chế nhất định. Do đó, các nhà khoa học đã và đang tiến hành tìm kiếm các
nguồn phân lập MSCs thay thế. Ngoài tủy xương, MSCs có thể được phân lập từ các
nguồn như: một số cơ quan và máu của bào thai trước sinh, dịch ối và dây rốn. Trong
đó, dây rốn là nguồn phân lập MSCs có tiềm năng nhất vì đã khắc phục được các hạn
chế gặp phải khi phân lập MSCs từ tủy xương. Hơn thế, dây rốn là nguồn cung cấp

MSCs rất dồi dào và luôn sẵn có vì chúng là rác thải sinh học sau khi em bé ra đời.
MSCs có thể được phân lập từ các nguồn khác nhau trong dây rốn, đó là máu,
Wharton’s jelly (lớp mô đệm của dây rốn), màng lót và lớp nội mô tĩnh mạch dây rốn.
Trong số đó, phân lập MSCs từ tĩnh mạch dây rốn là hướng đi mới nhất và đang được
nghiên cứu rộng rãi.
MSC được phân lập từ các nguồn khác nhau không đại diện cho một quần thể tế
bào đồng nhất. Hiện nay, vẫn chưa có cách nào đơn giản để xác định MSC bằng một
dấu hiêu đơn nhất. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Đánh giá sự thuần
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Mở đầu
nhất của quần thể tế bào gốc trung mô được phân lập từ lớp lót trong tĩnh mạch dây rốn
trẻ sơ sinh trong nuôi cấy in vitro“ nhằm đánh giá sự biểu hiện các marker bề mặt của
MSC trong từng giai đoạn nuôi cấy từ đó chủ động nguồn tế bào gốc trung mô phục vụ
cho các nghiên cứu tiếp theo.
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương 1 – Tổng quan
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ
1.1.1. Định nghĩa tế bào gốc trung mô
Tổng hợp từ các kết quả nghiên cứu trước đó, Soufiane Ghannam đã đưa ra ba
tiêu chuẩn sau để định nghĩa MSC [27]:
• Là một quần thể các tế bào tăng sinh in vitro, bám dính vào bề mặt nhựa, có
khả năng phát triển thành các quần lạc dạng nguyên bào sợi.
• Không biểu hiện các chỉ thị bề mặt CD11b, CD14, CD34, CD45 nhưng biểu
hiện CD73, CD90, và CD105.
• Có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào trung mô có nguồn gốc khác
nhau gồm xương, mỡ, sụn.
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu tế bào gốc trung mô
“Trung mô” là thuật ngữ để chỉ mô liên kết thưa đang phát triển của một phôi,
chủ yếu bắt nguồn từ trung bì, và tạo ra phần lớn các tế bào của mô liên kết ở cơ thể

trưởng thành. Định nghĩa thường được mở rộng để bao hàm các tế bào mô liên kết ở
mô trưởng thành như mô nguyên bào sợi (cơ), xương, sụn, mỡ, dây chằng,… [51].
Sự xuất hiện của các tế bào tiền trung mô đã được ghi nhận từ cuối thế kỷ 19
với các nghiên cứu của Goujon năm 1869, ông là người đầu tiên mô tả tiềm năng biệt
hóa thành xương trong cấy ghép lệch vị trí của tủy xương thỏ, và sau đó được xác nhận
ở thí nghiệm cấy ghép của Biakow năm 1870. Năm 1960, Danis chứng minh rõ ràng
hơn rằng toàn bộ tế bào tủy xương có thể tạo thành xương và đó không phải là tế bào
được cảm ứng, hay hấp dẫn hóa học cho các tế bào xương. Tiềm năng tạo xương của
tủy xương đã được chứng minh bằng thí nghiệm cấy ghép tế bào tủy xương lên các vị
trí khác nhau trên cơ thể. Phân tích mô học ở các vị trí cấy ghép cho thấy có sự hình
thành của các mô mang chất nền của xương và tủy xương, các mô này cũng có thể hỗ
trợ cho quá trình tạo máu ở cơ thể nhận. Người ta cũng tiến hành những thí nghiệm cấy
ghép tương tự như vậy nhưng sử dụng các ống khuếch tán gồm các màng bán thấm
được ngăn bởi một vòng nhựa để ngăn cản sự đi qua của các tế bào cho hoặc tế bào từ
cơ thể nhận đi qua. Những ống này có chứa hoặc là mẫu tủy xương hoặc là các dịch
huyền phù tế bào tủy xương được cấy ghép. Thí nghiệm cho thấy sự hình thành của các
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương 1 – Tổng quan
mô tạo xương bên trong ống sau một tháng. Điều này cho thấy, không phải các tế bào
của người cho thu hút các tế bào tạo xương của người nhận, mà là có sự tồn tại một
loại tế bào tiền thân có tiềm năng biệt hóa thành xương bên trong chất nền tủy xương
được cấy ghép. Những thí nghiệm tương tự được thực hiện để khẳng định bởi các
nhóm khác [24].
Sau đó, năm 1973 Friedenstein và cộng sự chỉ ra rằng tiềm năng tạo xương của
tủy xương là tính chất của một loại quần thể tế bào nhỏ, gọi là các tế bào hình thành
quần lạc nguyên bào sợi (fibroblast colony forming cell–FCFC) hay các đơn vị hình
thành quần lạc dạng nguyên bào sợi (colony forming units–fibroblastic, CFU–F). Quá
trình nuôi cấy in vitro tủy xương của giống chuột khoang ở mật độ thấp trong môi
trường có huyết thanh đã tạo ra các quần lạc giống như nguyên bào sợi bắt nguồn từ
một tế bào duy nhất. CFU–F có khả năng tăng sinh in vitro cao, nhưng trong điều kiện

