Phương pháp xác định hoạt độ một số loại enzim

CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 68
Chng 7: PHNG PHÁP XÁC NH HOT  MT SÔ LOI
ENZIM
(Copfacto: cht phi hp hay cht cng tác ca enzim
DEAE – celluloza: diethylamino – athylcelulose)
7.1. n vo hot :
c  hot ng ca enzim trong ch phm là thông tin quan trng v lng enzim
trong i tng nghiên cu, vì rng trong nhng u kin xác nh, tc  phn ng
enzim t l vi lng enzim trong hn hp phn ng. Lng enzim theo quy c quc t
c biu din bng n v enzim:
n v tiêu chun enzim là lng enzim có kh nng xúc tác chuyn hóa 1 micro mol
 cht sau 1 phút  nhng u kin xác nh cho trc
- Trong trng hp enzim ch phân gii mt s liên kt ca phân t c cht (ví d
proteinaza vi c cht protein, amilaza vi c cht tinh bt) thì n v hot  tiêu chun
a enzim không tính micromol c cht b chuyn hoá mà tính bng micromol ng
ng ca các nhóm tng ng c to thành. Tc là tính theo s liên kt (peptit hay
glucozit) b phân gii.
- Trong trng hp phn ng gia 2 loi phân t theo kiu thì
n v enzim là lng enzim xúc tác chuyn hóa 1 micromol c cht A hoc B, hoc 2
micromol c cht A (hoc B) nu A=B sau 1 phút.
- Khi xác nh hot  enzim trong pha lng (dch th) thì tính sn v enzim trong
100 ml.
-  cht dùng các n v dn xut ca n v biu din: mili n v, kilô n v.
- Trong quá trình tách và làm sch (tinh ch) enzim thì ánh giá hiu qu ca quá
trình này, ngi ta dùng n v hot riêng: ó là sn v enzim tính trên 1 mg protein.
n v này ánh giá mc  thun khit ca enzim.
- u bit chính xác trng lng phân t ca enzim thì có th xác nh c hot 
phân t ca nó: là s phân t c cht (hoc sng lng các nhóm tng ng) b
chuyn hoá di tác dng ca 1 phân t enzim sau 1 phút.
- u bit c s trung tâm hot ng trong phân t enzim có th bit c hot  ca

trung tâm xúc tác. ó là s phân t c cht b chuyn hoá do 1 trung tâm xúc tác ca
enzim sau 1 phút. Nh vy nu enzim ch có mt trung tâm xúc tác thì i lng này
trùng vi hot  phân t enzim.
- ng  enzim trong dung dch c biu din bng sn v hot ng trong 1 ml.
- Nhng u cn lu ý khi xác nh hot  enzim:
+ Bn cht các enzim là protein nên thng không bn vng, rt nhy cm vi các
tác nhân lý, hoá. Vì vy khi làm thí nghim vi enzim cn tránh các yu t có th gây
A + B C + D
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 69
bin tính vô hot enzim nh: t
0
cao, pH quá axit, quá kim, kim loi nng và mui ca
chúng...tránh to bt trong dung dch vì mt s enzim có th b kìm hãm trên b mt phân
chia pha.
+ Các u kin (thông s) phn ng (t
0
, pH, áp sut...) phi  trong gii hn
enzim có th tn ti bn vng và c gi cnh trong sut thi gian phn ng. Mun
y phi tin hành phn ng trong dung dch có pH xác nh, bình phn ng phi t
trong máy siêu n nhit, các cht phn ng (c cht, cofacto...) phi có nhit  ca bình
phn ng trc khi np vào.
+ Phn ng enzim c tin hành trong u kin d c cht và cofacto. Cn tính
trc  sao cho khi kt thúc phn ng ch cô  20% c cht ban u b chuyn hoá.
trc ó cn xác nh nng  c cht thích hp cho phn ng bng các thí nghim qui
hoch ng.
+ Thi gian xác nh hot  không nên quá lâu, thng trong khong 5 – 30 phút.
t nht là xác nh tc  phn ng  phút u tiên (30 – 60s) vì tc  phn ng n
nh enzim cha b các tác ng nh hng nhiu n hot . Trong mt s trng hp
u hot  enzim quá thp hay cn nghiên cu nh hng ca mt s yu t hoá hc,

hoá sinh (kim loi, gc axit, baz...) cn phi  enzim vi c cht có yu t kho sát
trong thi gian  lâu (>1h).
+ Khi xác nh hot  enzim, bên cnh mu thí nghim (enzim tác dng vi c
cht) cn làm mu kim tra (kim chng, mu trng) trong ó enzim ã b mt hot ng
(hoc không có enzim) trc khi tip xúc vi c cht. Mu này cng thc hin ging mu
thí nghim nhng ch khác là phi vô hot (ình ch hot ) enzim hoc là không thêm
enzim. Hot  enzim c tính bng hiu s lng c cht (hay sn phm phn ng)
gia mu thí nghim và kim tra.
7.2. Các phng pháp xác nh hot  enzim:
Có th phân chia thành 2 loi phng pháp: liên tc và gián n.
- Phng pháp liên tc: s dng máy móc, thit bc bit hot ng tng liên tc
(chun , so sánh, o c) vi c cu tng ghi li liên tc s bin i ca các cht và
các thông s phn ng (hin th bng bng, biu,  th, biu , enzim ...) trong sut
thi gian tác dng ca enzim.
Nh vy phng pháp này có nhiu u m, hoàn toàn tng, có kt qu ngay, cùng
t lúc có th có nhiu mu theo mt chng trình nh sn. ây là xu hng và thc
tin hin nay vi công ngh cao (high – tech)
- Phng pháp gián n: cho enzim tác dng vi c cht, sau nhng khong thi gian
nht nh thì ly mu phn ng  phân tích kt qu.
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 70
Có th gi phng pháp này là phng pháp cn nhng hin nay vn còn c s
ng ph bin trng nghiên cu thm dò, s b, thí nghim i cng, nh tính. Ch có
t s ít thao tác vi enzim tinh khit c xem là hin i.
Sau ây ta xem xét mt s phng pháp c th.
7.2.1. Phng pháp o  nht:
Thng dùng c cht ca enzim có  nht ln hn (hoc nh hn) sn phm phân
hu ca nó. S bin i  nht này là thc o hot  enzim. Phng pháp này thng
dùng  xác nh hot  enzim thu phân cho amylaza, proteinaza.
7.2.2. Phng pháp phân cc k:

Thng dùng khi c cht ca enzim hoc sn phm phân gii ca nó có kh nng làm
quay mt phng ánh sáng phân cc và góc quay riêng ca chúng có khác nhau. Ngi ta
thng dùng phng pháp này  xác nh hot  ca saccaraza. C cht ca enzim này
là ng saccaroza có góc quay riêng là +66,5
0
(phía phi). Sn phm thu phân ca nó
là glucoza (góc quay riêng +52,5
0
) và fructoza (góc quay riêng là -92,4
0
- phía trái). Khi
enzim tác dng lên saccaroza theo mc  thu phân mà góc quay tng cng gim dn và
chuyn t phi sang trái. ây là phn ng nghch o ng rt kinh n trong nghiên
u ng hc phn ng, ng to ra gi là ng nghch o (t phi sang trái mt
phng ánh sáng phân cc). Tác nhân xúc tác thông thng (không phi enzim) là axit vô
 (HCl, H
2
SO
4
).
7.2.3. Phng pháp áp k:
c dùng khi phn ng enzim to thành hay hp th khí, chng hn các loi phn
ng oxy hoá có s tham gia ca phân t oxy (oxy hoá hiu khí), decacboxy hoá, deamin
hoá (loi CO
2
, NH
3
). Ngoài ra có th dùng phng pháp này  xác nh hot  ca
enzim trong quá trình phn ng không trc tip làm bin i th tích nhng kho thông
qua các phn ng trung gian tip theo (th hin gián tip hot ng ca enzim và do ó

th hin hot  ca nó) li to thành hoc hp th khí.
Ví d: - Các phn ng to axit hu c do enzim oxy hoá kh lipaza xúc tác có th
dung dch m bicacbonat (HCO
3
-
)  to thành CO
2
(theo phn ng
- Các phn ng deamin hoá di tác dng ca enzim peptithydrolaza, sau phn ng
cho tác dng vi axit nit to thành N
2
- Các phn ng lên men cn (ym khí và hiu khí) có th thc hin trong bình
Enron, hp th CO
2
bng dung dch BaSO
4
.
7.2.4. Phng pháp ph quang k:
Thng dùng  xác nh hot  các enzim mà c cht, coenzim hoc sn phm phn
ng có kh nng hp th ánh sáng khác nhau  nhng bc sóng xác nh. S bin i 
p th bc sóng y trong quá trình phn nh là o hot  enzim. Phng pháp này
c s dng rng rãi  nghiên cu các enzim thuc nhóm oxy hoá kh
oxydoreductaza, chng hn:
- Các ehydrogenaza vi coenzim NAD
+
hoc NADP
+
. Tc  phn ng enzim c
xác nh theo mc  kh hoc oxy hoá coenzim ca chúng. Dng kh NADH, NADPH
và dng oxy hoá ca các coenzim này khác nhau rõ rt v kh nng hp th bc sóng

H
+
+ HCO
3
-
H
2
O + CO
2
)
(NH
3
+
HNO
HNO
3
+
N)
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 71
340 nm, s bin i này phn ánh mc  chuyn hoá gia 2 dng và cng chính là tc
 và hot  phn ng enzim.
- Enzim tyrosunaza xúc tác s oxy hoá các hp cht phenol thành các quinon. Phn ng
này làm tng  hp th  bc sóng 280 nm. ây là phng pháp xác nh hot 
tyrosinaza (gi là phng pháp A hay phng pháp tyrosin 280). Tng t nh trên,
EPPO xúc tác oxy hoá c cht pyrpcatechin.
Phng pháp này ch cn lng nguyên liu nghiên cu rt ít, li có  nhy cao, cho
phép xác nh nhanh chóng, chính xác hot  enzim. Vì vy ây là mt trong nhng
phng pháp c s dng ph bin nht  nghiên cu enzim hc. Thm chí có trng
p phn ng enzim không làm bin i rõ rt quang ph hp th thì mt tác nhân khác