in vivo thì ở trạng thái nghỉ. Những nghiên cứu cấy ghép sử dụng các ống khuếch tán
có chứa CFU–F nuôi cấy của giống chuột khoang vào xoang trong phúc mạc của động
vật chủ tạo nên sự hình thành xương, điều mà không thu được khi cấy ghép nguyên bào
sợi thu từ tụy. Phát hiện này đã được chứng minh và mở rộng bởi những nhà nghiên
cứu khác, với những chứng minh về sự hình thành xương, sụn và các mô sợi bên trong
ống khuếch tán được tiêm vào cùng với các nguyên bào sợi từ tủy xương được nuôi
cấy [37].
Friedenstein (1980) còn chỉ rõ, CFU–F đã được hình thành từ những tế bào đơn
lẻ, một số CFU–F này còn có thể hình thành cả xương lẫn vi môi trường cần thiết cho
sự hình thành những phân tử tạo máu. Điều này đã dẫn đến khái niệm về sự tồn tại của
một loại tế bào chất nền không biệt hóa nằm ở tủy xương, có khả năng hình thành cả
xương và sụn; tuy nhiên không thể loại trừ khả năng có tồn tại các tế bào gốc đã định
hướng, mà mỗi tế bào tạo ra một loại tế bào chuyên hóa khác nhau. Để làm sáng tỏ vấn
đề này, các dòng nguyên bào sợi đơn lẻ được cấy ghép vào lớp dưới vỏ thận. Khoảng
15% số quần lạc được cấy ghép tạo ra một cơ quan tủy xương bao gồm mô tạo xương,
các tế bào mỡ thông thường và các tế bào chất nền tủy xương. Bởi vậy, các quần lạc
bắt nguồn từ một tế bào đơn nhất có khả năng tạo ra nhiều dòng tế bào khác nhau [37].
Khái niệm về việc tế bào gốc đa tiềm năng bắt nguồn từ chất nền nằm ở tủy
xương đã được chính thức đưa ra lần đầu tiên bởi Owen năm 1978. Ông cho rằng các
loại tế bào biệt hóa nằm trong chất nền tủy xương có thể bắt nguồn từ một tế bào tiền
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương 1 – Tổng quan
thân hay tế bào gốc chung, tương tự các nhân tố tạo máu trong tủy xương. Trên cơ sở
giả thuyết này, ông cũng đã mở rộng và đề xuất mô hình chi tiết hơn, trong đó các tế
bào gốc, tế bào tiền thân được định hướng, và tế bào trưởng thành đều xuất hiện trong
chất nền tủy xương, với khả năng biệt hóa thành các tế bào lưới, nguyên bào sợi, mỡ,
và tế bào tạo xương, Vào năm 1991, Caplan tiếp tục mở rộng học thuyết này và cho
rằng tế bào gốc hay tiền thân chung đó có khả năng biệt hóa thành tất cả các tế bào
thuộc dòng trung mô, cụ thể là các tế bào cơ, sụn, gân, xương, mỡ và nguyên bào sợi
chất nền. Ông là người đầu tiên sử dụng thuật ngữ “Tế bào gốc trung mô”, tuy nhiên

không có bằng chứng thực nghiệm nào tại thời điểm đó ủng hộ học thuyết này [37].
Việc chứng minh tính đa tiềm năng của MSC, hay CFU–F đều được thực hiện
từ các thí nghiệm trên quần thể tế bào. Đến năm 1999, Pittenger và cộng sự đã chứng
minh được rằng các quần thể tạo quần lạc MSC người có khả năng biệt hóa in vitro
thành các tế bào xương, sụn, mỡ [42]. Cũng về tiềm năng biệt hóa của MSC, L.Song và
R S. Tuan đã chứng minh được tính biệt hóa chéo của MSC: các nguyên cốt bào được
biệt hóa từ MSC có khả năng biệt hóa chéo thành các tế bào mỡ cũng như sụn, và
ngược lại. Ngoài ra nguyên cốt bào đã biệt hóa hoàn toàn từ MSC có thể giải biệt hóa
và giữ được tính đa tiềm năng [53]. Đặc biệt, năm 2001 M.Reyes và cộng sự đã phân
lập và duy trì ex vivo các tế bào từ tủy xương sau khi sinh, có thể biệt hóa không chỉ
thành các tế bào có nguồn gốc trung bì mầm chi mà còn thành các tế bào có nguồn gốc
trung bì tạng, ví dụ như nội mô. Các tế bào này được họ gọi là “Tế bào tiền thân trung
bì” (mesodermal progenitor cell–MPC) [48] mà một năm sau đó, Jiang và cộng sự gọi
là “Tế bào tiền thân trưởng thành đa tiềm năng có định hướng” (Multipotent adult
progenitor cells – MAPC) và chứng minh tính đa tiềm năng của loại tế bào này [30],
qua đó phần nào chứng minh rằng tế bào gốc trưởng thành cũng có tiềm năng không
kém gì tế bào gốc phôi.
1.1.3. Các nguồn thu nhận MSC
Trước đây, nguồn thu nhận chính của MSC vẫn là tủy xương. Hiện nay, có
nhiều phương pháp để phân lập MSC từ tủy xương, không chỉ là từ người mà còn từ
nhiều loài động vật khác như chuột, thỏ, mèo, cừu, [40, 46, 49, 57]. Tuy nhiên, việc
thu nhận MSC từ tủy xương gây đau đớn cho bệnh nhân, dễ nhiễm khuẩn và đặc biệt là
tiềm năng của MSC thu được từ nguồn này giảm dần theo tuổi của bệnh nhân. Do đó
việc tìm kiếm nguồn thu nhận MSC thay thế tủy xương là một hướng nghiên cứu đầy
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương 1 – Tổng quan
hứa hẹn cho việc tập trung vào các nguồn thu nhận khác có tiềm năng lớn hơn như khả
năng tăng sinh nhanh, dễ thu nhận cũng như khả năng nhiễm khuẩn thấp.
Ngày càng có nhiều báo cáo về việc phân lập MSC từ các nguồn khác nhau như
mô mỡ, máu ngoại vi, mạch, da, dịch ối và thậm chí từ răng sữa [5, 9, 41]. MSC được

phân lập từ các nguồn khác nhau có những khác biệt trong sự biểu hiện của những chỉ
thị phân tử bề mặt nhất định [64], tiềm năng tăng sinh và biệt hóa [28, 47].
Trong các nguồn trên thì dây rốn là nơi có thể thu nhận được nhiều quần thể
MSC nhất. Gần đây, một số nhóm thành công trong việc phân lập MSC từ nhiều vị trí
khác nhau của dây rốn. Romanov và cộng sự (2003) đã tìm ra phương pháp chọn lọc
MSC từ qui trình phân lập tế bào nội mô tĩnh mạch dây rốn ở người và Baksh (2007)
báo cáo nghiên cứu so sánh cho thấy rằng MSC phân lập từ tĩnh mạch dây rốn tăng
sinh nhanh hơn và khác biệt tiềm năng so với MSC phân lập từ tủy xương. Vì vậy, tĩnh
mạch dây rốn được cho là một nguồn hứa hẹn của MSC [50].
1.1.4. Các đặc điểm của MSC
1.1.4.1. Khả năng tự đổi mới
Một trong những đặc trưng của tế bào gốc là khả năng tự đổi mới, tạo ra những
tế bào con giống hệt với tế bào mẹ qua một quãng thời gian dài (thậm chí toàn bộ đời
sống của sinh vật) [23, 52].
Hình 1. Khả năng tự đổi mới của MSC
Các tế bào gốc phân chia liên tục, một trong hai tế bào con giữ các vẫn giữ các đặc điểm của
tế bào gốc trong khi tế bào còn lại phân chia thành các tế bào gốc đa tiềm năng có định
hướng và từ đó hình thành các tế bào chuyên hóa [46].
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương 1 – Tổng quan
Theo các tác giả Reyes và Colter thì MSC thu được từ tủy xương ở người là một
quần thể hỗn hợp nhiều loại tế bào khác nhau. Chúng gồm ba loại tế bào có hình thái,
sinh lý, biểu hiện chỉ thị bề mặt, khả năng tăng sinh và biệt hóa khác nhau: các tế bào
nhỏ thuôn dài có khả năng tăng sinh cao, các tế bào lớn hơn phẳng hoặc h́nh đa giác có
khả năng tăng sinh chậm và các tế bào nhỏ tăng sinh rất nhanh mà được cho là các tế
bào gốc sớm nhất và có tiềm năng biệt hóa mạnh nhất (MAPC) [14, 30, 48].
Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, MSC ban đầu bám vào bề mặt chai nuôi cấy
và có hình dạng giống nguyên bào sợi, chúng phát triển thành những quần lạc đối xứng
sau 5 đến 7 ngày nuôi cấy. Mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu không chỉ ảnh hưởng đến
sự tăng sinh của MSC mà còn ảnh hưởng đến hình thái của chúng. Khi tế bào sinh

trưởng ở mật độ thấp, chúng phần lớn biểu hiện hình dạng sợi, nhưng khi đạt mật độ đủ
để cấy chuyển và bắt đầu sinh trưởng thành những mảng song song thì các tế bào trở
nên dẹt hơn [57]. Trong những nghiên cứu ban đầu của Friedenstein và cộng sự, MSC
có thể duy trì đến 20 lần nhân đôi quần thể. Tuy nhiên mới đây, dưới những điều kiện
tối ưu, MSC có thể được duy trì đến lần nhân đôi quần thể thứ 61 [36]. Điều này cho
thấy tiềm năng tăng sinh rất lớn của loại tế bào này. Số lần nhân đôi cao là hệ quả của
việc thêm các nhân tố sinh trưởng như nhân tố sinh trưởng nguyên bào sợi 2 (FGF–2)
vào môi trường cơ bản [7]. Tương tự tế bào sinh dưỡng, telomere của MSC ngắn dần
trong các lần phân chia, FGF–2 làm trì hoãn, nhưng không loại bỏ sự lão hóa của tế
bào. Sự ngắn dần của telomere thường dẫn đến sự trì trệ tăng sinh, nhưng nó có thể
được sửa chữa bởi các telomerase sau khi phân chia tế bào, do đó làm gia tăng đời sống
của tế bào.
Trong điều kiện in vivo, MSC được giữ ở trạng thái nghỉ, không phân chia
(giai đoạn G0 trong chu trình tế bào) như đã được chứng minh ở nghiên cứu của
Friedenstein (1974) và Song (2005) [45]. Vì phần lớn các mô hay cơ quan được sử
dụng để thu MSC có tốc độ thay thế khá thấp ở các sinh vật trưởng thành, nên có
thể giả định rằng sự tự đổi mới hay tăng sinh của MSC thường bị ức chế in vivo
do quá trình cân bằng tự nhiên của mô và có thể được điều hòa bởi các nhân tố
bên trong có mặt ở vi môi trường quanh MSC hoặc qua tương tác trực tiếp hoặc
gián tiếp với các tế bào xung quanh.
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương 1 – Tổng quan
1.1.4.2. Chỉ thị bề mặt của MSC
Cho đến nay, người ta vẫn chưa xác định được một chỉ thị đặc hiệu đơn nhất
nào cho MSC. MSC biểu hiện một số lượng lớn các phân tử kết dính, các protein chất
nền ngoại bào, các cytokine và các thụ thể cho nhân tố sinh trưởng, liên quan đến chức
năng và các tương tác tế bào của chúng. Chúng cũng biểu hiện nhiều kháng nguyên đặc
trưng cho các loại tế bào khác. Tuy nhiên, MSC được phân lập từ nhiều nguồn khác
nhau chỉ có một vài sai khác về chỉ thị bề mặt xuất hiện giữa các quần thể khác nhau.
Đặc biệt là MAPC lại không biểu hiện những chỉ thị đặc hiệu và đã biết ở các MSC