(enzim hay mt tác nhân khác) tác dng làm sn phm phm ng  thay i s hp th.
7.2.5. Phng pháp chun  liên tc:
c dùng  nghiên cu các phn ng enzim mà kt qu ca nó to thành axit hoc
baz. Lúc ó dùng thit b tng thêm kim hoc axit vào  gi pH môi trng phn
ng cnh, ng thi tng ghi ng biu din lng kim hoc axit ã tiêu tn vào
phn ng trung hoà. Lu lng kim hoc axit này phn ánh tc  phn ng enzim.
Phng pháp này có thc mô t m rng ra  nghiên cu các i tng khác
nhng trên nguyên tc liên tc nh lng (sn phm to thành hay lng c cht tiêu
hao), chng hn gián tip o th oxy hoá kh vi n cc tiêu chun khi nghiên cu các
enzim oxy hoá.
7.2.6. Phng pháp sc ký:
ây là phng pháp hin i, hin nay c s dng rt nhiu và trong nhiu trng
p dùng  tinh ch enzim. Tt c các phng pháp sc ký u có th áp dng  xác
nh hot  enzim. T phng pháp lâu i nht nh sc ký giy, sc ký trao i ion cho
n các phng pháp hin i nh sc ký lng cao áp, sc ký khí kt hp vi các phng
pháp phân tích hin i khác (phân tích axit ami tng, cng hng t ht nhân, cc
ph). Lng enzim và c cht cng nh sn phm phn ánh rt ít cng cho kt qu chính
xác, nhanh chóng.
7.2.7. Phng pháp hoá hc:
Dùng các phn ng hoá hc khác nhau  nh lng c cht b hao ht hoc sn
phm phn ng to thành di tác dng ca enzim. Các phn ng này thuc loi at màu
c trng, to màu vi thuc thc trng, ....nói chung là mt du hiu  nói lên mc
 hay thi m kt thúc phn ng. (ví dm tng ng khi nh phân axit – baz
c xác nh bi si màu fenolftalein, quì tím...)
Trong tt c các phng pháp va nêu, tu theo u kin, yêu ccu nghiên cu thc t
mà quyt nh phng thc tin hành (chng hn tin hành trong u kin thi gian nh
nhau, hay nng  enzim, nng  c cht không i ...) qui hoch thc nghim  xác
nh các thông s ti u.
7.3. Chun b dch chit enzim  xác nh ho.
Ch phm enzim có th dng rn, lng, bao gm giá th (c cht, cht n, ht cc)

các b phn khác nhau ca c th sinh vt sinh enzim (mô, t bào, khun ty, bào t...) và
CÔNG NGH ENZIM GVC: Ths. Trn Xuân Ngch
Trang: 72
môi trng sinh tng hp enzim (ch yu là nc) có th cha c enzim trong ó. Trong
quá trình nuôi cy, ny mm, enzim có th tin hành vào môi trng (enzim ngoi bào)
hoc enzim tn ti trong t chc c th sinh vt (mô, t bào), vì vy phi cn x lý nhm
y enzim  xác nh.
-i enzim ngoi bào:
+ Nu quá trình nuôi cy hay tích lu enzim bng phng pháp b sâu trong môi
trng lng. Sau khi ly mu xong cn làm sch nhanh chóng xung 0
0
C ri ly tâm tc
 cao 5000 – 6000 vòng/phút  thu c dung dch trong sut.
+ Nu quá trình nuôi cy hay tích lu enzim bng phng pháp b mt trên môi trng
n (hay ht cc) thì ly mu 10 – 20 gam, chit rút bng dung dch m tng ng vi
pH xác nh trong u kin lnh (0
0
C)  enzim khkông b bin tính hay gim hot tính,
ng dung dch này khong 200 ml (gp 10 – 20 ln ch phm). Lc qua phu hay ly
tâm vt  thu c dung dch trong sut.
-i enzim ni bào:
Phi phá v t bào  gii phóng enzim t do bng nhiu phng pháp:
+ Phng pháp c hc: ph bin nht là nghin thông thng (trong ci s, thu tinh,
máy nghin quay tay, máy nghin có ng c), nghin vi cát, vn thu tinh.
+ Phng pháp vt lý: dùng sóng siêu âm  phá v cu trúc t bào, mô.
+ Phng pháp hoá sinh: dùng enzim thích hp (xenluloza, pectinaza)  phân hu
màng t bào, mô  gii phóng enzim (trc ht có th nhn c t bào trn rt có giá tr
trong nghiên cu t bào hc, enzim hc).
Tip ó có th dùng các phng pháp chit rút thích hp (dùng dung dch m, dùng
(NH

4
)
2
SO
4
, axeton...) và hc  nhn c dung dch trong sut
Trong trng hp sau khi xác nh xong hot  ca dch chit cn tính toán hot 
a ch phm ban u (qui v hàm lng cht khô tuyt i)