được phân lập cho đến nay [30]. Chúng có thể được phân biệt với các tế bào trưởng
thành hơn nó nhờ sự có mặt của các epitope bề mặt đặc hiệu và các protein được biểu
hiện như thụ thể cho nhân tố sinh trưởng nội mô mạch máu 2 (vascular endothelial
growth factor receptor 2–VEGFR–2), thụ thể tyrosine kinase, thụ thể transferrin và
annexin II. Các tế bào này không biểu hiện Stro–1 [19, 48].
Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, sự biểu hiện của một số kháng nguyên có thể
bị thay đổi, do những điều kiện nuôi cấy đặc biệt và thời gian trước mỗi lần cấy
chuyển. Thú vị là, một số kháng nguyên được biểu hiện trên MSC ngay sau khi phân
lập, nhưng sau đó lại biến mất trong khi duy trì, ví dụ như CD34. Phân tử CD34 biểu
hiện trên MSC thu được từ phôi thai chuột, nhưng không biểu hiện in vitro khi nuôi
cấy [22]. Điều này có thể giải thích là do sự biểu hiện của phân tử này biến mất trong
quá trình trưởng thành. Các phân tử có hiện tượng tương tự như trên là các thụ thể
chemokine như CCR1, CCR7, Việc thay đổi trong kiểu hình của MSC có liên quan
đến việc tăng số tế bào dừng lại ở G0 và sự kích thích của con đường chết theo chương
trình [9].
Sự thay đổi trong biểu hiện kháng nguyên cũng được thể hiện ở các MSC trải
qua quá trình biệt hóa. Ví dụ, phân tử CD166 trình diện trên MSC chưa biệt hóa nhưng
lại biến mất khỏi các tế bào đã trải qua quá trình biệt hóa thành tế bào xương. Hơn nữa,
các dòng tế bào thu được từ các mô khác nhau có thể khác nhau đôi chút về các phân
tử bề mặt. Ví dụ như MSC phân lập từ mô mỡ có thêm CD49d, CD62e và CD31 so với
MSC phân lập từ tủy xương [34].
Bảng 1. Dữ liệu về sự biểu hiện chỉ thị bề mặt của MSC
Loại chỉ thị
Tên chỉ thị
Dương tính Âm tính
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương 1 – Tổng quan
Kháng nguyên
đặc hiệu
SH2, SH3, SH4, Stro–1,

ACTA1
CD133
Chỉ thị tế bào tạo
máu
CD4, CD14, CD34, CD45,
(PTPRC), c–kit/SCFR (CD117)
Các thụ thể
cytokine và nhân
tố sinh trưởng
IL1R, IL3R, IL4R, IL6R, IL7R,
LIFR, SCFR, G–CộNG SựFR,
IFNγR, TNFR1, TNFR2,
TGFβR1, TGFβR2, bFGFR,
PDGFR, EGFR
IL–2R (CD25)
Các phân tử kết
dính
Các Integrin α1(CD49a),
α2(CD49b), α3(CD49c),
aα(CD49c), β1(CD29),
β3(CD61), β4(CD104)
α4(CD49d), αL(CD11a),
Cβ2(CD18)
Các phân tử và
thụ thể chất nền
ngoại bào
ICAM–1 (CD54), ICAM–2
(CD102), VCAM–1 (CD106),
ALCAM –1 (CD166), LFA3
(CD58), L–selectin (CD62L),

endoglin (CD105), hyaluronate
(CD44), CK18, CK19
ICAM –3 (CD50), E–selectin
(CD62E), P–selectin (CD62P),
PECAM –1 (CD31), vWF,
Cadherin 5
Các chỉ thị khác
CD9, CD13, Thy–1 (CD90),
HLA–ABC (MHC I) (thấp)
HLA–DR (MHC II)
Đây là những dẫn liệu thu được từ các nhóm nghiên cứu của Pittenger, Minguel,
Majumdar, Wagner [37].
1.1.4.3. Tiềm năng biệt hóa của MSC
Ngay từ sau khi phát hiện được MSC vào những năm 1960, người ta đã bắt đầu
nghiên cứu về tiềm năng biệt hóa của nó trong in vitro. Trong những nghiên cứu ban
đầu, các nhà khoa học đã chứng minh được rằng MSC phân lập từ tủy xương của
người, chó, thỏ, chuột có khả năng biệt hóa thành các tế bào có nguồn gốc trung bì.
Mới đây, qua nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học, chúng ta biết được rằng
MSC không chỉ có khả năng biệt hóa thành các tế bào có nguồn gốc từ trung bì mà còn
có thể biết hóa thành nhiều loại tế bào có nguồn gốc từ cả ba lá phôi, gồm cả nguyên
bào xương, tế bào sụn, tế bào mỡ, nguyên bào sợi, nguyên bào cơ và tế bào cơ tim, tế
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương 1 – Tổng quan
bào gan, tế bào nội mô, và thậm chí là cả tế bào thần kinh [30, 35, 38, 43, 50]. Hiện
tượng này được gọi là “Tính mềm dẻo của tế bào gốc” .
Hình 2. Tiềm năng biệt hóa của MSC
Tế bào gốc trung mô có khả năng biệt hóa thành các tế bào có nguồn gốc khác nhau như
nguyên bào xương, tế bào sụn, tế bào mỡ,… thậm chí là tế bào thần kinh, tế bào cơ tim,…
[12].
Ít nhất có bốn giải thích khả dĩ cho tính mềm dẻo của tế bào gốc [62, 63] (Hình

3). Trước nhất, ở cùng một mô nhất định có thể tồn tại những loại tế bào gốc không
liên quan gì đến mô đó, ví dụ như tế bào gốc tạo máu tồn tại ở cơ. Chính những tế bào
này đã tăng sinh cùng với tế bào được phân lập có chủ đích. Thứ hai là, có thể các tế
bào được cấy ghép đã dung hợp với tế bào chủ của một dòng khác, dẫn đến sự chuyển
thông tin di truyền của tế bào cấy ghép vào trong tế bào vật chủ, từ đó dẫn đến sự biểu
hiện của một số đặc tính gốc trong các tế bào quan sát được. Do đó, tính mềm dẻo có
thể quan sát thấy ở những mô có thể tồn tại thể tứ bội như là cơ, gan, tế bào Purkinje.
Sự dung hợp tế bào có thể thấy trong quá trình đồng nuôi cấy tế bào gốc phôi và tế bào
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương 1 – Tổng quan
soma. Giải thích thứ ba liên quan đến quá trình tái lập trình ở nhân và giải biệt hóa
cũng như tái biệt hóa của tế bào. Người ta đã quan sát thấy ở cừu Dolly quá trình tái
lập trình ở nhân để đạt trạng thái nhiều tiềm năng khi tiêm nhân của tế bào soma vào
trong tế bào chất của một trứng không được thụ tinh. Quá trình giải biệt hóa và tái biệt
hóa cũng được cho là cơ sở của khả năng tái tạo ngẫu nhiên các chi ở lưỡng cư và cá.
Giải thích cuối cùng cho rằng các tế bào với tính nhiều tiềm năng vẫn còn tồn tại ngay
cả sau quá trình phát triển phôi. Có thể lấy ví dụ là loại tế bào MAPC. Tuy nhiên vẫn
chưa có dẫn liệu chứng minh rằng MAPC có tồn tại in vivo [63].
Hình 3. Những giải thích khả dĩ cho tính mềm dẻo của tế bào gốc.
(a) Tế bào gốc ở một mô nhất định có thể xuất hiện ở một cơ quan không liên quan. (b) Tính
nhiều tiềm năng có thể do các tế bào cấy ghép dung hợp với tế bào chủ của một dòng khác,
dẫn đến chuyển thông tin di truyền từ tế bào cấy ghép sang tế bào chủ. (c) Tính mềm dẻo có
thể xảy ra qua loại và tái biệt hóa, giống như trong trường hợp nhân dòng hay tái tạo chi ở
lưỡng cư. (d) Các tế bào với những đặc điểm nhiều tiềm năng có thể tồn tại sau quá trình phát
triển phôi [30]
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương 1 – Tổng quan
1.1.5. Ứng dụng của tế bào gốc trung mô
Ưu điểm chính trong việc sử dụng MSC người là chúng không gây đáp ứng
miễn dịch. MSC biểu hiện phức hệ phù hợp tổ chức chính (major histocompatibility

complex – MHC) lớp I nhưng không biểu hiện MHC lớp II cũng như các phân tử đồng
kích thích như CD40, CD80 và CD86, những phân tử gây ra đáp ứng miễn dịch; bởi
vậy, cấy ghép MSC không yêu cầu phải có sự ức chế miễn dịch ở cơ thể nhận. Thêm
vào đó, MSC có thể điều hòa hệ thống miễn dịch thông qua kích thích hay ức chế sự
tăng sinh của các tế bào miễn dịch [60]. Ngoài ra, như đã đề cập, nguồn thu nhận MSC
là rất đa dạng, do đó dễ dàng tiếp cận với tế bào MSC mà không vấp phải những vấn
đề về mặt đạo đức hay pháp luật.
Với khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào có nguồn gốc khác nhau, và với
các ưu điểm về đáp ứng miễn dịch, nguồn thu nhận,… MSC đã trở thành công cụ ứng
dụng cho các thử nghiệm lâm sàng trong y học tái tạo sửa chữa các mô, cơ quan bị sai
hỏng.
1.1.5.1. Các bệnh về tim
Điều trị lâm sàng bệnh tim bằng tế bào gốc bắt đầu với một số giai đoạn I và II
nghiên cứu sử dụng tế bào đơn nhân tủy xương. Một số giai đoạn I và II nghiên cứu
hiện đang sử dụng điều trị cho bệnh nhân nhồi máu cơ tim, bệnh cơ tim giãn, và bệnh
thiếu máu tim cục bộ.
Hiện nay, chứng nhồi máu cơ tim là một trong những bệnh về cơ tim được quan
tâm nhất. Wang và cộng sự đã chứng minh rằng MSC của chuột tham gia vào quá trình
hình thành các tế bào cơ tim mới ở cá thể khỏe mạnh. Họ tiêm MSC thu được từ cùng
cơ thể, sau đó chứng minh được rằng các MSC đó có mặt ở tim, biểu hiện các chỉ thị
của tế bào cơ tim [66]. Nhóm của Tomita và cộng sự đã sử dụng mô hình động vật có
thương tổn ở tim và chứng minh MSC đã định cư ở mô bị tổn thương và biệt hóa thành
các tế bào tim hoạt động [56].
1.1.5.2. Các bệnh về xương
Có thể nói, một trong những bệnh về xương được nghiên cứu sớm và rộng rãi
nhất là hội chứng xương bất toàn (osteogenesis imperfecta – OI), gây ra bởi sai hỏng
của gen qui định collagen loại I, dẫn đến biến đổi cấu trúc của xương. Horwitz và cộng
sự năm 1999 là những người đầu tiên ứng dụng cấy ghép MSC vào chữa trị bệnh này.
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương 1 – Tổng quan

Ba đứa trẻ mắc OI được cấy ghép tủy xương từ những anh chị em có cùng HLA của
chúng. Kết quả là tất cả ba đứa trẻ đều cho thấy có MSC nguồn gốc từ người cho nằm
ở tủy xương của người nhận. Những MSC này có khả năng biệt hóa thành các nguyên
bào xương lành lặn, dẫn đến tăng thành phần chất xương cũng như tăng tốc độ sinh
trưởng và giảm tần số xuất hiện của các mảnh xương vỡ [28].
Ứng dụng của việc sử dụng MSC trong hàn gắn xương được mô tả trong khuyết
tật xương nghiêm trọng của chuột, MSC cũng được phục vụ kiểm tra khả năng phục
hồi xương trong một mô hình lỗ hổng khuyết tật đùi ở chó. Một cách tiếp cận khác để
phục hồi xương đó là những giàn giáo canxi photphat và đĩa kim loại được phủ MSC
lên, và nuôi cấy một tuần trong điều kiện tạo xương, sau đó cấy chúng vào chuột, kết
quả là có sự đẩy mạnh quá trình hình thành xương quanh mô cấy [1].
1.1.5.3. Các bệnh về sụn
Mô sụn khó có khả năng lành trở lại khi bị tổn thương, đặc biệt ở động vật
trưởng thành, vì thế MSC cũng quan tâm nhiều trong ứng dụng cho công nghệ tạo mô
sụn, sửa chữa sụn. Một số nghiên cứu sửa chữa sụn qua việc cấy MSC vào bên trong
những cấu trúc polymere khác nhau, chẳng hạn những vật liệu polymere có thành phần
là axit hyluronic, axit polylactic.
Wakitani là người đầu tiên thực hiện những thí nghiệm in vivo trên thỏ trắng
New Zealand về khả năng sửa chữa sụn. MSC được chỉ ra là có thể biệt hóa thành các
tế bào sụn tiết ra chất nền sụn, chất mà sau đó được thay thế bằng xương ở các vùng
dưới sụn để tạo thành các lớp khác nhau ở lõi cầu đùi [65]. Sự tái tạo này dường như
xảy ra do các tế bào ở tủy xương tiết ra nhân tố biệt hóa (TGF–β và các BMP). Các thí
nghiệm sau này chỉ ra rằng, bản thân MSC không thể tái tạo lại sụn trừ khi nó được
kích thích bởi các nhân tố tạo sụn thích hợp (BMP–2, TGF–β1, IGF–1, Sox9), từ đó
nảy sinh ý tưởng là cần phải kết hợp việc cấy ghép đồng thời tế bào và các nhân tố đặc
hiệu với nhau [26, 59, 61].
1.1.5.4. Các bệnh về gân
Các mô hình thử nghiệm sửa chữa gân cho thấy, MSC đồng cấy ghép vào vật
liệu mang chất nền collagen có thể sát nhập vào mô mới. MSC đã liên kết vào các sợi
và các tế bào tại chỗ. Để sửa chữa gân Achilles, MSC khi được kết hợp với collagen

type I đã lấy lại gần 65% trường lực tối đa của gân bình thường [1].
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương 1 – Tổng quan
1.1.5.5. Các bệnh về thần kinh
MSC được kiểm tra như là các tác nhân liệu pháp cho sự sửa chữa tổn thương
não. Nghiên cứu của Chopp và Li cho thấy rằng việc cấy ghép MSC tăng cường khả
năng phục hồi sau tai biến mạch máu não hay những tổn thương khác ở não. Thêm vào
đó, khi đồng nuôi cấy in vitro MSC với các tế bào gốc thần kinh, người ta quan sát
thấy, MSC có thể biệt hóa thành tế bào thần kinh [13].
Trong mô hình bệnh Parkinson, chuột cảm ứng được tiêm MSC biểu hiện
tyrosine hydrolase, đã biểu hiện sự cải thiện quan trọng trong chức năng não. Với mô
hình đột quỵ, chuột được tiêm MSC cho thấy sự cải thiện mô thần kinh [1].
1.1.5.6. Điều trị bỏng và tái tạo da
MSC cũng được sử dụng trong điều trị các khuyết hổng da, cũng như tái tạo da
trong những năm gần đây. Nhiều báo cáo đã điều trị thành công các khuyết hổng da
như bỏng, các vết loét khó lành trong các bệnh tiểu đường MSC sau khi tăng sinh, đã
có khả năng biệt hóa in vivo thành các tế bào cơ, tế bào sợi,… khi cấy chúng vào vết
thương [3].
1.1.6. Nghiên cứu MSC ở Việt Nam
Ở nước ta hiện nay, nghiên cứu về MSC vẫn còn rất hạn chế do đó chưa thể áp
dụng công nghệ MSC vào trong y học một cách rộng rãi. Tuy nhiên, chúng ta cũng đã
đạt được những thành công bước đầu đáng ghi nhận.
Nhóm nghiên cứu của Mai Mạnh Tuấn từ bệnh viện Y học cổ truyền Trung
Ương và bệnh viện Saint Paul Hà Nội đã cấy ghép MSC trên màng Biobrane (Dow
Hickams Pharmaceuticals, Mỹ) vào những bệnh nhân bị bỏng, tổn thương trong phẫu
thuật ghép da, vết loét gan bàn chân, ngoài ra còn trên bệnh nhân được phẫu thuật thẩm
mỹ. Các kết quả đều cho thấy các vết thương đều lành nhanh hơn nhiều so với phương
pháp thông thường. Bệnh nhân được phẫu thuật thẩm mỹ cũng được làm đầy những vết
lõm và mờ nếp nhăn [3].
Năm 2005 PGS.TS. Phan Toàn Thắng phân lập thành công MSC từ màng lót

dây rốn. Đồng thời ứng dụng MSC phân lập từ màng lót dây rốn trong việc điều trị
bỏng, tái tạo da [3].
Năm 2007, nhóm nghiên cứu thuộc Khoa Sinh học – Đại học Khoa học Tự
Nhiên – ĐHQG Thành phố Hồ Chí Minh đứng đầu là Thạc sĩ Phan Kim Ngọc đã thu
nhận được MSCs từ máu dây rốn người. Các tế bào này sau đó được biệt hóa thành các
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương 1 – Tổng quan
tế bào mỡ và tế bào xương. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này tác giả không đưa ra kết
quả kiểm tra bằng các marker phân tử xem dòng tế bào thu được có phải là MSCs hay
không [2].
Năm 2009, Trần Công Toại và các cộng sự thành công trong việc biệt hóa
MSCs thu từ máu dây rốn thành nguyên bào xương sử dụng môi trường có chứa
vitamin D
2
và FGG9. Kết quả nhuộm alizarin red, alkaline phosphatase và Von Kossa
với các tế bào sau khi biệt hóa đều cho kết quả dương tính. Kết quả phân tích RT–PCR
cũng khẳng định được các tế bào biệt hóa từ MSCs biểu hiện các marker của tế bào
xương [55].
Có lẽ cũng phải nhắc đến việc chúng ta đã xây dựng thành công ngân hàng tế
bào gốc đầu tiên ở Việt Nam mang tên MekoStem. Ngân hàng sẽ cung cấp các dịch vụ
về thu thập, phân tích, xử lý tách tế bào, bảo quản các loại tế bào gốc từ máu và màng
dây rốn cho cộng đồng. Mặc dù sự ra đời của MekoStem mới chỉ là bước đi đầu tiên
trong tổng thể chương trình phát triển nghiên cứu tế bào gốc tại Việt Nam, song đây là
một bước tiến vượt bậc ghi nhận khả năng nghiên cứu, ứng dụng chuyên sâu của giới y
khoa Việt Nam trong việc sử dụng nguồn tế bào gốc quý giá mà nhiều năm qua bị vứt
bỏ như một loại rác thải y tế.
Tháng 3 năm 2010, nhóm nghiên cứu thuộc ngân hàng tế bào gốc Mekostem
(ngân hàng tế bào gốc đầu tiên của Việt Nam) công bố nghiên cứu đăng trên tạp trí
Thông tin Y dược phân lập MSCs từ màng dây rốn trẻ sơ sinh. Các tế bào này được
chứng minh dương tính với các marker CD13, CD44, CD90 và CD166, âm tính với các

marker CD34, CD45 và HLA–DR. Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu cũng biệt hóa được
MSCs này thành các tế bào giống tế bào mỡ [4].
1.2. TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ TĨNH MẠCH DÂY RỐN
1.2.1. Cấu trúc dây rốn
Dây rốn là đoạn kết nối giữa rốn của thai nhi và nhau thai bám ở thành tử cung
của người mẹ, có vai trò là cầu nối giữa người mẹ và em bé để vận chuyển chất dinh
dưỡng từ người mẹ chuyển qua đứa trẻ.
Dây rốn thường có chiều dài 50 cm và dày 2 cm, có một tĩnh mạch và hai động
mạch bao quanh bởi các mô nhầy hay gelatin, còn gọi là chất nền Wharton (Wharton’s
jelly) và được bọc bởi màng ối. Có thể xác định ba vùng khác nhau của chất nền: vùng
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương 1 – Tổng quan
dưới màng ối, chất nền Wharton, và lớp mô bao quanh các mạch máu. Vùng chất nền
Wharton gồm các phân tử collagen loại I, III, VI nằm ở trong những khoảng không
gian có hình dạng giống như rãnh. Xung quanh rãnh này là các phân tử collagen loại
VI, laminin và heparin sulfate proteoglycan. Các khoảng không gian chứa đầy chất nền
Wharton có dạng rãnh được bao quanh bởi các tế bào chất nền là các nguyên bào sợi
cơ mảnh có dạng ống biểu hiện vimentin, desmin và actin cơ trơn. Dây rốn giai đoạn
sớm chỉ có vimentin và desmin. Cấu trúc và thành phần của dây rốn giúp bảo vệ các
mạch máu khỏi bị nén và cũng có thể hỗ trợ quá trình trao đổi giữa máu dây rốn và
dịch ối [44].

Hình 4. Cấu tạo của dây rốn
Các nghiên cứu mới đấy chỉ ra rằng dây rốn là một nguồn giàu tế bào gốc. Có
hai loại tế bào gốc đã được xác định trong dây rốn: tế bào gốc trung mô từ chất nền,
tĩnh mạch, các vùng xung quanh và giữa các động mạch, vùng dưới màng ối và máu
của dây rốn; tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn [58]. Các tế bào gốc thu được từ dây
rốn và máu thai biểu hiện kháng nguyên bạch cầu người (human leukocyte antigen–
HLA) ở mức thấp và ít bị đào thải trong cấy ghép. Đây là nguồn tế bào gốc quan trọng
trong việc thay thế tủy xương khi không thể tìm được người cho có HLA phù hợp.

1.2.2. Tế bào gốc trung mô từ tĩnh mạch dây rốn
Cho đến nay, tủy xương vẫn là nguồn thu nhận MSC chính. Tuy nhiên việc
phân lập MSC từ tủy xương người vấp phải những khó khăn sau:
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương 1 – Tổng quan
• Thu nhận MSC từ tủy xương gây đau đớn cho bệnh nhân và dễ bị lây nhiễm
các nguồn virut.
• Số lượng cũng như tiềm năng tăng sinh và biệt hóa của MSC thu nhận từ tủy
xương giảm dần theo tuổi người bệnh.
Chính từ những nhược điểm này mà có nhiều nghiên cứu trên thế giới đi tìm
nguồn thu nhận MSC thay thế. Và một trong những nguồn thu nhận MSC dồi dào đó là
từ dây rốn, MSC thu nhận tử dây rốn có những ưu điểm sau:
• Hiện nay, dây rốn vẫn được có là rác thải y tế, vì thế rất chủ động trong
nguồn cung cấp, không gây đau đớn cũng như không vi phạm các nguyên
tắc về đạo đức.
• Khả năng nhiễm khuẩn là tương đối thấp.
• Do được thu nhận ngay sau khi thai nhi ra đời, nên tiềm năng tăng sinh và
biệt hóa là rất cao.
Các kết quả của Campagnoli và Erices [11, 21] chỉ ra rằng MSC có tồn tại trong
nhiều cơ quan bào thai và tuần hoàn trong máu của thai tiền sinh đồng thời với các tế
bào gốc tạo máu. Bởi vậy, dường như là máu dây rốn trong giai đoạn mang thai có
chứa các MSC nhiều tiềm năng. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu về việc phân lập MSC từ
máu dây rốn đã cho thấy không phải lần nào cũng phân lập thành công MSC. Từ đó đặt
ra một giả thuyết rằng: MSC trong máu dây rốn đã định cư ở đâu sau khi thai nhi ra
đời?
Và đề giải thích câu hỏi này, nhóm nghiên cứu của Romanov là những người đi
tiên phong trong việc chứng minh MSC có tồn tại ở lớp dưới nội mô của tĩnh mạch dây
rốn người [50] bằng cách phân lập chúng thành công từ tĩnh mạch dây rốn và duy trì
trong điều kiện nuôi cấy thích hợp với MSC thu nhận từ tủy xương. Các nghiên cứu
sau đó cho thấy UV–MSC có các đặc điểm tương tự như MSC thu nhận từ tủy xương

[17, 35, 43].
Cũng giống như MSC từ tủy xương, UV–MSC cũng có hình thuôn dài, dạng
giống như nguyên bào sợi. Khi nuôi cấy đạt mật độ cao, chúng hình thành các quần lạc.
Tốc độ nhân đôi của chúng là khoảng 2 lần mỗi 24h. Tiềm năng tăng sinh giảm sau 6–
20 lần cấy chuyển [17, 35, 43, 50].
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương 1 – Tổng quan
Nghiên cứu kiểu hình miễn dịch của UV–MSC cho thấy chúng không biểu hiện
MySM (smooth muscle myosin), các kháng nguyên của tế bào mono hay đại thực bào,
vWF, PECAM–1, CD45, CD14, glycophorin A, HLA–DR, CD51/61, CD106 và
CD49d, biểu hiện ASMA, CD29, CD13, CD44, CD49e, CD54, CD90, HLA lớp I và
tạo ra fibronectin, collagen loại I trong chất nền ngoại bào [43, 50]. Kết quả này khá
giống với kết quả thu được từ MSC tủy xương và các nguồn khác [11, 15, 21, 29, 39].
Thêm vào đó, nhóm của Kestendjieva (2008) bằng phương pháp RT–PCR và
miễn dịch huỳnh quang đã cho thấy UV–MSC dương tính với survivin, hTERT và
Bcl–2. Việc biểu hiện cả survivin, hTERT và Bcl–2 đã chứng minh tiềm năng tăng
sinh, biệt hóa cũng như khả năng hình thành quần lạc của UV–MSC.[35] Việc điều hòa
giảm sự biểu hiện của survivin trong quá trình biệt hóa UV–MSC chứng tỏ rằng những
tế bào này mất khả năng tăng sinh sau khi biệt hóa [35].
Về tiềm năng biệt hóa, ngay từ nghiên cứu của mình Romanov và cộng sự đã
chứng minh được UV–MSC có thể biệt hóa thành các tế bào mỡ và xương.[50] Khả
năng này đã được chứng minh lại ở các nghiên cứu sau đó. Nhóm của Kestendjieva
(2008) còn phát hiện ra tiềm năng biệt hóa thành tế bào nội mô của UV–MSC.[35]
Năm 2005, nhóm của các nhà khoa học Iran đã thành công trong việc biệt hóa UV–
MSC thành tế bào cơ tim [32], đây là một hướng đi mới trong việc tìm phương pháp
chữa trị các bệnh về tim.
1.3. FLOW CYTOMETRY VÀ ÚNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH DI
TRUYỀN TẾ BÀO
1.3.1. Lịch sử nghiên cứu Flow cytometry
Flow cytometry hay đếm tế bào theo dòng chảy là công cụ mạnh mẽ để đánh giá

những đặc điểm về hình thái, kích thước, thành phần acid nucleic, protein của từng tế
bào riêng lẻ trong số hàng nghìn tế bào của mẫu, tạo điều kiện cho việc xác định các
loại tế bào khác nhau trong một quần thể không đồng nhất. Flow cytometry đã phát
triển trong hơn 60 năm qua, từ những thiết bị ban đầu chỉ đo được một thông số là kích
thước tế bào, cho đến những chiếc máy hiện đại ngày nay có thể cung cấp 13 thông số
đánh giá cùng lúc cho mỗi tế bào.
Bảng 2. Lịch sử phát triển của Flow cytometry
Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học